Vorlesung LV-Nr. 954.104 Molekularbiologie für Agrarwissenschaften J. Glößl, SS 2007 Thematik: Molekularbiologische Methoden Teil 3 Die ppt Folien wurden freundlicherweise von Prof. Florian Rüker aus der Vorlesung Einführung in die Molekularbiologie, LV 954100, bereitgestellt Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 1
Biotechnologisch relevante Expressionssysteme gemeint ist haupsächlich Herstellung von rekombinanten Proteinen Prokaryontisch: E. coli: rekombinante Proteine allgemein B. subtilis: hauptsächlich Proteasen (z.b. für Waschmittel: Subtilisin) Eukaryontisch: Hefe: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris Pilze: hauptsächlich Sekundärmetaboliten (Antibiotika,...) Säugerzellen: CHO (Chinese Hamster Ovary), Myelomzellen u.a. Insektenzellen transgene Tiere: z.b. Expression in der Milch mit ß-Casein Promoter transgene Pflanzen: Tabak, Mais u.a. Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 2
Expressionsvektoren Wie wird ein einfacher Klonierungsvektor zum Expressionsvektor? Elemente für Transkription Promoter, Terminator, Regulationssequenzen (z.b. lac Operator, lac Repressor, Introns) Elemente für Translation Ribosomenbindungsstelle (in Bakterien Shine-Dalgarno) Translation Initiationscodon (ATG, oder, selten GTG oder TTG) Translationterminationscodons (TAA, TGA, TAG) Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 3
Grundsätzliche Überlegungen zur Wahl des Expressionssystems Wofür soll das Produkt eingesetzt werden? Therapeutisch: höchste Anforderungen an Qualität Funktion Toxizität, Verträglichkeit Reinheit (Freiheit von Bestandteilen der Wirtszelle, des Mediums, von Abbauprodukten) Antigenizität Stabilität Authentizität (Struktur, posttranslationale Modifikationen) Reagens Funktion,... Anforderungen je nach Verwendung variabel Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 4
Grundsätzliche Überlegungen zur Wahl des Expressionssystems Quelle des zu exprimierenden Gens? Pro- bzw. eukaryontisch cdna oder genomisch synthetisch benötigte Proteinmenge? Ist natürlich ein entscheidender Faktor, das wichtigste ist aber immer die Qualität, d.h. was muß mein Protein können technische Möglichkeiten, Zeitbedarf Schüttelkolben, Fermentation, scale up Downstream processing, ev. Refolding von inclusion bodies Zeitrahmen: E. coli: Tage Hefe: Wochen tierische Zellen: Monate Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 5
Expressionsvektoren - Entscheidungen Selektion - dominant oder Komplementation einer Mutation? Induzierbare oder konstitutive Expression? Extrachromosomale Replikation oder Integration ins Genom? Intrazelluläre Expression oder Ausschleusung ins Medium? Soll ev. ein Fusionsprotein gemacht werden? Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 6
Transgene Tiere Übergeordnetes Prinzip ein kloniertes Gen wird in den Kern eines befruchteten Eies eingebracht Dieses Ei wird in ein scheinschwangeres (Behandlung mit Hormonen) Tier implantiert Bei den Nachkommen wird überprüft, ob das fremde genetische Material ins Genom integriert wurde Durch Inzucht solcher modifizierter Tiere wird eine neue, homozygote genetische Linie etabliert Einsatzgebiete genetische Information einbringen genetische Information zerstören Verwendung als Lebend-Bioreaktor Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 7
Transgene Tiere Durch Wahl geeigneter Promotoren läßt sich der Ort der Genexpression steuern z.b.: ß-Casein Promotor Immunglobulin-Promotor... Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 8
Methodenspektrum Transgene Tiere Gentransfer mittels retroviraler Vektoren Mikroinjektion von DNA Transfektion embyonaler Stammzellen Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 9
Transgene Tiere - Transfektion embryonaler Stammzellen Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 10
Transgene Tiere - retroviraler Gentransfer Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 11
