Photomorphogenese: Wirkung des Lichts auf die Entwicklung von Pflanzen

Photomorphogenese: Wirkung des Lichts auf die Entwicklung von Pflanzen

Literatur L. Taiz, E. Zeiger: Physiologie der Pflanzen Spektrum Verlag H.W. Heldt, B. Pichulla: Pflanzenbiochemie Spektrum Verlag Brennicke, Schopfer: Pflanzenphysiologie Spektrum Verlag

Licht = Elektromagnetische Strahlung : 350 bis 780 nm -> der für das Auge sichtbare Bereich

Lichtperzeption Pflanzen können Licht wahrnehmen: - Licht - Lichtrichtung - Lichtintensität - Dauer der Belichtung - Spektralbereich (Qualität) Spektrale Verteilung von Licht. Tageslicht Baumkrone Dämmerung

Was ist Licht für die Pflanze? - Energiequelle - Signal für die Steuerung einer Vielzahl von Entwicklungsprozesse

Licht steuert die Enwicklung von Pflanzen Photomorphogenese Skotomorphogenese Licht-gekeimte Pflanzen Dunkel-gekeimte Pflanzen

Photorezeptoren der Pflanzen Phytochrom (Hellrot- und Dunkelrotlicht, 660 bzw. 730 nm): steuern Wachstums- und Entwicklungsvorgänge von Pflanzen Schattenvermeidung, Blühinduktion, Phototaxis Cryptochrom (UV-A und Blaulicht, 340 bis 520 nm): Aufrechterhaltung der circadianen Rhythmik steuern Photomorphogenese und Blühinduktion Phototropin (UV-A und Blaulicht, 340 bis 520 nm) vermittelt effiziente Lichtnutzung und Phototropismen auch an der Chloroplastenbewegung, der Stomataöffnung beteiligt UV-B-Photorezeptor (280 bis 350 nm) Schutzfunktion

Photorezeptoren der Pflanzen Yuling Jiao, On Sun Lau & Xing Wang Deng Nature Reviews Genetics 8, 217-230 (March 2007) doi:10.1038/nrg2049

Photorezeptoren Photorezeptoren sind Chromoproteine - Chromophore: absorbiert Licht - Apoprotein: Konformationsänderung führt zur Signalübertragung Informationsübertragung verläuft über Signalkaskaden

SB21.17 Klassische Phytochromwirkungen Dikotyle Keimung oft Licht abhängig 3 Kriterien der Photomorphogenese: - Hypokotyl-Elongation - Öffnung des Hypokotylhakens - Entwicklung von Kotyledonen Skotomorphogenese Sinapis alba Photomorphogenese

Monokotyle Alternative Entwicklungsstrategie - Streckung der Koleoptile im Dunkeln

Klassische Phytochromwirkungen Rotlicht aktiviert die Keimung von Salat-Samen (Lactuca sativa) dunkelrotes Licht revertiert diese Aktivierung (Keimung gehemmt) Lettuce seed germination is a typical photoreversible response controlled by phytochrome (Taiz L., Zeiger E., 2010)

Klassische Phytochromwirkungen Erlangung der Blühfähigkeit auf bestimmte Tageslängen angewiesen: Unterscheidung von Kurztagpflanzen und Langtagpflanzen Taiz L., Zeiger E., 2010

Klassische Phytochromwirkungen Plastidendifferenzierung ist lichtabhängig

Das Phytochrom-System In Pflanzen gibt es mehrere Phytochrome - von verschiedenen Proteinen expremiert - zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung Es gibt 5 Phytochrom-Gene in Arabidopsis (Dikotyle): phya, phyb, phyc, phyd, phye Monokotyle (z.b. Mais) haben weniger Phytochrom-Gene: phya, phyb, phyc Alle Phytochrome haben den selben Chromophor - unterscheiden sich in ihrer Sensitivität zu Licht Unterschiedliche Phytochrome sind für unterschiedliche Prozesse verantwortlich.

