Non-Invasive Prenatal Testing (NIPT)

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1 Non-Invasive Prenatal Testing (NIPT) Methode & klinische Anwendung Information für Fachkreise Qualität aus Deutschland

2 Non-Invasive Prenatal Testing (NIPT) Die Untersuchungsmethode des PraenaTest basiert auf der Analyse zellfreier DNA (cell-free DNA, cfdna) im Blut der schwangeren Frau. Die cfdna liegt in Fragmenten vor und zirkuliert frei im maternalen Blut. Sie enthält neben maternaler cfdna zu zirka 2 40% (im Mittel zirka 10%) auch zellfreie fetale DNA (cell-free fetal DNA, cffdna). Die cffdna stammt maßgeblich aus dem Zytotrophoblast, d.h. aus plazentaren Zellen des heranwachsenden Embryos und ist damit extra-embryonalen Ursprungs (Abb. 1). Sie entsteht durch Apoptose und Nekrose der Trophoblastenzellen und wird fortwährend in den Blutkreislauf der Schwangeren abgegeben. Die Lebensdauer der DNA-Fragmente beträgt zirka zwei Stunden. Innerhalb weniger Stunden nach der Geburt des Kindes ist die cffdna im Blut der Mutter nicht mehr nachweisbar. Mit dem PraenaTest wird auf Basis der cffdna im maternalen Blut festgestellt, ob eine chromosomale Imbalance für ein bestimmtes Chromosom vorliegt, um somit eine entsprechende Chromosomenstörung beim ungeborenen Kind zu bestimmen. Vorgeburtliche Tests, die auf dieser Methode basieren, werden als non-invasive prenatal testing (NIPT) bezeichnet. Abb. 1: Schematische Darstellung des Transfers der cffdna in den maternalen Blutkreislauf Mütterliches Blut Plazenta cffdna maternale DNA Ein Rechenbeispiel zur Verdeutlichung der Mengenverhältnisse der DNA Angenommen, die Plasma-Probe einer Schwangeren enthält 100 Chromosom 21-spezifische Fragmente, dann wären bei einem euploiden Fötus zirka 10 der Fragmente fetalen und 90 Fragmente maternalen Ursprungs. In einer vergleichbaren Plasma-Probe einer Schwangeren mit einem Fötus mit Trisomie 21 wären von 105 Chromosom 21-spezifischen Fragmenten 15 vom Fötus und 90 von der Mutter. Die PraenaTest -Methode weist diesen Unterschied von 1:1,05 zuverlässig nach. 2

3 PraenaTest -Analyse im Diagnostiklabor der LifeCodexx AG Gewinnung zellfreier DNA aus der Blutprobe Zunächst wird aus dem mütterlichen Blut das Blutplasma isoliert. Dann wird aus dem Blutplasma die zellfreie DNA gewonnen. Diese stammt von Mutter und ungeborenem Kind und wird nicht voneinander getrennt. Bestimmung des Gehalts zellfreier fetaler DNA Voraussetzung für eine erfolgreiche Analyse ist ein Gehalt an fetaler DNA im Gemisch mit der maternalen DNA von mindestens 4% (bei Zwillingsschwangerschaften mindestens 8%). Zunächst wird der prozentuale Anteil an zellfreier fetaler DNA an der Gesamtmenge bestimmt. Dies erfolgt mittels eines proprietären Assays (Quantfe ). Ist der Anteil der cffdna zu gering, wird eine erneute Blutentnahme zu einem späteren Zeitpunkt in der Schwangerschaft empfohlen. DNA-Sequenzierung (next generation sequencing) Um die DNA sequenzieren zu können, werden die in geringer Menge vorliegenden DNA-Fragmente zuvor in einer genomischen Bibliothek angelegt und vervielfältigt. Dann wird die DNA mit hochmodernen Analysegeräten und mittels der Methode des random massively parallel sequencing (rmps) entschlüsselt. Pro Probe werden etwa 15 Millionen Sequenzen erzeugt. Bioinformatische Datenauswertung mit CE-gekennzeichneter PraenaTest DAP.plus Software Ziel ist festzustellen, ob die Menge an Sequenzen für das jeweils untersuchte Chromosom den Normbereich überschreitet, der bei einem euploiden, d.h. normalen Chromosomensatz gefunden wird. Dazu werden zunächst die generierten 15 Millionen Sequenzen nach festgelegten Qualitätskriterien unter Nutzung eines humanen Referenzgenoms sortiert. Etwa 6 Millionen Sequenzen können daraus für die nachfolgende Analyse verwendet werden. Diese Sequenzen zeichnen sich dadurch aus, dass sie jeweils nur einmal an einer bestimmten Region des humanen Genoms zu finden sind und hundertprozentig mit dem Referenzgenom übereinstimmen. Anschließend wird die Menge der zugeordneten Sequenzen pro Chromosom ermittelt (Abb. 2). DNA-Sequenzen 15 Mio. Sequenzen 6 Mio. Sequenzen Quantifizierung Abb. 2: Bioinformatische Datenauswertung mit PraenaTest DAP.plus Software 3