Transgene Pflanzen - wie? Bestimmte Bakterienarten können Pflanzen infizieren Agrobacterium tumefaciens Ti-Plasmid (tumor inducing) Agrobacterium rhizogenes Ri-Plasmid (root inducing) "entwaffnete" Ti Plasmide werden zum Gentransfer eingesetzt Pathogenitätsgene wurden entfernt enthalten sind: DNA-Abschnitte für die Integration ins Wirtsgenom Selektionsmarker Fremdgen Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 12
Transgene Pflanzen - wie? Blattstücke werden mit Suspension rekombinanter Agrobakterium- Zellen inkubiert Auf einem Medium mit geeigneter Hormonzugabe wird Sproßbildung induziert Bakterien werden mit Antibiotikum abgetötet Transformierte Pflanzen(zellen) werden positiv selektioniert Wurzelbildung wird hormonell induziert ganze Pflanzen werden regeneriert geht nur in dikotylen Pflanzen gut Getreide, Mais, Reis sind monokotyl direkter Gentransfer mittels Gene Gun Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 13
Transgene Pflanzen - was wird verbessert? Resistenz gegen Schädlinge Viren Pilze Insekten Resistenz gegen Pflanzenschutzmittel Verbesserung der Pflanzenqualität Fettsäurespektrum im Raps Aminosäurezusammensetzung der Proteine Anti-Matsch Paradeiser Stärke-Qualität und Gehalt bei Erdäpfeln Produktion von Fremdprotein Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 14
Optimierungsmöglichkeiten Codon usage Datenbank: www.kazusa.or.jp/codon/ Kopienzahl ( Amplifikation ) Integrationsort Regulation stärkerer Promoter schwächerer Promoter dichterer Promoter nicht nur die kodierende Sequenz ist wichtig, auch die Umgebung, z.b.: Kozak sequence in Eukaryonten :GCCGCCPuCCAUGG Sekundärstruktur der mrna Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 15
PCR Überblick Polymerase Chain Reaction Grundlagen, Komponenten Enzyme fidelity quantative PCR, real-time PCR alternative DNA- und RNA- Amplifikationsmethoden Hauptanwendungsgebiete: Diagnostik: Nachweis von Krankheitserregern, Mutationen, Genexpression, Identität von Individuen Gentechnik: extrem wichtiges Hilfsmittel beim Klonieren Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 16
PCR Exponentielle Amplifikation E = b * 2 n E= Zahl an gebildeten Molekülen b= Ausgangszahl von Molekülen n= Zahl der PCR Zyklen Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 17
PCR Reagenzien Template (DNA oder RNA) 2 Primer dntps PCR Puffer und: thermostabile DNA Polymerase (Taq Polymerase) vom thermophilen Mikroorganismus Thermus aquaticus http://www.dnalc.org/shockwave/pcranwhole.html Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 18
PCR Prinzip Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 19
Vergleich von 2 wichtigen thermostabilen DNA Polymerasen Taq Exonuklease 5'-3 Ja 3-5' Nein Reverse Transcriptase Aktivität schwach entstehende DNA Enden 3'A Pfu Nein Ja n.a. Blunt Taq: Thermus aquaticus Pfu: Pyrococcus furiosus (proofreading Aktivität!) zahlreiche andere thermostabile DNA Polymerasen stehen zur Verfügung reverse Transkriptase Aktivität nur unter speziellen Pufferbedingungen (z.b. Mangan statt Magnesium) Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 20
Design von PCR-Primern meistens 15-30 Nukleotide lang "uniqueness" am besten mit Computerprogramm überprüfen besonders am 3' Ende des Primers muß die Basenpaarung optimal sein 5' die Basen sollten zufällig verteilt sein, der G+C Gehalt möglichst nicht extrem lange A+T bzw. G+C Abschnitte wenn möglich vermeiden interne Sekundärstruktur minimieren 3' Verlängerung durch Polymerase möglich! Beispiel für ein Computerprogramm zum Primerdesign: http://www.changbioscience.com/primo/primo.html Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 21
Design von PCR-Primern die 2 Primer sollten zueinander möglichst wenig komplementär sein 5' Primer 1 vs. Primer 1, Primer 2 vs. Primer 2, Primer 1 vs. Primer 2 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' die Annealingtemperatur der beiden Primer sollte möglichst gleich sein, weniger als 3 Unterschied ideal am 5' Ende der Primer können lange (bis zu etwa 30 Basen), nichtkomplementäre Sequenzen angehängt werden, um z.b. Restriktionsstellen an das PCR Produkt anzufügen 3' 5' 3' Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 22