Phytochrome exists in 2 states (Pr and Pfr) Pr form: - absorbs at a peak of 666 nm - is the form synthesized in dark - when Pr absorbs red light, it is converted to the Pfr form Pfr form: - absorbs at a peak of 730 nm - Pfr form is the active form that initiates biological responses - when Pfr absorbs far red light, it is converted to the Pr form - Pfr can also spontaneously revert to the Pr form in the dark Pr = Phytochrome red light absorbing, inactive Pfr = Phytochrome far-red light absorbing, active

The photoconvertible Pr and Pfr forms Pr = Phytochrome red light absorbing, inactive Pfr = Phytochrome far-red light absorbing, active

Absorptionsspektrum von Phytochrom Absorptionspektren von Pr und Pfr überlappen the Pr form absorbs maximally at 660 670nm (R) the Pfr form absorbs maximally at 725 735nm (FR)

- Aufgrund überlappender Absorptionsspektren liegt immer ein Gleichgewicht von Pr und Pfr vor: o Gleichgewicht in Rotlicht: 85% Pfr und 15% Pr -> Pfr absorbiert R-Licht o Gleichgewicht in Dunkelrotlicht: 97% Pr und 3% Pfr -> Pr absorbiert etwas DR-Licht

Struktur des Chromophors Das Protein (Apoprotein) ist kovalent an ein Chromophor gebunden. Der Chromophor ist ein linearer Tetrapyrrol (Phytochrombilin). Beide sind über eine Thioetherbrücke miteinander verbunden. Pflanzliche Phytochrome sind Homodimere (bestehend aus 2 gleichen Polypetiden).

Struktur des Chromophors Rotlicht bewirkt die reversible Isomerisierung zwischen den Tetrapyrrolringen C und D. Diese Veränderung am Chromophor verändert die Konformation des Proteins.

Domänenstruktur N-Terminus: C- Terminus: - Phy-Spezifität - Dimerisierungsdomäne - Chromophorbindung - Ubiquitinbindung - PEST für Degradation - Signalweiterleitung - Serin/Threonin-Kinase Domäne

Domänenstruktur

R/DR-Lichtverhältnis

R/DR-Lichtverhältnis µmol m -2 s -1 R/FR ratio Day 1900 1.19 Sunset 26.5 0.96 Under Canopy 17.7 0.13 5mm deep in Soil 8.6 0.88

3 Arten der Phytochrom-Antworten Einteilung ist abhängig von der Lichtintensität: 1. VLFR (very low fluence responses) < 10-3 µmol photons/m 2 2. LFR (low fluence responses) 1-1000 µmol photons/m 2 3. HIR (high irradiance responses) >1000 µmol photons/m 2

3 Arten der Phytochrom-Antworten Niederflußantwort (LFR, low fluence response) - RL durch DR revertierbar - Phytochrom B (auch C, D und E) Hochintensitätsrekation (HIR, high irradiance reaction) - Wirkung bei Dauerbestrahlung - energieflußabhängig - nicht revertierbar - v.a. Phytochrom A, z.t. Phytochrome B Niedrigstflußreaktion (VLFR, very low fluence response) - benötigt < 0.01% Pfr - nicht revertierbar - Phytochrom A

Low fluence response (LFR) abhängig von R/DR Verhältnis reguliert: - Keimung -> Licht stimuliert oder hemmt Keimung (Spezies-spezifisch) -> z.b. Salat -> RL stimuliert Keimung -> bis zu 8h nach Bestrahlung durch DR revertierbar - De-Etiolierung -> Ergrünen von etiolierten Keimlingen bei Belichtung ( nach erreichen der Erdoberfläche bzw. durchbrechen der Blattschicht/Vegetation) -> massive Chlorophyllsynthese, heterotropher -> autotropher Stoffwechsel

Phytochrom-abhängige Keimung Red Dark Red Far-red Dark Dark (control) Red Far-red Red Dark Red Far-red Red Far-red Rotlicht fördert Keimung, Dunkelrot hemmt Keimung

Etioliert: - kein Chlorophyll -> Etioplasten - Hypokotyl lang - geschlossener Hypokotylhaken - kleine Blätter De-etioliert: - Chlorophyll -> Chloroplasten - grüne, entfaltete Blätter - Hemmung des Längenwachstums

Schattenvermeidung Shaddow Pfr > Pr long hypokotyl field plants at the edges are shorter, because less shaded

High irradiance response (HIR) ist abhängig von der Dauer (Kontinuität) und der Intensität (Photonenflussrate) der Bestrahlung ist unabhängig von R/DR-Verhältnis reguliert: - Chlorophyllsynthese - Plastidendifferenzierung - Keimung von Samen - Hemmung des Längenwachstums - De-Etiolierung - zirkadiane Rhythmik

