Laktoseintoleranz -13910C>T-Realtime LT 2 - Version vom 07.07.2014 1 attomol Laktoseintoleranz -13910C>T- Realtime LT 2 Testkit zur Bestimmung der Transition -13910C>T vor dem humanen Laktase-Gen mit dem LightCycler mit Abgrenzung möglicher Nachbarpolymorphismen In-vitro-Diagnostikum 40 Reaktionen Best.-Nr.: 1188 C 1. Einführung Die Aufnahme von Milch oder anderen laktosehaltigen Lebensmitteln führt bei einigen Erwachsenen zu Unverträglichkeiten. Diese werden oft dem Krankheitsbild der primären (angeborenen), im Erwachsenenalter manifestierten Laktoseintoleranz (LIT) zugeordnet. Zu den häufigsten Symptomen gehören Laktosemaldigestion, Meteorismus (Trommelbauch), Blähungen und Durchfälle (Obermayer-Pietsch, 2004, Journal für Mineralstoffwechsel, 11(3):20-23). Die Laktosetoleranz kann u.a. durch eine aktivierende Mutation im MCM6-Gen (minichromosome maintenance-gen) auf dem Chromosom 2, nahe dem Laktase-Gen (Laktase Phlorizin Hydrolase-Gen, LPH- Gen), ausgelöst werden. Unter aktivierender Mutation versteht man, dass Träger dieser Mutation einen biologischen Vorteil gegenüber Nicht-Mutationsträgern haben. Im Falle der mit diesem Testkit zu bestimmenden Mutation findet an der Position -13910 vor dem Laktase-Gen ein Basenaustausch von C zu T statt, der dazu führt, dass bei Trägern der homozygoten Mutation eine lebenslange Laktoseverträglichkeit besteht. Bei heterozygoten Merkmalsträgern wird vermutet, dass die Inaktivität des einen Allels zumindest teilweise kompensiert werden kann (Obermayer-Pietsch, 2004, Journal für Mineralstoffwechsel, 11(3):20-23; Sibley, 2004, Am J Pharmacogenomics, 4(4):239-245). Beim Vorliegen des Wildtyps kommt es zu einer verminderten Laktaseaktivität, die mit zunehmendem Alter noch weiter abnimmt. Das führt dazu, dass Laktose immer weniger in Glukose und Galaktose abgebaut werden kann. Da ungespaltene Laktose vom Körper nicht resorbiert werden kann, kommt es zu den oben genannten Symptomen (Srinivasan und Minocha, 1998, Postgrad Med, 104(3):109-111, 115-116, 122-123). Der Laktase-Aktivitätsverlust beginnt meist nach der Abstillphase und endet im Erwachsenenalter im Zustand der Laktoseintoleranz. Die Prävalenz variiert weltweit stark zwischen verschiedenen ethnischen Gruppen. Unter Europäern ist die Laktoseintoleranz mit einer Prävalenz von weniger als 30 % relativ gering verbreitet (Sahi, 1994, Scand J Gastroenterol, 202(29):7-20). In Österreich sollen z.b. 20-25 % der Bevölkerung von der primären adulten Laktoseintoleranz betroffen sein (Obermayer-Pietsch, 2004, Journal für Mineralstoffwechsel, 11(3):20-23). In unmittelbarer Nähe zur Mutation an Position -13910 gibt es noch weitere mögliche Mutationen, dazu zählen u.a. die Mutationen -13907C/G, -13913T/C, -13914G/A und -13915T/G. Diese Mutationen können gehäuft bei Personen mit afrikanischer oder arabischer Abstammung auftreten (Tag et al, 2007, Clin Chem, 53(1):146-148; Torniainen et. al, 2009, BMC Genet, 10(31)). Die Bedeutung für die Laktosetoleranz ist je nach Mutation verschieden. 2. Wichtige Hinweise angegebene Lagerungstemperatur des Testkits einhalten Testkit ausschließlich für in-vitro-anwendungen benutzen Testkit stets anhand der beigefügten Bedienungsanleitung abarbeiten Testkit nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden zur Durchführung der Tests ist ein entsprechend eingerichtetes molekularbiologisches Labor sowie in in-vitro-dns-amplifikation geschultes Fachpersonal erforderlich bei der Abarbeitung des Tests sind stets Handschuhe zu tragen Patientenproben sollten als potentiell infektiös behandelt und nach der Verwendung dementsprechend entsorgt werden Reagenzien zur Durchführung der PCR getrennt von Patienten-DNS-Templates und Amplifikationsprodukten lagern 3. Testbestandteile Art.-Nr. Reagenzienbezeichnung Menge Lagertemperatur 2 Tubes mit je 40 µl Primer-/ -20 C bis zur ersten Verwendung, Oligomix LIT -13910C>T LT 2 314 Sondengemisch, angebrochene Tubes dann bei 4 C (roter Deckel) gebrauchsfertig dunkel aufbewahren* * bei 4 C maximal 4 Wochen haltbar, nur dann wieder einfrieren, wenn eine Benutzung innerhalb der nächsten 4 Wochen nicht geplant ist.