4 Unter Berücksichtigung des prozentualen Anteils der zugeordneten Sequenzen pro Chromosom an der Gesamtmenge der 6 Millionen zugeordneten Sequenzen wird dann der sogenannte z-score errechnet. Der z-score ist ein statistischer Wert anhand dessen bestimmt wird, ob die untersuchte Probe eine Chromosomenstörung aufweist. Er wird für das jeweils untersuchte Chromosom einer Probe berechnet. Die Grenzwerte der z-scores, anhand derer ein positives von einem negativen Testergebnis unterschieden wird, sind für die Trisomien 21, 18 und 13 aufgrund biologischer und analytischer Faktoren unterschiedlich. Für die Bestimmung gonosomaler Aneuploidien (Turner-, Triple -, Klinefelter- und -Syndrom) werden weitere Bewertungskriterien herangezogen, so dass der z-score allein nicht aussagekräftig ist (Abb. 3). Beispiel: Berechnung des z-scores basierend auf der Untersuchung des Chromosoms 21 In einer Probe mit euploidem Chromosomensatz können ungefähr Sequenzen dem Chromosom 21 zugeordnet werden. Der prozentuale Anteil dieser Sequenzen an der Gesamtmenge der 6 Millionen Sequenzen beträgt 1,27% (Abb. 3, Probe 1). Liegt in einer untersuchten Probe eine fetale Trisomie 21, d.h. eine zusätzliche Kopie des Chromosoms 21 vor, sind es ungefähr Sequenzen, welche zum Chromosom 21 gehören. Der prozentuale Anteil beträgt in diesem Fall 1,32% (Abb. 3, Probe 2). Für die Berechnung des z-scores für ein bestimmtes Chromosom wird nun der prozentuale Anteil mit dem jeweiligen prozentualen Anteil eines Referenzkollektivs (d.h. eines Sets von Proben mit euploidem Chromosomensatz) in Relation gesetzt. Weicht er in einem bestimmten Maß vom Median des Referenzkollektivs ab, kann mit hoher Sicherheit für die betreffende Probe eine fetale Trisomie 21 festgestellt werden. z-scores < 3 werden typischerweise bei Schwangerschaften ohne fetale Trisomie 21 gefunden. Die Verteilung der z-scores solcher Schwangerschaften entspricht der Gauß schen Normalverteilung. z-scores 3 weisen auf das Vorliegen einer fetalen Trisomie 21 hin. Relative Häufigkeit Prozentualer Anteil (Chr21) Median Referenz 1,26 MAD Referenz Probe 1 1,27 Max. Abweichung von Median 1,28 z(chr21) sample = %(Chr21) sample Median(Chr21) reference Mad(Chr21) reference Probe 2 1,32 z-score < 3 euploid Trisomie 21 1,27 1,26 1,5 1,32 1,26 z-score 0 1,5 3 8,7 Abb. 3: z-score Berechnung des Chromosoms 21 8,7 PraenaTest Ergebnismitteilung Abschließend wird das Ergebnis fachlich interpretiert und in der Ergebnismitteilung dokumentiert. Die Diagnosestellung sowie die damit verbundene humangenetische Beratung (in Deutschland gemäß 10 GenDG) unterliegt dem Arztvorbehalt. Der verantwortliche Arzt kann daher auf Basis der Ergebnismitteilung sowie im Kontext aller anderen relevanten klinischen Befunde das Vorliegen einer der untersuchten Chromosomenstörungen mit hoher Sicherheit entweder ausschließen oder bestätigen. 4