Schmelztemperatur T m durch Hitze "schmelzen" die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren T m ist die Temperatur, bei der die Hälfte der DNA Stränge als Einzelstrang und die andere Hälfte als Doppelstrang vorliegt T m ist abhängig von der Länge und der Basenzusammensetzung der DNA: mehr Basen und/oder ein höherer Gehalt an G und C bedeutet höhere T m, weil: einfache Faustformel für T m von kurzen Oligos 4 C für jedes G C Basenpaar 2 C für jedes A T Basenpaar Tm G C > Tm A T für längere Oligos: Computerprogramm für T m verwenden! ungefähr: T anneal wird ca. 4 C unter T m gewählt Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 23
Diagnostische Anwendung der PCR Mit normaler PCR bekommt man sehr leicht und schnell ein qualitatives Ergebnis, d.h. z.b. eine Antwort auf die Frage ist ein bestimmer Krankheitserreger im Probematerial enthalten?. Eine quantitative Aussage, also wieviele Viruspartikel, wieviel mrna, etc. ist allerdings nicht möglich. Das wird klar, wenn man sich die Bildung von PCR Produkt während einer PCR Reaktion ansieht. PCR-Produktbildung in Abhängigkeit von der Templatemenge Menge an PCR Produkt Ausgangsmenge an Template PCR Zyklus Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 24
Daraus folgt: Quantitative PCR darf nicht primär nur die Menge an Endprodukt untersuchen, sondern muß genau verfolgen, wann das Produkt gebildet wird. Also: wieviel mit wann kombinieren Produktmenge unterhalb der Nachweisgrenze Diagnostische Anwendung der PCR Menge an PCR Produkt # PCR Zyklus d.h. man muß während der gesamten PCR beobachten, was passiert! Ausgangsmenge an Template Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 25
Real-time PCR (RT-PCR) - quantitative PCR präzise, high-throughput, und relativ leicht durchführbar Quantifizierung der Reaktionsprodukte bei jedem einzelnen PCR Zyklus. Sehr breiter dynamischer Bereich: ca. 10 7 -fach Alle real-time PCR Systeme basieren auf der Detektion und Quantifizierung eines fluoreszierenden Reporters, dessen Signal direkt proportional mit der Mange an gebildetem PCR Produkt ist. Im einfachsten Format verwendet man einen für DNA spezifischen Farbstoff, SYBR Green (sprich: Seiber Grien). SYBR Green bindet an doppelsträngige DNA, und fluoresziert im gebundenen Zustand nach Anregung mit Licht entsprechender Wellenlänge. Mit zunehmender Menge an PCR Produkt nimmt die beobachtete Fluoreszenz zu. Vorteile von SYBR Green: billig, sensitiv, einfach zu verwenden. Nachteil: bindet an jeden DNA-Doppelstrang, also auch z.b. an Primer- Dimere, und an unspezifische, falsche PCR Produkte. Gutes Design der Primer und geeignete Kontrollreaktionen unbedingt nötig! Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 26
Dideoxy DNA Sequenzierung - was ist ein ddntp? dd = dideoxy die Methode wurde von Fred Sanger entwickelt Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 Dec;74(12):5463-7 DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. 5' 4' Deoxy 3' um die Elongation des DNA-Strangs zu verhindern; kann keine Phosphodiesterbindung mit einem dntp bilden 2' 1' Deoxy (weil es DNA ist!) Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 27
DNA Sequenzierung - Animationen http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/sangerseq.html http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/cycseq.html http://www.dnalc.org/shockwave/cycseq.html Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 28
