Institut für Mikrobiologie ETH Zürich PRAKTIKUM IN MIKROBIOLOGIE

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1 Institut für Mikrobiologie ETH Zürich PRAKTIKUM IN MIKROBIOLOGIE Ausgabe FS2013 Dr. Markus Künzler und Prof. Dr. Peter Lüthy Assistentinnen und Assistenten des Instituts für Mikrobiologie

2 INHALTSVERZEICHNIS 1 INHALTSVERZEICHNIS 1. GRUNDLAGEN FÜR DAS ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN... 3 Versuch 1: Herstellung eines flüssigen Nährmediums... 6 Versuch 2: Herstellung von Agarplatten... 7 Versuch 3: Aerobe und anaerobe Kultivierung von Bakterien in Schrägagarröhrchen... 7 Versuch 4: Isolierung von Einzelkolonien zur Herstellung von Reinkulturen MIKROORGANISMEN IN DER UMWELT MIKROORGANISMEN AUF OBERFLÄCHEN Versuch 1: Abklatsch mit Rodac-Schalen MIKROORGANISMEN IN BIOFILMEN Versuch 2: Isolierung von Kariesbakterien aus der eigenen Mundschleimhaut MIKROORGANISMEN IN DER LUFT Versuch 3: Luftanalyse mit spontaner Keimsedimentation MIKROORGANISMEN UND BAKTERIOPHAGEN IM ABWASSER Versuch 1: Bestimmung des Bakteriengehaltes in Rohwasser aus einer Kläranlage Versuch 2: Nachweis der Wirkung des Filters mit der Porengrösse 0,45 m Versuch 3: Bestimmung des Phagentiters (Coli-Phagen) im 0,45 m Filtrat LEBENSMITTELMIKROBIOLOGIE EINFÜHRUNG KEIMZAHLBESTIMMUNG IN WASSER UND MILCH Versuch 1: Bestimmung aerober, mesophiler Keime in Wasser Versuch 2: Bestimmung des Keimgehaltes von Milch Versuch 3: Der Nachweis von Escherichia coli MIKROBIELLE KONSERVIERUNG VON LEBENSMITTELN Versuch 4: Herstellung von Joghurt Versuch 5: Herstellung von Weinessig MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK MORPHOLOGISCHE KRITERIEN EINFÜHRUNG IN DIE DIAGNOSTIK Versuch 1: Makroskopische Beurteilung Versuch 2: Mikroskopische Beurteilung Versuch 3: Gramfärbung und Wachstum auf MacConkey Agar Versuch 4: Der Oxidasetest Versuch 5: Differenzierung der Gram-negativen, Oxidase-positiven Bakterien Versuch 6: Differenzierung der Gram-negativen, Oxidase-negativen Bakterien ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE ANTIBIOTIKA UND CHEMOTHERAPEUTIKA Versuch 1: Pilze als Antibiotika-Produzenten Versuch 2: Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration von zwei Antibiotika Versuch 3: Unterschiedliche Empfindlichkeit von gram-positiven und gram-negativen Bakterien sowie Bäckerhefe gegenüber einer Auswahl von Antibiotika Versuch 4: Sulfonamid-Versuch ANTIMIKROBIELLE PFLANZENINHALTSSTOFFE UND BAKTERIELLE BOTENSTOFFE Versuch 5: Antimikrobielle Wirkung von Senf und Knoblauch Versuch 6: Quorum Sensing von Bakterien ANTIMIKROBIELLE ENZYME Versuch 7: Nachweis von Lysozym-Aktivität MIKROBIELLE GENETIK Versuch 1: Kreuzung von Bäckerhefe Versuch 2: Konjugation von Escherichia coli... 57

3 INHALTSVERZEICHNIS 2 Versuch 3: Transformation von Bacillus subtilis mit Plasmid-DNA Versuch 4: Generalisierte Transduktion IMMUNABWEHR GEGEN BAKTERIEN Versuch 1: Nachweis von anti-legionella pneumophila Antikörpern DIE PHYLLOSPHÄRE ALS MIKROBIELLER LEBENSRAUM Versuch 1: Herstellung von Blattabdrücken ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: SCHÄDLINGSBEKÄMPFUNG MIT BACILLUS THURINGIENSIS GRUNDLAGEN EXPERIMENTE ZU BACILLUS THURINGIENSIS Versuch 1: Quantitative Bestimmung der insektentoxischen Aktivität von Bacillus thuringiensis israelensis gegenüber Stechmückenlarven Versuch 2: Prüfung der spezifischen insektentoxischen Aktivität von zwei verschiedenen Subspecies von Bacillus thuringiensis MYKOLOGIE EINFÜHRUNG UND UEBERSICHT MORPHOLOGIE Versuch 1: Bestimmung der Zellzahl einer Hefekolonie Versuch 2: Mikroskopie pilzlicher Erscheinungsformen Versuch 3: Verbreitung durch Sporen PHYSIOLOGIE Versuch 4: Bestimmung von minimalen, optimalen, und maximalen Wachstumstemperaturen Versuch 5: Phototropismus und Lichtregulation der Sporenbildung Versuch 6: Nachweis der amylolytischen und proteolytischen Aktivität ANHANG Empfohlenene Literatur "Allgemeine Mikrobiologie" von Georg Fuchs und Hans G. Schlegel, Thieme Verlag, 8. Auflage 2007 "Taschenlehrbuch Biologie: Mikrobiologie" von Katharina Munk, Thieme Verlag, 2008 Empfohlenene Websites

4 1.GRUNDLAGEN FÜR DAS ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN 3 1. GRUNDLAGEN FÜR DAS ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN Einführung Herstellung von Verdünnungsreihen Die Herstellung von Verdünnungsreihen ist zwar keine klassisch mikrobiologische Technik, kommt aber während des Praktikums häufig vor und bereitet erfahrungsgemäss immer wieder Probleme. Deshalb wird die Technik an dieser Stelle anhand eines Beispiels kurz erklärt: Um aus einer Probe einer bestimmten Konzentration (hier: 1) eine Reihe von 10fach Verdünnungen herzustellen, werden Probenröhrchen mit je 9 Volumeneinheiten (VE; hier: ml) Verdünnungsmittel (z.b. Wasser) vorbereitet und beschriftet. Anschliessend wird 1 VE der zu verdünnenden Probe ins erste Röhrchen pipettiert und die Flüssigkeiten durch Auf- und Abpipettieren und Vortexen gemischt. Mit derselben oder einer neuen Pipettenspitze wird dann 1 VE der entstandenen 10fach-Verdünnung ins zweite Röhrchen pipettiert und die so entstandene 100fach-Verdünnung ebenfalls gemischt. Für die weiteren Verdünnungen wird analog verfahren. Am Ende der Verdünnungsreihe enthält das letzte Röhrchen 10 VE der grössten Verdünnung, von den anderen Verdünnungen liegen nur 9 VE vor. Dies hat aber keinen Einfluss auf die Verdünnungen bzw. die Konzentrationen der Probe in den einzelnen Röhrchen. Nährmedien und Züchtungsbedingungen Die Zusammensetzung von Nährmedien muss den Nährstoffansprüchen der Mikroorganismen, die unter Laborbedingungen zur Vermehrung gebracht werden sollen, angepasst sein. Viele Bakterien sind anspruchslos und gedeihen in Nährmedien einfacher Zusammensetzung, während andere auf das Vorhandensein von Spurenelementen oder Vitaminen angewiesen sind. Der Handel bietet viele

5 1.GRUNDLAGEN FÜR DAS ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN 4 Standardmedien an für Mikroorganismen, die in der Medizin, in der Lebensmittelindustrie oder in Forschungslabors routinemässig gezüchtet oder identifiziert werden müssen. Die Züchtung erfolgt entweder auf festen oder in flüssigen Nährmedien. Für die Herstellung von festen Medien werden der wässrigen Nährlösung % Agar zugesetzt. Agar ist ein Polysaccharid, das aus Meeralgen gewonnnen wird und dem Nährmedium gelartige Konsistenz verleiht. Agar schmilzt bei 100 C und festigt sich erst unterhalb einer Temperatur von 45 C. Agar selbst dient, von ganz wenigen Ausnahmen abgesehen, den Mikroorganismen nicht als Nährstoffquelle. Die gebräuchlichen Zuchtgefässe für Agarkulturen sind Petrischalen oder Reagenzgläser mit einer schrägen Agarschicht. Bakterien in flüssigen Kulturen werden in Reagenzgläsern oder Erlenmeyerkolben gezüchtet. Grössere Kulturgefässe wie Fermenter oder Bioreaktoren dienen zur Produktion von grossen Mengen an Mikroorganismen oder deren Metaboliten. Der Sauerstoff ist bei der Züchtung von Bakterien von grosser Bedeutung. Aerobe Bakterien benötigen O 2, während die Anaerobier nur unter Ausschluss von Sauerstoff gezüchtet werden können. Anaerobe Bedingungen werden erreicht, indem der Sauerstoff im luftdicht abgeschlossenen Zuchtgefäss durch ein Sauerstoffadsorptionsmittel (z.b. alkalisches Pyrogallol) gebunden wird oder die Züchtung in Kammern oder Gefässen mit einem definierten Gasgemisch mit Stickstoff als Hauptbestandteil erfolgt. Die Züchtungs- und Inkubationstemperatur liegt in der Regel zwischen 20 C und 37 C. Sterilisation Damit beim Experimentieren mit Bakterien oder Pilzen reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden, muss mit Reinkulturen gearbeitet werden. Das Arbeiten mit Reinkulturen wiederum setzt keimfreie Kulturgefässe, Nährlösungen und Arbeitsgeräte voraus. Im Folgenden sind daher verschiedene Sterilisationsmethoden beschrieben. Sterilisation durch trockene Hitze Direktes Ausglühen: Diese Sterilisationsmethode eignet sich für Metall. Es ist eine schnelle Methode, die vor allem bei der Entkeimung der Impfösen Anwendung findet. Das Ausglühen erfolgt durch schräges Halten der Impföse in der Oxidationsflamme des Bunsenbrenners bis diese glüht. Bei Impfnadeln und Impfösen ist auch der metallene Teil des Halters zu erhitzen. Dabei ist es wichtig, die Impföse vor dem Kontakt mit Mikroorganismen abkühlen zu lassen. Die Entkeimung dieser Geräte soll nicht nur vor, sondern auch unmittelbar nach der Verwendung durchgeführt werden, um eine unnötige Kontamination der Umgebung zu vermeiden. Abflammen: Das Abflammen dient vor allem der Aussensterilisation von Glas- und Metallgefässen, um deren Ränder zu sterilisieren. Gleichzeitig verhindert die beim Erhitzen entstehende, nach oben gerichtete Warmluftströmung das Eindringen von Keimen. Heissluftsterilisation bei 160 C während 2 Stunden im Trockenschrank: Geeignet für leere Glasgefässe, Pipetten und chirurgische Instrumente.

6 1.GRUNDLAGEN FÜR DAS ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN 5 Sterilisation durch feuchte Hitze Feuchte Hitze (gesättigter Wasserdampf) ist wesentlich wirksamer als trockene Hitze. Thermostabile Flüssigkeiten (z.b. viele Nährmedien) werden auf diese Weise entkeimt. Drucksterilisation: Im so genannten Autoklaven wird die Sterilisation durch Anwendung von Wasserdampf bei einer Temperatur von 121 C durchgeführt. Der Druck, der benötigt wird um diese Temperatur zu erreichen, beträgt 2 bar. Um eine reine Dampfphase zu erzielen, muss die Luft durch Ausströmenlassen von Dampf aus dem Autoklaven verdrängt werden. Die eigentliche Sterilisation erfolgt darauf während 20 Minuten bei 121 C. Sterilisation durch Filtration Flüssigkeiten, die hitzeempfindliche Substanzen enthalten, entkeimt man durch Sterilfiltration. Filter, die Bakterien zurückhalten sollen, dürfen eine maximale Porengrösse von 0,45 m aufweisen. Sterile Einwegfilter sind in Porengrössen von 0,2 bis 5 m erhältlich. Filter mit kleiner Porengrösse verringern die Durchflussgeschwindigkeit. Diese lässt sich durch Druck oder Vakuum erhöhen. Sterilisation durch Gas Hitzeempfindliche Materialien aus Kunststoff (Petrischalen, Spritzen, Filter) und Einwegmaterial aus Glas (Pipetten) werden vor dem Einschweissen in Plastikhüllen mit Ethylenoxid sterilisiert. Sterilisation durch Bestrahlung Nachdem die Verwendung von ionisierenden Strahlen, insbesondere bei der Entkeimung von Lebensmitteln an Bedeutung verloren hat, ist diese Methode im Zusammenhang mit dem Bioterrorismus wieder aktuell geworden. Zurzeit werden Postsendungen, die an offizielle Stellen in den USA gerichtet sind, bestrahlt, um pathogene Keime wie Bacillus anthracis, den Erreger des Milzbrands, abzutöten. Impftechnik Beim Beimpfen von flüssigen oder festen Nährmedien mit Bakterien ist darauf zu achten, dass keine Verunreinigungen oder Fremdkeime mit übertragen werden. Die Einführung in die gebräuchlichsten Impftechniken ist Bestandteil der ersten nun folgenden Versuche.

7 1.GRUNDLAGEN FÜR DAS ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN 6 Folgende Bakterien werden bei den Versuchen 2-4 verwendet: Escherichia coli ist ein Gram-negatives, peritrich begeisseltes Stäbchen. Es ist ein natürlicher Darmbewohner. E. coli überlebt aber auch eine Zeitlang ausserhalb des Darmes und lässt sich leicht nachweisen. Es spielt daher für die Überwachung der Wasserqualität eine besondere Rolle. Das Vorhandensein von E. coli in Wasserproben deutet auf fäkale Verunreinigungen hin. Die Coli-Zahl gibt an, wie viele vermehrungsfähige Zellen von E. coli in einem Milliliter Probewasser enthalten sind. Nach der Lebensmittelverordnung dürfen in 100 ml unbehandeltem Trinkwasser keine Colibakterien und keine Coliformen nachweisbar sein. Bei der Ermittlung der Coli-Zahl werden besondere Indikator- Nährböden (z.b. MacConkey-Agar oder TBX-Agar, siehe Anhang) verwendet, auf denen E. coli und andere coliforme Keime eine charakteristische Färbung der Kolonien zeigen, so dass eine erste Differenzierung möglich ist. Spezielle Laborstämme von E. coli bilden die Basis für genetische Forschungsarbeiten. Enterococcus faecalis. Kleine Kokken, die während der logarithmischen Wachstumsphase typische Ketten bilden. Sie sind ubiquitär und kommen zum Beispiel in Milchprodukten und anderen organischen Substanzen vor, die sich leicht abbauen lassen. Pseudomonas fluorescens gehört zu den im Boden weit verbreiteten Bakterien der Gattung Pseudomonas. Es handelt sich um bewegliche kurze Stäbchen, die Gram-negativ sind. Clostridium butyricum ist ein gram-positives, sporenbildendes Stäbchen. Das Bakterium ist dank seiner peritrichen Begeisselung beweglich. C. butyricum ist in der Natur sehr weit verbreitet. Zu seinen Stoffwechselprodukten gehört unter anderem die Buttersäure, die der gewachsenen Kultur den markanten abstossenden Geruch verleiht. Serratia marcescens ist ein gram-negatives, bewegliches Stäbchen. Auffallend ist die Bildung des tiefroten Pigments, des Prodigiosin. Das Pigment enthält als Grundgerüst drei Pyrrolringe. Früher wurde S. marcescens auch als Hostienpilz bezeichnet, da der Organismus sich als rot gefärbte Kultur bei genügender Feuchtigkeit auf Brot entwickeln kann. Versuch 1: Herstellung eines flüssigen Nährmediums Wie bereits erwähnt, setzt das Züchten von Mikroorganismen sterile flüssige oder feste Kulturmedien voraus. Die folgenden Arbeitsschritte gehören deshalb in einem Mikrobiologie-Labor zur alltäglichen Routine. In einem ersten Versuch sollen pro Assistentengruppe 400 ml flüssiges Luria Bertani Glucose (LBG) Nährmedium für Versuch 6.2 hergestellt werden. Vorgehen: Die entsprechenden Mengen der einzelnen Bestandteile des Mediums (siehe Anhang Agar für flüssiges Medium weglassen!) werden auf der Waage eingewogen (wegen Staubentwicklung nicht

8 1.GRUNDLAGEN FÜR DAS ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN 7 Schütten, sondern Löffel benutzen!), in einen Messzylinder mit vorgelegten 100 ml deionisiertem Wasser transferiert, mit deionisiertem Wasser auf 400 ml aufgegossen und mit Hilfe eines Rührfisches gelöst. Das gelöste Kulturmedium wird in eine Schottflasche gegossen und verschlossen. Die Flasche wird mit Autoklavierband versehen, mit dem Gruppennamen, der Labornummer und dem Datum beschriftet und in den Autoklavenraum gestellt. Versuch 2: Herstellung von Agarplatten Agarhaltige Nährmedien werden zur Oberflächenkultivierung von Mikroorganismen benutzt. Pro 2er- Gruppe sollen in diesem Versuch je 2 LBG- und Malzagarplatten gegossen werden, die in Versuch 2.3 Verwendung finden werden. Vorgehen: Die agarhaltigen Nährmedien wurden aus Zeitgründen bereits vorbereitet und sind während 20 min bei 121 C autoklaviert worden. Sie befinden sich im Wasserbad bei 60 C, um das Festwerden des Agars zu verhindern. Das autoklavierte Medium wird nun wie folgt in sterile Petrischalen aus Plastik gegossen: - Flasche mit flüssigem Nährmedium kurz schwenken - Die Nährmedienflasche öffnen und die Öffnung kurz durch die Flamme ziehen. - Den Deckel der Petrischale öffnen und soviel Medium (ca. 25 ml) hineingiessen, bis der Boden einige mm bedeckt ist. - Die Petrischale unverzüglich wieder zudecken und die Nährmedienflasche verschliessen und ins Wasserbad zurückstellen. - Die Platten stehenlassen bis der Agar fest wird. Danach die Platten mit Deckel nach unten lagern und auf der Unterseite beschriften. Versuch 3: Aerobe und anaerobe Kultivierung von Bakterien in Schrägagarröhrchen Neben Petrischalen können auch Schrägagarröhrchen für die Oberflächenkultivierung von Mikroorganismen verwendet werden. Diese habe den Vorteil, dass sie auf einfache Art und Weise anaerob gemacht werden können, um das Wachstum von Mikroorganismen unter Ausschluss von Sauerstoff zu prüfen. In diesem Versuch sollen die oben erwähnten Bakterien auf Wachstum unter aeroben und anaeroben Bedingungen geprüft werden. Material: Bakterienkulturen auf Platten 4 LBG-Schrägagarröhrchen pro 2er-Gruppe 2 Gummistopfen Soda- und Pyrogallol-Lösung

9 1.GRUNDLAGEN FÜR DAS ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN 8 Vorgehen: Mit einer ausgeglühten und anschliessend abgekühlten Impföse wird aus einer Stammkultur wenig Bakterienmaterial entnommen. Das sterile Schrägagar-Röhrchen wird beimpft, indem die Agaroberfläche von unten her mit der Impföse bestrichen wird. Je zwei Schrägagarröhrchen (LBG- Agar) werden auf diese Weise pro 2er-Gruppe mit C. butyricum und einem der anderen Bakterien (notieren welches!) beimpft (total 4 Röhrchen). Je ein beimpftes Schrägagar-Röhrchen wird ohne weitere Manipulation (aerob) inkubiert. Dem anderen Schrägagar-Röhrchen wird folgendermassen der Luftsauerstoff entzogen: Der Wattestopfen wird über dem Reagenzglas abgeschnitten und bis auf die Höhe des Agars ins Reagenzglas hineingestossen. Darüber kommt eine etwa 2 cm hohe Schicht fettfreier Watte, die mit 4 bis 5 Tropfen Sodalösung (Na 2 CO 3 gesättigt in H 2 O) und 4 bis 5 Tropfen Pyrogallol (20 % in H 2 O) getränkt wird. Das Reagenzglas wird mit einem Gummizapfen luftdicht abgeschlossen auf den Kopf gestellt und inkubiert.

