Research at the Institute aims to

Institut für Molekulare Strahlenbiologie Institute of Molecular Radiation Biology Neuherberg (Direktor / Director: Prof. Dr. Jean-Marie Buerstedde) Die Institute Ziel der Forschung am Institut für Molekulare Strahlenbiologie (IMS) ist es besser zu verstehen, auf welche Weise ionisierende Strahlung Zellschäden, genetische Erkrankungen und Krebs verursacht. Dabei wird vorausgesetzt, dass die meisten biologisch relevanten Effekte von Bestrahlung durch direkte DNS-Schäden in Form von Doppelstrangbrüchen oder oxidierten Basen entstehen. Diese Läsionen können zum Zelltod durch Replikationsblockade, chromosomaler Missegregation oder poptose führen. Von ebenso großer Bedeutung sind jedoch enommodifikationen in überlebenden Zellen in Form von endeletionen, Basensubstitutionen und Chromosomaberationen, da diese für das erhöhte Risiko von Krebs und erblichen Erkrankungen nach Strahlenexposition verantwortlich sind. Eine Vielzahl von Reaktionswegen beteiligt sich an der Reparatur von Strahlenschäden, wobei Doppelstrangbruchreparatur und die Exzision von oxidierten Basen die größte Bedeutung besitzen. Viele der strahlenempfindlichen DN-Reparaturdefizienzen manifestieren sich als Immunodefizienzen, da ubiquitäre DNS-Reparaturfaktoren für die Entstehung des enrepertoires von ntigenrezeptoren benötigt werden. Die enge Verbindung zwischen DNS-Schäden, allgemeiner DNS-Reparatur und Krebsentstehung bewirkt, dass die Forschung in der molekularen Strahlenbiologie von einer interdisziplinären usrichtung profitiert. Zwei Forschungsgruppen am IMS arbeiten im oben genanntem Kontext i) an der Charakterisierung von zytogenetisch erkennbaren Chromosomenaberrationen in strah- Research at the Institute aims to understand how ionising radiation causes cell toxicity, genetic disease, and cancer. It is assumed that most of the biologically relevant effects of radiation are related to direct DN damage in the form of double-strand breaks and oxidised bases. hese lesions can lead to cell death due to replication blockage, chromosomal missegregation, or apoptosis. enome modifications of surviving cells in the form of gene deletions, base substitutions, and chromosomal rearrangements are equally important results of ionising radiation, as they are responsible for the increased risks of cancer and hereditary disease after exposure. variety of pathways participate in the repair of radiation damage, most prominent among them being doublestrand break repair and the excision of oxidised bases. Many of the radiation sensitive DN repair deficiencies manifest themselves as immunodeficiencies, because the development of the antigen gene receptor repertoire requires doublestrand break repair factors and, at least in some vertebrate species, homologous recombination. he close relationship between DN damage, general DN repair, and development of cancer means that current research in molecular radiobiology profits from an open interdisciplinary approach. wo research groups at the institute work within the outlined context focusing on i) the characterisation of cytogenetically detectable chromosome alterations in radiation-induced or radiation-treated SF 211

