Voet Biochemistry 3e 1. Überblick 2. Stoffwechselquellen für Acetyl-Coenzym A 3. Enzyme des Citronensäure- Cyclus 4. Regulation des Citronensäure-Cyclus 5. Amphibole Natur des Citronensäure-Cyclus
1. Überblick Der Citronensäure-Cyclus kommt in Eukaryonten und Prokaryonten vor. Wird auch Tricarbonsäure-Cyclus (TCA-Cyclus) oder Krebs-Cyclus genannt. Die Acetylgruppe eines Acetyl-CoA-Moleküls wird zu 2 Molekülen CO2 oxidiert und die Energie wird gespeichert um später ATP zu Erzeugen. Voet Biochemistry 3e
Reaktionen 8 Enzyme -> es entstehen: 2 CO2 3 NADH -> in oxidative Phosph. 1 FADH2-> 1 GTP Tertiärer Alkohol -> schwer oxidierbar Oxalacetat wird regeneriert -> unendliche Zahl von Acetylgruppen Kann mit einem Oxalacetat Oxidiert werden. Voet Biochemistry 3e Page 766 Sekundärer Alkohol -> leichter oxidierb.
2. Stoffwechselquellen für Acetyl-Coenzym A Thioester Kohlenhydrat- Fettsäuren- Aminosäurenabbau Energiereiche Bindung Amidbindung Vitamin Voet Biochemistry 3e Page 768 Chemische Struktur von Acetyl-Coenzym A
A. Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex Pyruvat Vorstufe von Acetyl-CoA. Multienzymkomplex Pyruvate decarboxylase multienzym Complex (PDC) katalysiert. Multienzymkomplex= nicht kovalent assoziierte Enzyme die 2 or mehr sequentielle Reaktionen katalysieren. Komplex in E. coli beschrieben. PDC Enzyme: Pyruvate dehydrogenase (E1) Dihydrolipoyl transacetylase (E2) Dihydrolipoyl dehydrogenase (E3) Voet Biochemistry 3e Page 769 intact complex core complex
Structural organization of the E. coli PDC. E2 core 24 subunits E1 E3 Combined 60 subunit complex Voet Biochemistry 3e Page 769
Comparison of the X-ray structures of the dihydrolipoyl transacetylase (E 2 ) cores of PDCs Voet Biochemistry 3e Page 769 The cubic Azobacter vinelandii E 2 core. Gram-negative Bakterien The dodecahedral B. stearothermophilus E 2 core. Gram-positive Bakterien und Eukaryontische Mitochondrien (20 E2 trimere, 30 E1 tetramere, 12 E3 dimere Mitochondrien von Gram-Positiven? Mit. Haben aber doppelmembran Wie gram-negative.-> Sequenzvergleiche Ricketsia prowazekii (typhus) -> gram neg. aber dodecahedral
Multienzymkomlexe sind katalytisch effizient 1. Enzymatische Reaktionsraten sind limitiert durch die Frequenz mit der das Substrat mit dem Enzym kollidiert. In einem Multienzymkomplex wird die Diffusion zwischen den aktiven Zentren minimiert -> Ratenverbesserung 2. Kanalisierung metabolischer Zwischenprodukte wird möglich -> Verringerung von Nebenreaktionen. Voet Biochemistry 3e 3. Reaktionen können koordiniert kontrolliert werden.
Acetyl-CoA Bildung geschieht in 5 Schritten Pyruvate + CoA + NAD+ -> acetyl-coa + CO2 + NADH Voet Biochemistry 3e Page 770 The five reactions of the PDC.
The Coenzymes and Prosthetic Groups of Pyruvate Dehydrogenase. Reaktion 1 Reaktion 2 Voet Biochemistry 3e Page 771
Reaktion 3 Reaktion 5 Reaktion 4 wrong goes to reaction 2 Voet Biochemistry 3e
Struktur von Lipoamid Voet Biochemistry 3e Page 771
Der Lipolysyl-Arm befördert die Zwischenprodukte von einer Untereinheit des Enzyms zur nächsten Wie werden Zwischenprodukte von einem Enzym zum nächsten weitergegeben? Liposylyl-Arm wie eine Liane -> schwingt von E1 nach E3 E2 Lianen schwingen auch gegeneinander -> gegenseitige Acetylierung Voet Biochemistry 3e -> Jede E1 UE kann nehrere E2 UE acetylieren und jede E3 UE kann mehrere E2 reoxidieren.
Die Struktur von E2 der PDC Voet Biochemistry 3e Page 773 Domain structure of the dihydrolipoyl transacetylase (E 2 ) subunit of the PDC.
Coenzym A lipoamid Voet Biochemistry 3e Page 773 X-Ray structure of a trimer of A. vinelandii dihydrolipoyl transacetylase (E 2 ) catalytic domains.
Lys Seitenkette zu welcher die Lipoylgruppe gebunden wird ist in einem type 1 β turn. Voet Biochemistry 3e Page 773 The NMR structure of the A. vinelandii dihydrolipoyl transacetylase (E 2 ) lipoyl domain.