10 1.GRUNDLAGEN FÜR DAS ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN 9 Auswertung: Beurteile das Wachstum der Bakterien unter aeroben und anaeroben Bedingungen (+ Wachstum; - kein Wachstum) und entscheide auf dieser Basis, ob es sich bei den oben erwähnten Bakterien um obligat anaerobe, obligat aerobe oder fakultativ anaerobe (können unter beiden Bedingungen wachsen) Organismen handelt: Bakterium mit O 2 ohne O 2 Typ Clostridium butyricum Escherichia coli Enterococcus faecalis Pseudomonas fluorescens Serratia marcescens Bemerkung: Die Züchtung im Anaerobtopf ist eine alternative Methode, mit der Oberflächenkulturen unter sauerstofffreien Bedingungen kultiviert werden können, sofern ein sauerstofffreies Gasgemisch zur Verfügung steht. Der anaerob wachsende Mikroorganismus wird auf Agarmedium in Petrischalen ausgestrichen. Die Schalen werden in einen luftdicht schliessenden Topf mit einem Ventil für die Begasung gelegt. Die atmosphärische Luft wird durch dreimalige Spülung mit Stickstoff ersetzt. Man lässt im Topf einen geringen Überdruck. Die Kulturen werden anschliessend bei den geeigneten Temperaturen bebrütet. FRAGE 1.1: Sie arbeiten in Versuch 3 mit dem obligat anaeroben Bakterium C. butyricum unter aeroben Bedingungen. Wie kann dieser Organismus diese Bedingungen überleben? ANTWORT: Versuch 4: Isolierung von Einzelkolonien zur Herstellung von Reinkulturen Der Isolierung von Einzelkolonien und Herstellung von Reinkulturen ausgehend von Mischkulturen wie z.b. Freilandproben kommt in der Mikrobiologie eine zentrale Bedeutung zu. Ein von Robert Koch ebenso einfaches wie geniales Verfahren beruht auf der Isolation von Einzelkolonien auf festen Nährböden. Eine Einzelkolonie (Klon) entsteht durch vielfache Teilung einer einzelnen Bakterienzelle und stellt somit bereits eine Reinkultur dar. Um solche zu erhalten, muss eine Bakteriensuspension sehr stark verdünnt werden. In diesem Versuch werden zwei Methoden, der Verdünnungsausstrich und das Plattengussverfahren, vorgestellt, um ausgehend von einer Mischung Einzelkolonien und somit Reinkulturen von Escherichia coli (weisse Kolonien) und Serratia marcescens (rote Kolonien) zu isolieren.

11 1.GRUNDLAGEN FÜR DAS ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN 10 a) Verdünnungsausstrich Vorgehen: Auf dem Agarmedium (LBG-Agar) einer Petrischale wird mit der Impföse ein Tropfen (30 l) der Mischkultur auf der einen Seite der Schale in 2 bis 3 Parallelstrichen ausgestrichen (1). Die Öse wird dann abgeflammt und die Petrischale um 90 gedreht. Ausgehend vom einen Ende der Parallelstriche wird erneut in einem 90 -Winkel Bakterienmaterial ausgestrichen. Wird dieser Vorgang noch ein- bis zweimal wiederholt, sollte es möglich sein, nach Inkubation von h bei Raumtemperatur Einzelkolonien zu erhalten. b) Plattengussverfahren Vorgehen: 1 ml einer 1:100 und einer 1:1000 Verdünnung (in sterilem Wasser) der Mischkultur wird in leere Petrischalen gegeben und mit ml flüssigem und auf 60 C temperiertem LBG-Agar übergossen. Die Bakterien werden durch Schwenken der Platten auf der Arbeitsfläche im noch flüssigen Nährmedium verteilt. Nach Erstarren des Mediums werden die Platten für h bei Raumtemperatur inkubiert. Dieses Verfahren wird auch zur Bestimmung der Anzahl kultivierbarer Mikroorganismen in Lebensmittelproben verwendet (siehe Kap. 4.2.). FRAGE 1.2: Warum kommt in der Mikrobiologie der Arbeit mit Reinkulturen eine so grosse Bedeutung zu? ANTWORT:

12 2. MIKROORGANISMEN IN DER UMWELT MIKROORGANISMEN IN DER UMWELT 2.1. Mikroorganismen auf Oberflächen Versuch 1: Abklatsch mit Rodac-Schalen Mit dieser Technik werden Bakterien auf Oberflächen nachgewiesen. Diese Methode ist in der Lebensmittelhygiene von Bedeutung. So werden zum Beispiel Oberflächen in Küchen von Restaurants oder in Lebensmittel verarbeitenden Betrieben auf das Vorhandensein unerwünschter Mikroorganismen überprüft. Rodac-Schalen sind ähnlich wie Petrischalen, aber mit einem Doppelrand versehen. Im Innern giesst man ein Agarkissen eines Kulturmediums, hier LBG. Vorgehen: Das Agarkissen der Rodac-Schale wird während 10 Sekunden leicht auf die Untersuchungsfläche aufgedrückt und während 3 Tagen bei 30 C inkubiert. So erhält man einen "Fingerabdruck" der untersuchten Fläche. Zur Untersuchung kommen in Frage: Hände (gewaschen und ungewaschen), Körperfläche, Handtücher etc. Auswertung: Oberfläche Anzahl Anzahl Sonstige Beobachtungen (Form, Bakterienkolonien Pilzkolonien Farbe, Geruch der Kolonien) 2.2. Mikroorganismen in Biofilmen Der Begriff Biofilm beschreibt eine Gemeinschaft derselben Art oder von unterschiedlichen Arten von Mikroorganismen, welche von einer dünnen selbstproduzierten Schleimschicht umhüllt sind. Ein Biofilm entsteht, wenn Mikroorganismen eine feste oder flüssige Oberfläche besiedeln. Vorausgesetzt die Umgebung ist feucht und es sind genügend Nährstoffe vorhanden, scheiden die Mikroorganismen bestimmte Zucker und andere Stoffe aus, die sich zu einer schleimigen Schicht verbinden. Diese Schleimschicht wird als extrazelluläre polymere Substanz (EPS) bezeichnet. Dabei handelt es sich um Polysaccharide, Proteine, Glykoproteine und andere stark wasserbindende, polymere Substanzen. Beispiele von Biofilmen sind der Zahnbelag oder die glitschigen Schleimschichten in Blumenvasen, auf Flusskieseln oder in Wasserleitungen. Viele Bakterien besitzen die Fähigkeit, Biofilme zu bilden. Bakterien leben auf diese Weise in einer Art organisierten Lebensgemeinschaft, in der sie miteinander kommunizieren (siehe Kapitel 6, Versuch 6) und besser geschützt sind vor Umwelteinflüssen wie extremen Temperaturen oder ph-werten. Eine besondere Bedeutung haben Biofilme in der Medizin: In Biofilmen organisierte Bakterien sind sehr gut vor unserem Immunsystem und vor Antibiotika geschützt. Viele sind so tausendmal resistenter gegen Antibiotika als freilebende Bakterien des gleichen Stammes. In diesem Kurs werden zwei Beispiele von bakteriellen Biofilmen angeschaut. Eines davon ist der Zahnbelag (Plaque), der sich bildet, wenn

13 2. MIKROORGANISMEN IN DER UMWELT 12 das Zähneputzen einmal ausgelassen wird. Das zweite Beispiel ist ein Biofilm (Essigmutter), der sich bildet, wenn aus Wein Essig entsteht (Kapitel 4, Versuch 5). Versuch 2: Isolierung von Kariesbakterien aus der eigenen Mundschleimhaut Streptococcus salivarius ist ein gram-positives Milchsäurebakterium, welches Kohlenhydrate (Glucose) vergärt und dabei Milchsäure produziert. Es ist verantwortlich für die Entstehung von Karies und kommt natürlicherweise in unserer Mundhöhle vor. S. salivarius bildet in der Mundhöhle kleine Kolonien aus, die an der Oberfläche von Zähnen relativ fest anhaften und einen Biofilm ausbilden. Insbesondere bei mangelnder Mundhygiene und einer guten Versorgung der Bakterien mit Saccharose (Haushaltszucker) ist die Schleimbildung besonders stark. Diese Biofilme bilden viel Milchsäure, welche den Zahnschmelz angreift und zu Karies führen kann. Material: Sterile Wattestäbchen, Saccharose-Agarplatten, Platten mit Reinkulturen von E. coli (auf LBG-Agar) und S. salivarius (auf Saccharoseagar). Vorgehen: Mittels sterilen Wattestäbchen werden Proben von der Mundschleimhaut flächig auf eine Saccharose- Agarplatte ausgestrichen. Die Platten werden mit Parafilm verschlossen und 2-3 Wochen bei Raumtemperatur inkubiert, um Bakterienkolonien mit charakeristischer Schleimbildung aus der Mundschleimhaut zu isolieren. Als Kontrollen für die Schleimbildung auf Saccharose-Agar dienen Reinkulturen von E. coli (Negativkontrolle) und S. salivarius (Positivkontrolle), die nebeneinander auf eine Saccharose-Agarplatte überstrichen werden. Auswertung: Wie unterscheiden sich die Einzelkolonien der verschiedenen Bakterien (Eigenisolate, Kontrollen) auf den Saccharose-Agarplatten? Bei welchen Proben sind schleimbildende Kolonien erkennbar? FRAGE 2.1: Was ist die hauptsächliche Einschränkung der im Praktikum gezeigten Methoden zum Nachweis von Mikroorganismen in Umweltproben im Vergleich zu modernen Ansätzen wie DNA- Sequenzierung (Metagenomik)?

14 2. MIKROORGANISMEN IN DER UMWELT Mikroorganismen in der Luft Mikrobiologische Luftanalysen sind sehr aufwendig, da die Mikroorganismenzahl in der Luft grossen Schwankungen unterworfen ist, wie dies die nachstehende Tabelle veranschaulicht. Beispiele von Luftkeimzahlen an verschiedenen Standorten: Messorte Anzahl Probenahmen Keime/m 3 Durchschnitt Keime/m 3 Extremwerte Arosa (freies Feld) /220 Klotener Ried /343 (freies Feld) Arosa (Dorfrand) /458 Kloten (Strassenkreuzung) /1236 Zur Erfassung der Mikroorganismen in der Luft gibt es verschiedene Methoden. Die einfachste ist das Auslegen von offenen Agarplatten, wobei man Bakterien und Pilze, die sich in der Luft befinden, über eine bestimmte Zeit sedimentieren lässt. Die Platten werden anschliessend bebrütet und die sich entwickelnden Kolonien nach 24 bis 48 h ausgezählt. Eine zuverlässigere Methode ist die Verwendung von automatischen Luftkeimsammlern. Dabei wird eine bestimmte Menge Luft angesogen und auf ein Nährmedium geschleudert, auf dem die Keime kleben bleiben. Bei der Erfassung der Mikroorganismen in der Luft ist die Wahl des Mediums wichtig (siehe Anhang für die Zusammensetzung einiger Medien). Für Bakterien eignen sich Plate-Count (PC) oder Luria Broth Glucose (LBG) Agar, für die selektive Erfassung von Pilzen wählt man Malzager (MA), Potato Dextrose Agar (PDA) oder Sabouraud-Dextrose-Agar (SD). Es stehen im Kurs Platten mit LBG-Agar und mit Malzagar zur Verfügung. Versuch 3: Luftanalyse mit spontaner Keimsedimentation Durchführung: Die Luftanalyse mit Sedimentationsplatten wird wie folgt durchgeführt: Die in Versuch 1.1 selber hergestellten Agarplatten werden an bestimmten Standorten offen während zum Beispiel 1-2 h exponiert. Anschliessend werden die Platten bei 30 C bebrütet und nach 24 bis 48 h ausgewertet. Jeder Teilnehmer legt je eine Platte mit LBG-Agar und mit Malzagar (aus Experiment 1.2) aus. Wie erwähnt vermehren sich auf dem LBG-Agar insbesondere Bakterien, auf dem Malzagar Pilze. Auswertung: Medium/Standort Anzahl Anzahl Sonstige Beobachtungen (Form, Bakterienkolonien Pilzkolonien Farbe, Geruch der Kolonien) LBG/ MA/

15 3. MIKROORGANISMEN UND BAKTERIOPHAGEN IM ABWASSER MIKROORGANISMEN UND BAKTERIOPHAGEN IM ABWASSER Bakteriophagen Twort (1915) und d`hérelle (1917) entdeckten ein infektiöses Agens, das Bakterienfilter passieren und einen Bakterienrasen lysieren konnte. Sie nannten dieses Agens Bakteriophagen. Heute weiss man, dass es sich bei diesen filtrierbaren und lichtmikroskopisch nicht sichtbaren Bakteriophagen um Viren handelt, die nur Bakterien infizieren können. Wie die Viren bestehen die Bakteriophagen (kurz auch Phagen genannt) aus Proteinen und Nukleinsäure. Die Phagen enthalten entweder DNA oder RNA, nie jedoch beides zusammen. Die Nukleinsäure wird bei der Infektion ins Bakterium eingespritzt und liefert dann die Information für die Synthese neuer Phagenpartikel. Die Energie, Bausteine (Nukleotide, Aminosäuren) und die Produktionsstrukturen (Ribosomen, Membranstrukturen) werden vom Wirtsorganismus bereitgestellt. Fast von allen Bakterienarten sind heute Bakteriophagen isoliert und beschrieben worden. Dabei fand man, dass der Wirtskreis eines Bakteriophagen sehr beschränkt ist, d.h. dass eine bestimmte Phagenart nur eine oder wenige Bakterienarten befallen kann. Die Erkennung und Isolierung von Phagen ist nur dann einfach, wenn der Phage virulent ist, d.h. wenn er sich nach der Infektion im Bakterium sofort vermehrt und dieses schliesslich unter Freisetzung genetisch identischer Phagen lysiert. Daneben gibt es auch temperente Phagen, die zwar ihre Nukleinsäuren einspritzen, sich dann aber im Wirtsbakterium nicht sofort vermehren. Die Phagennukleinsäure wird dabei ins Wirtschromosom eingegliedert und in den normalen Wachstumszyklus des Bakteriums einbezogen. Erst unter speziellen Bedingungen (z.b. Induktion durch UV-Strahlen oder chemische Mittel) beginnt sich die Phagen-DNA wieder selbstständig zu machen und zu vermehren: der temperente Phage wird lytisch. Um die Anzahl der Phagen (den Phagentiter) zu bestimmen wird die Plaque-Test-Methode verwendet. Bei dieser Methode werden wenige Phagen mit einem Überschuss an sensitiven Bakterien zusammengegeben, mit Weichagar vermischt und auf der Oberfläche einer Agarplatte verteilt. Wo sich ein Phagenpartikel befindet, werden die Bakterien in einem gewissen Umkreis lysiert. So entstehen im dichten Bakterienrasen "Löcher" - in der Fachsprache Plaques genannt. Aus statistischen Gründen nimmt man an, dass jedes Plaque aus der Infektion eines einzelnen Phagen entsteht, d.h. dass man durch Auszählen der Plaques ein Mass für die Anzahl infektiöser Partikel (Phagentiter) in einem Lysat erhält. Versuche Für diesen Versuch wird Rohwasser aus einer Kläranlage verwendet. Das Fäkalwasser enthält unter vielen Mikroorganismen auch Escherichia coli, begleitet von den entsprechenden Bakteriophagen. Da Bakterien generell einen Durchmesser von 0,8 m bis 3 m haben und Bakteriophagen einen solchen von 10 bis 100 nm, können sie durch Filtration voneinander getrennt werden.

16 3. MIKROORGANISMEN UND BAKTERIOPHAGEN IM ABWASSER 15 Versuch 1: Bestimmung des Bakteriengehaltes in Rohwasser aus einer Kläranlage Es wird versucht, die in Rohwasser vorhandene Menge an Mikroorganismen zu schätzen. Gleichzeitig soll die Wirkung des Bakterienfilters mit Porengrösse 0,45 m geprüft werden (Versuch 2). Vorgehen: Je 1 ml des unfiltrierten Rohwassers werden in sterilem Wasser in 10er Schritten bis zu einem Faktor von 10 5 verdünnt. 1 ml der Verdünnungen 10 3, 10 4 und 10 5 werden in je eine Petrischale pipettiert und mit ca. 20 ml LBG-Agar (60 C) übergossen (Plattengussverfahren, siehe Kap. 1, Versuch 1.4). Das Mischen von Bakterien und Agar erfolgt durch vorsichtige kreisförmige Bewegung der Schale auf der Tischplatte. Nach 24 bis 48 Stunden Inkubation bei 37 C wachsen die Einzelzellen zu Kolonien aus und können ausgezählt und auf die Anfangskonzentration zurückberechnet werden. Versuch 2: Nachweis der Wirkung des Filters mit der Porengrösse 0,45 m Es soll gezeigt werden, dass ein Filter mit der Porengrösse 0,45 m sämtliche Mikroorganismen zurückbehält. Vorgehen: 5 ml Rohwasser werden durch einen Filter mit der Porengrösse 0,45 m in ein steriles Röhrchen filtriert. Anschliessend wird 1 ml des unverdünnten Filtrats mit dem Plattengussverfahren in LBG-Agar ausplattiert. Filtrat nicht wegwerfen wird noch für Versuch 3.3 gebraucht! Versuch 3: Bestimmung des Phagentiters (Coli-Phagen) im 0,45 m Filtrat Bei der Bestimmung wird die Weichagarschicht-Methode (ein modifiziertes Plattengussverfahren) angewendet. Die Phagen werden dabei in einen Weichagar eingebettet, der zugleich auch mit den Wirtsbakterien beimpft wird. Der Weichagar begünstigt die Diffusion der Phagen, so dass sie leichter auf eine Wirtszelle treffen und die Bakterien infizieren können. Nach etwa 20 Minuten, in deren Verlauf in jeder infizierten Zelle 20 bis 200 neue Phagen synthetisiert werden, lysieren die befallenen Bakterien und setzen Phagen frei. Diese freigesetzten Phagen infizieren die noch intakten Nachbarzellen. So entsteht bei Bebrütung im dichten Bakterienrasen eine bakterienfreie Zone, auch als Lysehof oder Plaque bezeichnet. Vorgehen: 7 ml H-Topagar (in einem Reagenzglas) werden im siedenden Wasserbad geschmolzen und anschliessend auf ca. 60 C abgekühlt. Dann mischt man sehr schnell 0.5 ml des 0,45 m Filtrates bzw. der 1:10 Verdünnung des Filtrats (in sterilem Wasser) und 100 l E. coli BL21 Kultur mit dem Weichagar, giesst die Mischung des Reagenzglases unverzüglich (bevor der Weichagar wieder erstarrt) auf eine (warme) H-Agar Platte und verteilt diese gleichmässig durch kreisförmiges Bewegen der

17 3. MIKROORGANISMEN UND BAKTERIOPHAGEN IM ABWASSER 16 Platte. Nach 12 bis 24 Stunden Inkubation kann der Phagentiter (pfu/ml = plaque forming units per ml) bestimmt werden. Auswertung der Versuche 1-3: Auszählung der auf den verschiedenen Platten gewachsenen Bakterienkolonien und Bestimmung der cfu/ml (colony forming units per ml) (siehe auch Kap. 4) bzw. pfu (plaque forming units)/ml: Vorbehandlung der Abwasserprobe unfiltriert 0.45 m Phagentiter unverd. Phagentiter 1:10 verd. cfu/ml bzw. pfu/ml Beschreibung der aufgetretenen Kolonie bzw Plaques FRAGE 3.1: Wie erklären Sie sich die verschiedenen Grössen und Klarheiten der erhaltenen Plaques? ANTWORT: Persönliche Notizen:

18 4. LEBENSMITTELMIKROBIOLOGIE LEBENSMITTELMIKROBIOLOGIE 4.1. Einführung Das Gebiet der Lebensmittelmikrobiologie hat während der letzten Jahre stark an Bedeutung gewonnen. Lebensmittel, eingeschlossen Wasser und andere Getränke, haben bestimmten hygienischen Anforderungen zu genügen. Diese sind den veränderten Lebensgewohnheiten anzupassen. Lebensmittel werden heute länger und in grösseren Mengen gelagert; sie werden über weitere Strecken transportiert; sie werden durch die Einrichtung von Fast Food Ketten und Gemeinschaftsverpflegungen in grossen Mengen zubereitet. In tropischen Drittweltländern nimmt der Stand der Hygiene immer noch ab, was sich besonders auf die Qualität von Trinkwasser auswirkt. Die Folgen davon sind Ausbrüche von Epidemien wie Cholera (Erreger Vibrio cholerae) oder Salmonellosen. Haltbarmachung von Lebensmitteln durch Mikroorganismen: Der Einsatz von Mikroorganismen zur Haltbarmachung von Lebensmitteln hat zum Ziel, das Nahrungsmittel so zu verändern, dass es gegen den Angriff von Fremdkeimen weitgehend geschützt ist. Als Beispiele seien die Ansäuerung durch Milch- oder Propionsäurebakterien (Molkereiprodukte, Wurstwaren, Sauerkraut) oder die Produktion von Alkohol durch Hefen bei zuckerhaltigen Getränken genannt. Verderb und Verunreinigung von Lebensmitteln durch Mikroorganismen Ungeschützte Nahrungsmittel sind dem mikrobiellen Angriff ausgesetzt. In der Regel werden die Lebensmittel bei unsachgemässer Aufbewahrung durch mikrobiellen Abbau ungeniessbar. Viele Mikroorganismen produzieren Exoenzyme wie Proteasen oder Lipasen, die in der Lage sind, Proteine und Fette in Lebensmitteln abzubauen und die Spaltprodukte als Energiequelle und für den Aufbau mikrobieller Zellsubstanz zu nutzen. Meist sind diese Mikroorganismen apathogen. Einige wenige Arten sind aber pathogen, indem sie Toxine bilden (z.b. Clostridium botulinum) oder zu Darminfektionen (Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Salmonellen) führen. Bei mikrobiellen Kontaminationen von Lebensmitteln mit pathogenen Keimen ist in der Regel eine Quelle vorhanden, aus der die Mikroorganismen ins Nahrungsmittel abgegeben werden, wie Verunreinigung von Eiern oder Geflügelfleisch mit Salmonellen oder Kontamination von Wasser und Lebensmittel durch Ausscheider von Cholerabakterien. Im Schweizerischen Lebensmittelbuch sind Grenzwerte festgelegt, welche für die Belastung von Lebensmitteln durch Mikroorganismen gelten. In unserem Kurs wollen wir an bekannten Beispielen die mikrobielle Haltbarmachung von Lebensmitteln zeigen und eine bakteriologische Trinkwasseruntersuchung durchführen.