leninduzierten und therapeutisch bestrahlten Krebszellen, ii) der Entwicklung des Immunoglobulingenrepertoires und iii) spekten von DN-Reparatur im Zusammenhang mit Strahlenresistenz. Diese Forschung erlaubt Einblicke, wie ionisierende Strahlung Krebs induziert und welche Faktoren die Resistenz von Krebs bei Strahlentherapie beeinflussen, wie es gelingt, genetische Vielfalt lokus- und zelltypspezifisch zu erzeugen und auf welche Weise alternative Reaktionswege bei der Reparatur von Strahlenschäden zusammenarbeiten. Klinische nwendungen liegen in der Entwicklung von zytogenetischen Markern für strahleninduzierten Krebs, neuen diagnostischen Markern für die Diagnose und die Behandlung von B-Zelllymphomen und in der Möglichkeit, die Strahlenempfindlichkeit von einzelnen Patienten vorherzusagen. Das Institut für Molekulare Strahlenbiologie ist an folgenden POF-Programmen beteiligt: Zytogenetik (Dr. Horst Zitzelsberger) Umwelt und esundheit DN-Rekombination (Prof. Dr. Jean-Marie Buerstedde) Umwelt und esundheit, Infektion und Immunität. Zum Jahresende waren im IMS 8 Wissenschaftler/innen, 2 technische Mitarbeitern/ innen und 8 Diplomanden/innen und Doktoranden/innen beschäftigt, von denen etwa die Hälfte aus Drittmitteln finanziert wird. cancer cells, ii) the development of the immunoglobulin gene repertoire, and iii) aspects of DN repair relevant to radiation resistance. his research provides an insight into how ionising radiation induces cancer and what factors determine resistance of cancer to radiation therapy, how cells generate genetic diversity in a locus and cell type specific fashion, and how alternative pathways cooperate in the repair of radiation damage. Potential clinical applications include the development of cytogenetic markers for radiation induced-cancer, new diagnostic markers for the diagnosis and treatment of B-cell lymphomas, and the possibility of identifying the level of radiation susceptibility of individuals. he research groups Cytogenetics (Dr. Horst Zitzelsberger) and DN-Recombination (Professor Jean-Marie Buerstedde) participate in the POF-Programme Environmental Health, and the research group DN-Recombination in the POF-Programme Infection and Immunity. t the end of the year there were 8 scientists, 2 technicians, and 8 undergraduate and postgraduate students working at the Institute, approximately half of them supported by grant funds. Untersuchung des Mechanismus der Hypermutation von Immunoglobulingenen H. rakawa, H. Saribasak, N. Saribasak und J.-M. Buerstedde Während B-Zellen der Maus und des Menschen ihr Repertoire von Immunoglobulingenen weitgehend durch die Rekombination von V, D, J-ensegmenten erzeugen, spielt die sogenannte V(D)J-Rekombination bei den meisten Wirbeltieren nur eine untergeordnete Rolle für die Repertoireentwicklung. In diesen rten wird das primäre, antigenunabhängige Repertoire durch enkonversion geschaffen, wobei Pseudo-V-ene als Sequenzspender auftreten. In allen bisher untersuchten rten wird die Produktion von hochaffinen ntikörpern durch nachfolgende Hypermutation von funktionell rearrangierten V(D)J-Segmenten ermöglicht (bb. 1). Immunoglobulingenkonversion und Hypermutation sind abhängig von der Expression des sogenannten ctivation Induced Cytidine Deaminase (ID)- ens. ID deaminiert aller Wahrscheinlichkeit nach Cytosinebasen in den Immunoglobulingenen zu Uracilbasen. Diese Reaktion und die weitere Prozessierung der Uracilbasen lässt sich gut in der Hühner B-Zelllinie D4 212 SF