Laktoseintoleranz -13910C>T-Realtime LT 2 - Version vom 07.07.2014 2 4. Benötigte Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel, die nicht mitgeliefert werden zu untersuchende Patienten-DNS-Proben (genomische DNS, gelöst in Aqua dest. bzw. TE-Puffer) Kontrolltemplate (LIT -13910C>T heterozygote DNS) Mikropipetten (Volumenbereich 0,5-1000 µl) mit sterilen, gestopften Pipettenspitzen (Filtertips) aus dem Kit LightCycler Faststart-DNA-Master HybProbe von Roche (Katalognr. 12 239 272 001 oder 03 003 248 001): Vial Nr. 1a (rote Kappe) nach Herstelleranleitung mischen mit Vial Nr.1b (farblose Kappe), der daraus entstehende 10fach konzentrierte Fertigmix (enthält Taq-Polymerase, Nukleotide, MgCl 2 ) wird im Folgenden Roche-Mix genannt PCR-Wasser LightCycler -Kapillaren (20 µl, für den LightCycler 1 oder 2; Katalognr. 04 929 292 001) oder passende PCR-Gefäße für den LightCycler 480 LightCycler 1.x, 2.0 oder 480 mit zugehöriger Steuer- und Auswertesoftware Zentrifuge für Kapillaren bzw. PCR-Gefäße 5. Testprinzip Im vorliegenden Realtime-Test werden nach Isolierung der DNS aus Patientenblut die zu genotypisierenden Allele einer Probe in einem Reaktionsansatz vervielfältigt. Der Nachweis der Amplifikationsprodukte erfolgt durch Hybridisierung einer spezifischen, die Mutation überdeckenden LoopTag 1) -Sonde. Die LoopTag-Sonde hybridisiert am verlängerten Primer, wodurch die Entstehung einer Sonden-Primer-Schleife und FRET vom Fluoreszenz-Donor-Farbstoff (D) zum Fluoreszenz-Akzeptor-Farbstoff (A) ermöglicht wird (Abb. 1). Die Dehybridisierung der Nachweissonde erfolgt während der Schmelzkurvenanalyse je nach vorliegender Templatesequenz beim Wildtyp- und mutierten Allel bei unterschiedlichen Temperaturen. Liegt in einer Patientenprobe auf beiden Allelen für -13910 der Wildtyp vor (homozygot Wildtyp), entsteht eine eingipflige Schmelzkurve (Maximum bei 53,0 ± 2 C). Bei Vorliegen einer heterozygoten Konstellation (je ein Wildtyp- und ein mutiertes Allel) wird eine Schmelzkurve mit 2 Peaks sichtbar (53,0 und 57,0 ± 2 C). Ist die Patientenprobe homozygot mutiert, entsteht nur der Peak bei 57,0 C. Liegt an einer der Positionen -13907, -13913, -13914 oder -13915 eine Mutation vor, entsteht ein Peak bei 46,5 ± 2 C. Diese weiteren Mutationen können mit dem vorliegenden Test von der Mutation an der Position -13910 abgegrenzt, aber nicht untereinander differenziert werden (siehe Erläuterungen zu Abb. 2). Für eine Differenzierung zwischen den zusätzlichen Mutationen muss ein zweites Testverfahren (z.b. Sequenzierung) hinzugezogen werden. Eine klinische Diagnose sollte nicht allein mit Hilfe der Ergebnisse einer einzelnen diagnostischen Methode erhoben werden. Zur Diagnoseerstellung sollten vom Arzt alle möglichen klinischen und Laborbefunde berücksichtigt werden. 3 5 A Primerelongation FRET A D Abb. 1: LoopTag-Testprinzip 3 Sondenhybridisierung 1) LoopTag ist eine von der Firma Attomol patentrechtlich geschützte Technologie (Patent-Nr. PCT/EP2008/057512).