Es gibt 5 Phytochrom-Gene in Arabidopsis: PhyA-E Phytochrom A - Licht-instabil - Hauptform in Samen und etiolierten Pflanzen Phytochrom B-E - Licht-stabil - Hauptform in de-etiolierten Pflanzen

Phytochrome haben überlappende Funktionen HIR LFR

Mutants: Chromophor mutants ->all phytochromes are affected Apoprotein mutants loss of function mutants -> e.g. defect in signaling component gain of function mutants -> e.g. constitutive active signaling component Phenotypes: - dark phenotype in light - light phenotype in dark Muramoto et al., 1999

Photorezeptor-Mutanten von Arabidopsis Phenotype of phy mutants (phy = phytochrome); Li et al., 20011

Photorezeptor-Mutanten von Arabidopsis Phenotypes of 4-d-old WT, phya, phyb, and phyab mutant plants

Phytochrome regulieren Genexpression Gen-Aktivierung während der Photomorphogenese: 1979: Lhcb-Gene (Antennenprotein der PS-Komplexe) in Gerste heute: > 1500 Gene sind Phytochrom-reguliert: - Photosynthese-Gene - N/S-Metabolismus - Gene für Plastiden-lokalisierte Protein - Pigment-Gene (Anthocyane und Flavonoide) Phytochrom-Level kontrolliert eigene Expression (phya) über negative feedback-schleife

Expression von Phytochrom-Genen

Phytochrom-Biosynthese

Wie reguliert Phytochrom die Genexpression? (i) P fr reguliert Transkriptionsraten im Kern Signaltransduktion 1.Konformationsänderung von Pr zu Pfr in Rotlicht 2.Translokation von Pfr in den Zellkern 3.P fr assoziiert mit regulatorischen Proteinen (Transkriptionsfaktoren wie z.b. PIFs = phytochrome interacting factors) 4.Aktivierung lichtregulierter Gene 5.Autophosphorylierung von Pfr Ein kleiner Teil der Pfr-Form bleibt in Cytosol > vermittelt cytosolische Phyochromantworten Nito et al, 2013 Phosphorylierungsgrad (py) von Phytochrom entscheidend für Signaltransduktion -> phosphorylierte Pfr-Form ist im Kern inaktiv

Phytochrom-Signaltransduktion

Interaktion mit Transkriptionsfaktoren - Interaktionspartner identifiziert (mittels yeast two-hybrid-screens und Mutantenanalysen) - am besten untersucht sind phytochrome-interacting factors (PIFs), z.b. PIF3 - PIFs sind basische Helix-Loop-Helix (bhlh) Transkriptionsfaktoren - PIFs sind im Kern lokalisiert und binden an G-Box-Motive (= light responsive element) in den Promotoren lichtregulierter Gen (z.b. MYB (Transkriptionsfaktor) - im Licht interagiert Pfr mit PIFs -> führt zur deren Abbau - Proteolyse von PIFs aktiviert Expression lichtregulierter Gene ( early genes ; z.b. MYB) - diese Proteine aktivieren late genes - physiologische Reaktionen auf Licht

Wie reguliert Phytochrom die Genexpression? (ii) Proteolyse von Repressoren der Photomorphogenese - Repressoren (neg. Regulatoren) z.b. COP1, COP10, COP9 und SPA -> sind im Kern lokalisiert - COP1 besitzt eine E3 Ubiquitin-Ligase Aktivität - kann sich selbst und andere interagierende Proteine (Transkriptionsfaktoren z.b. HY5 und LAF1) ubiquitinylieren - reguliert dadurch den Abbau (oder die Akkumulation) verschiedener Transkriptionsfaktoren im Dunkeln (bzw. Licht) -> TF werden im Dunkel durch den COP1 /SPA-Komplex abgebaut -> im Licht wird COP1-SPA-Komplex inaktiviert und TF stabilisiert

Phytochrome signaling pathway Li et al., 20011 PIFs inhibieren durch Licht induzierte Antworten HY5, HFR1 und LAF1 mit positiver Wirkung auf lichtabhängige Antworten

Phototropismus Phototropismus: Wachstumsbewegung von Pflanzen in Abhängigkeit des Lichtreizes positiver Phototropismus -> Krümmung zum Licht hin negativer Phototropismus -> Krümmung vom Licht weg Light Time 0 min Time 90 min (b) Coleoptiles before and after light exposures