Huhn Maus Mensch Kuh Schwein Kaninchen ene donversion Hypermutation bb. 1: Erzeugung des Immunoglobulingenrepertoires in verschiedenen Wirbeltierarten. Während B-Zellen im Mensch und in der Maus ihre rearrangierten Immunoglobulingene nur durch Hypermutation diversifizieren, verwenden B-Zellen im Huhn, Kühen, Schweinen und Kaninchen eine Kombination von enkonversion und Hypermutation. studieren. D4 diversifiziert sein Immunoglobulinleichtkettengen normalerweise durch enkonversion, doch wir konnten im letzten Jahr zeigen, dass enkonversion in Hypermutation umgewandelt wird, wenn die benachbarten pseudo-v-ene deletiert werden. Um zu überprüfen, ob die ID induzierten Uracilbasen durch Uracil-DNS- lykosylase (UN) weiter prozessiert werden, wurde das UN-en in D4 durch gezielte Integration eines defekten enkonstrukts inaktiviert. Eine nalyse der Oberflächenexpression von Immunoglobin im wild-type usgangsklon (ID R ) und in der UN-Mutante (IDRUN / ) zeigt eindeutig, dass sich in UN defizienten Klonen sehr rasch Subpopulationen von Immunoglobulin-negativen Zellen entwickeln (bb. 2). Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass die UN-Inaktivierung Immunoglubulinhypermutation auslöst mit der Folge, dass unvorteilhafte Mutationen die Immunoglobulinexpression verhindern. Diese Vermutung wurde durch eine Sequenzanalyse des Die Institute nti- IgM ID / UN / ID R ID R ψv ID R UN / ID R UN R ID-IRES-FP Events in sigm( ) gates 49.% 23.84%.19% 1.5% 7.18% ID / UN / ID R ID R ψv ID R UN / ID R UN R bb. 2: Erhöhter Verlust von Immunoglobulinoberflächenexpression im UN negativen Klon. Der UN mutierte Klon ID R UN / wurde in parallel mit dem wild-type usgangsklon ID R und dem Pseudo-V-en deletierten Klon ID R ψv analysiert. Wiederexpression des UN-enes nach ransfektion einer cdn-expressionskassette stabilisiert die Oberflächenexpression von Immunoglobulin in dem Klon ID R UN R. SF 213

From o 5 51 1 C 2 6 1 415 5 Cell line ID R UN -/- ID R ΨV bb. 3: Spektrum der Leichtkettenmutationen nach Deletion der Pseudo-V-ene oder Inaktivierung des UN-ens. Diese Ergebnisse unterstützen ein Model, in dem ID-Cytosine in rearrangierten Immunoglobulin Locus deaminiert und die resultierenden Uracile durch UN prozessiert werden (bb. 4). From Leichtkettengens aus UN-negativen Zellen bestätigt. Im Vergleich mit dem D4 Klon ID R ψv, in dem Hypermutation durch die Deletion der Leichtkettenpseudo-V-ene aktiviert wurde, zeigt der UN-negative ID R UN / Klon allerdings ein verändertes o 25 75 18 3 C 2 15 3 182 147 1 31 Mutationsspektrum, die den ransversionsmutationen fast vollständig unterdrückt sind (bb. 3). Zytogenetische Marker für eine erhöhte Strahlenresistenz in menschlichen Kopf-/Hals-umoren Die Strahlentherapie zählt neben der chirurgischen Entfernung zu den wirksamsten Behandlungsmethoden von Kopf/Hals- umoren. llerdings wird bei strahlentherapeutischer Behandlung auch die Problematik der Strahlenresistenz einiger umore deutlich, was sich in der Bildung von Lokalrezidiven mit einer ungünstigen Prognose für die betroffenen Patienten manifestiert. Um zytogenetische Marker und enveränderungen zu identifizieren, die mit einer erhöhten Strahlenresistenz der umoren und einem ungünstigen Krankheitsverlauf nach Strahlentherapie einher gehen, haben wir ein ausschließlich aus anämischen Rearrangiertes V(D)J-Segment C Keine Mutationen ID (blockiert durch ID Deletion) Baen Exzision durch UN2 (blockiert durch UN Inaktivierung) U ransition Mutationen ransversion und ransition Mutationen Fehlerfreie Reparatur C Homologe Rekombination (blockiert durch sv en Deletion) or or C enkonversion bb. 4: Model der Entstehung von enkonversion und Hypermutation in Immunoglobulingenen In dieser Situation entstehen entweder enkonversionsereignisse oder, falls enkonversion durch Deletion der Pseudo-V-Donorsequenzen verhindert ist, ransversions- und ransitionsmutationen. Inaktivation des UN-ens blockiert die Prozessierung der Uracile. Dabei wird die enkonversionsaktivität beeinträchtigt und größtenteils in Hypermutation überführt. llerdings entstehen in dieser Situation ausschließlich ransitionsmutationen, was durch die fehlerhafte Paarung der nichtprozessierten Uracile mit denosin während der nächsten DNS-Replikation erklärt werden kann. 214 SF