Laktoseintoleranz -13910C>T-Realtime LT 2 - Version vom 07.07.2014 3 6. Arbeitsanleitung Es wird empfohlen, in jeder Probenserie folgende Kontrollen mitzuführen: 1. Negativkontrolle (PCR-Leerwert) 2. Positivkontrolle (für -13910 heterozygotes Kontrolltemplate) Das Kontrolltemplate kann separat vom Hersteller dieses Testkits bezogen werden (Art.-Nr. 160). Bereits beim Anwender als heterozygot bestimmte Patientenproben können auch als Positivkontrolle verwendet werden. Arbeitsschritte: DNS-Präparation erfolgt aus Patientenblut nach Standardverfahren. Die dabei erhaltenen DNS- Proben (ca. 20 ng/µl) können unverdünnt eingesetzt werden. Hinweis: Bei auftretenden Problemen (schlechte Amplifikation, keine auswertbaren Schmelzkurven) ist zunächst eine Wiederholung des Tests mit verdünnter Proben-DNS (z.b. 1:10) durchzuführen. Oligomix auftauen, kurz schütteln und zentrifugieren, um gebildetes Kondenswasser zum Oligomix zurückzuführen. Lagerungshinweis: Nach Entnahme der benötigten Menge Oligomix das angebrochene Tube im Kühlschrank (dunkel) lagern, nur dann wieder einfrieren, wenn eine Benutzung innerhalb der nächsten Tage nicht geplant ist. Vor jeder Benutzung kurz zentrifugieren und mischen! Generell gilt: Den Oligomix so wenig wie möglich auftauen und wieder einfrieren. Herstellung des PCR-Mixes (es werden jeweils 8 µl PCR-Mix und 2 µl Proben-DNS für einen Ansatz benötigt) Zur Herstellung des PCR-Mixes werden je nach Probenzahl PCR-Wasser, Roche-Mix und Oligomix entsprechend der folgenden Tabelle in ein Eppendorfgefäß pipettiert und anschließend gut gemischt. Probenanzahl PCR-Wasser Roche-Mix Oligomix Probenanzahl PCR-Wasser Roche-Mix Oligomix 1 5,7 1,1 2,0 11 62,7 12,1 22,0 2 11,4 2,2 4,0 12 68,4 13,2 24,0 3 17,1 3,3 6,0 13 74,1 14,3 26,0 4 22,8 4,4 8,0 14 79,8 15,4 28,0 5 28,5 5,5 10,0 15 85,5 16,5 30,0 6 34,2 6,6 12,0 16 91,2 17,6 32,0 7 39,9 7,7 14,0 17 96,9 18,7 34,0 8 45,6 8,8 16,0 18 102,6 19,8 36,0 9 51,3 9,9 18,0 19 108,3 20,9 38,0 10 57,0 11,0 20,0 20 114,0 22,0 40,0 Pipettieren der Reaktionsansätze in LightCycler -Kapillaren bzw. -reaktionsgefäße Negativkontrolle: Positivkontrolle: Patientenbestimmung: 8 µl PCR-Mix 8 µl PCR-Mix 8 µl PCR-Mix + 2 µl PCR-Wasser + 2 µl Kontrolltemplate + 2 µl DNS Kapillaren/Reaktionsgefäße verschließen und zentrifugieren PCR-Inkubation der Ansätze im LightCycler mit den im Anhang 1 aufgeführten Programmen Genotypisierung der Patientenproben durch Auswertung der Anzahl und Lage der Peakmaxima wie in Abbildung 2 beschrieben
Laktoseintoleranz -13910C>T-Realtime LT 2 - Version vom 07.07.2014 4 Abb. 2: Beispiel für die Auswertung der Schmelzkurven - einer homozygoten Wildtypprobe (-13910C/C = laktoseintolerant, blaue Kurve) - einer heterozygoten Probe (-13910C/T, grüne Kurve) - einer homozygot mutierten Probe (-13910T/T = laktosetolerant, rote Kurve) - einer Probe mit einer heterozygoten Konstellation für die Position -13915T/G und homozygot Wildtyp für -13910C/C (ockerfarbige Kurve) - einer Probe mit einer heterozygoten Konstellation für die Position -13914G/A und heterozygoten Konstellation für -13910C/T (braune Kurve) - Negativkontrolle (schwarze Kurve) Auswertehilfe zu Abbildung 2 für die Bewertung der erhaltenen Schmelzkurven Allel 1 Allel 2 Schmelzkurvenpeak(s) bei -13910 andere Mut.