DNA Sequenzierung Wie die DNA nach der Sequenzierungsreaktion sichtbar gemacht wird: 5 3 5 DNA Polymerase dntps (100µM) früher: radioaktive Markierung von Primer oder den eingebauten Nukleotiden verwendete Isotope: 35 S, 32 P heute: Fluoreszenz-Markierung der Dideoxynucleotide für jedes der 4 ddntps wird eine andere Farbe (also ein anderer Fluoreszenzfarbstoff) verwendet http://www.dnalc.org/shockwave/cycseq.html +ddatp (1µM) +ddgtp (1µM) +ddttp (1µM) A G T C +ddctp (1µM) A G T C A G T C Gemisch von Reaktionsprodukten, die sich in der Länge um jeweils 1 Base unterscheiden. Die letzte Base trägt dabei jeweils den spezifischen Fluoreszenzfarbstoff. Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 29
DNA Sequenzierung - Elektrophorese Gele in Kapillaren (oder, in älteren Geräten, flach zwischen Glasplatten Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 30
DNA Sequenzierung - Auswertung Jedes der 4 ddntps ist mit einem anderen Farbstoff markiert Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 31
Microarrays Was sind DNA arrays oder Microarrays? Array: Aufstellung, Ansammlung (militärisch) DNA arrays bestehen aus einer großen Anzahl regelmäßig und systematisch aufgebrachter (aufgespotteter; spot = Punkt, Fleck) DNA Moleküle auf einem festen Träger (Nylon Membran, Glasplättchen, Silicon chip). Ein Spot enthält in der Regel nur eine Art (Sequenz) von DNA. Der Durchmesser der Spots in microarrays ist meist kleiner als 250 µm). Hunderte bis viele Tausend solcher Spots gemeinsam bilden einen Array. Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 32
Microarrays Hauptsächlich kommen 2 Arten von DNA arrays zur Anwendung: 1. Oligonucleotid Microarrays oder oligo chip. Bei den immobilisierten DNA Molekülen handelt es sich um Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 20 bis 30 Basen. 2. cdna Microarrays oder cdna chip. cdna oder (meist mit PCR amplifizierte cdna) wird immobilisiert. Die Länge der cdna Stücke ist meist kleiner als 2000 bp. 3. Selten kommen auch Genomische Microarrays oder genomic chips zum Einsatz. Hier werden genomische DNA Abschnitte mit einer Länge mehrerer kbp immobilisiert. Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 33
Was macht man mit DNA Arrays? Microarrays Das Hauptziel ist meist, Information über die Expression von Genen in bestimmen Geweben, Zellen, etc. zu gewinnen. Z.B.: welche Gene werden in einem bestimmten Gewebe exprimiert oder nicht exprimiert, welche Gene werden unter bestimmten Einflüssen hinauf- oder hinunterreguliert. Man untersucht z.b.: verschiedene Gewebe eines Organismus verschiedene Entwicklungsstadien alt - jung verschiedene Genotypen krank - gesund verschiedene Behandlungen verschiedene Zeiten nach einer Behandlung Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 34
Microarrays www.gene-chips.com www.affymetrix.com www.nhgri.nih.gov/dir/microarray/main.html www.umanitoba.ca/faculties/afs/plant_science/courses/bioinformatics/lec12/lec12.1.html Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 35
Blotting Techniken Southern Blot: DNA auf Filter immobilisiert, Detektion mit markierter DNA oder RNA Sonde (probe). J Mol Biol 1975 Nov 5;98(3):503-17 Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Edward M. Southern Northern Blot: RNA auf Filter immobilisiert Western Blot: Protein auf Filter immobilisiert, Detektion mit spezifischem Antikörper Markierung: radioaktiv: P 32, S 35 nicht-radioaktiv: DIG (Digoxigenin, Roche), Biotin-Streptavidin Markierung http://www.dnalc.org/shockwave/southan.html Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 36
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Prinzip Southern Blots macht man, um komplementäre DNA Sequenzen mit spezifischen Sonden nach Auftrennung mittels Elektrophorese zu detektieren. Northern Blots sind eine Variation des Southern Blots. Beim Northern wird nicht DNA sondern RNA elektrophoretisch aufgetrennt und dann mit spezifischen Sonden detektiert. Im Gegensatz zu einer unspezifischen Färbung (z.b. mit Ethidiumbromid) werden nur die spezifischen Banden sichtbar gemacht. Damit die DNA Banden während der Hybrisidierung nicht davonschwimmen immoblisiert man sie auf einer Membran aus Nylon oder Nitrozellulose. Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007, J. Glößl, Teil 3 38