Real time RT-PCR Verfahren zur Detektion, Quantifizierung und Genotypisierung von Hepatitis-C-Virus Seminar Molekulare Diagnostik 2011 30. November 2011, Wien
AnDiaTec Kernkompetenz Entwicklung und Produktion von breit-reaktiven, sensitiven und gleichzeitig robusten Nachweisverfahren für schwierig zu detektierende RNA-Viren
Punktmutationen Genomdiversität von RNA-Viren generiert während Replikation des RNA-Genoms RNA-Polymerasen ohne Proofreading-Aktivität Unterscheidung im Genom der Nachkommenviren im Vergleich zum Elternvirus nach 1 Replikationszyklus um 1-30 Nukleotide Unterschiede zw. verschiedenen RNA-Virusfamilien je nach Replikationssystem und Genomstrukturierung Genetische Rekombination/ Gen. Re-Assortment Bei Infektion einer Wirtszelle durch zwei nahe verwandte Viren Auch Rekombination zwischen viraler und zellulärer Nukleinsäure Hervorragende Adaptation an den Wirt Breite Detektion dieser Viren sehr schwierig
Genomdiversität von RNA-Viren Porcines Reproduktives und Respiratorisches Syndrom Virus (PRRSV) Evolutionsrate: 7.3 x 10-2 Austausche pro Nukleotid und Jahr Humanes Enterovirus 71 (EV71) Evolutionsrate: 4.5 x 10-3 Austausche pro Nukleotid und Jahr Humanes Immundefizienz-Virus I (HIV I) Evolutionsrate: 4.0 x 10-3 Austausche pro Nukleotid und Jahr Caliciviren (u.a. best. Noroviren) Evolutionsrate: ~ 3.1 x 10-3 Austausche pro Nukleotid und Jahr Flaviviren (z.b. Classical Swine Fever Virus (CSFV)) Evolutionsrate: 2.0 x 10-3 Austausche pro Nukleotid und Jahr Hepatitis C Virus (HCV) Evolutionsrate: 1.1 x 10-3 Austausche pro Nukleotid und Jahr
Hepatitis-C-Virus Sequenzanalyse
Lösungsansätze AnDiaTec Primer ACGTAAGGCGATTGACTTAGCCGATGGCTAGCTAAGCCTAGCAT Primer mit Spacer Affinität des Spacers zum DNA-backbone Hohe Sensitivität des Primers Keine unspezifische Bindung
Lösungsansätze AnDiaTec Primer ACGTAAGGCGATTGACTTAGCCGATGGCTAGCTAAGCCTAGCAT Sehr kurzer Primer (11 16 Nukleotide) Erhöhung der Bindungsaffinität des Primers durch Modifikationen am 5 - und 3 -Ende Keine unspezifische Bindung Gute Sensitivität
Lösungsansätze AnDiaTec Primer 1 Probe Primer 2 ACGTAAGGCGATTGACTT GCCGATGGCTAGCTAAGCCTAGCAT ACGTAAGGCGATTGACTT GCCGATGGCTAGCT AGCCTAGCAT Multiplex-System zur Detektion der unterschiedlichen Stämme Gezielte Auswahl von Primern, die parallel an das Template binden können keine Interferenz zwischen Primern/ Sonden Screening-Methode zur Identifizierung geeigneter Primer/ Sonden Hohe Sensitivität Breite Reaktivität und langzeitig stabileres Verfahrens
Zielsetzung HCV-Diagnostik Breit reaktives Screening-Verfahren Quantifizierender Nachweis von HCV Genotypisierendes Assay
Relevanz Screening-Verfahren/ Quantifizierung Breit reaktives Verfahren für eine sichere Detektion aller Feldstämme Quantifizierung für Kontrolle des Therapie-Verlaufs Problematik Perfekte Abstimmung von Primern und Sonden Mögliche Beeinträchtigung der PCR-Effizienz (charakterisiert über die lineare Regressionslinie) Abbruch der Linearität nach einem bestimmten Zyklus der PCR Linearität nur in engem Amplifikationsbereich Quantifizierung wäre dadurch nur bedingt möglich
Screening-Verfahren/ Quantifizierung Ergebnisse Wettbewerber Kit 40 38 R 2 = 0.9997 36 POS NEG 34 R 2 = 0.999 AnDiaTec Kit POS 461 3* NEG 0 178 A ve rage C t V alu e 32 30 28 26 24 22 Stratagene Av Ct 7500 Fast Dx Av Ct 20 0 1 2 3 4 5 6 Dilution * 3 Proben als richtig-positiv identifiziert
Relevanz Genotypisierung V.a. Unterscheidung zwischen Genotyp 1 (a/b) vs. Genotypen 2-6 Information relevant zur Therapie-Entscheidung (Dosierung PEG- IFNα + Ribavirin Therapie-Dauer) und Aussicht auf Erfolg Problematik Keine eindeutigen Genotyp-spezifischen Basenaustausche Keine eindeutigen Genotyp-spezifischen Basenaustausche Auch hier muss mit mehr als einem Primer-/Sondenpaar gearbeitet werden Mögliche Kreuz-Reaktivitäten und dadurch falsche Differenzierungsergebnisse Falsche Therapie-Entscheidung Probleme mit Ringversuchszertifikaten und Akkreditierung des Labors für HCV-Diagnostik
AnDiaTec Testformate Screening-Verfahren CE-Markierung erteilt Quantifizierende Kitversion CE-Markierung kurz vor Abschluss Differenzierendes Assay - Evaluierungsphase
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