135 BIOCHEMIEPRAKTIKUM II PLATZ 8: ANTIBIOTIKAREITENZ VON BAKTERIEN, DNA-REKOMBINATION- TECHNIK, POLYMERAE-KETTENREAKTION IN DER MEDIZINICHEN DIAGNOTIK In den folgenden Experimenten werden Eigenschaften von DNA (Exp. 8.10), Plasmiden (Exp. 8.7) und Restriktionsenzymen (Exp. 8.8) untersucht. Anhand des Exp. 8.9 wird eine Anwendung der strukturgetreuen DNA-Vermehrung durch Polymerase-Kettenreaktion in der medizinischen Diagnostik erläutert. Theoretische Grundlagen: Molekularbiologische Methoden (. 45-50) UV-pektren von Nucleotiden (. 20) Bezug zu anderen Plätzen: ubstratspezifität von Enzymen Exp. 1.6, Exp. 10.5 Elektrophorese Exp. 4.2 EXPERIMENT 8.7: Antibiotikaresistenz von Bakterien Prinzip: Im Versuch wird die Wachstumshemmung von E. coli-bakterien in Flüssigkulturen durch die Antibiotika Ampicillin (ein Penicillinderivat) und Tetracyclin geprüft. Ausgehend von E. coli, die kein Plasmid enthalten, ist ein Teil der Bakterien mit Plasmid, welches ein Resistenzgen enthält, transfiziert worden (Aus zeitlichen Gründen kann die Transfektion am Kursnachmittag nicht durchgeführt werden). Resistenzgene sind spezifisch für bestimmte Antibiotika, d.h. gegen Penicilline oder Tetracycline, aber nicht gegen beide Antibiotika-Typen. Das Resistenzgen für Penicillin (Ampicillin) führt zur Bildung des Enzyms $-Lactamase, das Penicilline durch paltung des Lactamrings inaktiviert. Tetracyclinresistenz beruht auf der Bildung eines membranständigen Proteins, welches aufgenommenes Tetracyclin aus der Bakterienzelle transportiert. Material und Lösungen: 1) LB-Kulturmedium (=Luria-Bertani Nährlösung) 2) Ampicillin, 60 µg/ml, in LB-Kulturmedium 3) Tetracyclin, 15 µg/ml, in LB-Kulturmedium 4) 70% Alkohol
136 5) E. coli Kultur A, B, C Ausführung: 9 sterile Plastikröhrchen mit überstülpbarem chnappdeckel beschriften (A1, A2, A3; B1, B2, B3; C1, C2, C3) und beschicken. Röhrchen sogleich wieder bedecken (nicht einschnappen). Mit Pasteurpipette vorsichtig je 2 Tropfen E. coli A in alle Röhrchen A, E.coli B in alle Röhrchen B und E. coli C in alle Röhrchen C pipettieren (Plastikhandschuhe tragen). Gebrauchte Pasteurpipetten in bereitgestelltes ammelgefäss geben. Bei Verschmutzung Arbeitsfläche mit Papiertüchlein aufwischen und anschliessend mit 70% Alkohol reinigen! Röhrchen A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 Lösung 1) LB (ml) 5 5 5 2) LB-Amp (ml) 5 5 5 3) LB-Tet. (ml) 5 5 5 je 2 Tropfen E. coli A E. coli B E. coli C Resultat:........................... Plasmid:......... Die Röhrchen gruppenweise den Assistierenden abgeben. ie werden für ca. 16 tunden bei 37 0 C inkubiert. Die Kulturlösungen müssen dabei mit kreisförmigen chüttelbewegungen (280 Umdreh./min) mit Luft durchmischt werden. Weshalb? Auswertung: Im Laufe des Nachmittags werden Ihnen die Röhrchen des vorangegangenen Kurstages zur Beurteilung abgegeben. Vermehrung der Bakterien ist durch Trübung und dichte chlierenbildung beim chwenken der Röhrchen sichtbar. Resultate (Trübung - bis +++) in Tabelle eintragen und beurteilen, welche E. coli (A,B,C) ein Resistenzplasmid enthalten. Bakterien können auch auf festem, Nährlösung enthaltendem Agar vermehrt werden. Wenn die auf einem Agarboden ausgesäten Zellen genügend verdünnt sind, wird jedes lebensfähige Bakterium eine sichtbare und abgegrenzte Kolonie bilden, d.h eine Ansammlung einer riesigen Anzahl von Tochterzellen. Eine solche Kolonie stellt einen Zellklon dar. Durch Zählen der Kolonien und Berücksichtigung der Verdünnung kann die Anzahl der Bakterien in einer uspension bestimmt werden. Dieses Verfahren hat in der ärztlichen Praxis eine grosse Bedeutung. Es wird als sog. Urikult-