* -13910 andere Mut.* (Toleranz jeweils ± 2 C) Kurvenfarbe WT (C) WT WT (C) WT 53 C blau MU (T) WT WT (C) WT 53 C 57 C grün MU (T) WT MU (T) WT 57 C rot WT (C) MU WT (C) WT 46,5 C 53 C ocker WT (C) MU MU (T) WT 46,5 C 57 C braun WT (C) MU WT (C) MU 46,5 C nicht dargestellt * andere Mut.: damit ist eine der Mutationen an Position -13907, -13913, -13914 oder -13915 gemeint Je nach verwendetem Gerätetyp und Laufbedingungen während der Schmelzkurvenanalyse kann es vereinzelt vorkommen, dass die Schmelztemperaturen der Peaks außerhalb des angegebenen Toleranzbereiches liegen. Zur zweifelsfreien Bestimmung der Proben empfiehlt sich deshalb, eine für -13910 heterozygote Referenzprobe in jeder Probenserie mitzuführen. Bei eventuell auftretenden Problemen während der Testdurchführung oder -auswertung wenden Sie sich bitte an den Hersteller.
Laktoseintoleranz -13910C>T-Realtime LT 2 - Version vom 07.07.2014 5 Anhang 1 Die für die Anregung und die Detektion erforderlichen Wellenlängen sind folgender Tabelle zu entnehmen: LC 1.x LC 2.0 LC 480 Anregung automatisch automatisch 483 oder 498 nm Detektion 640/510 nm 640/530 nm 640 nm Für die Durchführung der PCR und die anschließende Auswertung sind die nachfolgend angegebenen LightCycler -Programme zu verwenden. Programm für LC 1.x und 2.0 Programm für LC 480 Program: Aktivierung; Type: None; Cycles: 1 Program: Aktivierung; Analysis : None; Cycles: 1 Temperature Hold Time Slope Target Hold Ramp Rate Target ( C) (sec) ( C/sec) ( C) (s) ( C/s) 95 420 20 none 95 none 420 4.4 Program: Amplifikation; Type: Quantification; Cycles: 40 Program: Amplifikation; Analysis : Quantification; Cycles: 40 Temperature Target ( C) Hold Time (sec) Slope ( C/sec) Target ( C) Hold (s) Ramp Rate ( C/s) 95 3 20 none 95 none 3 4.4 55 20 20 single 55 single 20 2.2 72 15 20 none 72 none 15 4.4 Program: Schmelzkurve; Type: Melt. Curves; Cycles: 1 Program: Schmelzkurve; Analysis : Melt. Curves; Cycles: 1 Temperature Target ( C) Hold Time (sec) Slope ( C/sec) Target ( C) Hold (s) Ramp Rate ( C/s) 95 5 20 none 95 none 5 4.4 50 10 20 none 50 none 10 2.2 40 20 20 none 40 none 20 2.2 80 0 0.4 step 80 continuous 0 0.19 2 Program: Kühlen; Type: None; Cycles: 1 Program: Kühlen; Analysis : None; Cycles: 1 Temperature Hold Time Slope Target Hold Ramp Rate Target ( C) (sec) ( C/sec) ( C) (s) ( C/s) 40 20 20 none 40 none 20 2.2 Anhang 2 Übersicht über die verwendeten Etikettensymbole Erklärung der Symbole h Hersteller l Chargennummer v verwendbar bis explanation of symbols manufacturer batch number expiry date 2 t 6 Lagerung zwischen +2 C und +6 C store between +2 C and +6 C o -20 Lagerung bei maximal -20 C store at a maximum of -20 C b Bestellnummer i In-vitro-Diagnostikum pn g Inhalt ausreichend für <n> Bestimmungen Gebrauchsanweisung beachten catalogue number in vitro diagnostic medical devices content sufficient for <n> determinations consult instructions for use