5 Europas erster nicht-invasiver Pränatal-Test (NIPT) mit wahlweise 3 Testoptionen für individuelle medizinische Fragestellungen Aus dem Blut schwangerer Frauen mit erhöhtem Risiko für fetale Aneuploidien bestimmt der PraenaTest ab SSW p.m. wahlweise die Trisomie 21, die Trisomien 21, 18 und 13 oder zusätzlich gonosomale Aneuploidien (Turner-, Triple -, Klinefelterund -Syndrom). Auf Wunsch wird das Geschlecht des Kindes ebenfalls bestimmt. Zuverlässig Schnell Sicher Eindeutiges Ergebnis keine Risikobewertung Bestimmung des cffdna-gehalts bei Probeneingang Auch bei Zwillingsschwangerschaften und nach Kinderwunschbehandlung einsetzbar Als einziger NIPT in der Europäischen Union wurde der PraenaTest auch für die Untersuchung bei Zwillingsschwangerschaften unabhängig geprüft. Er kann uneingeschränkt nach allen Therapieformen der Assistierten Reproduktionstechnik, auch nach Eizellspende, eingesetzt werden. Schon heute von vielen Krankenkassen in Einzelfällen bezahlt Mehr als 20 private und gesetzliche Krankenkassen in Deutschland und in der Schweiz übernehmen bereits die Kosten für den PraenaTest je nach individueller Situation der Patientin. Weiterhin wird in 2015 der Gemeinsame Bundesausschuss (G-BA) den PraenaTest auf Probe in die Regelversorgung der GKV aufnehmen*. Eine wesentliche Voraussetzung hierfür ist der Einsatz der PraenaTest -Software als CE-gekennzeichnetes Medizinprodukt. * Erprobungsregelung gem. 137e Abs. 7 SGB V Bei Fragen sind wir gerne für Sie da! Tel. +49 (0) info@lifecodexx.com LifeCodexx AG Jakob-Stadler-Platz 7, Konstanz Tel. +49 (0) , Fax +49 (0) Arbeitstage mit Express-Service 8 10 Arbeitstage mit Standard-Service Sensitivität 99%, Falsch-Positiv-Rate 0,1% (für Trisomien 21, 18 und 13) Einziger NIPT mit CE-gekennzeichneter Software gemäß In-Vitro-Diagnostik- Richtlinie 98/79/EG Für Patientinnen mit erhöhtem Risiko für fetale Aneuploidien Nationale und internationale Fachgesellschaften empfehlen den Einsatz von NIPT bei schwangeren Frauen mit erhöhtem Risiko für fetale Aneuploidien als primäre Diagnostik in Kombination mit einem Ultraschall, z.b bei erhöhtem Alter oder Zwillingsschwangerschaft, sowie als Follow-up-Test nach positivem Ersttrimester-Screening (ETS). Der PraenaTest ist auch für Risikoschwangere geeignet, welche das Zeitfenster für das ETS bereits überschritten haben. Nur der original PraenaTest wird ausschließlich in Deutschland entwickelt und durchgeführt Setzen Sie auf zertifizierte und unabhängig kontrollierte Qualität gemäß deutscher und europäischer Gesetzgebung, verbunden mit höchster wissenschaftlicher Expertise. Wir unterstützen Sie in Ihrer täglichen Praxis. Kontaktieren Sie unsere wissenschaftlichen Experten, die den PraenaTest täglich durchführen und kontinuierlich weiterentwickeln. LifeCodexx AG, PraenaTest /PrenaTest sind eingetragene Warenzeichen der LifeCodexx AG, Deutschland WM-1103-DE-001 / Oktober 2014