Test häufig zur Abschätzung der Anzahl Bakterien im Urin verwendet. tark vermehrter Bakteriengehalt im Urin sichert die Diagnose eines bakteriellen Infekts der ableitenden Harnwege. Wo kann somit der Infekt anatomisch lokalisiert sein? Falls dem Agar ein Antibiotikum zugesetzt ist, werden Resistenzplasmid enthaltende Bakterien selektioniert. Dieser Vorgang bildet die Grundlage zur Klonierung von DNA, weil zu isolierende Fremd-DNA in ein Plasmid eingefügt und herausgeschnitten werden kann. Untersuchungen von Bakterienwachstum auf antibiotikahaltigem Agar spielt in der Medizin eine wichtige therapeutisch/diagnostische Rolle. Welche? 137 Wie kann man nachweisen, dass Bakterien Plasmide mit Antibiotikaresistenzgenen enthalten? Wo greifen Penicillin und Tetracycline in den bakteriellen toffwechsel ein? Welche Erklärungen gibt es, wenn z.b. die mit B bezeichneten E. coli in allen drei Kulturmedien (Lösungen 1-3) gewachsen wären. Wie kann man herausfinden, welche Möglichkeit zutrifft? Warum werden die Flüssigkulturen beim Inkubieren geschüttelt, d.h. mit Luft durchmischt? EXPERIMENT 8.8: pezifische paltung von DNA durch Restriktionsenzyme Prinzip: Das für die Penicillinresistenz verantwortliche Plasmid in Exp. 8.7 wird mit den Restriktionsenzymen EcoRI, Bgl I oder mit beiden verdaut. Die Restriktionsfragmente werden mittels Elektrophorese aufgetrennt. Material und Lösungen: - 1.2% Agarose-Gel, enthält Ethidiumbromid (nicht mit blossen Händen anfassen. Carcinogen!) - Plasmid-DNA, Puffer H, Restriktionsenzyme Eco RI, Bgl I - Ladepuffer Ausführung: 4 verschliessbare Eppendorf-Röhrchen auf dem Deckel beschriften (1 bis 4) und mit folgenden Volumina beschicken (µl):
138 1 2 3 4 (unverdaut) (Eco) (Bgl) (Eco + Bgl) Wasser 20 10 10 - Plasmid-DNA 10 10 10 10 Puffer H 10 10 10 10 Restriktionsenzym EcoRI - 10-10 Bgl I - - 10 10 Röhrchen dicht verschliessen, gut mischen und zur Verdauung für 45-60 Minuten ins 37 0 C Wasserbad stellen. Nach der Verdauung zu allen 4 Röhrchen je 5 µl Ladepuffer zugeben. Röhrchen dicht verschliessen. Auswertung: Unverdaute DNA und DNA-paltprodukte unterscheiden sich in Länge und Form. Mit Hilfe der Agarose-Gel-Elektrophorese wird DNA auf Grund unterschiedlicher Länge und Form in Exp. 8.9 aufgetrennt (zusammen mit den Proben von Exp. 8.9, siehe dort; 1 Gel pro Gruppe). Weshalb erlauben die Resultate der Restriktionsverdauung zu entscheiden, ob die untersuchte Plasmid-DNA linear oder ringförmig ist. Weshalb zeigt die unverdaute DNA unterschiedlich weit wandernde DNA-Banden? Eine ungefähre Karte mit den Restriktionsstellen der beiden Enzyme erstellen. Das Plasmid besteht aus rund 3'000 Basenpaaren (3 kbp). Welche chemische Reaktion führen Restriktionsenzyme durch? Welche paltprodukte entstehen? (wo welche funktionellen Gruppen?) Zeichnen ie die durch EcoR I, Pst I und ma I gebildeten DNA-Enden (stumpfe, überhängende oder zurückversetzte Enden; Nucleotidsequenz). Welche Enden können durch DNA-Ligase miteinander verbunden werden? Wie könnte gezeigt werden, dass bei obiger Verdauung des Resistenzplasmids mit EcoRI und Bgl I das vollständige Gen für $-Lactamase im kleineren DNA-Fragment (ca. 1.4 kbp) enthalten ist? Falls das Gen für β-lactamase im kleineren DNA-Fragment enthalten ist, muss das Enzym also weniger als... Aminosäurereste enthalten.
