J.H.Peters H.Baumgarten M.Schulze Monoklonale Antikörper Herstellung und Charakterisierung Unter Mitwirkung von F. Bieber W Gerlich E.Hempelmann Th.Werfel Mit 32 Abbildungen FACHBEREICH BIOLOGIE (10) der Technischen Hochschule-Darmstod» - Brbliothek - D-6100 Darmstadt / B. R. D. Inv.-Nr.j5-A Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York Tokyo
Inhaltsverzeichnis 1 GRUNDLAGEN* 1.1 Grundlagen der Zellhybridisierung von Hybridomen und Selektion für die Herstellung monoklonaler Antikörper - J.H. Peters 3 2. IMMUNISIERUNG 2.1 Prinzipien und Strategien der Immunisierung M. Schulze 15 2.2 Immunisierung von Mäusen zur Herstellung monoklonaler Antikörper J.H. Peters, M. Schulze 21 2.3 Blutentnahme und Serumgewinnung bei der Maus H. Baumgarten, M. Schulze 25 3 ZELLFUSION 3.1 Präparation von Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten J.H. Peters 29 3.2 Zellfusion zur Herstellung.von monoklonalen Antikörpern der Maus J.H. Peters 32 3.3 Gefrierkonservierung von Zellen unmittelbar nach der Fusion J.H. Peters 42 3.4 Gefrierkonservierung von Hybridomen in Zellkulturplatten M. Schulze 44
X 4 KLONAUSBEUTE UND. NOMENKLATUR 4.1 Berechnung der zu erwartenden Zahl von Hybridomklonen J.H. Peters 51 4.2 Arbeitsbezeichnung und Benennung von monoklonalen Antikörpern H. Baumgarten... 54 5 OPTIMIERUNG DER KULTURBEDINGUNGEN 5.1 Zellkulturbedingungen für die Aufzucht von Hybridomen J.H. Peters 59 5.2 Fehlersuche bei der Herstellung und Aufzucht von Hybridomen J.H. Peters, 67 5.3 Konditioniertes Medium aus humanen Nabelschnur- Endothelzellen J.H. Peters 72 6 KONTROLLE VON ZELLKULTUREN <6.1 Fluoreszenztest zur Vitalitätsbestimmung von Zellen J.H. Peters 77 6.2 Vitalitäts- und Aktivitäts-Bestimmung von Zellen (MTT-Test) J.H. Peters, H-. Baumgarten 81 6.3 Bestimmung, von zellulärem Protein H. Baumgarten R4 7 ERKENNUNG UND BEHANDLUNG VON INFEKTIONEN 7.1 Bakterien- und Pilzinfektionen^" " J.H. Peters 89 7.2 Eingrenzen einer Infektion in einer Kulturschale mit mehreren Näpfen J.H. Peters 92 7.3 Fluoreszenztest zum Nachweis von Mykoplasmen-Infektionen adhärenter und suspendierter Zellen J.H. Peters 9 4 7.4 Reinigung Mykoplasmen-infizierter Zellen durch Kokulturen mit Makrophagen J.H. Peters 102
XI 8 NACHWEISE VON ANTIGENSPEZIFISCHEN ANTIKÖRPERN 8.1 Wahl des Testsystems zur Identifikation antigenspezifischer Klone M. Schulze 109 8.2" Immunoassays zum Nachweis von monoklonalen Antikörpern gegen lösliche Proteine M. Schulze -. 114 8.2.1 Direkter und indirekter ELISA zum Nachweis von monoklonalen Antikörpern gegen lösliche Antigene H. Baumgarten, M. Schulze 122 8.2.2 ELISA zum Nachweis von Maus-Immunglqbulin G (Biotin-Streptavidin System) H. Baumgarten 129 8.2.3 Bestimmung der Immunglobulin-Subklasse von monoklonalen Antikörpern M. Schulze " 134 8.3 Wahl des Testsystems zum Nachweis von monoklonalen Antikörpern gegen zelluläre Antigene H. Baumgarten 136 8.3.1 Immunfluoreszenznachweis von Membranantigenen vitaler Leukozyten (Biotin-Streptavidin System) H. Baumgarten 146 8.3.2 Immunfluoreszenz-Nachweis von membrangebundenen und intrazytoplasmatischen Immunglobulinen H. Baumgarten 150 8.3.3 Immunzytochemischer Nachweis von zellulären Antigenen mit,der Peroxidase-Anti-Peroxidase (PAP) Methode H. Baumgarten..: 154 8.3.4 Tüpfel-Test zum Nachweis von Änti-Zellmembran Antikörpern H. Baumgarten..'^rr; 1 60 9 MASSENPRODUKTION VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN 9.1 Kriterien für die Massenproduktion von monoklonalen Antikörpern in Zellkultur oder Aszites M. Schulze 167 9.2 Massenzellku-ltur" zur Produktion von monoklonalen Antikörpern H. Baumgarten 1 70
XII 9.3 Zubereitung von serumfreiem Iscove-Medium für Hybridomkulturen H. Baumgarten 175 9.4 Kultivierung von Hybridomen bei erniedrigter Temperatur ~~~H. Baumgarten,, J.H. Peters 177 9.5 Produktion von monoklonalen Antikörpern in Maus- Aszites H. Baumgarten 179 10 REINIGUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN 10.1 Reinigung von monoklonalen Antikörpern M. Schulze 1 85 10.2 Ammoniumsulfatfällung monoklonaler IgG-Antikörper aus Hybridpmaszites M. Schulze, E. Hempelmann', 189 10.3 Protein A-Sepharose Säulen-Chromatographie H. Baumgarten 192 10.4 Anionenaustausch-Chromatographie zur Reinigung monoklonaler IgG-Antikörper M. Schulze 197 1 1 MARKIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN 11.1 Konjugation monoklonaler Antikörper mit Peroxidase W. Gerlich, M... Schulze 205 11.2 Biotinylierung monoklonaler Antikörper F. Bieber 209 12 CHARAKTERISIERUNG MONOKLONALER 'ANTIKÖRPER ' 12.1 Affinitätskonstanten-Bestimmung "~ H. Baumgarten ' 215 12.2 Epitop-Analyse H. Baumgarten 219 13 PROTEIN-ANALYTIK 13.1 Analytische SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) E. Hempelmann 227
XIII 13.2 Polychromatische Silberfärbung E. Hempelmann 232 13.3 Protein-Blotting E. Hempelmann ; 237 13.4"* Glykoprotein-Nachweis mit Schiffs Reagenz E. Hempelmann 243 13.5. Isoelektrische Fokussierung H. Baumgarten, Th. Werfel 246 14 ANHANG 14.1 Firmenanschriften 257 14.2 Sachverzeichnis 261