rezidivfreie Überlebenswahrscheinlichkeit 1,,8,6,4,2 mp. 16q23-24 mp. 18p11.2 1 Ohne mplifikation auf 16q23-24 oder 18p11.2 2 Mit mplifikation auf 16q23-24 oder 18p11.2 2 1, 1 2 3 4 5 6 Die Institute 1 2 3 4 5 6 Monate nach Strahlentherapie bb. 5: Beispiele für high-level -mplifikationen in Hals/Kopf-umoren, die durch CH-nalyse nachgewiesen wurden. Neben dem hybridisierten Chromosomenpaar (links) ist ein Durchschnittsprofil der gemessenen Intensitäten von rotem (Referenz DN) zu grünem (umor DN) Fluoreszenz-Farbstoff zu sehen. Die weiße Linie repräsentiert das gemessene Fluoreszenzprofil, während die rote und die grüne Linie Schwellen für die Klassifizierung von mplifikationen und Deletionen darstellen. High-level -mplifikationen sind als grüne nfärbungen auf den Chromosomen und als grün markierter Profilabschnitt zu erkennen. Patienten bestehendes Kollektiv mit gut dokumentiertem Krankheitsverlauf der Radiologischen Universitätsklinik Freiburg bearbeitet. In Zusammenarbeit mit dem Pathologischen Institut der Universität Freiburg wurden zunächst CH-Untersuchungen (vergleichende genomische Hybridisierung) durchgeführt, bei denen DN- mplifikationen und Deletionen im umorgenom erfasst werden. uf diese Weise wurden in 68 umoren von anämischen Patienten und in 17 umoren aus einem nicht-anämischen Kontrollkollektiv eine Vielzahl von DN-mplifikationen und Deletionen nachgewiesen, die z.. auch als sog. high-level -mplifikationen sichtbar sind (bb. 5). Zusätzliche Kaplan-Meier- nalysen in Verbindung mit weiteren statistischen Untersuchungen (Univariate nalysen, Cox Proportional Hazard Regression) bb. 6: raphische Darstellung des krankheitsfreien Überlebens in bhängigkeit vom Vorliegen einer mplifikation auf 16q23-24 und auf 18p11.2. Die gegenseitige bhängigkeit von 16q- und 18p- berrationen ist im unteren eil der bbildung dargestellt (Kreis: Vorliegen einer berration pro Fall in bhängigkeit von der Überlebenszeitspanne nach Strahlentherapie). ergaben, dass die DN-mplifikationen auf 16q23-24 und 18p signifikant mit einem ungünstigen Krankheitsverlauf im anämischen Kollektiv korrelieren (bb. 6). Darüber hinaus konnte auch gezeigt werden, dass diese prognostisch bedeutsamen zytogenetischen berrationen gemeinsam mit Veränderungen, die als typisch für Kopf/Hals umoren angesehen werden, auftreten (signifikante Co-lterationen zwischen mplifikation auf 16q23-24 und Deletion auf 3p14 und zwischen mplifikation auf 18p und Deletion auf 18q22). Um darüber hinaus veränderte Kandidatengene in den prognostisch bedeutsamen Chromosomenregionen 16q23-24 und 18p nachzuweisen, wurden in Zusammenarbeit mit dem SF-Institut für Strahlenbiologie rray-echniken etabliert, die eine genauere Charakterisierung der veränderten Chromosomenregionen (16q23-24 und 18p11.2) erlauben ( rray CH ). Hierfür wurde umor DN von Fällen mit vorliegender mplifikation auf 16q23-24 auf sog. 1 MB BC (bacterial artificial chromosomes) rrays hybridisiert, auf die DN von BC- Klonen, die im menschlichen enom mit einem bstand von ca. 1 MB lokalisiert sind, SF 215