139 EXPERIMENT 8.9: Amplifikation eines spezifischen DNA-Abschnitts durch Polymerase- Kettenreaktion Mukoviszidose ist eine autosomal rezessiv vererbte törung der exokrinen Körperdrüsen. ie gehört zu den häufigsten lebensbedrohlichen Erbkrankheiten des Menschen und kommt in der chweiz bei etwa 1:2'500 Neugeborenen vor. Die bei den meisten Mukoviszidosekranken auftretenden fibrotischen Veränderungen der Bauchspeicheldrüse (fibrotische Vermehrung des Bindegewebes) haben zur synonym gebräuchlichen Bezeichnung zystische Fibrose des Pankreas, kurz zystische Fibrose, geführt (CF = cystic fibrosis). Krankheitssymptome der Mukoviszidose manifestieren sich in den meisten Fällen bereits im Kindesalter und sind durch die ekretion eines dicken, zähflüssigen chleims bedingt (Mucus viszidus = zähflüssiger chleim, daher der Name "Mukoviszidose"). Dieser erleichtert die chronische Besiedlung der Lunge mit opportunistischen Erregern (meist taphylokokken und Pseudomonas aeruginosa). Die körpereigene Abwehr kann die Bakterien nur unzureichend bekämpfen und trägt stattdessen zu einer fortschreitenden Zerstörung der kleinen Bronchien bei. Die fibrotischen Veränderungen und Degeneration der Drüsengänge im Pankreas verhindern die ekretion von Verdauungsenzymen. Dies führt zu mangelhafter Nahrungsverwertung, Mangelerscheinungen und Gedeihstörungen. Mit zunehmender Fibrose kann es durch Ausfall des endokrinen Pankreas zu einem Diabetes mellitus kommen. Im Erwachsenenalter kann die Krankheit mit fibrotischen Leberschäden und Gallensteinen einhergehen. Fast alle männlichen Betroffenen sind unfruchtbar wegen fehlenden permien in der amenflüssigkeit (Azoospermie). Das CF-Gen überspannt einen Bereich von etwa 250 kbp, besitzt 27 kodierende Exons und bildet das CFTR-Protein (Cystic Fibrosis Transporter Protein), ein transmembranales ATP-abhängiges Transportprotein für Chlorid und Wasser (1480 Aminosäuren), das in allen Epithelzellen vorkommt. Fehlen oder mangelhafte Funktion des CFTR-Proteins führt zu ungenügendem Flüssigkeitstransport durch Epithelmembranen, was als primäre Ursache der Mukoviszidose angesehen wird. Eine grosse Anzahl verschiedenster Mutationen kann zu Mukoviszidose führen. Zu den zehn häufigsten gehört u.a. eine Punktmutation, die im folgenden Experiment nachgewiesen werden kann. Durch eine Basensubstitution entsteht eine im Wildtypgen nicht vorhandene Erkennungsstelle für eine bestimmte Restriktionsendonuclease, deren Vorhandensein oder Fehlen leicht nachweisbar ist. Für diese Nachweismethode ist Voraussetzung, dass es gelingt, den betreffenden Genabschnitt, z.b. aus Leukozyten, zu amplifizieren. Prinzip: Mit 2 für das CF-Gen spezifischen Oliogonucleotid-Primern werden DNA-Proben aus menschlichen Leukozyten durch PCR amplifiziert (Aus praktischen Gründen liegt bei den verwendeten DNA-Proben ein Teil des CF-Gens bereits angereichert vor!). Durch anschliessende Restriktionsverdauung der amplifizierten DNA wird geprüft, ob bei den Proben die gesuchte Punktmutation vorliegt. Durch Basensubstitution entsteht eine in der Wildtyp-DNA nicht vorhandene Restriktionsstelle, wodurch bei der Verdauung zwei DNA-Fragmente (ca. 150 und 350 Bp) gebildet werden. Lösungen: 1) DNA-Proben A, B in speziellen PCR-Röhrchen (dünnwandig, besonders wärmeleitfähig) 2) CF1 (40 ng/µl) = Oligonucleotid 1 = 5'-Primer 3) CF2 (40 ng/µl) = Oligonucleotid 2 = 3'-Primer