19 4. LEBENSMITTELMIKROBIOLOGIE Keimzahlbestimmung in Wasser und Milch Einleitung In den meisten Flüssigkeiten sind naturgemäss mikrobielle Keime enthalten. Die Wasserqualitäten unterliegen einer strengen Überwachung und in den verschiedenen Verordnungen sind Höchstwerte festgelegt. Für Getränke sind diese zusammen mit den Prüfmethoden im Schweizerischen Lebensmittelbuch enthalten. Im Folgenden sind einige Verfahren zur Bestimmung von Höchstwerten im Rahmen der Lebensmittelüberwachung beschrieben. Zum einem wird die totale Anzahl Keime bestimmt. Zum anderen wird auf einzelne Mikroorganismen zurückgegriffen, welche als Indikatoren für Kontaminationen benutzt werden. Eine solche Spezies ist Escherichia coli. Sie deutet auf Verunreinigung durch tierische Fäkalien hin. Daher darf abgefülltes Trinkwasser wohl eine gewisse Anzahl aerober, mesophiler Keime, aber keine E. coli Bakterien enthalten. Die entsprechenden gesetzlichen Toleranzwerte für Trinkwasser sind laut Hygieneverordnung des EDI (SR ): Trinkwasser Untersuchungskriterien Toleranzwerte (cfu) An der Fassung Aerobe, mesophile Keime - E. coli 100/ml - nn/100ml Im Verteilnetz Aerobe, mesophile Keime - E. coli 300/ml - nn/100ml Abgefüllt in Behältnisse Aerobe, mesophile Keime - E. coli nn/100ml - nn/100ml nn = nicht nachweisbar Verfahren Es gibt verschiedene Verfahren Keime nachzuweisen. Will man nur die Gesamtmenge der vorhandenen Keime bestimmen, wird ein allgemeines Verfahren mit nicht-selektiven Medium gewählt. Benutzt man ein selektives Medium kann man die Vermehrung einer speziellen Art gezielt steuern und dadurch die Grenzwerte überprüfen. Je nach Probengrösse oder festgelegtem Höchstwert werden Plattengussverfahren oder Membranfiltertechnik gewählt. Plattengussverfahren: Die Bezeichnung Gussverfahren leitet sich davon ab, dass der noch nicht erstarrte Nährboden in die Petrischale gegossen wird, in der sich bereits die Probe (1 ml) befindet. Probe und Nährboden werden durch sorgfältige Kreisbewegung der Petrischale miteinander vermischt. Im erstarrten Nährboden entwickelt sich jede Einzelzelle zu einer Kolonie, die nach einer bestimmten Inkubationszeit visuell ausgezählt werden kann. Da die Kolonienbildung nicht notwendigerweise von Einzelzellen ausgeht, benutzt man häufig anstelle von Keimzahl auch den Ausdruck Koloniebildende Einheiten (KBE) oder englisch colony forming unit (cfu). Dieses Verfahren wird für die Bestimmung von Keimzahlen in kleinen Probenvolumina gewählt. Membranfiltertechnik: Bei dieser Technik werden bereits gegossene Platten verwendet. Eine bekannte Menge der Probe (100ml) wird durch einen Membranfilter der Porengrösse 0.45 m filtriert, auf dem die Mikroorganismen zurückbehalten werden. Der Filter wird auf die Agar-Platten gelegt und saugt sich mit Nährmedium voll. Auf dem Filter wachsen die Keime zu Kolonien aus, die wie beim Gussverfahren visuell ausgezählt werden können. Bei dieser Technik lassen sich grössere

20 4. LEBENSMITTELMIKROBIOLOGIE 19 Probevolumina verwenden. Diese Methode eignet sich für die Überprüfung des E. coli Gehalts in Trinkwasser. Es werden immer neue Verfahren entwickelt, um einzelne Arten von Mikroorganismen gezielt und einfach auf ihre Anwesenheit zu testen. So gibt es für bakteriologische Wasseruntersuchungen Kapseln, deren Inhalt in einem sterilen Gefäss mit der Probe suspendiert wird. Nach Inkubation kann lässt sich anhand der auftretenden Farbänderung qualitativ auf die Anwesenheit von E. coli schliessen. Versuch 1: Bestimmung aerober, mesophiler Keime in Wasser Jede Assistentengruppe bestimmt nach der oben beschriebenen Plattengusstechnik den Gesamtkeimgehalt in 1 ml Stadtwasser, Mineralwasser (mit und ohne Kohlensäure), Seewasser, Flusswasser und Quellwasser. Es wird LBG-Agar verwendet. Die Platten werden vor dem Auszählen 3 Tage bei 30 C inkubiert. Um eine korrekte Auswertung zu gewährleisten, sollten auf einer Platte nicht mehr als 300 Kolonien wachsen. Resultate: Wasserprobe Anzahl Bakterienkolonien pro ml Versuch 2: Bestimmung des Keimgehaltes von Milch Jede Assistentengruppe bestimmt den Keimgehalt von Roh-, Past- und UHT-Milch. Die Proben werden dazu in 10er Schritten bis zu einem Faktor von 10 4 in sterilem Wasser verdünnt. 1 ml der Verdünnungen 10 2, 10 3 und 10 4 sind im Plattengussverfahren auf LBG-Agar auszuplattieren. Resultate: Milchprobe Ausgezählte Anzahl Bakterienkolonien Anzahl Bakterienkolonien Verdünnung pro ml verdünnt pro ml unverdünnt Rohmilch Pastmilch UHT-Milch

21 4. LEBENSMITTELMIKROBIOLOGIE 20 Versuch 3: Der Nachweis von Escherichia coli Mit dem spezifischen TBX-Agar werden 100 ml obiger Wasserproben (NICHT Rohwasser!) mittels Membranfiltrationstechnik auf das Vorhandensein von E. coli geprüft. Als Positivkontrolle für den TBX-Agar wird ein Tropfen (30 l) Rohwasser mittels Verdünnungsausstrich auf einer TBX-Agar ausgebracht. Die ermittelten Keimzahlen werden im Kurs zusammen mit den zulässigen Höchstwerten verglichen und besprochen. Resultate: Wasserprobe Anzahl E. coli-kolonien pro 100 ml 4.3. Mikrobielle Konservierung von Lebensmitteln Versuch 4: Herstellung von Joghurt Einleitung: Joghurt als Lebensmittel muss so alt sein wie der Konsum von Milch durch die. Milchsäurebakterien sind in Rohmilch in grosser Zahl vorhanden (>10 4 /ml), sodass es oft spontan zur Entstehung von Joghurt kommt. In Europa wird Bulgarien als Ursprungsland der Joghurtherstellung betrachtet. Das klassische Joghurt wird mit Stämmen der beiden Bakterienarten Streptococcus thermophilus und Lactobacillus bulgaricus hergestellt. Das Disaccharide Lactose, das in Kuh-, Schaf-, und Ziegenmilch mit etwa 4.5% vorhanden ist, wird zu Milchsäure fermentiert. Man unterscheidet zwischen homofermentativer und heterofermentativer Milchsäuregärung. Die von den Mikroorganismen produzierte Milchsäure senkt den ph-wert von etwas über ph 6 in den Bereich von ph 3, wobei die Milchproteine koagulieren. Stichfestes Joghurt wird durch Zugabe von Milchpulver erreicht. Durch die Senkung des ph-wertes wird Joghurt über Tage, ja Wochen, haltbar. Joghurt ist sehr bekömmlich und hat als Probiotika grosse Bedeutung erlangt. Auf dem Markt werden Produkte mit speziellen Milchsäurebakterien angeboten, die sich auf das Verdauungssystem besonders positiv auswirken sollen. Die homofermentative Milchsäuregärung:

22 4. LEBENSMITTELMIKROBIOLOGIE 21 Lactose Glucose + Galactose Material: - Bio-Joghurt nature (z.b. Coop, Migros ), Pastmilch, pro zwei Praktikumsteilnehmer ein Joghurtglas, ph-indikatorpapier, Esslöffel. - Milchsäure-Agar (MS-Agar) flüssig im Wasserbad bei 55 0 C. Pro Assistentengruppe 600 ml (2x500 ml Flaschen mit 300 ml Medium). Durchführung: Pro 2er-Gruppe Vorgehen: - wird ein Joghurtglas mit 180 ml UHT Milch mit einem Teelöffel Joghurt beimpft und anschliessend und bei 43 0 C für 5 h inkubiert. - Der ph-wert vom frischen Joghurt wird bestimmt und pro 2er-Gruppe wird eine Verdünnungsreihe von 10 1 bis 10 5 in 1ml Eppendorf-Röhrchen hergestellt. Von jeder Verdünnung werden 0.1 ml in eine Petrischale pipettiert, mit ml MS-Agar (55 0 C) übergossen und sorgfältig aber gründlich gemischt. Anschliessend erfolgt eine Inkubation für 4 Tage bei 37 0 C und dann Aufbewahrung bei RT. - Als Kontrolle wird pro Assistentengruppe vom ursprüglichen Joghurt (Starterkultur) eine Verdünnungsreihe zwischen 10 1 und 10 8 hergestellt. Die Verdünnungen 10 4 bis 10 8 werden wie oben ausplattiert. Auswertung: 1. Messen der ph-werte von Milch und Joghurt (nach 5h und nach 7 Tagen). 2. Vom Joghurt, das als Starterkultur diente und vom frischen Joghurt werden im Mikroskop (Objektiv 40x) Lactobacillus spp. und Streptococcus spp. nachgewiesen.

23 4. LEBENSMITTELMIKROBIOLOGIE Bestimmung der CFU s pro ml Joghurt nach Inkubation von 5 h und 7 Tagen. und Rückberechnung der Keimzahlen des Ausgangssubstrates. Bem.: Milchsäurebakterien lösen den Kalk um die Kolonien auf und ihre Anzahl lässt sich so bestimmen. Lactobacillen und Streptococcen lassen sich voneinander aufgrund ihrer Kolonieform unterscheiden. Die Lactobacillen bilden im MS-Agar runde Kolonien, während diejenigen der Streptococcen spindelförmig sind. 4. Durchführung von Gram-Färbungen von Lactobacillus spp. und Streptococcus spp. Kolonien während Experiment 5.3. ph-wert CFU s/ml Lactobacillen CFU s/ml Streptococcen Milch - - Starterkultur Yoghurt Nach 5 h Inkubation bei 43 0 C Nach 7 Tagen bei RT Versuch 5: Herstellung von Weinessig In diesem Versuch soll mit Hilfe von Essigsäurebakterien (Acetobacter aceti) aus Wein Weinessig hergestellt werden. Dabei soll die Zunahme der Konzentration von Essigsäure anhand der ph- Abnahme und des charakteristischen Geruchs über die Zeit verfolgt werden. Wein bildet natürlicherweise mit der Zeit Essig, da die Essigsäurebakterien bereits im Wein vorhanden sind oder aus der Luft in den Wein gelangen. Vielleicht haben Sie schon zu Hause einen Wein zu lange stehen gelassen und nachher Essig gehabt. Damit dies allerdings nicht geschieht, werden die Weine oft mit Schwefel versetzt. Damit aus Wein Essig wird, muss genügend Sauerstoff vorhanden sein. Dann sind die Essigsäurebakterien in der Lage, Ethanol mit Hilfe von Sauerstoff zu Essigsäure zu oxidieren. In der Industrie wird heute mit einer Starterkultur von Essigsäurebakterien gearbeitet. Wenn diese zum Wein gegeben werden, beschleunigt dies die Essigbildung. Genau dies sollen Sie in diesem Versuch ausprobieren. Dazu wird der Wein in einem nur teilweise gefüllten Gefäss gelagert, bis der Wein zu Essig geworden ist. An der Grenzfläche Wein/Luft bildet sich eine Kahmhaut, weil dort die Bedingungen für die Ethanol-Oxidation günstig sind. Diese Kahmhaut ist ein Biofilm aus Essigsäurebakterien und wird auch als Essigmutter bezeichnet. Material: - Polystyrol-Mikrotiterplatte mit 6 Vertiefungen (wells) - Verdünnter Rot- oder Weisswein (6% Alkoholgehalt, möglichst schwefelfrei und ph-neutral) - Starterkultur von Essigsäurebakterien (Acetobacter aceti) auf YPM-Agar - ph-indikatorpapier - 10 ml Pipette

24 4. LEBENSMITTELMIKROBIOLOGIE 23 Vorgehen: 1. Jede Vertiefung (well) wird mit 5 ml verdünntem Wein gefüllt. 2. Acetobacter aceti-zellen werden mit einer sterilen Pipettenspitze von der Platte entnommen und in 0.5 ml sterilem Wasser resuspendiert. Von dieser Zellsuspension werden je 100 µl in 4 Wells pipettiert. Die anderen 2 Wells dienen als Nullkontrolle (K). Anschliessend wird mit Hilfe des ph-indikatorpapiers der ph-wert aller Ansätze bestimmt (Wert in untenstehende Tabelle eintragen). 3. Die Platte wird mit einem Deckel geschlossen und für 3 Wochen bei Raumtemperatur stehen gelassen. Auswertung: Nach einer, zwei und drei Wochen werden die Entstehung und das Wachstum der Kahmhaut und der Geruch beobachtet und dokumentiert. Mit einer Pipette kann vorsichtig am Rand etwas Probe entnommen werden um den ph-wert der Ansätze zu bestimmen. Dokumentieren Sie die Entwicklung der Kahmhaut und der Flüssigkeit in untenstehender Tabelle. Kahmhaut (Aussehen beschreiben) ph-wert Woche Aa K +Aa K +Aa K +Aa K Geruch Beantworten sie folgende Fragen: 1) Worauf ist die beobachtete Veränderung des ph-wertes zurückzuführen? Notieren Sie die Reaktionsgleichung mit den entsprechenden Strukturformeln.

25 4. LEBENSMITTELMIKROBIOLOGIE 24 2) Wo in der Flüssigkeit wird der Biofilm gebildet und warum? 3) Warum soll mit ungeschwefeltem Wein gearbeitet werden? FRAGE 4.1: Kennen Sie andere Beispiele von Lebensmitteln für deren Herstellung und Konservierung die Anreicherung von spezifischen Mikroorganismen essentiell ist? Welche Mikroorganismen werden angereichert? ANTWORT: Persönliche Notizen:

26 5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK 5.1. Morphologische Kriterien Aufbau der Zellen Grösse, Teilung Prokaryontische Zellen lassen sich im Lichtmikroskop gerade noch erkennen. Der Durchmesser einer Zelle mag je nach Art im Durchschnitt 1-2 m betragen. Die Längen sind sehr unterschiedlich. Für die Untersuchung von Feinstrukturen benötigt man das Elektronenmikroskop. Eukaryontische Zellen von Pilzen sind 5-10x grösser (5-8 x 5-15 m). Die Zellen vermehren sich in der Regel durch Querteilung. Unter idealen Wachstumsbedingungen kann die Querteilung mit einer gewissen Verzögerung stattfinden, sodass sich charakteristische Zellverbände (Ketten, Trauben, kubische Pakete, Tafeln, Tetraden) bilden. Sowohl bei den Bakterien als auch bei den Pilzen gibt es mehrzellige Formen, deren Zellverbände Filamente ausbilden und die sich durch Sporen vermehren. Bei filamentösen Pilzen ist die Zellteilung auf die Zelle an der Filamentspitze beschränkt (polares Wachstum, siehe Kap. 11). Zellwand Nach aussen hin sind die Zellen von Mikroorganismen von einer Zellwand umgeben, die der Zelle die notwendige Stabilität verleiht. Bei Bakterien besteht das Grundgerüst der Zellwand aus Murein, einem Netzwerk aus Heteropolysaccharid-Strängen und Peptidbrücken. Bei Archaeen ist die Zellwand aus Eiweiss und/oder Polysacchariden aufgebaut und bei Pilzen aus Polysacchariden. Aufgrund des Zellwandaufbaus lassen sich die Bakterien in zwei wichtige Gruppen unterteilen, die Gram-positiven und die Gram-negativen. Die Gram-positiven Bakterien besitzen eine dicke Zellwand, während diejenige von Gram-negativen Organismen relativ dünn ist, aber zusätzlich von einer äusseren Membran aus Lipopolysacchariden und Lipoproteinen umgeben ist. Differenziert zwischen Gramnegativen und Gram-positiven Bakterien wird mit Hilfe einer Färbemethode, der so genannten Gramfärbung (vgl. Versuch 5). Gram-positive Organismen bleiben nach Färbung mit Kristallviolett und anschliessendem Beizen mit Kaliumjodid-Lösung angefärbt, während bei Gram-negativen Bakterien der Farbstoff mit Äthanol wieder entfernt werden kann. Kapsel oder Schleimschicht Die Zellwände können zusätzlich von einer Kapsel oder Schleimschicht umgeben sein. Es handelt sich dabei um Polysaccharidausscheidungen, die für die Zellen eine zusätzliche Schutzfunktion erfüllen. Von einer Kapsel spricht man, wenn die Polysaccharide relativ kompakt sind und an den Zellen haften. Im Gegensatz dazu lässt sich der wässerige Schleim relativ leicht von den Zellen lösen. Cytoplasmamembran Zwischen der Zellwand und dem Cytoplasma finden wir die Cytoplasmamembran. Es handelt sich um eine doppelte Schicht von Lipiden, in welche Proteine eingelagert sind. Die Cytoplasmamembran erfüllt in erster Linie Transportfunktionen für Nährstoffe und Metaboliten. In ihr sind aber auch für den Metabolismus der Zelle wichtige Enzyme lokalisiert.