bb. 7: CH rray-nalyse unter Verwendung eines 1 MB BC-rrays (ca. 36 BC-Klone). Es sind die logarithmischen Quotienten der Fluoreszenz-Intensitäten für jeden BC-Klon angegeben (umor DN: grün, Referenz DN: rot). Der vergrößerte usschnitt im unteren eil der bbildung zeigt die nalyse für Chromosom 16: sechs BC-Klone zeigen eine signifikant erhöhte rünfluoreszenz, die auf eine mplifikation dieses Bereiches im umorgenom hindeutet. punktförmig aufgebracht wurden. Die umor DN wurde mit einer unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Referenz DN auf diese sog. Spots hybridisiert; anschließend wurden die Fluoreszenz-Intensitäten eines jeden BC- Spots gemessen und nach statistischer ufarbeitung, graphisch dargestellt (bb. 7). Im Falle eines Kopf/Hals- umors mit einer 16q23-24-mplifikation konnte die Veränderung durch rray CH bestätigt und mit einer höheren uflösung dargestellt werden. Die veränderten BC- Klone müssen nun durch weiterführende FISH-nalysen auf umorgewebe hybridisiert werden, um die Veränderungen zu verifizieren. nhand der BC-Klone mit aberranten Fluoreszenz-Intensitäten sind ebenfalls ussagen über betroffene Kandidatengene möglich, die nun Hinweise auf die molekularen Mechanismen der herapieresistenz in diesen umoren geben können. Zusammenarbeit National SF-Institut für Strahlenbiologie SF-Institut für Pathologie SF-Institut für oxikologie SF-Institut für Epidemiologie Institut für Radiobiologie der Bundeswehr bteilung Strahlenheilkunde der Radiologischen Universitätsklinik, Freiburg Institut für Pathologie, Universitätsklinik Freiburg Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie und Radiologische Onkologie der U München BfS-Institut für Strahlenhygiene Charité, Institut für Humangenetik, Berlin IMB Jena LMU-Strahlenbiologisches Institut LMU, Klinikum roßhadern Med. Klinik III Universitätsklinikum Regensburg Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried International Bute Medical School, University of St. ndrews, UK Molecular Cytogenetics Laboratory, Veterinary School, University of Cambridge, UK Cancer Cell Unit, Hutchinson/MRC Research Centre, Cambridge, UK South West Wales Cancer Institute, Singleton Hospital, Swansea, UK Department of Cellular and Molecular Pathology, Universita di Napoli Frederico II, Naples, Italy Institute of Endocrinology and Metabolism, cademy of Medical Scienes of Ukraine, Kiev, Ukraine Leiden University Medical Center University of California Los ngeles, US University of oronto, Hospital of Sick Children, Canada MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK Sanger Center, Microarray Facility, Hinxton/Cambridge, UK Sanger Center, Molecular Cytogenetics, Hinxton/Cambridge, UK usgewählte Veröffentlichungen Caldwell, R.B., Kierzek,.M., rakawa, H., Bezzubov, Y., Zaim, J., Fiedler, P., Kutter, S., Blagodatski,., Kostavska, D., Koter, M., Plachy, J., Carninci, P., Hayashizaki, Y. and Buerstedde, J.-M.: Full-length cdns from bursal lymphocytes to facilitate gene function analysis. enome Biology 6: R6 (25) Hirano, S., Yamamoto, K., Ishiai, M., Yamazoe, M., Seki, M., Matsushita, N., Ohzeki, M., Yamashita, Y. M., rakawa, H., Buerstedde, J. M., Enomoto,., akeda, S., hompson, L.H., akata, M.: Functional relationships of FNCC to homologous recombination, translesion synthesis, and BLM. EMBO J. 24: 418-27 (25) Müller, I., einitz, H., Braselmann, H., Baumgartner,., Fasan,., hamm, R., Molls, M., Meineke, V., Zitzelsberger, H.: ime-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 63:1214-122 (25) Braselmann, H., Kulka, U., Baumgartner,., Eder, C., Müller, I., Figel, M., Zitzelsberger, H.: SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis. Mutat Res 578:124-133 (25) 216 SF