Phototropic effectiveness 1.0 0.8 0.6 0.4 436 nm 0.2 0 400 450 500 550 600 650 700 Wavelength (nm) (a) Phototropism action spectrum Blaulicht: 400 500 nm

Blaulichtrezeptoren Pflanzen detektieren Richtung, Intensität und Wellenlänge. Phototropine (NPH) Cryptochrome (CRY) (Photolyasen)

Phototropin-gesteuerte Reaktionen Phototropismus Chloroplastenbewegung Stomataöffnung teilw. überlappende Funktion mit Phytochromen: o Stomataöffnung o Genexpression o Pototaxis o Hemmung des Hypokotylwachstum Phototropin-gesteuerte Reaktionen in Arabidopsis: WT: Wild-type p1p2: phototropin-deficient Arabidopsis mutant

Phototropine Struktur: zwei LOV Domänen (Light oxygen voltage): LOV1 und LOV2 eine Proteinkinasedomäne Flavin (FAD) dient als Chromophor Phototropine sind in Plasmamembran verankert

Modell zur Aktivierung der Phototropine: im Dunkeln ist Phototropin inaktiv -> da Proteinkinasedomäne durch LOV2 blockiert Blaulicht bewirkt Änderung der Struktur: -> Aktivierung der Kinasedomäne -> Autophosphorylierung der Phototropine -> Signalweitergabe -> Änderung der Genexperession

Phototropin photoreaction Flavin > R CH 3 N O CH 3 O N Cystein BL R CH 3 N O 5 4a NH N H 5 4a N CH 3 N H SH S H O O S Slow dark recovery Redox reaction!!!!!!! O N NHH Cysteinyl-C(4a) adduct Batschauer Nach Belichtung verändern sich die Konformation. Dadurch bindet das Chromophor kovalent das Protein kovalente Bindung zw. C(4a) des FMN und einem Cystein-Rest der LOV-Domäne.

Phototropin-mediated reactions Phototropismus Chloroplasts movement Stomata opening 2 Phototropine in Arabidopsis: phot1 und phot2 -> One of the two phototropins is responsible for low light responses, the other for high light responses.

Blue light induces chloroplast movement low light high light WT phot1 phot2 phot1/ phot2 TIPS Genotype Phototropismus Chloroplast movement Stomata opening

Blue light induces chloroplast movement

Blue light directs auxin to the shaded side to induce phototropic curvature

Blue Light directs stomata opening

Guard cells with chlorophyll fluorescence

. However stomata opening is regulated by many factors

Cryptochrome (Cry) in Pflanzen, Bakterien und Tieren identifiziert in Sequenz und Struktur den Photolyasen sehr ähnlich, haben jedoch keine Photolyase-Aktivität (keine DNA-Reparatur) Vorwiegend im Zellkern lokalisiert, auch im Cytoplasma Pterin Flavin

Cryptochrom-gesteuerte Reaktionen Hemmung des Sproßwachstums De-etiolierung Blühinduktion Stimulation der Anthocyanin-Biosynthese Circadianer Rhythmus

Cryptochrom Struktur: Binden zwei Co-Faktoren: i. Flavin (FAD) -> dient als katalytisches Chromophor ii. Pterin (MTHF) - > fungiert als Antennenpigment Signalweitergabe durch Phosphorylierung und Protein-Interaktion

Cryptochrome is central for the control of circadian rhythm Linnès Blumenuhr Neben Cryptochromen auch Phytochrome beteiligt!

Linnés Blumenuhr

Tagesrhythmische Blattbewegung von Mimosa pudica Blattgelenk mit Leitbündelverlauf

Tagesperiodische Blattbewegungen von Phaseolus-Pflanzen A und B: Nacht- und Tagstellung der Blätter C: Tagesperiodische Bewegung, Aufzeichnung dieser Bewegung über mehrere Tage, die ersten zwei Tage mit Licht-Dunkel-Wechsel, dann Dauerdunkel

Biologische Rhythmen Biologische Rhythmen: Phänomene, die sich in regelmäßigen Zeitabständen wiederholen, z.b. einem Tag, Monat oder Jahr. circadianen Rhythmen (~1 Tag) lunar (~ 1 Monat annual (~ 1 Jahr) zyklischer Wechsel mit Licht-Dunkel, Wärme-Kälte, Luftfeuchte und Gravitation Rhythmen werden durch innere Uhren (Zeitmesssysteme) erzeugt Phasenlage synchronisieren mit äußeren Faktoren (den Zeitgeber )