4) Puffer/dNTP: Desoxy-Nucleotidtriphosphate, je 1.6 mm; MgCl 2 2.5 mm; Pufferlösung ph 7.5 5) Taq Polymerase: Thermostabile DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus 6) Puffer H 7) Restriktionslösung R1, enthält Restriktionsenzym 8) 1.2% Agarose-Gel, enthält Ethidiumbromid (nicht mit blossen Händen anfassen. Carcinogen!) 9) Ladepuffer; Elektrophoresepuffer 140 Ausführung: 1. Amplifikation mit PCR Zwei Eppendorf-Röhrchen mit A0, B0 beschriften. 1.1 Die beiden PCR-Röhrchen A und B, die bereits Probanden-DNA enthalten, wie folgt beschicken (Volumina µl): DNA-Proben (10 µl) A B in PCR-Röhrchen Oligonucl. Primer CF1 10 10 " " CF2 10 10 Puffer/dNTP 60 60 5 Minuten 94 0 C (Trennen der DNA-tränge), dann Zugabe von Taq-Polymerase. 10 10 Deckel dicht verschliessen und mischen. 1.2 Röhrchen aller Kursteilnehmer zusammen in Lochhalterung des Thermal-Cyclers stellen. Deckel schliessen durch sanftes Drücken und Einrasten. tarttaste drücken, Temperaturanzeige verfolgen. Während 5 Minuten werden die DNA-tränge durch Hitzedenaturierung bei 94 0 C getrennt. Zehn ekunden vor Beendigung der Denaturierung (Zeitangabe des Anzeigefelds verfolgen) die Pause-Taste drücken und Deckel des Thermal-Cyclers öffnen. Achtung: Innenseite des Deckels ist heiss! 1.3 Allen Röhrchen Taq-Polymerase zugeben, Deckel dicht verschliessen, gut mischen und anschliessend je 10 µl entnehmen (=Proben vor Amplifikation; von PCR-Röhrchen A in A0, bzw. von PCR-Röhrchen B in B0 pipettieren) und für die Elektrophorese beiseite stellen. 1.4 PCR-Röhrchen in Thermal-Cycler zurückstellen. Zur Fortsetzung des Programms Pause-Taste erneut drücken. Der Thermal-Cycler führt nun 20 Zyklen mit folgendem Temperaturprogramm durch: 1 Minute 94 0 C, 1 Minute 57 0 C, 1 Minuten 72 0 C.
1.5 Verdauung der amplifizierten DNA (siehe unter 2.) bereits jetzt mit den Proben des vorangegangenen Kurstags ansetzen. Aus Zeitgründen kann damit nicht bis zur Beendigung der PCR gewartet werden. 1.6 Nach Beendigung der PCR je 10 µl in ein A20 bzw. B20 beschriftetes Eppendorf-Röhrchen pipettieren (=unverdaute Probe nach 20 PCR-Zyklen) und für die Elektrophorese beiseite stellen (Deckel beschriften). Den Rest der amplifizierten Proben A und B den Assistierenden abgeben; auf keinen Fall wegwerfen! 141 2. Verdauung der amplifizierten DNA mit Restriktionsendonuclease: Die Proben A und B (Röhrchen AR und BR) für die Verdauung mit Restriktionsenzym werden vom Assistierenden ausgeteilt. 2.1 Zu AR und BR je 10 µl Restriktionsenzym-Lösung R1 geben. Röhrchen dicht verschliessen, gut mischen (Vortex-chüttler) und für 45-60 Min ins 37 0 C Wasserbad stellen. 2.2 Nach der Verdauung 2 µl Ladepuffer zugeben. 3. Agarose-Gel-Elektrophorese: (ein Agarose-Gel pro Gruppe!) Die Proben dieses Experiments werden zusammen mit Proben von Exp. 8.8 auf demselben Gel aufgetrennt! 3.1 Elektrophoreseapparatur mit 600 ml Elektrophoresepuffer füllen, sodass das Gel vollständig mit Puffer bedeckt ist. 3.2 Die Proben vor (A0,B0; siehe oben, 1.3) und nach 20 PCR-Zyklen (A20,B20; siehe oben, 1.6) sowie die amplifizierten und mit Restriktionsenzym verdauten Proben (AR, BR; siehe oben, 2.3) werden elektrophoretisch aufgetrennt und miteinander verglichen. Zu den Proben A0, B0, A20, B20 je 10 µl Wasser und 2 µl Ladepuffer pipettieren. Alle Röhrchen verschliessen, auf dem Vortex-chüttler gut mischen und zusammen mit den Röhrchen AR und BR (diese Proben vom Vortag enthalten bereits 2 µl Ladepuffer) vor dem Auftragen auf das Agarose-Gel ca. 30 ekunden zentrifugieren. Deckel der Eppendorf-Röhrchen vorsichtig öffnen ohne die Proben aufzuwirbeln. 3.3 Durch den glycerolhaltigen Ladepuffer sind die Proben deutlich schwerer als Wasser und können vorsichtig in die Ladeschlitze des mit Pufferlösung überschichteten Agarose-Gels pipettiert werden. Pro Ladeschlitz wird je 10 µl Probe in der Reihenfolge A0, B0, A20, B20, AR, BR aufgetragen (Anleitung durch Assistierende). Die ersten 2 Ladeschlitze frei lassen! 3.4 Proben 1-4 von Exp. 8.8 (sollten bereits 5 µl Ladepuffer enthalten; siehe Exp. 8.8) werden vor dem Auftragen kurz zentrifugiert. Anschliessend an die bereits aufgetragenen Proben zwei Ladeschlitze frei lassen und vorsichtig je 10 µl der Proben 1-4 wie oben auftragen.