27 5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK 26 Cytoplasma Im Cytoplasma findet sich das Chromosom, Ribosomen, Proteine, Reservestoffe sowie alle weiteren für die Zellvermehrung und den Aufbau von Zellsubstanz notwendigen Verbindungen. Das Cytoplasma von eukaryontischen Pilzzellen enthält zahlreiche Kompartimente (Mitochondrien, Vakuolen, Zellkern). Beweglichkeit Viele Bakterienarten sind befähigt, sich aktiv fortzubewegen. Sie sind mit Geisseln ausgerüstet. Die Verankerung der Geisseln reicht durch die Zellwand hindurch bis in die Cytoplasmamembran hinein. Aufbau und Funktion der Geisseln ist kompliziert. Die Anordnung der Geisseln an der Oberfläche ist ein charakteristisches, taxonomisch wichtiges Merkmal. So gibt es zum Beispiel Bakterien, welche nur an einem Ende eine einzige Geissel besitzen (monopolar monotrich begeisselt) oder, als anderes Extrem, solche, die rundherum Geisseln tragen (peritrich begeisselt). Zellen von Archaeen und Pilzen sind in der Regel nicht beweglich. Sporenbildung Die Familie der Bacillaceae umfasst Bakterien, die hitzeresistente Dauersporen bilden. Sie ist in die Gattungen Bacillus und Clostridium unterteilt. Die Gattung Bacillus umfasst die aeroben, die Gattung Clostridium die anaeroben Sporenbildner. Sporenbildner sind in der Natur weit verbreitet und schliessen z.b. auch die filamentösen Actinomyceten und sämtliche Pilze ein. Die Bildung der Sporen setzt ein, sobald die vegetative Zellvermehrung durch Nährstoffmangel zum Stillstand kommt. Die Sporen können jahrelang an ihrem Standort verharren und erst wieder zu vegetativen Zellen auskeimen, wenn die Bedingungen für vegetatives Wachstum gegeben sind. Das Mikroskop und seine Anwendung in der Mikrobiologie Mikroorganismen können von blossem Auge nur dann wahrgenommen werden, wenn sie in sehr grosser Zahl auftreten. Klare Kulturflüssigkeiten zeigen erst bei einer Keimzahl grösser als etwa 10 6 /ml eine Trübung. Eine Kolonie auf einer Agarplatte, die gerade noch von blossem Auge sichtbar ist, dürfte etwa aus Zellen bestehen; d.h. eine einzelne Zelle auf der Agarplatte wird etwa nach 15 Teilungszyklen als Kolonie sichtbar. Lichtmikroskopie ermöglicht das Beobachten einzelner Mikroorganismen. Sehr leicht lassen sich verschiedene Zellformen erkennen, ebenso lassen sich die Dimensionen der betrachteten Mikroorganismen abschätzen. Strukturelle Einzelheiten sind hingegen im Lichtmikroskop kaum sichtbar. Auf das Vorhandensein von Geisseln kann zum Beispiel nur indirekt geschlossen werden: begeisselte Bakterien zeigen in der Regel gut sichtbare aktive Bewegung (vgl. Kap. 7; Versuch 4). Die zur Verfügung stehenden Lichtmikroskope sind mit Phasenkontrast ausgerüstet. Der Phasenkontrast ermöglicht das Betrachten von Mikroorganismen in ihrem Nativzustand. Auf früher übliche Methoden der Kontrastvergrösserung etwa durch Anfärben der Präparate kann somit heute weitgehend verzichtet werden.

28 5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK 27 Zellformen eukaryontischer Mikroorganismen (vgl. auch Kap. 11) Einzellige Pilze (Hefen): - bedeutend grösser als Bakterien - kugelige, elliptische oder längliche Formen - unbeweglich - Zellkerne und Vakuolen im Lichtmikroskop erkennbar - Asexuelle Vermehrung durch Sprossung, selten Querteilung (Schizosaccharomyces-Arten) Sprossung (z.b. Gattungen: Saccharomyces, Candida, Torulopsis) Querteilung: (Gattung: Schizosaccharomyces) Mehrzellige (filamentöse, myzelbildende) Pilze: - Die Differenzierung der Myzelbildner im Mikroskop ist schwierig (Myzelien sehen alle gleich aus) - Zellkerne und Vakuolen in Mycelfäden (Hyphen) meist sichtbar Achtung! Es gibt auch mycelbildende Prokaryonten, z.b. die Actinomyceten, die sich aber in den Dimensionen und in der fehlenden Zellkompartimente von den filamentösen Pilzen unterscheiden. Zellformen prokaryontischer Mikroorganismen Kokken: - kugelige Zellen, Durchmesser < 2 m - unbeweglich - Unterscheidung nach Zahl der Teilungsebenen Mikrokokken: meist einzelne Zellen, selten grössere Zellagglomerate. Diplokokken: meist 2er-Pakete, selten einzelne Zellen oder grössere Agglomerate.

29 5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK 28 Sarcinen: rhombisch angeordnete 4er-Pakete, selten andere Zellagglomerate. Streptokokken: häufig längere, kettenförmige Zellverbände. Es treten immer viele kurze Ketten zusammen mit einzelnen Zellen auf. Staphylokokken: häufig grössere Zellhaufen, es treten daneben aber immer Einzelzellen und kleine Zellhäufchen auf. Stäbchen: - grosse Variabilität des Längen/Breiten-Verhältnisses, Abmessungen: (0.2-1) x (1-5) m - gerade oder krumme Stäbchen (im Lichtmikroskop häufig nicht zu unterscheiden) - beweglich oder unbeweglich - Vermehrung durch Querteilung Kurze Stäbchen: neben Einzelzellen meist auch solche, welche sich gerade teilen Lange Stäbchen: neben Einzelzellen findet man häufig solche, welche noch zusammenhängen und so längere Ketten bilden.

30 5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK 29 Sporulierte Zellen Beispiele: Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis - charakteristische Lichtbrechung im Phasenkontrastmikroskop, erscheinen leuchtend hell. - kugelige oder längliche Form der Sporen, welche sich entweder noch in den Mutterzellen befinden oder diese teilweise oder ganz abgestossen haben. Seltenere Zellformen Bakterien zeigen eine grosse Formenvielfalt. Stäbchen und Kokken sind Grundformen, welche man sehr häufig antrifft. Es gibt daneben aber eine ganze Reihe Bakteriengattungen, deren Vertreter von sehr charakteristischer Form sind: Spirochaeten Gattungen: Treponema: Erreger von Syphilis Borrelia: Erreger von Lyme Disease Vibrionen Gattung: Vibrio z.b. Vibrio cholerae: Erreger der Cholera Keulenförmige Bakterien Gattung: Corynebacterium z.b. Corynebacterium diphteriae: Erreger der Diphterie (Keuchhusten) Gestielte Bakterien Gattung: Caulobacter Filamentöse, mehrzellige Bakterien Gattung: Streptomyces Bem.: Diese Bakterien vermehren sich wie die filamentösen Pilze durch Sporen.

31 5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK 30 Leitfaden zur Lichtmikroskopie Aufbau des Lichtmikroskops Okular Objektiv Objekttisch, Kreuztisch Kondensor mit Blende Grob- und Feintrieb Leuchtfeldblende Bedienung des Lichtmikroskops Mikroskope sind teure und empfindliche Geräte. Sie sind für die sorgfältige Behandlung des Kursmikroskops verantwortlich. Vermeiden Sie bitte bei der Handhabung starke Erschütterungen. Für die Arbeit orientieren Sie sich am folgenden Ablauf: 1. Mikroskopiebeleuchtung einschalten. 2. Objektiv mit kleinster Vergrösserung auswählen. 3. Präparat auf den Objekttisch einklemmen und ausrichten. 4. Das Objektiv durch Drehen des Grobtriebs unter Sichtkontrolle von der Seite unmittelbar über das Objekt bringen. 5. Durch das Okular schauen und langsam mit dem Grobtrieb den Abstand vergrössern (richtige Drehrichtung beachten!) bis das Objekt scharf wird. Am besten am Deckglasrand orientieren. 6. Zu Beginn werden gelegentlich Staubpartikel im Strahlengang des Mikroskopes mit dem Objekt verwechselt. Test: Wenn das Objekt auf dem Objekttisch bewegt wird, muss das auch im Mikroskop zu sehen sein. Bewegen sich die Partikel nicht, arbeitet man in der falschen Ebene. 7. Feintrieb zum genauen Scharfstellen benutzen. 8. Wenn das Objekt klar zu sehen ist, kann ohne Veränderung des Abstandes zum nächst stärkeren Objektiv gewechselt werden. Mikroskope sind so gebaut, dass die Fokussierung nahezu erhalten bleibt. 9. Die Oelimmersion wird zum Mikroskopieren fixierter Objekte verwendet. In diesem Fall geben Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl unmittelbar auf das Objekt und tauchen Sie das Immersionsobjektiv (und nur das!) vorsichtig ein. Den Abstand beim Drehen von der Seite kontrollieren. Das Objektiv darf nicht auf dem Objektträger aufsitzen, sondern sollte gerade nur in die Oelschicht eintauchen. Dann erst fokussieren Sie mit dem Feintrieb nach. Das Immersionsobjektiv muss nach Gebrauch mit Kleenex-Papier gereinigt werden. 10. Achten Sie strikt darauf, dass andere Objektive nie mit Immersionsöl in Berührung kommen. Das Oel löst den Kitt der Frontlinsen auf und beschädigt dadurch die Objektive irreversibel. 11. Linsen und Okulare mit eventuell leicht angefeuchtetem Kleenex-Papier reinigen. Vor allem eventuell an die Frontlinse gekommene Kulturreste oder Flüssigkeit bitte sofort und sorgfältig entfernen.

32 5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK 31 Lichtmikroskopie von Mikroorganismen a) Mikroorganismen in Flüssigkultur gewachsen: - Kultur mit Wasser so stark verdünnen, bis eine leicht trübe Suspension erhalten wird. - Einen kleinen Tropfen davon mit Pasteurpipette auf einen sauberen Objektträger geben. - Deckglas auflegen, sodass möglichst keine Luftblasen eingeschlossen werden. - Mit Kleenex-Tüchlein falls notwendig überschüssige Flüssigkeit absaugen (zwischen Objektträger und Deckglas soll lediglich ein dünner Wasserfilm liegen). - Das Präparat sofort im Phasenkontrastmikroskop untersuchen. b) Mikroorganismen auf Agarmedium gewachsen: - Einen kleinen Tropfen Wasser auf einen sauberen Objektträger geben. - Wenig Zellmaterial mit Zahnstocher oder Öse von der Platte wegkratzen und im Wassertropfen verreiben, bis eine leicht trübe, möglichst homogene Suspension entstanden ist. - Deckglas auflegen, sodass möglichst keine Luftblasen eingeschlossen werden. - Mit Kleenex-Tüchlein falls notwendig überschüssige Flüssigkeit absaugen. - Das Präparat sofort im Phasenkontrastmikroskop untersuchen. Frage 5.1: Wie kann man die gesamte Vergrösserung eines Mikroskops ausrechnen? ANTWORT: ANTWORT: 5.2. Einführung in die Diagnostik Die Bestimmung eines unbekannten Mikroorganismus ist aufwendig und nimmt viel Zeit in Anspruch, da man nicht, wie zum Beispiel bei Pflanzen, allein auf morphologische Kriterien abstellen kann. Aufgrund morphologischer Kriterien lässt sich allerdings meistens bereits beurteilen, ob es sich beim vorliegenden Mikroorganismus um einen Pilz oder um ein Bakterium handelt. Unter den Bakterien lässt sich im Lichtmikroskop zwischen Kokken, Stäbchen und Spirillen unterscheiden oder, sofern man ein geeignetes Nährmedium verwendet, sagen, ob der vorliegende Organismus zu den Sporenbildnern gehört. Ein sehr wichtiges taxonomisches Merkmal für Bakterien ist ihre Gram-Reaktion. Mit Hilfe der Gram-Färbung teilt man sämtliche Bakterien entweder in die Gruppe der Gram-negativen oder der Gram-positiven ein. Die nächsten Schritte in der Bestimmung umfassen das Prüfen von verschiedensten physiologischen und biochemischen Eigenschaften; z.b. Verwertung von Zuckern, Aminosäuren sowie diverser anderer Stoffe als C- oder N-Quellen, Gas- oder Säurebildung unter definierten Wachstumsbedingungen, die Fähigkeit anaerob zu wachsen, die Resistenz oder Empfindlichkeit gegenüber antibakteriellen Stoffen. Für Mikroorganismen, die in der Lebensmittelmikrobiologie oder vor allem in der Medizin eine wichtige Rolle spielen, werden von verschiedenen Firmen Testsysteme angeboten. Diese Systeme umfassen Wachstumstests auf verschiedensten Selektivnährböden, Enzym- und Antikörpertests.

33 5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK 32 In unserem Kurs wird mit einem solchen Testsystem, den Diagnostik-Tubes von Roche, gearbeitet. Die in den Testsystemen integrierten Agarmedien sind so konzipiert, dass mit minimalem Aufwand an Material und Zeit grössere Serien zeitgerecht durchgetestet werden können. Der Gebrauch dieser Diagnostik-Tubes garantiert allerdings nur dann korrekte Ergebnisse, wenn die folgenden Voraussetzungen erfüllt sind: - nur Reinkulturen testen - nur mit frischen Kulturen arbeiten - einen unbekannten Mikroorganismus erst dann auf Diagnostik-Tubes impfen, wenn alle vorgeschriebenen Vortests (z.b. Gramfärbung, Oxidasetest) durchgeführt wurden Diagnostikversuche Es werden mit Mikroorganismen bewachsene Agarplatten ausgeteilt, die mit Buchstaben gekennzeichnet sind. Auf jeder Platte soll der Mikroorganismus bestimmt werden. Wir gehen bei der Bestimmung nach der in den Tabellen 1 und 2 (am Ende dieses Kapitels) aufgeführten Reihenfolge vor. Die Resultate der Beobachtungen und der verschiedenen Tests sollen laufend in die Tabelle 3 (am Ende dieses Kapitels) eingetragen werden. Versuch 1: Makroskopische Beurteilung Von Auge werden die auf den Agarplatten gewachsenen Kolonien beurteilt. Man beachte vor allem eventuell vorhandene Mycelbildung sowie Farbe und Morphologie der Kolonien. Die Aussagekraft ist in der Regel gering. Versuch 2: Mikroskopische Beurteilung Von jeder Kultur wird ein Nativpräparat hergestellt. Zellform, Zellgrösse und das Vorhandensein von Zellkernen bzw. von Vakuolen wird beurteilt. Versuch 3: Gramfärbung und Wachstum auf MacConkey Agar Bekanntlich lassen sich Bakterien aufgrund der Beschaffenheit ihrer Zellwand in Gram-positive und Gram-negative einteilen. Die Gram-Färbung liefert in der Praxis nicht immer eindeutige Resultate, denn die Übergänge von rot zu violett sind häufig recht fliessend. Es ist daher unerlässlich, Referenzstämme mitzuführen. Die Gramfärbung muss immer mit jungen Kulturen, welche auf Vollmedium angezogen wurden, durchgeführt werden. Es ist wichtig, nicht zuviel Zellmaterial auf den Objektträger zu streichen, denn grössere Zellklumpen halten trotz gutem Waschen soviel Kristallviolett zurück, dass eine Kultur fälschlicherweise leicht als Gram-positiv klassiert wird. In der medizinischen Mikroorganismen-Diagnostik nimmt die Gramfärbung noch immer eine zentrale Stellung ein. Vielfach wird jedoch durch geeignete Isolationsverfahren direkt für Gram-negative Bakterien selektioniert. Diese Verfahren beinhalten einen Schritt, bei welchem auf MacConkey Agar No. 3 plattiert wird. Dieser Agar ist streng selektiv für Gram-negative Organismen, d.h. alle Bakterien, welche auf diesem Agar wachsen können sind Gram-negativ. Es müssen jedoch nicht alle Bakterien,

34 5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK 33 welche auf dem MacConkey Agar No. 3 nicht wachsen, unbedingt Gram-positiv sein. Einige Arten der Gram-negativen Gattungen Moraxella, Pseudomonas, Flavobacterium und Pasteurella wachsen nicht auf MacConkey Agar. Lösungen und Material: Kristallviolett Lugol sche Lösung A: 2.0 g Kristallviolett in 20 ml Ethanol 1.0 g Iod B: 0.8 g Ammoniumoxalat in 80 ml H 2 0 dest. 2.0 g Kaliumjodid A + B zusammengeben 100 ml H 2 O dest. Safraninlösung 2.5 g Safranin, gelöst in 100 ml Ethanol 95%ig, (Stocklösung). Von der Stocklösung 10ml in 100 ml H 2 0 dest. aufnehmen. 1 MacConkey No. 3 Agarplatte Vorgehen: Mit jenen Organismen, welche im Mikroskop als Bakterien erkannt wurden, wird die Gramfärbung durchgeführt: 1. Zellmaterial aus einer frischen Bakterienkultur wird mit der Öse oder mit einem Zahnstocher auf einem sauberen Objektträger mit wenig Wasser verstrichen. 2. Der Ausstrich wird luftgetrocknet Minute mit Kristallviolett färben. 4. Waschen mit Wasser. 5. Ausstrich 1 Minute mit Lugol'scher Lösung beizen. 6. Präparat vorsichtig mit Alkohol-Aceton (1 : 1) Lösung waschen. 7. Sofort mit indirektem Wasserstrahl waschen Sekunden mit Safranin gegenfärben. 9. Waschen mit indirektem Wasserstrahl. 10. Ausstrich lufttrocknen. 11. Im Mikroskop unter Hellfeld-Einstellung, 100xObjektiv (Immersionsöl) betrachten. 12. Gram-negative erscheinen rötlich, Gram-positive sind blau-violett. Es können Gram-positive und Gram-negative Organismen auf dem gleichen Objekträger und sogar als Mischsuspension gefärbt werden. Die ausgeteilte MacConkey Agarplatte wird in Zonen eingeteilt. Jede dieser Zonen wird mit wenig Zellmaterial einer Bakterienkultur beimpft. Nach h Inkubation bei 37 C kann die Auswertung erfolgen. MacConkey Agar, der unter anderem Gallensalze enthält, erlaubt nur Wachstum von Gramnegativen Keimen.

35 5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK 34 Versuch 4: Der Oxidasetest Wie aus Tabelle 5.2 hervorgeht, nimmt der Oxidasetest bei der Differenzierung der Gram-negativen Bakterien eine zentrale Stellung ein. Mit diesem recht einfachen Test wird geprüft, ob das zu untersuchende Bakterium Cytochrom vom c-typus besitzt oder nicht. Die Energiegewinnung durch Atmung ist für Eukaryonten, wo sich dieser Vorgang in den Mitochondrien abspielt, sehr gut untersucht worden. In den Mitochondrien findet man immer gleichzeitig Cytochrom vom a-, b- und c-typus. Prokaryotische Zellen besitzen keine Mitochondrien. Das Funktionieren der Atmungskette gewährleisten hier unter anderem Enzyme und Elektronenträger, die sich von jenen der Eukaryonten unterscheiden. Der Cytochrom c-nachweis im Oxidasetest wird mit N,N,N,N -Tetramethyl-p-phenylendiamin durchgeführt. Das Redoxpotential dieses leicht oxidierbaren Reagens liegt gerade so, dass es seine Elektronen mit hoher Effizienz an Cytochrom c abgeben kann. Das so oxidierte Reagens ist im Gegensatz zur reduzierten Ausgangsform kräftig blau. Zur Reaktion: 1. Schritt H 3 C H 3 C N N CH 3 CH 3 H 3 C H 3 C N N CH 3 CH e- farblos blau 2. Schritt Cytochrom c (oxidiert) + 2 e - Cytochrom c (reduziert) Vorgehen: Der Oxidasetest wird mit den Gram-negativen Bakterienkulturen wie folgt durchgeführt: Ein Filterpapier wird leicht angefeuchtet. Dann wird eine Impföse mit Bakterienmaterial auf den Filter auftragen. Ein Tropfen Reagens wird auf die Bakterien gegeben. Tiefe Blaufärbung in 10 sec = positive Reaktion. Versuch 5: Differenzierung der Gram-negativen, Oxidase-positiven Bakterien Mit dem "Oxi/Ferm-Tube" wird der Gram-negative, Oxidase-positive Bakterienstamm beimpft (siehe Tabelle 5.2) und bei 37 C inkubiert. Die Auswertung erfolgt nach 24 Stunden. Versuch 6: Differenzierung der Gram-negativen, Oxidase-negativen Bakterien Im nächsten Schritt werden Enterotubes mit dem Oxidase-negativen Bakterienstamm beimpft und bei 37 C inkubiert. Die Auswertung erfolgt nach 24 Stunden.