Bindungstellen für E1 und E3 Voet Biochemistry 3e Page 773 The NMR structure of the peripheral subunit-binding domain from B. stearothermophilus E 2.
E1 E2 E2 catalytic domain - E1 binding d. Voet Biochemistry 3e Page 774 Electron microscopy based images of the bovine kidney pyruvate dehydrogenase complex at ~35 Å resolution. E3
Arsenverbindungen sind giftig weil sie Lipoamid maskieren Arsenverbindungen sind toxisch da sie kovalente Verbindungen mit Sulfhydrylgruppen eingehen können. -> Inaktivierung lipoamidhaltiger Enzyme Pyruvat-Dehydrogenase α-ketoglutarat-dehydrogenase -> Unterbrechung der Atmung Voet Biochemistry 3e Organische Arsenvergiftungen toxischer für Mikroorganismen als für den Menschen -> zu Beginn des 20. Jahrhunderts Syphilis-Behandlung und Trypanosomen- Behandlung -> = erste Antibiotika, aber schwere Nebenwirkungen. Anektote Napoleon: Arsen in Haar -> Vergiftet? - grüne Tapeten mit Pigment Kupfer- Arsenat (CuHAsO4).-> in feuchtheissem Klima -> Pilze konvertieren dies zu Trimethyl Arsin ((CH3)3As) welches flüchtig und sehr giftig ist.
Die Struktur von E1 Neben PDC noch andere sehr ähnliche Multienzymkomplexe: α-ketoglutarat dehydrogenase Komplex (Reaktion 4 im Citrat Zyklus) Verzweigte Ketten α-ketosäure dehydrogenase Komplex (degradation von Ile, Leu und Val) Alle in Familie von 2-Ketosäure Dehydrogenase mit gleichem E3 enzym und spezifischen E1 und E2 Struktur jedoch bei allen ähnlich. α-untereinheiten β-untereineheiten TPP cofaktoren an Bindungsstelle von Untereinheiten. Voet Biochemistry 3e Page 776 X-Ray structure of E 1 from P. putida branched-chain α-keto acid dehydrogenase. (a) The α 2 β 2 heterotetrameric protein.
Voet Biochemistry 3e Page 776 X-Ray structure of E 1 from P. putida branched-chain α-keto acid dehydrogenase. (b) A surface diagram of the active site region.
B. Mechanismus der Dihydrolipoyl Dehydrogenaase (E3) 2 electron acceptor sites: Fad and disulfid bond Voet Biochemistry 3e
Röntgenstruktur von Dihydrolipoamid Dehydrogenase 2 Subunits Interface Domäne Zentral Domäne NAD+ FAD Voet Biochemistry 3e Page 777 NAD+ Bindungsdomäne FAD Bindungsdomäne X-Ray structure of dihydrolipoamide dehydrogenase (E 3 ) from P. putida in complex with FAD and NAD +. (a) The homodimeric enzyme.
Voet Biochemistry 3e Page 777 X-Ray structure of dihydrolipoamide dehydrogenase (E 3 ) from P. putida in complex with FAD and NAD +. (b) The enzyme s active site region.
Katalytischer Reaktionszyklus der Dihydrolipoyl Dehydrogenase 2 substrates Charge Transfer complex Voet Biochemistry 3e Page 778
Charge Transfer Complex S FAD NAD+ Voet Biochemistry 3e Page 780 The complex of the flavin ring, the nicotinamide ring, and the side chain of Cys 63 observed in the X-ray structure of human erythrocyte glutathione reductase (very similar to Dihydrolipoyl dehydrogenase). The reaction transferring an electron pair from dihydrolipoyl dehydrogenase s redox-active disulfide in its reduced form to the enzyme s bound flavin ring.
C. Kontrolle der Pyruvat-Dehydrogenase A) Kontrolle durch Produktinhibition PDC reguliert den Eintritt von aus Kohlenhydraten stammenden Acetyleinheiten In Citronesäure Cyclus. E1 irreversibler Schritt -> genaue Regulation da sonst keine anderen Wege zur Synthese von Acetyl-CoA in Säugern. Voet Biochemistry 3e Page 781 Produkt Inhibition: NADH und Acetyl-CoA treiben die reversiblen Reaktionen E2 und E3.
B) Kontrolle durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung Phospohatase und Kinase Voet Biochemistry 3e Page 781 Phospohorylierung eines Ser Restes in E1
3. Enzyme des Citronensäure-Cyclus A. Citrat-Synthase Kondensation von Acetyl-CoA mit Oxalacetat. -> Induced Fit Enzym, sequenzieller Mechanism. Oxalacetat bindet zuerst -> Konformationsänderung -> Aectyl-CoA bindet. Oxalacetat Bindungsstelle Voet Biochemistry 3e Page 782 Conformational changes in citrate synthase. (a) Space-filling drawing showing citrate synthase in the open conformation. Conformational changes in citrate synthase. (b) Space-filling drawing showing citrate synthase in the closed, substrate-binding conformation.
