Molekularbiologische Methoden im Lebensmittel-Labor Dr. rer. nat. Armin Pahl LADR GmbH MVZ Dr. Kramer & Kollegen 04152 803-0 www.ladr.de
DNA 1866 Gregor Mendel veröffentlicht seine Versuche über Pflanzen-Hybriden, die aber keine Beachtung finden. 1869 Friedrich Miescher isoliert aus Zellkernen das Nuclein, dessen Aufbau und Funktion zunächst rätselhaft bleiben. 1889 Richard Altmann identifiziert die Nucleinsäure und eine basische Proteinfraktion als Bestandteile des Nucleins. 1903 Chromosomen werden als Träger der Erbinformation erkannt (W. Sutton). 1953 J. Watson und F. Crick postulieren die Doppelhelix-Struktur der DNA. 1961 bis 1965 Dechiffrierung des genetischen Codes. 1975 DNA-Sequenzierung (Frederick Sanger, Allan Maxam, Walter Gilbert). 1983 Kary Mullis entwickelt die Polymerase-Kettenreaktion. 1995 Das erste prokaryotische Genom (von Haemophilus influenzae) ist sequenziert. 1997 Das erste eukaryotische Genom, das der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, ist sequenziert. 2003 Als Resultat des Humangenomprojektes steht die Referenzsequenz des menschlichen Genoms zum Download im Internet bereit. 2008 Das 1000-Genome-Projekt wird gestartet. 2012 1000er Marke erreicht 2009 - Massively Parallel Sequencing: The Next Big Thing in Genetic Medicine
Bausteine der DNA
Aufbau der DNA
Die Richtung der RNA / DNA
Replikationsgabel
DNA Synthese Eine DNA Polymerase kann nur einen partiellen Doppelstrang verlängern. Es findet keine Initiation der DNA Synthese durch die DNA Polymerase eines Einzelstranges statt.
Polymerase Chain Reaction Denaturierung bei 95 C Primerhybridisierung bei 54 C Elongation durch TAQ-Polymerase bei 72 C Ende des ersten Zyklus
Taq-Polymerase Heiße Quelle: Thermus aquaticus. In fast allen PCR-Ansätzen der Welt finden sich heute so genannte Taq-Polymerasen aus dem Bakterium Thermus aquaticus. Dieser Mikroorganismus lebt in heißen Quellen bei etwa 70 C. Der erste T. aquaticus-stamm, aus dem Polymerasen für die PCR gewonnen wurden, stammte aus dem amerikanischen Yellowstone-Nationalpark.
Effizienz der PCR
DNA Gelelektrophorese Gelkammer Ethidiumbromid-gefärbtes Gel
GVO gentechnisch veränderter Organismus Gentechnisch verändert ist ein Organismus, dessen genetisches Material in einer Weise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürliche Rekombination nicht vorkommt. Artikel 2 der europäischen Freisetzungs- Richtlinie (2001/18/EG).
Gentechnisch veränderte Pflanzen
GVO Screening Das klassische qualitative Screening umfasst den 35S-Promotor (aus CaMV) und NOS-Terminator (aus Agrobacterium tumefaciens) und detektiert ca. 90% aller bekannten GVO-Pflanzen. (momentan!)
Gentechnisch veränderte Organismen
GVO Nachweis über PCR
P 35S: Promotor-Sequenz, stammt aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus. T-Nos: Terminator-Sequenz; stammt aus dem Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens. FMV: Promotor-Sequenz aus dem Braunwurzmosaikvirus (Figwort mosaic virus). CTP2-CP4-EPSPS: vermittelt Resistenz gegen das Herbizid Gylphosat (RoundUp Ready ) Bar: Gen, das Resistenz gegen den Wirkstoff Phosphinotricin (Totalherbizid) verleiht. Pat-syn: Bar und Pat unterscheiden sich bei gleicher Funktion in ihrer DNA-Sequenz.
P 35S: Promotor-Sequenz, stammt aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus. T-Nos: Terminator-Sequenz; stammt aus dem Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens. FMV: Promotor-Sequenz aus dem Braunwurzmosaikvirus (Figwort mosaic virus). CTP2-CP4-EPSPS: : vermittelt Resistenz gegen das Herbizid Gylphosat (RoundUp Ready ) Bar: Gen, das Resistenz gegen den Wirkstoff Phosphinotricin (Totalherbizid) verleiht. Pat-syn: Bar und Pat unterscheiden sich bei gleicher Funktion in ihrer DNA-Sequenz.
Glyphosat EPSPS: 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase
Real Time PCR PAC-Man - - - -TAQ-Man
TAQ Man Prinzip Hydrolysesonden
Realtime Salmonellen PCR
Interne Kontrolle der Salmonellen PCR
Botulinumtoxin (BTX) PCR- Nachweis
Listeria monocytogenes
Sanger Sequencing Gelelectrophoresis
Die Richtung der RNA / DNA
Didesoxynukleotide
Sanger Sequencing Gelelectrophoresis
S35 Sequenzierung
Automatisierte DNA Sequenzierung
Bestimmung von Bakterien mithilfe der 16S RNA Sequenzierung Amplifikation im konservierten Bereich der 16 s RNA (100 1500 bp) Sequenzierung des Amplifikats Abgleich der Sequenzen mit öffentlichen (z. B. Genbank-nicht verifizierte Daten), oder kommerziellen (Microsec verifizierte Daten) Datenbanken
Bestimmung von Bakterien mithilfe der 16S RNA Sequenzierung Vorteile: Keine spezifischen Primer notwendig universell anwendbar. Keine aufwendigen Bak.- Verfahren notwendig Hohe Erfolgsrate Nachteile: Teure Analysegeräte Reinkultur Qualität der öffentlichen Datenbanken Nicht alle Spezies besitzen eine eigene 16 S RNA Sequenz Kosten
Solid Chip
DNA-Chip für Tierartenbestimmung
Tierartennachweis Cytochrom b Gen Protein aus der Atmungskette 389 bp Fragment Interne Amplifikationskontrolle Hybridisierungskontrolle
Testablauf
Scannen und Evaluation Detection of Cy3-label at 532 nm (green) Detection of Cy5-label at 635 nm (red) orientation control printing control hybridisation control Hybridisation Horse Donkey Pig Orientation Goat Cattle Chicken PCR control species specific probe Sheep Turkey Orientation 40 PCR
Danke für die Aufmerksamkeit