36 5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK 35 Tabelle 5.1: VORGEHEN BEI DER BESTIMMUNG EINES UNBEKANNTEN AEROBEN MIKROORGANISMUS Herstellen einer Reinkultur mycelbildende Pilze makroskopische Beurteilung: Mycelbildung? JA NEIN Actinomyceten (Strahlenpilze) = Bakterien mikroskopische Beurteilung: Vermehrung durch Sprossung bzw Teilung? Grosse, kompartimentierte Zellen? JA Spross- bzw Spalthefen NEIN Sporenbildung? JA Bacillus-Arten NEIN Gram-Färbung durchführen. Färbung? NEIN JA gram-positive Bakterien Zellformen / verschiedene Selektiv-Agars Gram-negative Bakterien (weiteres Vorgehen: Tabelle 5.2) 2) Bacillen, Corynebakterien, Kokkenförmige, Milchsäurebakterien, Propionibakterien

37 5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK 36 Tabelle 5.2: BESTIMMUNG VON GRAM-NEGATIVEN, AEROBEN BAKTERIEN Kolonien auf Universal- (1) oder MacConkey-Agar (2) Oxidase-Test (3) + - Beimpfung von Oxi/Ferm-Tube (4) Beimpfung von Entero-Tube (5) Anaerobe Dextrosereaktion + - Dextrosereaktion Aeromonas-Spezies Plesiomonas-Spezies Vibrio-Spezies Flavobacterium-Spezies Pseudomonas-Spezies Pseudomonas aeruginosa Moraxella-Spezies Alcaligenes-Spezies Achromobacter-Spezies Bordatella bronchiseptica Pasteurella-Spezies + - Enterobacteriaceae Pseudomonas maltophilia Pseudomonas mallei Acinetobacter anitratus (Herellea) Acinetobacter lwoffii (Mima) (1) z.b. Bact-Plate ST Roche mit anschliessender Gram-Färbung. (2) z.b. Bact-Plate MC Roche zur Isolierung gram-negativer Keime. Einige Arten der Gattung Moraxella, Pseudomonas, Flavobacterium und Pasteurella wachsen nicht auf MacConkey-Agar. (3) Oxidasereagens Roche. (4) Gebrauchsfertige Bunte Reihe zur Identifizierung von gram-negativen, aeroben Bakterien (5) Gebrauchsfertige Bunte Reihe zur Identifizierung der Enterobacteriaceae.

38 5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK 37 Tabelle 5.3: ZUSAMMENFASSUNG DER RESULTATE AUS DEN DIAGNOSTIK-VERSUCHEN Stamm Morphologie Morphologie Gram- Wachstum Oxidase- Bestimmt als: makroskopisch: mikroskopisch: Färbung auf Test Wachstum, Zellform, Grösse, MacConkey- Kolonieform Beweglichkeit Agar A B C D E F G H

39 6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE 6.1. Antibiotika und Chemotherapeutika Einführung Unter den vielen Mikroorganismen gibt es eine relativ geringe Zahl, die pathogene Eigenschaften gegenüber Mensch, Tier oder Pflanzen besitzen. Ihre Bedeutung in der medizinischen Mikrobiologie und in der Phytomedizin nimmt einen hohen Stellenwert ein. Mit den Antibiotika und Chemotherapeutika verfügt man über antimikrobielle Wirkstoffe, die zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten eingesetzt werden können. Die Basis bilden die Antibiotika, die von Mikroorganismen produziert werden. Chemotherapeutika sind synthetische Verbindungen mit antimikrobiellen Eigenschaften, wobei der Übergang zu den Antibiotika fliessend ist, da eine Reihe von Antibiotika chemisch modifiziert werden, um ihre Wirkung zu erhöhen oder zu stabilisieren. Die meisten Mikroorganismen, die Antibiotika als Sekundärmetaboliten ausscheiden, gehören zur Gruppe der Aspergillales (Pilze), zu den Actinomyceten und zu einigen anderen Bakterien. Tausende von antimikrobiellen Wirkstoffen sind untersucht worden. Für therapeutische Anwendungen eigenen sich aber nur wenige Verbindungen. Trotzdem verfügt die Medizin über eine Palette von Antibiotika und Chemotherapeutika, um durch Bakterien und Pilze verursachte Infektionen zu bekämpfen. Dosierung und Dauer der Therapie sind so zu wählen, dass die Infektionserreger alle abgetötet werden. Bei einer nur teilweisen Elimination des Krankheitserregers kann es zur Resistenzbildung kommen. Mikroorganismen, die an ihren Standorten im Ökosystem Antibiotika produzieren, haben einen wichtigen Vorteil, indem sie andere Organismen in der Entwicklung hemmen oder gar blockieren. Daraus resultiert eine erhöhte Verfügbarkeit von Nährstoffen. Bedingung ist allerdings, dass die Antibiotikaproduzenten gegenüber ihren eigenen Wirkstoffen unempfindlich sind. Hier liegt der Ursprung der Resistenz, indem die betreffenden Gene auf andere Mikroorganismen übertragen werden können. Die Resistenz gegenüber Antibiotika und Chemotherapeutika ist zu einem Hauptproblem der Medizin geworden. Die Mehrzahl der Resistenzen sind plasmidcodiert und werden leicht von dem einen auf den anderen Mikroorganismus übertragen. Die plasmidbedingten Antibiotikaresistenzen beruhen auf chemischer Modifikation des antimikrobiellen Wirkstoffes. So wird zum Beispiel Chloramphenicol acetyliert oder Penicillin wird durch Penicillinase gespalten. Eine Anhäufung von resistenten Mikroorganismen ist insbesondere in Spitälern zu finden. Im Kurs wird die Wirkung einiger Antibiotika und Chemotherapeutika untersucht. Auf den folgenden beiden Seiten sind die Wirkstoffe, mit welchen gearbeitet wird, dargestellt. Neben den Antibiotikas und Chemotherapeutikas gibt es eine Reihe weiterer, antimikrobieller Wirkstoffe; als Beispiel werden im Kurs Gewürze und tierische (menschliche) Sekrete auf ihre antimikrobielle Wirkung getestet. In letzterem Fall beruht die Wirkung auf einem Enzym, dem Lysozym, das das Murein in der Zellwand von Bakterien spalten kann.

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42 6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE 41 Kanamycin und Derivate Aminoglykosid-Antibiotikum mit breitem Wirkungsspektrum gegen Bakterien. Wird in der Humanmedizin vor allem zur lokalen Behandlung von bakteriellen Augeninfektionen eingesetzt. Bindet an die 30S Untereinheit des bakteriellen Ribosoms und hemmt so die Proteinbiosynthese. Bestimmte Derivate wie Geneticin (G418) hemmen auch die eukaryontische Proteinbiosynthese. Kanamycin wird vom Actinomyceten Streptomyces kanamyceticus synthetisiert. Versuch 1: Pilze als Antibiotika-Produzenten Das erste industriell produzierte Antibiotikum, Penicillin, wurde 1928 durch Zufall von Alexander Fleming entdeckt und läutete ein neues Zeitalter in der Bekämpfung von bakteriellen Infektionskrankheiten ein. Fleming erhielt 1945 für seine Entdeckung den Nobelpreis in Medizin. Penicillin wird nicht von Bakterien sondern vom Pinselschimmel (filamentöser Pilz, siehe Kap. 11), Penicillium chrysogenum (notatum), produziert. In diesem Versuch soll die Penicillin-Produktion durch Penicillium chrysogenum (notatum) anhand der Wirkung auf das Wachstum von E. coli demonstriert werden. Material: - 1 LBG-Agarplatte mit Penicillium chrysogenum - 1 Reagenzröhrchen mit 7 ml LBG-Weichagarmedium (im Wasserbad) - Eppendorfröhrchen mit Ampicillin-Stocklösung (100 mg/ml) - Sterile Filterrondellen - Flüssigkultur von E. coli (gram-negativ) Ausführung Wie in Versuch l Bakterien in Weichagarmedium auf die Agarplatte verteilen. 2 Filterdisks mit 20 l H 2 O bzw. Ampicillin bestücken und mit steriler Pinzette gemäss untenstehendem Schema auf die Platten legen. Platte 2 Tage bei 30 C inkubieren. Auswertung: Zeichne in untenstehendem Schema die erhaltenen Hemmhöfe ein.

43 6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE 42 FRAGEN 6.1: Weshalb sind wohl gerade filamentöse Mikroorganismen (Streptomyceten, Pilze) so bedeutende Antibiotikaproduzenten? ANTWORT: Versuch 2: Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration von zwei Antibiotika In Reagenzgläsern, die Komplexmedium enthalten, werden Verdünnungsreihen mit 2 verschiedenen Antibiotika vorbereitet. Diese werden nun mit B. subtilis (Gram-positiv) angeimpft und bei 30 C inkubiert. Röhrchen, bei denen die Antibiotikum-Konzentration zu gering ist, um den Organismus abzutöten, werden nach einigen Stunden trüb, d.h. Bakterien können sich noch vermehren. Ist die Konzentration jedoch so gross, dass der Organismus abstirbt, bleibt das Röhrchen klar. Die minimale Hemmkonzentration ist dann bei dem Reagenzglas zu finden, das gerade keine Trübung mehr zeigt. Material: - 2 Antibiotika-Stammlösungen (Konzentration) Streptomycin (6,25 mg/ml) Chloramphenicol (0,1 mg/ml) - 11 kurze, sterile Reagenzgläser - Flüssigkultur von B. subtilis - Schottflaschen mit LBG-Flüssigmedium aus Versuch 1.1 Ausführung: Sterile Reagenzgläser mit je 4 ml LBG-Flüssigmedium bestücken. 1 ml Antibiotika-Stammlösung in Reagenzglas (RG) 1 geben, dann eine 4-Schritt-Verdünnung durchführen gemäss untenstehendem Schema d.h. 1 ml aus RG 1 in RG 2 transferieren. Mit dem Vortex gut mischen. Dann 1 ml aus RG 2 in RG 3 geben usw. Bei 2 Antibiotika gibt das 10 Röhrchen, die je 4 ml Flüssigkeit enthalten.

44 6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE 43 Wichtig: Vor dem Beginn des Versuchs sind sämtliche Röhrchen mit der notwendigen Information (Verdünnung, Antibiotikum) zu beschriften inkl. eines Röhrchens ohne Antibiotikum als Kontrolle (K). Verdünnungsschema 0 Antibiotikas tammlösung 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml K enthalten je 4 ml Medium Verdünnung en: Kontrolle 1:5 1:25 1:125 1:625 1:3125 Nach der Verdünnungsreihe alle Röhrchen mit 1 Tropfen (50 l) Bakterienkultur animpfen. Als Kontrolle wird ein Röhrchen mit der entsprechenden Bakterienkultur ohne Antibiotikum beimpft. Nach 24 h Inkubation bei Raumtemperatur lassen sich die Trübungsgrenzen leicht von Auge feststellen. Auswertung: Mit Hilfe der nachstehenden Tabelle sind die minimalen Hemmkonzentrationen zu ermitteln. Konzentrationstabelle (Beachten Sie die verschiedenen Konzentrationen der Stammlösungen): Reagenzglas Nr. Antibiotikum 0 = Stammlösung Konz. und Einheiten 1 1:5 2 1:25 3 1: : :3'125 Streptomycin 6250 µg/ml 1' Chloramphenicol 100 µg/ml Wachstum: + = Wachstum, - = kein Wachstum

45 6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE 44 B. subtilis (Gram-positiv) Reagenzglas Antibiotikum K Streptomycin Chloramphenicol Versuch 3: Unterschiedliche Empfindlichkeit von gram-positiven und gramnegativen Bakterien sowie Bäckerhefe gegenüber einer Auswahl von Antibiotika Der unterschiedliche Zellaufbau von gram-positiven und gram-negativen Bakterien sowie von Hefe ist verantwortlich für die unterschiedliche Empfindlichkeit dieser Organismen gegenüber bestimmten Antibiotika. Dieser Unterschied soll an den Organismen B. subtilis (gram-positiv), E. coli (gramnegativ) und S. cerevisiae (Bäckerhefe) und den Antibiotikas Polymyxin B, Erythromycin und Geneticin (G418) demonstriert werden. Material: - 2 LBG-Agarplatten - 1 YPD-Agarplatte - 2 Reagenzröhrchen mit 7 ml LBG-Weichagar - 1 Reagenzröhrchen mit 7 ml YPD-Weichagar - Flüssigkulturen von B. subtilis, E. coli und S. cerevisiae - Sterile Filterrondellen - steriles H 2 O - Stocklösungen von Polymyxin B (0.15 mg/ml in H 2 O), Erythromycin (1 mg/ml in EtOH) und G418 (50 mg/ml in H 2 O) Vorgehen: Je 100 l Bakterien- bzw. Hefesuspension in Weichagar auf die 3 Agarplatten verteilen - für die Bakterien LBG, für die Hefe YPD verwenden. Je 4 Filterdisks mit 20 l H 2 O, Polymyxin B (PB), Erythromycin (Em) bzw. G418 bestücken und mit steriler Pinzette gemäss untenstehendem Schema auf die Platten legen. Platten 2 Tage bei 30 C inkubieren. Auswertung: Zeichne in untenstehendem Schema die Hemmhöfe ein. Erkläre aufgrund der in der Einleitung beschriebenen Wirkstoffe die erhaltenen Resultate:

46 6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE 45 H 2 O PB H 2 O PB H 2 O PB Em G418 Em G418 Em G418 E. coli B. subtilis S. cerevisiae FRAGE 6.2: Welches der drei getesteten Antibiotika kann wohl für die Behandlung von mikrobiellen Infektionen beim Menschen nicht eingesetzt werden und warum? ANTWORT: Versuch 4: Sulfonamid-Versuch Bei der Behandlung von bakteriell verursachten Krankheiten spielen neben den Antibiotika die Sulfonamide eine wichtige Rolle. Sulfonamide (eingeführt um 1935) werden im Gegensatz zu den Antibiotika rein synthetisch hergestellt. Ihre Wirkungsweise beruht auf der Strukturähnlichkeit mit der p-aminobenzoesäure (PABA), die von Mikroorganismen für die Synthese von Tetrahydrofolsäure (THF) benötigt wird. Dabei verdrängen die Sulfonamide das natürliche Substrat PABA von der aktiven Stelle der Dihydropteroat-Synthese (kompetitive Hemmung) und verhindern so die Bildung von Dihydropteroat. Diese Hemmung kann durch einen Überschuss von PABA aufgehoben werden (Darstellung auf übernachster nächste Seite). Da, wie zu erwarten, Resistenz gegen Sulfonamide auftritt, wurde ein weitere Hemmstoff der THF- Synthese eingeführt, um die bakterizide Wirkung zu verstärken und die Entwicklung von resistenten Keimen zu erschweren. Dies gelang mit Trimethoprim, einem spezifischen Hemmstoff der bakteriellen Dihydrofolsäure-Reduktase. Beide Wirkstoffe sind im Medikament "Bactrim" (Roche) vereinigt, wobei Sulfomethoxazol die Sulfonamidkomponente ist. Die Wirkungen der beiden Komponenten potenzieren sich, d.h. ihr Effekt ist mehr als additiv (Synergismus). Sulfonamide üben auf menschliche Zellen nur eine geringe Wirkung aus, da diese THF nicht synthetisieren können, sondern auf die Zufuhr von Folsäure angewiesen sind. Bei längerer Behandlung durch "Bactrim" kann Folsäuremangel auftreten, da ein grosser Teil der vom Menschen aufgenommenen Folsäure von den Darmbakterien produziert wird. Mit Hilfe des Disktests soll Folgendes geprüft werden: - bakterizider Effekt von Sulfomethoxazol, Trimethoprim und Bactrim - Synergismus der beiden Komponenten von Bactrim - Antagonismus von p-aminobenzoesäure

47 6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE 46 Dazu werden kleine Scheiben, imprägniert mit den Chemotherapeutika und p-aminobenzoesäure, auf Agar gelegt, der mit einem Bakterium beimpft wurde. Die Empfindlichkeit kann anhand der Hemmzonen abgelesen werden. Material: - E. coli-flüssigkultur (LB-Vollmedium) - 3 Petrischalen mit Minimalmedium (MME) für E.coli - 3 Reagenzgläser mit je 7 ml MME-Weichagar - Filterrondellen mit Sulfomethoxazol (RL), Trimethoprim (W) und Bactrim (SXT) - p-aminobenzoesäure (PABA) 0.1 mg/ml (steril) - sterile Filterrondellen Vorgehen: µl der Bakteriensuspension (vor Gebrauch schütteln) steril in das Röhrchen mit flüssigem Weichagar (auf 55 C erwärmt) geben - Weichagar auf MME-Platte giessen, Platten sofort leicht schwenken und erstarren lassen - Sterile Filterrondellen mit 20 µl p-aminobenzoesäure-lösung bestücken und Rondellen mit abgeflammter Pinzette auf Bakterienagar legen (vgl. Skizze) - Platte bei 37 C über Nacht inkubieren Auswertung: Zeichne die beobachteten Hemmhöfe in der unteren Abbildung ein. Wie äussern sich der Synergismus und der Antagonismus im Hemmhoftest? Platte 1: Sulfomethoxazol (RL) und p-aminobenzosäure (PABA) Platte 2: Trimethoprim (W) PABA W RL Platte 3: Bactrim (SXT) SXT

48 6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE 47 FRAGE 6.3: Worauf beruht die Spezifität der Sulfonamide d.h. warum wirken Sulfonamide nur auf bakterielle und nicht auch menschliche Zellen? ANTWORT:

49 6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE Antimikrobielle Pflanzeninhaltsstoffe und bakterielle Botenstoffe Versuch 5: Antimikrobielle Wirkung von Senf und Knoblauch Nicht nur Antibiotika und Chemotherapeutika, sondern auch Bestandteile von Gewürzen habenantimikrobielle Wirkung. Es ist kein Zufall, dass in Küchen von Ländern, die klimatisch (warm, feucht) dem Wachstum von Mikroorganismen (und gewissen Gewürzen) entgegenkommen - Beispiele sind die Türkei, Indien und Thailand - der Gebrauch von scharfen Gewürzen viel verbreiteter ist als in der mittel und nordeuropäischen Küche. Gewürze mit nachgewiesener antimikrobieller Wirkung sind etwa Senf, Knoblauch, Chilischoten und Gewürznelken. Es wird vermutet, dass sekundäre Pflanzenstoffe wie Phenole, Flavonoide und Carotinoide dabei eine Rolle spielen. Die Inhaltsstoffe greifen die mikrobielle Cytoplasmamembran an und stören so den Stoffaustausch der Zelle mit der Umgebung. Im folgenden Versuch soll die antimikrobielle Wirkung von Senf und Knoblauch demonstriert werden. Material: (pro 2er Gruppe) - leere Petrischale - 2 LBG-Agarplatten, 1 YPD-Agarplatte - 2 Röhrchen mit LBG-Weichagar, 1 Röhrchen mit YPD-Weichagar - E. coli-, B. subtilis- und S. cerevisiae-flüssigkulturen - frischer Knoblauch - Senf aus der Tube (scharf) - Knoblauchpresse - Pasteurpipetten Vorgehen: - Der bei 60 C flüssig gehaltene LBG- bzw. YPD-Weichagar wird mit 100 l Flüssigkultur von E. coli oder B. subtilis bzw. S. cerevisiae (vor Entnahme auf Vortex resuspendieren) versetzt, auf Vortex gut gemischt, auf die (temperierte) LBG- bzw. YPD-Agarplatte gegossen und durch Kreisen der Platte auf der Arbeitsfläche gleichmässig verteilt. Die Platten werde zum Erstarren des Weichagars beiseite gestellt. - Die Knoblauchzehen werden mit der Knoblauchpresse in die leere Petrischale zerdrückt. - Mit dem hinteren Ende einer Pasteurpipette (zwischen verschiedenen Platten wechseln oder kurz abflammen) werden in jede der 3 Platten zwei Löcher gestanzt. Dieses wird mittels einer sterilisierten Pinzette mit zerdrücktem Knoblauch bzw. Senf aus der Tube gefüllt. - Die Platte wird über Nacht bei 30 C inkubiert. Auswertung: Eine klare Zone um das mit Senf oder Knoblauch gefüllte Loch auf dem ansonsten durch das Wachstum der Mikroorganismen getrübten Weichagar zeigt die Anwesenheit von antimikrobiellen Substanzen an. Zeichne die erhaltenen Hemmhöfe in untenstehendem Schema ein:

50 6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE 49 Versuch 6: Quorum Sensing von Bakterien Gram-negative und gram-positive Bakterien der gleichen und sogar von verschiedenen Arten können über chemische Botenstoffe miteinander kommunizieren. Man nennt diese Art der Kommunikation "Quorum sensing", da die Antwort der Bakterien auf diese Botenstoffe von der Konzentration der Botenstoffe im Medium und somit von der Zahl der Botenstoff-sekretierenden Zellen abhängt. Über Quorum Sensing regulierte bakterielle Phänomene sind u.a. Bioluminiszenz, Virulenz, Konjugation, Transfer von mobiler DNA, Antibiotika-Synthese oder Biofilmbildung. Da die Pathogenizität von Bakterien oft mit Biofilmbildung gekoppelt ist (was die Bekämpfung mit Antibiotikas erschwert) verspricht man sich für die Bekämpfung von Bakterien einiges von einem kombinierten Einsatz von Antibiotika mit Substanzen (z.b. aus Knoblauch), die mit dem Quorum Sensing der pathogenen Bakterien interferieren. In einem einfachen Experiment demonstrieren wir die Kommunikation zwischen zwei verschiedenen Arten von gram-negativen Bakterien, Serratia liquefaciens und Chromobacterium violaceum, die dieselbe chemische Sprache sprechen. Die Kommunikation wird sichtbar über die Quorum Sensingabhängige Bildung eines violetten Pigments (Violacein) im verwendeten Chromobacterium violaceum- Stamm, der seinerseits in der Bildung des eigenen Quorum Sensing Botenstoffs (Acyl-Homoserin- Lacton, AHL) defekt ist. Material pro 2er-Gruppe: - 1 LBG Agar Platte - Platte mit Serratia liquefaciens - Platte mit Chromobacterium violaceum Vorgehen: C. violaceum Zellen werden entsprechend dem untenstehenden Schema auf einer LBG Platte dicht beieinander liegend ausgestrichen. S. liquefaciens wird anschliessend im 90 Winkel bis zum C.