Mechanismus und Stereochemie der Citrat-Synthase Reaktion Aldol-Claisen-Esterkondensation in 3 Schritten Voet Biochemistry 3e Page 783
B. Aconitase Aconitase katalysiert die reversible Isomerisierung von Citrat und Isocitrat mit cis-aconitat als Zwischenprodukt. Voet Biochemistry 3e Page 784
Fluorocitrat hemmt Aconitase Fluoroacetat sehr giftig (LD50 bei Ratten= 0.2 mg/kg Körpergewicht) Kommt in Blättern bestimmter Pflanzen Aus Afrika, Australien und Südamerika vor. Selbst keine toxische Wirkkung wird aber In den Zellen umgewandelt zu Fluorocitrat. Dies hemmt Aconitase spezifisch und Inhibiert den Citrat transport durch die Mitochondrienmembran. Voet Biochemistry 3e
C. NAD+ -abhängige Isocitrat-Dehydrogenase Isocitrat-Dehydrogenase katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Isocitrat zu α-ketoglutarat, Wobei erstmalig im Citronensäure-Cyclus CO2 und NADH gebildet wird. In Säugern 2 verschiedene Formen: 1) Citronensäure-Cyclus Enzym in Mitocheondrien, NAD+ als Coenzym. 2) in Mitochondrien und Cytosol, NADP+ als Coenzym. Voet Biochemistry 3e Page 785 = sek. Alkohol = Keton Konnte noch nicht bewiesen werden
D. α-ketoglutarat-dehydrogenase α-ketoglutarat-dehydrogenase katalysiert die oxidative Decarboxylierung einer α-ketocarbonsäure, wodurch das zweite CO2 und das zweite NADH des Citronen- Säure-Cyclus grei werden. Reaktion ähnlich der von Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex. 3 Untereinheiten: α-ketoglutarat-dehydrogenase (E1) Dihydrolipoyl-Transsuccinylase (E2) Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (E3) Voet Biochemistry 3e E3 ist identisch mit E3 von PDC.
E. Succinyl-CoA-Synthase Hydrolysiert die energiereiche Verbindung Succinyl-CoA unter Kopplung an die Synthese eines Energiereichen Nucleosidtriphospphates. In Säugern -> GTP, in Pflanzen ATP. Beachte: Enzymnahmen können auch die Rückreaktionen benennen (wie hier). Durch Succinyl-CoA-Synthase katalysierte Reaktionen: Voet Biochemistry 3e Page 787 Bildung eines succinyl phosphates, ein high-energy mixed anhydride.
Formation of phosphoryl His, a high-energy intermediate. Voet Biochemistry 3e Page 787
Voet Biochemistry 3e Page 787 Transfer of the phosphoryl group to GDP, forming GTP. GTP Bildung äquivalent zu ATP Bildung da ineinander umwandelbar. GTP + ADP GDP + ATP freie Enthalpie = 0
F. Succinat-Dehydrogenase Dehydrierung von Succinat zu Fumarat Enzym gehemmt durch Malonat (ein C atom weniger als Succinat). Voet Biochemistry 3e
FAD ist kovalent an die Succinat-Dehydrogenase gebunden Normalerweise FAD nicht kovalent in Enzymen Gebunden Aber in Succinat dehydrogenase schon -> Problem:Wie wird FADH2 reoxidiert damit Enzym wieder funktionieren kann? Das Enzym wird über die Elektronentransportkette reoxidiert. Einziges and innere Mitochondrienmembran gebundenes Enzym des Citronensäure-Cyclus -> Auch als Complex II der Oxidationskette bekannt. Reoxidiert durch Coenzym Q Voet Biochemistry 3e Page 787
G. Fumarase Es ist nicht klar ob der Mechanismus über ein Carbanion oder einen Carbokation Übergangs- Zustand geht. Voet Biochemistry 3e Page 788
H. Malat-Dehydrogenase Regeneration von Oxalacetat Voet Biochemistry 3e
4. Regulation des Citronensäure-Cyclus Diese Enzyme arbeiten weit weg vom Gleichgewichtszustand unter natürlichen Bedingungen -> Diese Enzyme bestimmen Geschw. des Citratzyklus -> Voet Biochemistry 3e Kontrollpunkte
Regulation durch: 1) Verfügbarkeit der Substrate 2) Produkthemmung 3) Hemmung durch Zwischenprodukte Da Sauerstoffverbrauch, NADH Reoxidation und ATP-Produktion eng miteinander gekopplet sind, muss der Citronensäure-Cyclus über Rückkopplungsmechanismen, die seine NADH-Produktion auf den Energiver- Brauch abstimmen, reguliert werden. Wichtigste Regulatoren: -) Acetyl-CoA, Oxalacetat, NADH +) ADP, Ca2+ Voet Biochemistry 3e Page 791 Keine komplizierte Regulation über Hormone (vrgl. Glykogenabbau), da Keine Speicherstoffe gebildet werden. Produkte kurzfristig direkt an Atmung gekoppelt.
5. Amphibole Natur des Citronensäure-Cyclus 1. Glucose-Biosynthese 2. Lipid-Biosynthese 3. Aminosäure-Biosynthese 4. Porphyrin-Biosynthese Voet Biochemistry 3e Page 793 5. Oxidation von Aminosäuren