3.5 chutzdeckel auf Elektrophoreseapparatur aufsetzen und Kabel vom pannungsgerät anschliessen. Auf Polung achten (Wanderung in Richtung Anode). Die Elektrophorese wird bei 80 Volt für 25 Minuten durchgeführt (Falls die Elektrophorese länger durchgeführt wird, sind die DNA-Banden schlecht nachweisbar, da Ethidium gegenläufig aus dem Gel wandert). 3.6 Zur Auswertung wird das Agarose-Gel jeder Gruppe von den Co-Assistierenden photographiert. Beurteilen, ob die Probanden-DNA die gesuchte Mutation aufweisen. ind die zwei untersuchten Individuen bezüglich dieser telle im Genom homo- oder heterozygot, gesund oder krank? 142 Zeichnen ie den amplifizierten DNA-Doppelstrang mit den eingebauten Oligonucleotiden (Primer) und die beiden Möglichkeiten der ungefähren Position der Mutation schematisch auf. Wie könnte man zwischen den beiden Möglichkeiten unterscheiden? Berechnen ie, wieviel Prozent der Bevölkerung Träger einer krankmachenden Mutation sind, wenn von 2'500 Neugeborenen durchschnittlich 1 Kind an Mukoviszidose erkrankt?
143 Anhang zu Platz 8 Klinisch relevante Fragen für Interessierte (nicht Prüfungsstoff) zu Exp. 8.7 Antibiotikaresistenz von Bakterien (. 91): Wieso sind mehr und mehr Bakterien resistent gegen Antibiotika, vor allem Keime, welche Infektionen verursachen? Können in der Landwirtschaft eingesetzte Antibiotika und in die Umwelt abgegebene Antibiotika ein Gefährdung für den Mensch darstellen? Antwort in: Vom egen zum Alptraum, M. Teuber, Unimagazin 1/02, 31-34, 2001 (http://www.vam.unizh.ch/ibt/modules/bip/start.xhtml > Platz 8, Anhang zu Exp. 8.7: Unimag02-Antibiotika.pdf) Antibiotikumresistente Bakteriem: eine neue Dimension in der Lebensmittelmikrobiologie (http://e-collection.ethbib.ethz.ch/ecol-pool/bericht/bericht_50.pdf) Medical consequences of antibiotic use in agriculture, Witte, W., cience 279, 996-7 (1998), (http://www.hbi.unizh.ch/index.html > Recherche ----> Zeitschriften (freier Zugang zu Online-Zeitschriften von öffentlich zugänglichen Computern an der Universität) Resistenz gegen Antibiotika und andere antiinfektiöse ubstanzen - eine weltweit wachsende Bedrohung? Kann die Pharmaindustrie rechtzeitig neue Antibiotika zur Anwendung bringen? Antwort in: http://www.sciam.com/0297issue/0297techbus4.html (freier Zugang von Uni- Computern) Wie werden Bakterien resistent gegen Antibiotika? Antwort in: The challenge of antibiotic resistance, Levy,. B., cientific American (International Edition) 278, 46-53, 1998 (http://www.sciam.com/1998/0398issue/0398levy.html; freier Zugang von Uni-Computern) Tuberkulose erneut im Vormarsch - Ist eine Behandlung in Zukunft noch möglich? Antwort in: Evolution of drug-resistant tuberculosis: a tale of two species; M. D. Iseman, Proceedings of the National Academy of ciences of the United tates of America 91, 2428-9 (1994)