51 6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE 50 violaceum Ausstrich aufgetragen, so dass sich die beiden Ausstriche beinahe berühren. Die Zellen werden mehrere Tage bei RT inkubiert. S. liquefaciens C. violaceum Auswertung: Zeichne die beobachtete Region der Verfärbung von C. violaceum in obigem Schema ein. FRAGE 6.4: Warum ist es wichtig, dass im Experiment ein C. violaceum Stamm verwendet wird, der in der AHL-Bildung defekt ist? ANTWORT: 6.3. Antimikrobielle Enzyme Einführung Lysozym (Muramidase) ist ein weit verbreitetes Enzym, welches das in Bakterienzellwänden enthaltene Murein auflöst. Lysozym lässt sich auch in Geweben und Sekreten des menschlichen Körpers nachweisen (Tränen, Nasenschleimhaut, Speichel, Urin, Muttermilch). Lysozym kommt in Pflanzen vor, und kann auch von Bakterien z.b. nach Infektion mit Phagen produziert werden. Besonders reichlich ist Lysozym in Hühnereiweiss vorhanden. Sequenz und dreidimensionale Struktur des Enzyms, das aus 129 Aminosäuren besteht, sind bekannt. Das Mucopolysaccarid Murein ist das Stützskelett der Bakterienzellwand. Viele Gram-positive Bakterien, bei welchen das Mureinnetz mehrschichtig vorliegt und den Hauptbestandteil der Zellwand bildet, werden in hypotonischen Medien durch Lysozym allein aufgelöst. Nach Lysozymeinwirkung, die den Abbau der Zellwand zur Folge hat, schwellen die nackten Zellen (Protoplasten) an, bis sie platzen. Nur in iso- und hypertonischer Umgebung sind die kugeligen Protoplasten stabil.

52 6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE 51 Bei Gram-negativen Bakterien macht das Murein bekanntlich nur einen geringen Teil der Zellwand aus, wobei Lipoproteine und Lipopolysaccharide die äusseren Schichten bilden. Lyse ist bei Gramnegativen Bakterien, z.b. Escherichia coli, somit nur bedingt möglich. N-Acetyl-Glucosamin (NAG) wirkt als Inhibitor von Lysozym. Es handelt sich um eine kompetitive Hemmung. NAG wird an derselben Stelle gebunden wie das Substrat Murein, hat jedoch keine hydrolysierbare Bindung. Versuch 7: Nachweis von Lysozym-Aktivität Material: Tränenflüssigkeit, Speichel, Hühnereiweiss 6 kurze RG mit 0.9 ml Pufferlösung (Natriumphosphatpuffer, 0.1 M, ph 6.0) Micrococcus luteus (Gram-positiv)-Suspension als Indikatorbakterium (2.0 mg/ml) Vorgehen: - Tränenflüssigkeit, Speichel oder Hühnereiweiss nach untenstehendem Schema verdünnen (1 Röhrchen als Nullkontrolle ohne Lysozymquelle). Tränen durch Zerhacken von Zwiebeln erzeugen. 3 Tropfen Tränen entsprechen ca. 0.1 ml. Eiweiss nach Aufbrechen des Eis in Petrischale geben und mit Pipette, die eine genügend grosse Öffnung aufweist, 0.1 ml aufnehmen. Die Öffnung von Pipettenspitzen lässt sich durch Abschneiden mit einer Schere vergrössern. - Zu allen 6 Röhrchen 0.1 ml Micrococcus luteus (Gram-positiv)-Suspension geben - Nach 60 min auf Raumtemperatur bestimmen, bei welchen Verdünnungen das Röhrchen klar wird, d.h. eine Lyse stattfindet. Arbeitsschema: RG1 RG2 RG3 RG4 RG5 + RG0 (Nullkontrolle ohne Antibiotikum)

53 6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE 52 Auswertung: Schätze aufgrund der Resultate in der Grossgruppe den relativen Lysozymgehalt der 3 Quellen: Quelle Lysozymgehalt (+++ / ++ / +) Tränenflüssigkeit Speichel Hühnereiweiss Frage 6.5: Warum wirkt Lysozym auch auf stationäre Zellen und Penicillin nur auf wachsende Zellen? ANTWORT: Persönliche Notizen:

54 7. MIKROBIELLE GENETIK MIKROBIELLE GENETIK Einführung Die Weitergabe von genetischer Information an die Nachkommen im Rahmen der Vermehrung eines Organismus bezeichnet man als vertikalen Gentransfer ( Vererbung ). Eukaryontische Organismen wie z.b. die zu den Mikroorganismen gehörenden Pilze (siehe Kap. 10) - rekombinieren im Rahmen der sexuellen Vermehrung ihr ganzes Genom und die Individuen zeichnen sich deshalb durch eine grosse genetische Variabilität aus. Bei den sich durch mitotische Zellteilung (asexuelle Vermehrung) vermehrenden Prokaryonten wird die Erbinformation in der Regel unverändert an die nächste Generation weitergegeben. Zusätzlich zum vertikalen Gentransfer kann genetische Information auch zwischen Individuen derselben Generation einer bestimmten Art oder sogar zwischen Individuen unterschiedlicher Arten ausgetauscht werden (horizontaler Gentransfer). Bei Bakterien lassen sich dabei drei verschiedene Übertragungsmechanismen unterscheiden: Konjugation, Transformation und Transduktion. Bei all diesen Mechanismen ist es für die Vererbung an die nächste Generation entscheidend, dass die transferierte DNA in der Empfängerzelle repliziert wird z.b. indem die DNA als episomales genetisches Element (Plasmid) mit eigenem Replikationsursprung vorliegt oder durch Rekombination ins Wirtschromosom integriert wird. Konjugation, R- und F-Plasmide Der zunehmende Einsatz von Antibiotika seit den 50er Jahren zog eine fast ebenso rasche Verbreitung von bakteriellen Resistenzen nach sich. Als Resistenz-Transfer-Faktoren wurden so genannte Resistenz (R)-Plasmide (z.b. RP4, welches Resistenzen gegenüber Ampicillin, Tetrazyklin und Kanamycin vermittelt) identifiziert. Solche Plasmide, deren Wirtsspektrum oft sehr breit ist, werden mittels direktem Zell/Zell-Kontakt (bakterielle Paarung oder Konjugation) von einem Bakterium an ein nächstes weitergegeben. Die genetische Information, welche die Wirtszelle benötigt, um sich mit einer Empfängerzelle zu paaren und das Plasmid zu übertragen, wird von R-Plasmiden kodiert. Da lediglich eine Kopie des Plasmids auf die Empfängerzelle übertragen wird und das Original in der Spenderzelle verbleibt, kann auf diese Weise eine rasche Verbreitung der genetischen Information erfolgen. Die homologen Fertilitäts (F)-Plasmide tragen in der Regel Plasmidtransfer- aber keine Antibiotikaresistenzgene. Transformation, Kompetenz Die Übertragung von freier DNS auf eine Empfängerzelle wird als Transformation bezeichnet. Falls die aufgenommene DNS der Empfängerzelle einen Selektionsvorteil verschafft, wird die genetische Information entweder in Form eines Plasmids (nach einer Plasmid-Transformation) an die nachfolgende Generation weitergegeben oder durch Rekombination in das Genom der Empfängerzelle eingebaut. Die Entstehung stabiler Rekombinanten hängt von verschiedenen Faktoren ab. Einerseits muss die Empfängerzelle die Fähigkeit zur Aufnahme und Integration von DNS besitzen (Kompetenz). Andererseits müssen die transformierenden DNS-Stücke als Doppelstrang vorliegen, da denaturierte (einzelsträngige) DNS von den Zellen nicht aufgenommen wird. Zudem muss die aufgenommene DNS gegen Restriktionsenzyme geschützt sein. Diese Enzyme bauen fremde, nicht spezifisch methylierte

55 7. MIKROBIELLE GENETIK 54 und damit ungeschützte DNS ab. Die Methylierung der DNS ist in allen Bakteriengattungen verschieden, weshalb die Transformation nur zwischen genetisch verwandten Stämmen überhaupt möglich ist. Im Labor werden für die in vitro DNS-Transformation Bedingungen so optimiert, dass eine möglichst hohe Transformationsfrequenz erreicht wird. Restriktion, Rekombination Dringt fremde DNS in eine Bakterienzelle ein, werden zwei antagonistische Zellsysteme aktiviert: Restriktion und Rekombination. Um die eigene DNS von fremder DNS unterscheiden zu können, modifiziert das Restriktionssystem die zelleigene DNS durch Methylierung nach einem spezifischen Muster. DNS mit einem anderen Methylierungsmuster wird vom Restriktionsapparat als fremd erkannt und durch Restriktionsenzyme zerschnitten. Andererseits kann fremde DNS der Zelle möglicherweise einen Selektionsvorteil verschaffen. In einem solchen Fall kann durch das Rekombinationssystem der Zelle fremde DNS ins eigene Genom eingebaut werden. Bevorzugt wird dabei DNS, die der eigenen möglichst ähnlich in Bezug auf Sequenz und Methylierungsmuster aussieht. Transduktion, Phagen Die Übertragung von DNS aus einer Spender- in eine Empfängerzelle durch Bakteriophagen (Bakterien-Viren) wird als Transduktion bezeichnet. Vermehrt ein infiziertes Bakterium A einen Phagen, so kann versehentlich bakterielle statt Phagen-DNS in die Proteinhülle eines neuen Phagen- Partikels verpackt werden. Solche Phagen sind nach wie vor infektiös, da die Infektiosität durch die Phagen-Proteine bestimmt wird. Die Infektion eines Bakteriums B führt aber nicht zu dessen Lyse, da die dazu notwendige genetische Information von den Phagen nicht mitgeführt wird. Stattdessen findet ein horizontaler Transfer von DNS von Bakterium A ins Bakterium B statt. Verschiedene Typen der Transduktion werden unterschieden. Bei generalisierter Transduktion wird jedes bakterielle DNS-Stück mit derselben (wenn auch geringen) Häufigkeit übertragen. In einem System mit spezifischer Transduktion hingegen überträgt ein Phage nur bakterielle Gene, welche sich unmittelbar neben der Integrationsstelle der Phagen-DNS im Wirtschromosom befinden. Wird die Phagen-DNS beim Übergang vom temperenten in den virulenten Zustand nicht korrekt aus dem bakteriellen Chromosom ausgeschnitten, gelangt dann ein Stück chromosomale DNS des Wirtsbakteriums zusammen mit einem Teil der Phagen-DNS in die Proteinhülle der neuen Phagenpartikel. Erfolgt bei der Transduktion die Übertragung von mehr als einem Gen, spricht man von Cotransduktion. Weil durch die vorgegebene Grösse der Proteinhülle eines funktionellen Phagen nur relativ kleine DNS-Stücke verpackt werden können, gibt die Frequenz der Cotransduktion zweier Gene Aufschluss über deren Abstand auf dem bakteriellen Chromosom. IS-Elemente, Transposons IS-Elemente (insertion sequences) sind kurze DNS-Stücke, die im Erbmaterial herumhüpfen können. Sie bestehen im wesentlichen aus der genetischen Information, die es diesen Elementen erlaubt, sich selbst auszuschneiden oder zu kopieren und sich an einer anderen Stelle des Genoms (oder in ein Plasmid) wieder einzubauen. Häufig bilden zwei IS-Elemente zusammen mit einem dazwischenliegenden Strukturgen ein so genanntes Transposon. Solche mobile genetische Elemente

56 7. MIKROBIELLE GENETIK 55 erleichtern somit den Genaustausch zwischen Chromosom und Plasmiden. Vermittelt ein Transposon eine nützliche Eigenschaft, z.b. eine Antibiotika- oder Schwermetall-Resistenz, kann es sich über einen der oben vorgestellten Mechanismen schnell verbreiten. Versuche Versuch 1: Kreuzung von Bäckerhefe Einleitung: Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, auch Bier- oder Weinhefe genannt, hat sich in der Grundlagenforschung vor allem aufgrund ihrer Genetik als eukaryontischer Modellorganismus mit Pioniercharakter etabliert. So wurde zum Beispiel 1996 das Hefegenom als erstes eukaryontisches Genom vollständig sequenziert. Eine sehr praktische genetische Eigenschaft von S. cerevisiae ist ihr haplo-diploider Lebenszyklus, d.h. ihre Fähigkeit, sich sowohl im haploiden als auch im diploiden Zustand asexuell (durch Sprossung) zu vermehren (siehe Abb. 7.1). Die stabile Diplophase ist vor allem bei der Charakterisierung von Mutanten (Komplementationsanalyse) von Vorteil. Hefe besitzt zwei Paarungstypen ( MATing types ), a und alpha, und Paarung (Plasmo- und Karyogamie) findet nur zwischen Individuen mit unterschiedlichem Paarungstyp statt. Abb. 7.1: Haplo-diploider Lebenszyklus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

57 7. MIKROBIELLE GENETIK 56 Ziel: Demonstration der Komplementation von Gendefekten durch entsprechende Wildtyp-Gene des Paarungspartners im diploiden Zustand sowie die Abhängigkeit der Kreuzung vom Paarungstyp der Bäckerhefe. Zum besseren Verständnis einige Bemerkungen zur Nomenklatur des Hefegenoms: Hefegene werden mit einem Code aus 3 Buchstaben und einer Zahl bezeichnet. Dabei wurde folgendes vereinbart: ABC1 = Wildtyp(aktives)-Gen abc1 = mutiertes(inaktives) Gen Beispiele sind: HIS1, HIS3 = Gene für zwei unterschiedliche Enzyme der Histidinbiosynthese LEU2 = Gen für ein bestimmtes Enzym der Leucinbiosynthese URA3 = Gen für ein bestimmtes Enzym der Uracilbiosynthese MET15 = Gen für ein bestimmtes Enzym der Methioninbiosynthese LYS2 = Gen für ein bestimmtes Enzym der Lysinbiosynthese Material: Pro Zweiergruppe: - 1 YPD-Platte (Hefe-Komplettmedium) mit den folgenden 4 Hefestämmen: 14 (DC14): MATa his1 HIS3 LEU2 URA3 MET15 LYS2 17 (DC17): MATalpha his1 HIS3 LEU2 URA3 MET15 LYS2 41 (BY4741): MATa HIS1 his3 leu2 ura3 met15 LYS2 42 (BY4742): MATalpha HIS1 his3 leu2 ura3 MET15 lys2-1 leere YPD-Platte - 2 leere Hefe-Minimalmedium-Platten (MV-Platten) Vorgehen: 1. Auf der leeren YPD-Platte werden mit der Oese oder sterilen Zahnstochern alle 6 möglichen Kreuzungen der 4 Hefestämme angesetzt (Kreuzungen K1 bis K6; siehe Schema). 2. Nach 1-2h Kreuzung unter dem Mikroskop durch Suche nach fusionierten Hefezellen überprüfen. 3. Inkubation der Platte für insgesamt 5 Stunden bei Raumtemperatur. 4. Die 6 Kreuzungen sowie die 4 Ausgangsstämme in Sektoren auf den zwei MV-Platten ausstreichen. Wenig Material auf ganzer Fläche des Sektors ausstreichen! 5. Inkubation der Platten für 2 Tage bei 30 C. Auswertung: - Für welche beiden Kombinationen beobachten Sie klares Wachstum auf MV? - Werden bei gewissen Kombinationen unerwarteterweise einzelne Kolonien beobachtet? Wie könnten diese Kolonien zustandekommen?

58 7. MIKROBIELLE GENETIK 57 Versuch 2: Konjugation von Escherichia coli Einleitung: Die Genübertragung durch Konjugation ist bei Escherichia coli entdeckt worden und unter Enterobakterien sehr häufig. Die Fähigkeit zur Genübertragung in E. coli ist abhängig vom einem extrachromosomalen Element (Plasmid), dem sogenannten Fertilitäts (F)-Plasmid. Das F-Plasmid enthält die für den Konjugationsvorgang nötige Gene z.b. die Gene für die sogenannten F-Pili - die Oberflächenstrukturen, über die die DNA-Uebertragung stattfindet (vgl. Abb. 7.2 links). Normalerweise wird nur das F-Plasmid selber und keine chromosomale DNA übertragen. Zur Uebertragung chromosomaler DNA kommt es nach Integration des F-Plasmides ins Bakterienchromosom. Bei der Konjugation solcher high frequency of recombination (Hfr)-Zellen kommt es mit grosser Häufigkeit zur Rekombination der übertragenen chromosomalen DNA der Donorzelle mit der chromosomalen DNA der Empfängerzelle. Die Uebertragung der chromosomalen DNA erfolgt dabei als rolling circle und wird bestimmt durch den Integrationsort und die Orientierung des integrierten F-Plasmides im Chromosom (H, P801, P4X etc. in Abb. 7.2 rechts). Die Uebertragung beginnt am Ort des integrierten F-Plasmides entgegengesetzt zu dessen Orientierung d.h. im Falle von Hfr H werden zuerst die thr- und leu-biosynthesegene übertragen. Da die Geschwindigkeit der Uebertragung konstant ist, lassen sich Genloci über die Zeit für den Eintritt in die Empfängerzelle kartieren. Die Uebertragung des ganzen Chromosoms dauert ca. 100 min. (vgl. Abb.