Grundorganisation circadianer Systeme Exogene Zeitgeber: Temp, Licht, Luftfeuchtigkeit endogener Schrittmacher: (clock-gene z.b. per, tim, frq, toc) Response: Metabolismus, Verhalten, Aktivität Input: Aufnahme exogener Rhythmen Oszillator: fortlaufende Oszillation mit endogener Periode Output: vom Oszillator geregelte Prozesse

Merkmale circadianer Systeme 1) werden durch Umweltreize (Licht, Temperatur) synchronisiert (Entrainment: Fähigkeit der täglichen Synchronisation der Phasenlage mit exogenen Umweltfaktoren) 2) laufen mit einer individuellen Periodenlänge von ~ 24 Stunden 3) sind temperaturkompensiert, d.h. Periodenlänge bleibt über einen weiten Temperaturbereich hinweg konstant Q 10 : 0.8-1.3 Erhöhung der Temperatur um 10 C führt zur Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit um den Faktor 0.8-1.3

toc1 (timing of CAB/Lhcb expression)

Identifikation genetischer Komponente: period, timeless, clock, cycle Mechanistisches Grundprinzip: Oszillatoren werden durch Rückkopplungsschleifen der Transkription und Translation angetrieben, d.h. Protein hemmt die Transkription des eigenen Gens Fliegen (Drosophila melanogaster) Period & Timeless Clock und Cycle Isolierung von Mutanten (gestörte Rhythmik des Lokomotorverhaltens und Schlüpfens) Idendentifizierung der Gene perl, pers, pera Fliegen lang, kurz, arhythmisch Neurospora, Chlamydomonas, Arabidopsis, Maus

Rückkopplungsschleife der Genexpression in Drosophila: Clock (CLK) und Cycle (CYC) bilden Heterodimere im Kern CLK und CYC sind Transkriptionsfaktoren (besitzen bhlh- und PAS-Domänen) binden an Promotoren (E-Box-Sequenzen) von period und timeless aktivieren daraufhin die Transkription von period (PER) und timeless (TIM) PER und TIM sind Transkriptionsfaktoren (besitzen PAS-Domänen) mrnas wandern vom Zellkern ins Cytosol ->Translation im Cytosol PER und TIM wandern in Kern De-aktivierung des CLK-CYC-Komplexes -> Transkription von per und time gehemmt

Gonyaulax polyedra: Biolumineszenz in der Nacht Zellteilung bei Morgendämmerung Photosynthese am Tag Zellaggregration am Tag Fluorescence of luciferin circadiane Kontrolle erfolgt über Regulation der Translation - nicht transkriptionell -> Biolumineszenz: Regulation der Translation des Luciferinbindeprotein

Photolyases Vorkommen in prokaryotischen und in eukaryotischen Organismen Strukturell den Cryptochromen ähnlich Flavin (FAD) und Pterin als Chromophore Photolyasen sind Enzyme, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind -> DNA-Reparatur erfolgt mit Hilfe von Blaulicht sind keine Photorezeptoren

Photo-reactivation by blue light

. In summary: BL and RL

UV-B Rezeptor absorbiert bei 290-350 nm seit 70er Jahre physiogisch charakterisiert Induktion von Flavonen/Flavonoiden/Anthocyane -> Schlüssenenzyme dieses Syntheseweges 2011 UVR8 (UV resistance locus 8) identifiziert im Pflanzenreich ubiquitär verbreitet Schutzfunktion (UVB-Schäden) steuert Entwicklungsprozesse

UV-B Rezeptor-Struktur liegt in zwei strukturellen Zuständen vor: Licht- und Dunkelform -> im Dunklen als Homodimer -> in UVB-Licht Monomer besitzt Tryptophan-Pyramide als Chromophor -> diese fungiert als UV-B Lichtsensor

UV-B-vermittelte Signaltransduktion monomere Form bindet an das Signalprotein COP1 (COP1 = constitutively photomorphogenic 1) Bindung an COP1 löst Signaltransduktionskaskade aus -> Geneexpression -> Einleitung des genetischen Schutzprogramms