59 7. MIKROBIELLE GENETIK rechts). Die thr- und leu-biosynthesegene in Hfr H werden somit innerhalb der ersten 10 min. übertragen. Ziel: Die Uebertragung chromosomaler DNA durch Konjugation soll mittels Rekombination von chromosomalen Markern der E. coli -Stämme CGSC#259 (HfrH thi-1) und CGSC#7541 (F - leub6 thr- 1 StrR thi-1) demonstriert werden. BEMERKUNG: thi-1, leub6 und thr-1 zeigen Auxotrophien der entsprechenden Stämme für Thiamin, Leucin bzw. Threonin an; StrR zeigt eine Resistenz des entsprechenden Stammes gegen Streptomycin an. Material: Pro Grossgruppe: - Frische Uebernachtkulturen der beiden E. coli-stämme in Vollmedium (LBG) Pro 2er-Gruppe: - 2 Reagenzglasröhrchen mit je 5 ml LBG-Flüssigmedium - 4 Agarplatten E. coli-minimalmedium (MME) mit 50 mg/l Streptomycin (und 1mM Thiamin, da beide Stämme Thiamin-auxotroph sind) - Petrischalen mit Ethanol und Drigalsky-Spatel zum Plattieren Vorgehen: l der Übernachtkultur wird in 5 ml LBG-Medium (50x) verdünnt und 2 h 30 min. bei 37 C geschüttelt. 2. In einem Eppendorfgefässen werden je 50 l des Hfr-Stamms wird mit 950 l des F - -Stammes gemischt und 30 min bei 37 C ohne zu Schütteln inkubiert. 3. Je 100 l des Gemisches und der beiden Paarungspartner werden in sterilen Eppendorfgefässen abzentrifugiert (5 min. max. Drehzahl). 4. Die Zellen werden in 250 l sterilem Wasser auf dem Vortex resuspendiert. 5. Von dem Gemisch wird eine 1:10 Verdünnung in 250 μl sterilem Wasser hergestellt und diese sowie die 3 unverdünnten Bakteriensuspensionen (Donor, Rezipient und Konjugationsanatz) mittels Drigalsky-Spatel auf je eine MME Str Thi-Agarplatte verteilt. 6. Die Platten werden übers Wochenende bei 30 C inkubiert. Auswertung: Stamm CGSC#259 CGSC#7541 CGSC#259 x 7541 Koloniezahl per 100 l

60 7. MIKROBIELLE GENETIK 59 Abb. 7.2: Konjugation in E. coli (aus Schlegel, Allg. Mikrobiologie) Links: Elektronenmikroskopische Aufnahme von konjugierenden E. coli-zellen mit F-Pili. Rechts: Genkarte des zirkulären E. coli- Chromosoms (Einheit: min.) mit Integrationsort und Orientierung des F-Plasmides in unterschiedlichen Hfr-Stämmen (beschriftete Pfeile innerhalb des Kreises). Man beachte die relative Lage des F- Plasmides in HfrH (H) zu den thr und leu-genen um 0 min. Versuch 3: Transformation von Bacillus subtilis mit Plasmid-DNA Bacillus subtilis ist ein Gram-positives Bodenbakterium, welches die Fähigkeit hat sich als Endospore vor extremen Umweltbedingungen zu schützen. B. subtilis wurde bis vor kurzem als obligat aerober Organismus betrachtet, neuere Untersuchungen zeigten jedoch, dass es auch unter anaeroben Bedingungen leben kann. Kompetenz ist die Fähigkeit einer Zelle DNS aus der Umgebung aufzunehmen. Dabei wird zwischen natürlicher und induzierter Kompetenz unterschieden. Induzierte Kompetenz wird zum Beispiel benutzt, um E. coli Zellen zur Aufnahme von DNS zu zwingen. Dies wird erreicht, in dem die Zellmembran so behandelt wird, dass sie kurzzeitig für DNS permeabel ist. Natürliche Kompetenz wird in ca. 40 Bakterienarten beobachtet, die durch alle taxonomischen Gruppen verteilt sind. In den meisten Spezies ist die natürliche Kompetenz ein transienter Zustand, der durch verschiedene Signale induziert werden kann, z. B. Nährstoffmangel oder Quorum sensing. Unter Laborbedingungen kann die natürliche Kompetenz durch Nährstofflimitierungen oder unwirtliche Wachstumsbedingungen induziert werden. Die spezifischen Signale, sowohl als auch die regulierenden Mechanismen sind noch weitgehend unbekannt. Beobachtungen deuten jedoch darauf hin, dass unter Bedingungen, welche die Bildung von Endosporen fördern, häufig auch Kompetenz beobachtet wird.

61 7. MIKROBIELLE GENETIK 60 Ziel des Experimentes In diesem Experiment benutzen wir einen B. subtilis Stamm, um seine natürliche Kompetenz zu testen. Dazu benützen wir ein selbstreplizierendes Plasmid, welches eine Chloramphenicol Resistenz beinhaltet. Um zu verifizieren, dass die verwendete DNS das transformierende Prinzip ist, führen wir verschiedene Kontrollen durch. Die DNS wird z.b. in ansteigenden Mengen angeboten, was zu einer Zunahme der Transformationseffizienz führen sollte. Vorgehen: Neben der eigentlichen Transformation des Bakteriums mit Plasmid-DNS in unterschiedlichen Mengen (Ansätze P10, P1 und P0) werden folgende Kontrollen durchgeführt: Ansatz D: DNase-Verdau Bei diesem Ansatz wird deshalb die Plasmid-DNS mittels des Enzyms DNase I in ihre Bausteine, die Nukleotide, zerlegt. Dadurch wird die genetische Information des Plasmids zerstört. Ansatz K: Kontrolle der Sterilität der Plasmid-DNS-Lösung Die Plasmid-DNS-Präparation wird ohne Bakterienzugabe ausgestrichen. Damit wird überprüft, dass die Plasmid-DNS-Lösung frei von Bakterien ist, welche auf LB-Agar Platten mit Chloramphenicol wachsen und somit das Resultat des Transformationsexperiments beeinflussen würden. Material: Pro Zweiergruppe: - 5 LBG-Agarplatten supplementiert mit 5 mg/l Chloramphenicol - 1 Eppendorf-Tube mit dem replikativen Plasmid phps9 (100 ng/μl, auf Eis) - 1 Eppendorf-Tube mit sterilem ddh 2 O (auf Eis) - Drigalsky-Spatel, Wanne mit 70%-igem Ethanol Pro grosse Gruppe: - 1 Eppendorf-Tube mit DNase I-Lösung (10 U/ml in Puffer, auf Eis) - 1 Flüssigkultur (LB-Vollmedium) B. subtilis - Schottflasche mit Medium I (viel Stickstoff) - Schottflasche mit Medium II (wenig Stickstoff) - Heizblock, eingestellt auf 37 C Durchführung: Der Versuch soll in Zweiergruppen durchgeführt werden. Vorgehen: 1. Inokulation von 2 ml Medium I mit 200 μl Vorkultur (durch Assistenten) 2. Inkubation für 5 Stunden bei 200 rpm, 37 C

62 7. MIKROBIELLE GENETIK Ansätze gemäss folgendem Pipettierschema vorbereiten. Für jeden einzelnen Pipettierschritt eine neue sterile Pipettenspitze verwenden! Replikatives Plasmid phps9 P 10 P 1 P 0 D K DNA 10 μl 1 μl 0 10 μl 10 μl H μl 10 μl μl DNase μl 0 4. Ansatz D: 15 Minuten bei Raumtemperatur stehenlassen 5. 1 ml Vorkultur zu 4 ml Medium II (in Falconröhrchen) zugeben, mischen. 6. Bei allen Ansätzen ausser K 500 μl der verdünnten Kultur zugeben. 7. Zellen bei 37 C und 100 rpm für 90 Minuten inkubieren. 8. Zellen der Ansätze durch kurzes Zentrifugieren pelletieren (max. rpm für 2 Minuten), 350 ul des Überstands abnehmen und Pellets in den verbleibenden 150 ul Flüssigkeit resuspendieren. Anschliessend die 5 Ansätze auf die entsprechend beschrifteten Platten mit Drigalsky-Spatel ausplattieren; die Platten für mind. 2 Tage bei 37 C in der Feuchtkammer inkubieren. Auswertung: Anzahl Kolonien P 10 P 1 P 0 D K Versuch 4: Generalisierte Transduktion Transduktion einer Transposoninsertion in den Genen flighi von Salmonella typhimurium Salmonellen sind Gram-negative, motile Stäbchen der Gattung Enterobacteriaceae. Sie gehören zu den häufigsten Erregern von gastrointestinalen Erkrankungen weltweit. Salmonella typhimurium besitzt eine Reihe von Virulenzfaktoren. Zu den wichtigsten zählen zwei spezialisierte Protein- Sekretionssysteme (Typ III Sekretionssysteme), die zur Invasion in Epithelzellen und für das Überleben in Phagozyten dienen. Daneben besitzen Salmonellen Flagellen, die ebenfalls zu ihrer Virulenz beitragen (Penetration der intestialen Schleimschicht, Invasion in Epithelzellen, Adhäsion). Die etwa 25 Flagellenkomponenten sind in mehreren Operons kodiert, die über das Salmonellengenom verteilt sind. Die Biosynthese wird durch einen komplexen Regulationsmechanismus gesteuert. Die Flagellen bestehen aus 3 Abschnitten: 1. Dem Basalkörper, der das Flagellum in der Cytoplasmamembran und in der Zellwand verankert. 2. Dem Haken, der den Basalkörper mit dem Flagellum verbindet.

63 7. MIKROBIELLE GENETIK Dem Flagellum. Die Mutation nur eines Flagellengens führt in den meisten Fällen zum vollständigen Verlust der Motilität. Abb. 7.3: Struktur eines Flagellums von Salmonella. In diesem Experiment soll durch generalisierte Transduktion mittels des Salmonella spezifischen Phagen P22 eine Mutation der Flagellengene flighi transduziert werden und der Verlust der Beweglichkeit der Transduktanten nachgewiesen werden. Die Mutation der Flagellengene flighi liegt in einem Stamm als Transposoninsertion (mit Tetracyclinresistenz als Marker) vor. Abb.7. 4: Genregion, in die das Tn10 Transposon integriert wurde und welche durch Phagentransduktion mutiert werden soll (Massstab in bp). P22 ist ein lysogener, lambdoider Phage, dessen Integrase deletiert wurde, so dass er die Bakterien lytisch infiziert. Zudem trägt er eine Mutation, durch die er in erhöhtem Masse bakterielle genomische DNA bei der Lyse des Bakteriums verpackt ( generelle Transduktion ). In der Salmonellen-Genetik dient P22 als Werkzeug, um Mutationen, die mit genetischen Markern (Antibiotikaresistenzen) gekoppelt sind, sehr effizient von Stamm zu Stamm zu übertragen.

64 7. MIKROBIELLE GENETIK 63 Material: Pro Zweiergruppe: - P22 Phagenlysat, das auf dem Salmonellenstamm SB245 gezogen wurde, welcher die Mutation in den Flagellengenen trägt (flighi::tn10). - Flüssigkultur (LB-Vollmedium) mit dem Empfängerstamm M557: Salmonellen mit intaktem Flagellenapparat - 3 LBG-Tet-Platten mit Tetrazyklin (LBG-Agar, supplemetiert mit Tetrazyklin [12 g/ml]) - Drigalsky-Spatel - Motility-Agar Platte - Platte mit Salmonellenstamm M557 (am Auswertungstag) Durchführung: Der Versuch soll in Zweiergruppen durchgeführt werden. Vorgehen: l des bereitgestellten P22-Phagenlysats (flighi::tn10) werden mit 100 l der Übernachtkultur des Empfängerstamms (S. typhimurium M557) in einem Eppendorfgefäss gemischt. 2. Inkubation bei 37 C, 15 min (ohne Schütteln!) 3. Von dem Transduktionsansatz wird eine 1:10 und eine 1:100 Verdünnung hergestellt. Hierzu werden in 2 Eppendorfgefässen jeweils 90 l H 2 O vorgelegt. Dann gibt man in das erste Eppendorfgefäss 10 l des Transduktionsansatzes, vortext diesen kurz und gibt 10 l der 1:10 Verdünnung in das 2. Eppendorfgefäss. 4. Von dem Transduktionsansatz und den 1:10 und 1:1 00 Verdünnungen werden jeweils 50 l auf LBG-Tet-Platten ausplattiert und bei 37 über Nacht inkubiert. Auswertung: Die erhaltenen Transduktanten werden auf ihre Beweglichkeit getestet: Mittels Motility-Agar: Bei Motility-Agar-Platten handelt es sich um LBG-Platten, die sich von gewöhnlichen LBG-Platten dadurch unterscheiden, dass sie weniger Agar enthalten (0.3 % statt normal 1.5 %). Aufgrund der verringerten Menge Agar können sich motile Bakterien im Agar fortbewegen ( Schwimmen ). Die Bewegung ist durch Hofbildung leicht erkennbar. Je eine Kolonie des Empfängerstamms und des transduzierten Stamms werden mittels einer gelben Spitze von der Platte genommen und in einem Eppendorfröhrchen mit 10 l sterilem Wasser resuspendiert. Je 5 μl der Zellsuspension werden auf eine Motility-Agar aufgetropft. Die Platten werden bei 37 C inkubiert und nach mindestens 4 6 h auf Hofbildung überprüft. Wichtig: Da die Motility-Agar-Platten sehr wenig Agar enthalten, dürfen sie zum Inkubieren nicht auf den Kopf gedreht werden!

65 7. MIKROBIELLE GENETIK 64 FRAGE 7.1: Welche Mechanismen, neben Sexualität und horizontalem Gentransfer, tragen ebenfalls zur genetischen Variabiliät bei? Sind diese Mechanismen bei Mikroorganismen relevant? ANTWORT: FRAGE 7.2: Kennen Sie aus der Vorlesung ein System, das den horizontalen Gentransfer bei Bakterien einschränkt? Was könnte der Sinn eines solchen Systems sein? ANTWORT: Persönliche Notizen:

66 8. IMMUNABWEHR GEGEN BAKTERIEN IMMUNABWEHR GEGEN BAKTERIEN Einführung Infektionen von Säugetieren mit Mikroben (Bakterien, Pilze, Viren, Parasiten) lösen eine adaptive Immunantwort ( erworbene Immunität ) aus, die grob in zwei Äste aufgeteilt werden kann: i) Die zelluläre Immunantwort für die T Zellen verantwortlich sind und ii) die humorale Immunantwort, welche durch B Zellen vermittelt wird. Die humorale Immunantwort beinhaltet die Produktion von Mikroben-spezifischen Antikörpern (auch Immunoglobuline genannt, Ig) welche an die Mikroben binden und im optimalen Fall diese mit der Hilfe von anderen Komponenten des Immunsystems neutralisieren. Es existieren verschiedene Ig Isotypen: IgM ist der dominante Isotyp während der frühen Immunantwort. IgG ist der prominenteste Isotyp im Blut. IgA ist besonders in der Mukosa wichtig und IgE ist massgeblich involviert an der Immunantwort gegen Parasiten und in Allergien. Naive B Zellen erkennen Mikroben mittels dem B Zell Rezeptor. Diese Bindung führt zur Aktivierung der B Zellen und der Internalisierung von mikrobiellen Antigenen. Die B Zellen prozessieren daraufhin die aufgenommenen Antigene und präsentieren sie auf MHC class II Molekülen den CD4 + T Helfer Zellen. Falls die T Zellen spezifisch für das gleiche Antigen sind - ein Prozess der als linked recognition bezeichnet wird - können sie wiederum die B Zellen stimulieren und deren weitere Differenzierung auslösen. Nach mehreren Zellteilungen können die B Zellen schliesslich zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen oder langlebigen memory B Zellen differenzieren (Abb. 1). Abb. 1: Auslösung einer anti-mikrobiellen humoralen Immunantwort (aus: Janeway, Travers, Walport, and Shlomchik Immunobiology. 6th edition. Garland Science Publishing, New York) Naive B Zellen exprimieren IgM (und IgD) auf der Zelloberfläche und IgM ist der erste Isotyp der bei der Aktivierung von naiven B Zellen sekretiert wird. Das erste Auftreten von messbaren Pathogenspezifischen Antikörpern wird als Serokonversion bezeichnet. Bei zahlreichen Infektionskrankheiten wird die Serokonversion als definitiver diagnostischer Nachweis benutzt. Wir werden in diesem Kapitel die Serokonversion bzw. die Produktion von Pathogen-spezifischem IgG in Mäusen nachweisen, welche mit Legionella pneumophila (Lpn) infiziert wurden. IgM wird als Pentamer aus 5 IgM Monomeren sekretiert, welche durch eine J Kette zusammengehalten werden. Diese Pentamere sind sehr gross und können daher nicht in Gewebe eindringen. Andere Immunoglobulin Isotypen sind kleiner und können daher leichter in die mit Blut versorgten Gewebe eindringen. IgM tritt kurz nach dem ersten Kontakt mit Antigen auf und dominiert die initiale Antwort,

67 8. IMMUNABWEHR GEGEN BAKTERIEN 66 wird jedoch danach bald schwächer. Um andere Isotypen als IgM zu produzieren müssen B Zellen den Prozess des isotype class switching durchlaufen. Um class switching machen zu können, müssen die B Zellen mit T Helfer Zellen interagieren, welche das gleiche Antigen erkennen. IgG (und teilweise IgA) ist der dominante Isotype in späteren Phasen und bei memory Antworten. Die Mehrzahl der anti-mikrobiellen Antikörper sind gegen repetitive Strukturen und zahlreich vorhanden Makromoleküle auf der Oberfläche von Mikroben gerichtet. So sind zum Beispiel Antikörper welche bei Infektion mit gram-negativen Bakterien wie Legionellen induziert werden grösstenteils spezifisch für Lipopolysaccharide. Mikrobenstämme die antigenisch eng verwandt sind bilden sogenannte Serogruppen, und die zugehörigen Stämme sind generell vom gleichen Serotypen (oder Serovar). Polyklonale Antikörper (z.b. im Serum) welche spezifisch für einen bestimmten Serotyp einer Mikrobenspezies sind erkennen auch andere Stämme vom gleichen Serotyp dieser Spezie, jedoch nicht andere Serotypen (auch wenn die Mikroben der gleichen Spezies angehören). Experimente Versuch 1: Nachweis von anti-legionella pneumophila Antikörpern Einführung: Infektion mit Legionella pneumophila (Lpn) ist die Ursache einer potenziell tödlichen Form der Lungenentzündung welche als Legionärskrankheit bezeichnet wird. Durch Inhalation von kontaminierten Aerosolen gelangen die Bakterien in die Lunge und können dort alveoläre Makrophagen infizieren und darin replizieren. Die massive intrazelluläre Vermehrung der Bakterien, die Entzündung und die resultierende Einwanderung einer grossen Zahl von Immunzellen in die Lunge kann im betroffenen Wirten zu einer schweren Lungenentzündung führen. Primäre Legionellen-Infektionen werden durch die Abwehrmechanismen des angeborene Immunsystems kontrolliert und beseitigt. Die Infektion löst jedoch auch eine erworbene (adaptive) Immunantwort aus, so zum Beispiel CD4 + T Helfer Zellen und Antikörper. Diese erworbene Immunität schützt mittels spezifischer Antikörper in der Zirkulation und einer schnellen sekundären Immunantwort ( memory ) unmittelbar vor einer erneuten Infektion mit Legionellen. Ziel: Wir werden einen indirekten ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) durchführen um Lpnspezifische Antikörper zu detektieren und den Serotypen von Lpn JR32 zu bestimmen. Mäuse wurden zwei Mal mit cfu Lpn intravenös immunisiert und nach 30 Tagen Serumproben genommen. Um Lpn-spezifische Antikörper in diesen Seren nachzuweisen werden ELISA-Platten benutzt, die mit Gentamicin-getöteten Lpn Serotypen 1 und 6, und Salmonella typhimurium (Sm) beschichtet wurden (Die Immunisierungen, Abnahme der Seren und das Beschichten & Blockieren der ELISA-Platten werden von den Praktikums-Assistenten vorgängig durchgeführt). Die in den Seren enthaltenen anti- Lpn Antikörper binden daraufhin an die Bakterien, mit denen die ELISA-Platten beschichtet wurden. Ungebundene (unspezifische) Antikörper werden anschliessend weggewaschen und die gebundenen

68 8. IMMUNABWEHR GEGEN BAKTERIEN 67 Antikörper mit einem sekundären, horseradish peroxidase (HRPO)-markierten Antikörper detektiert. Nach einem erneuten Waschschritt wird schliesslich das chromogene HRPO-Substrat ABTS (2,2'- azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) und H 2 O 2 zu den Wells gegeben. HRPO katalysiert die Reaktion von ABTS mit H 2 O 2 in ein grünes Produkt (Abb. 2). Wells, die mit Lpn vom gleichen Serotypen wie Lpn JR32 beschichtet sind (d.h. dem Stamm, der für die Immunisierung benutzt wurde) und zu denen Immun-Serum geben wurde können danach einfach an der grünen Farbe erkannt werden. Sm-beschichtete Wells und Wells zu denen naives Serum gegeben wurde, dienen als Kontrollen. 2 ABTS + H 2 O 2 + 2H + 2 ABTS + +2 H 2 O Abb. 2: Reaktion von 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonsäure) (ABTS) mit H 2 O 2. Die Reaktion wird durch HRPO katalysiert. Material: Pro 2 Studenten: - 1 ELISA-Platte; geblockt, beschichtet mit Gentamicin-getöteten Lpn Serotyp 1 und 6, und Sm - ELISA Wash Buffer (1 Spritzflasche, 0.5 l): 0.05% Tween 20 in PBS - ELISA Blocking Buffer (1 Falcon Röhrchen): 1% bovines Serumalbumin in PBS - 1 snap cap Röhrchen (5 ml, Polystyren) - Serum von Lpn JR32-immunisierten Mäusen (1 Eppendorf Röhrchen); 1:250 verwenden - Serum von naiven Mäusen (1 Eppendorf Röhrchen); 1:250 verwenden - Ziege anti-maus Antikörper, HRPO-markiert (1 Eppendorf Röhrchen); 1:250 verwenden - ABTS Lösung (4 ml in snap cap Röhrchen): 0.02% (w/v) 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonsäure - H 2 O 2, 30% Lösung (1 Eppendorf Röhrchen) Vorgehen: 1. Platten waschen: Der Überstand aus der beschichteten und blockierten ELISA-Platte in den Abguss abschütten. Dann mit der Spritzflasche vorsichtig alle beschichteten Wells (A7-H9, siehe Abb. 3) mit Wash Buffer füllen. Den Wash Buffer wieder abschütten und den Waschvorgang zwei Mal wiederholen. Bevor mit dem nächsten Schritt weitergefahren wird, sollten alle Wells (A7-H9) mit Wash Buffer gefüllt werden. 2. Die beiden Seren (naiv und Lpn JR32-immun) in zwei separaten Eppendorf Röhrchen 1:250 in Blocking Buffer verdünnen und gut mischen. Es werden 100 µl/well der verdünnten Seren für

69 8. IMMUNABWEHR GEGEN BAKTERIEN Wells benötigt. Um genügend Volumen zu haben (inkl. Reserve), sollte genügend verdünntes Serum für 14 Wells vorbereitet werden. 3. Wash Buffer abschütten (in Abguss) und die umgekehrte ELISA-Platte auf Haushaltspapier blotten. Danach 100 µl des verdünnten Serums von naiven Mäusen in Wells A7-9, C7-9, E7-9, und G7-9 pipettieren, und 100 µl des verdünnten Serums von Lpn JR32-immunisierten Mäusen in Wells B7-9, D7-9, F7-9, und H7-9 pipettieren (siehe Abb. 3). Danach bei Raumtemperatur mindestens 1 Stunde inkubieren. 4. Platten wie in Schritt 1 waschen (über Abguss): Den Waschvorgang drei Mal wiederholen. Bevor mit dem nächsten Schritt weitergefahren wird, sollten alle Wells (A7-H9) mit Wash Buffer gefüllt werden. 5. Der HRPO-markierte sekundäre Antikörper (Ziege anti-maus) wird 1:250 in Blocking Buffer verdünnt (5 ml snap cap Röhrchen verwenden) und gut gemischt. Es werden 100 µl/well des verdünnten Antikörpers für 24 Wells benötigt. Um genügend Volumen zu haben (inkl. Reserve), sollte genügend verdünnter Antikörper für 28 Wells vorbereitet werden. 6. Wash Buffer abschütten (in Abguss) und die umgekehrte ELISA-Platte auf Haushaltspapier blotten. Danach 100 µl des verdünnten Antikörpers in jedes Well pipettieren (A7-H9). Danach bei Raumtemperatur mindestens 1 Stunde inkubieren. 7. Platten wie in Schritt 1 waschen (über Abguss): Den Waschvorgang 5 Mal wiederholen. Bevor mit dem nächsten Schritt weitergefahren wird, sollten alle Wells (A7-H9) mit Wash Buffer gefüllt werden µl H 2 O 2 zu 4 ml ABTS geben und gut mischen. Wash Buffer abschütten (in Abguss) und die umgekehrte ELISA-Platte auf Haushaltspapier blotten. Danach 100 µl ABTS/H 2 O 2 in jedes Well pipettieren (A7-H9). Bei Raumtemperatur für ~30 Minuten inkubieren und Farbumschlag beobachten (neutral zu grün). Abb 3: Ladeschema der ELISA-Platte.

70 8. IMMUNABWEHR GEGEN BAKTERIEN 69 Auswertung: Zeichne in Abb. 3 ein, in welchen Wells eine Färbung beobachtet wird und beantworte folgende Fragen: - Welches ist der Serotyp des für die Immunisierung verwendeten L. pneumophila (Lpn) Stammes JR32? - Ist eine Kreuzreaktion des Serums mit Salmonella typhimurium (Sm) erkennbar? Persönliche Notizen:

71 9. MIKROBIELLER LEBENSRAUM PHYLLOSPÄRE DIE PHYLLOSPHÄRE ALS MIKROBIELLER LEBENSRAUM Einführung Bei Landpflanzen wird im Hinblick auf die Besiedelung durch Mikroorganismen oft zwischen dem unterirdischen Teil der Pflanze, der Rhizosphäre, und dem oberirdischen Teil, der Phyllosphäre, unterschieden. Die von Mikroorganismen besiedelte Blattoberfläche stellt mit 6.4 x 10 8 km 2 einen enormen Lebensraum für Mikroorganismen dar. Zum Vergleich: das Festland nimmt auf der Erdoberfläche 1.5 x 10 8 km 2 ein. Die Blattoberflächen der Pflanzen werden von etwa Bakterienzellen/cm 2 besiedelt. Das Blatt wird aber nicht nur auf seiner Oberfläche von diesen epiphytisch lebenden Mirkoorganismen besiedelt, sondern auch von Endophyten, welche im Inneren des Blattes, dem Apoplasten, leben oder sogar bis ins Xylem vordringen können. Zu den häufigen Kolonisierern der Phyllosphäre zählen zahlreiche Vertreter der Gram-negativen Proteobakterien, so die Gattungen Pseudomonas und Methylobacterium. Aber auch Gram-positive Bakterien wie Bacillus wurden häufig nachgewiesen. Darüber hinaus werden Blätter von filamentösen Pilzen, Hefen, Algen und manchmal von Protozoen und Nematoden besiedelt, allerdings in geringerem Ausmass. Die Gattung Methylobacterium Die Gattung Methylobacterium zeichnet sich durch pinkfarbige Pigmentierung (Carotinoide) und einen fakultativ methylotrophen Stoffwechsel aus. Der Begriff methylotroph umschreibt die Fähigkeit, auf Substraten ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Verbindung zu wachsen. Methylotrophe Mikroorganismen können ihre Zellbestandteile aus C 1 -Verbindungen aufbauen und gewinnen die nötige Energie durch die Oxidation dieser reduzierten C 1 -Verbindungen. Zu den verwertbaren C 1 -Verbindungen zählen Methanol (CH 3 OH), Formaldehyd (CH 2 O) und Ameisensäure (HCOOH); auch Methylamine (z. B. CH 3 -NH 2 ), methylierte Schwefelverbindungen (z. B. CH 3 -SH) oder halogenierte Methanverbindungen (z. B. CH 3 -Cl) können von Vertretern der Gattung Methylobacterium verwertet werden. Die Fähigkeit, auf C 1 -Verbindungen zu wachsen, bedarf eines besonderen Stoffwechsels. Die zum Überleben und Wachstum nötige Energie wird aus der schrittweisen Oxidation des reduzierten Substrates bis hin zum CO 2 gewonnen (siehe Abb. 9.1). Dabei entstehen Reduktionsäquivalente, welche über die Atmungskette in ATP verwandelt werden können. Der Aufbau der Zellbestandteile erfolgt bei methylotropher Lebensweise ausschliesslich ausgehend von C 1 -Bausteinen. Die Vertreter der Gattung Methylobacterium nutzen dazu das toxische Formaldehyd sowie CO 2, welche über den Serinweg assimiliert werden (Abb. 9.1). Die fakultative Methylotrophie erlaubt es den Methylobakterien, neben den C 1 -Verbindungen auch komplexere Substrate wie Succinat oder Pyruvat als Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen, sofern diese Substrate zur Verfügung stehen.

72 9. MIKROBIELLER LEBENSRAUM PHYLLOSPÄRE 71 methylierte Amine methylierte Schwefelverbindungen H 2O CH 3OH HCHO HCOOH CO 2 2 H 2 H 2 H Serinweg Acetyl-CoA Biomasse Abb. 9.1: C 1 -Metabolismus in Methylobacterium. 1. Methanol Dehydrogenase, 2. Formaldehyd Oxidationssystem, 3. Formiat Dehydrogenase (modifiziert nach Lidstrom, The Prokaryotes, 2006) Neben der Gattung Methylobacterium gibt es weitere methylotrophe Mikroorganismen, die zum Teil obligat methylotroph leben, wie z. B. die Gattungen Methylobacillus und Methylophilus; des weiteren die Untergruppe der Methan-verwertenden Bakterien, die sogenannten methanotrophen Bakterien, wozu z. B. Methylococcus gehört. Weitere fakultativ methylotrophe Organismen sind zu finden innerhalb der Gattungen Hyphomicrobium, Paracoccus und Bacillus. Es sollte nicht unerwähnt bleiben, dass es neben den methylotrophen Bakterien auch methylotrophe Hefen gibt, z. B. innerhalb der Gattungen Hansenula, Pichia oder Candida. Verbreitung der Gattung Methylobacterium Methylotrophe Bakterien sind in der Natur weit verbreitet. Man findet sie in diversen aquatischen und terrestrischen Habitaten. Aber auch im Staub und in der Luft wurden sie nachgewiesen. Da verwundert es nicht, dass Vertreter der Gattung Methylobacterium als Kontamination in einer Weltraumfähre nachgewiesen wurden und dass es sich beim rosa schimmernden Schleim am Duschvorhang ebenfalls um Methylobacterium handelt. Beschrieben ist das Vorkommen von Methylobacterium auch im Mund und auf der Haut des Menschen. Bemerkenswert ist die konsistente Besiedelung von Pflanzen durch Vertreter der Gattung Methylobacterium. Auf fast jeder Pflanze, auf der man versucht hat, diese Mikroorganismen-Gattung nachzuweisen, ist dieses auch gelungen. Methylobacterium besiedelt insbesondere die Phyllosphäre. Man findet diese Bakterien auf der Blattoberfläche und in den Blättern, im Apoplasten. Man weiss inzwischen, dass die Methylobakterien vom Methanol profitieren können, welches von den Pflanzen produziert und emittiert wird. Die Pflanze produziert das Methanol als Abfallprodukt bei der Zellwandsynthese. Die fakultative Methylotrophie erlaubt es den Methylobakterien jedoch, auch andere

73 9. MIKROBIELLER LEBENSRAUM PHYLLOSPÄRE 72 C-Quellen zu nutzen, die auf der Blattoberfläche verfügbar sind. Die Fähigkeit der Methanolverwertung ist jedoch bei starker Konkurrenz um C-Quellen durch andere Blatt-Kolonisierer von Vorteil für die Methylobakterien. Die Gattung Pseudomonas Ähnlich wie die Vertreter der Gattung Methylobacterium, so kommen auch die Vertreter der Gattung Pseudomonas in den verschiedensten Habitaten vor. Im Gegensatz zu den Methylobakterien sind sie jedoch in der Lage eine grosse Vielfalt an organischen und anorganischen Substraten zu verwerten, ermöglicht durch die vielfältigen Stoffwechselwege, die die verschiedenen Vertreter dieser Gattung besitzen. Derzeit sind etwa 175 verschiedene Arten von Pseudomonaden beschrieben, während etwa 25 beschriebene Methylobacterium Arten existieren. Anders als die Vertreter der Gattung Methylobacterium findet man Pseudomonas auch häufig in der Rhizosphäre. Weiterhin gibt es unter den Pflanzen-assoziierten Pseudomonas Arten diverse phytopathogene Stämme. Diese lösen häufig Blattkrankheiten aus und/oder führen zum Welken der Pflanzen. Die sogenannten fluoreszierenden Pseudomonaden sind dazu in der Lage Siderophore zu produzieren. Das sind wasserlösliche, fluoreszierende Substanzen, die in die Umgebung abgegeben werden. Diese sind bei Tageslicht grünlichgelb gefärbt und zeigen unter der UV-Lampe bei 366 nm eine grünlichgelbe bis bläuliche Fluoreszenz. Siderophore dienen dem Eisentransport in die Zelle. Sie werden unter Eisenmangelbedingungen produziert und ausgeschieden.. Versuch 1: Herstellung von Blattabdrücken Durch die Herstellung von Blattabdrücken auf Nährmedien lassen sich Mikroorganismen auf Blättern einfach und schnell nachweisen. Ziel dieses Versuches ist es, Methylobacterium und fluoreszierende Pseudomonaden auf Weissklee (Trifolium repens) nachzuweisen. Für den eindeutigen Nachweis von Methylobacterium werden zwei Eigenschaften dieser Bakteriengattung ausgenutzt. Das Wachstum erfolgt auf einem Minimalmedium mit Methanol als einziger C-Quelle. Um das Wachstum von methylotrophen Eukaryonten zu verhindern, wird das Antibiotikum Cycloheximid zugegeben. Da auf diesem Medium die meisten methylotrophen Bakterien wachsen können, muss zur eindeutigen Bestimmung ein weiteres Charakteristikum der Gattung Methylobakterium herangezogen werden. In diesem Fall ist das die pinkfarbige Pigmentierung. Das zweite Medium, das in diesem Versuch eingesetzt wird, ist King B. Dieses Medium ist nicht sehr selektiv, d. h. neben den Pseudomonaden können auch einige andere Bakteriengattungen auf diesem Medium wachsen. Das King B Medium stimuliert jedoch bei den fluoreszierenden Pseudomonaden die Bildung der Siderophore, so dass man relativ sicher sein kann, dass es sich bei den fluoreszierenden Kolonien um Pseudomonaden handelt.

74 9. MIKROBIELLER LEBENSRAUM PHYLLOSPÄRE 73 Medien: Minimalmedium zur Kultivierung methylotropher Bakterien (MMM) Spurenelementlösung (NH 4 ) 2 SO g/l EDTA 1.50 g/l MgSO 4 7 H 2 O 0.2 g/l ZnSO 4 7 H 2 O 4.40 g/l NaH 2 PO 4 2 H 2 O 1.7 g/l CaCl 2 2 H 2 O 1.47 g/l K 2 HPO g/l MnSO 4 4 H 2 O 0.10 g/l Spurenelementlösung 1 ml/l FeSO 4 7 H 2 O 1.00 g/l Agar 15 g/l (NH 4 )Mo 7 O 24 4 H 2 O 0.22 g/l ph 7.0 CuSO 4 5 H 2 O 0.30 g/l CoCl 2 6 H 2 O 0.30 g/l Nach dem Autoklavieren werden dem Medium 5 ml/l sterilfiltriertes Methanol und 50 mg/l Cycloheximid (im Methanol gelöst) zugesetzt. King B Medium Proteose Pepton Glycerin K 2 HPO 4 MgSO 4 7 H 2 O Agar ph g/l 10.0 ml/l 1.5 g/l 1.5 g/l 15.0 g/l Material: (pro Student) - LBG-Agarplatte mit E. coli - 1 Agarplatte MMM - 1 Agarplatte King B Medium - 2 Trifoliate vom Weissklee - sterile Petrischale zum Transport der Kleeblätter Vorgehen: Die Kleeblätter werden unter möglichst sterilen Bedingungen gepflückt, d. h. zum Pflücken sollten Handschuhe getragen werden, und die Blätter sollten am Stängel gefasst werden. In einer sterilen Petrischale werden die Blätter ins Labor gebracht. Die Blattabdrücke werden von der Blattunterseite erstellt, da diese häufig stärker von Mikroorganismen besiedelt ist. Das hängt damit zusammen, dass die Lebensbedingungen auf der Blattunterseite weniger hart sind als auf der Oberseite (UV-Strahlung, Austrocknung). Zur Erstellung der Blattabdrücke wird ein Kleeblatt vorsichtig auf die Mitte der Agarplatte gelegt. Mit dem Finger drückt man jedes einzelne Blättchen des Trifoliates auf den Agar, um sicherzustellen, dass die gesamte Blattunterseite mit der Agaroberfläche in Berührung kommt. Es ist darauf zu achten, dass die einzelnen Blättchen dabei nach

75 9. MIKROBIELLER LEBENSRAUM PHYLLOSPÄRE 74 Möglichkeit nicht verrutschen und die Finger den Agar nicht berühren. Nachdem alle Teile des Blattes auf die Agar-Oberfläche gedrückt wurden, wird das Blatt entfernt. Ein Blatt wird für einen Abdruck auf MMM verwendet und das zweite für einen Abdruck auf King B Medium. Die Platten werden bei 30 C inkubiert. Die Inkubation erfolgt für die King B-Platte für 1 2 Tage, für die MMM-Platte für 5 7 Tage. Als Selektivitätskontrolle wird E. coli auf beiden Platten neben den Blattabdrücken ausgestrichen. Auswertung: a) Selektivität der Platten: Wie viele verschiedene Kolonietypen sind auf den beiden verschiedenen Platten zu erkennen? b) Abundanz der Mikroorganismen / Methylobakterien: Auf welcher der beiden Platten sind mehr Kolonien erkennbar? c) Lokalisation der Mikroorganismen: Können anhand der Blattabdrücke Rückschlüsse darüber gezogen werden, welche Stellen des Blattes bevorzugt von Mikroorganismen kolonisiert werden? d) Welche charakteristischen Eigenschaften der Gattung Methylobacterium werden ausgenutzt, um diese Organismengruppe anzureichern und zu identifizieren?

76 10. ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: BACILLUS THURINGIENSIS ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: SCHÄDLINGSBEKÄMPFUNG MIT BACILLUS THURINGIENSIS Grundlagen Einführung Die insektenpathogene Bakterienart, Bacillus thuringiensis (Bt), gehört als aerober Sporenbildner zur Gattung Bacillus (Familie: Bacillaceae). Charakteristisch ist für die Vertreter der Bacillaceae, dass die Bildung hitzeresistenter und gegenüber Umwelteinflüssen widerstandsfähiger Sporen einsetzt, sobald ein für die Zellvermehrung unentbehrlicher Nährstoff aufgebraucht ist. Erstmals wurde B. thuringiensis vor rund 100 Jahren aus einer Seidenraupenzucht in Japan isoliert und wurde Bacillus sotto genannt. Da das Bakterium in Seidenraupenzuchten unerwünscht war, schenkte man ihm keine besondere Beachtung. Im Jahr 1911 wurde ein Stamm von B. thuringiensis in toten Mehlmotten gefunden, die aus einer Mühle in Thüringen stammten. B. thuringiensis ist ein Bodenbakterium und geographisch weit verbreitet. Am besten lassen sich neue B. thuringiensis Stämme aus nährstoffreichen Quellen, Insektenkolonien und auch humusreichen Böden isolieren. In Sammlungen finden sich hunderte von B. thuringiensis Stämmen. Bacillus thuringiensis Stämme als Produzenten von Insektentoxinen. Gleichzeitig mit der Spore bildet B. thuringiensis innerhalb der Bakterienzelle einen Zelleinschluss, der aus Protein besteht und auch als Parasporalkörper bezeichnet wird. Die Parasporalkörper mit einem Durchmesser von µm sind etwas kleiner als die Spore, aber im Lichtmikroskop noch gut erkennbar. Es gibt auch B. thuringiensis Stämme, die mehr als einen Parasporalkörper ausbilden. Elektronenmikroskopisch lässt sich zeigen, dass die Parasporalkörper in vielen Fällen in kristalliner Form als Bipyramiden oder auch als Kuben vorliegen. Die Feinstruktur der Parasporalkörper wird von der Subspezies bestimmt, zu welcher der betreffende B. thuringiensis Stamm gehört. Die Parasporalkörper sind Träger insektizider Aktivitäten gegenüber zahlreichen Larvenstadien von Insektenarten, die den Ordnungen der Lepidopteren, Dipteren und Coleopteren angehören. Die Toxine werden als delta-endotoxine bezeichnet. Die ersten Bt-Isolate waren alle gegenüber Larven von Lepidopteren aktiv, bis 1976 in einem austrocknenden Tümpel in der Negev Wüste aus toten Mückenlarven ein B. thuringiensis Stamm isoliert wurde, dessen Toxin gegenüber Larvenstadien von Stechmücken eine sehr starke Wirkung zeigte. Es handelte sich um eine neue Subspezies, die den Namen B. thuringiensis israelensis (Bti) erhielt wurde dann eine Bt-Subspezies isoliert, B. thuringiensis tenebrionis, die auf Coleopteren, zum Beispiel auf Kartoffelkäfer, wirkt. Zum Wirkungsmechanismus der delta-endotoxine Die Wirkung der delta-endotoxine ist hochspezifisch und beschränkt sich jeweils auf die Larvenstadien weniger Gattungen innerhalb einer Insektenordnung. Die in den Parasporalkörpern vorhandenen Proteine, die als Protoxine bezeichnet werden und selbst keine Aktivität besitzen, müssen eine Reihe von Aktivierungsschritten durchlaufen: Die Parasporalkörper, vom Insekt mit der Nahrung

77 10. ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: BACILLUS THURINGIENSIS 76 aufgenommen, lösen sich im alkalischen Darmsaft auf. Darmsaftproteasen des Serintyps spalten die etwa 130 kda Polypetide in Einheiten von 60 kda, wobei vom C-Terminus her etwa die Hälfte des Moleküls entfernt wird. Am N-Terminus werden knapp 30 Aminosäuren abgespalten. Diese nun aktivierten Polypeptide binden an spezifische Rezeptoren, die sich im Epithel der Darmzellen befinden, und sehr wahrscheinlich Glykoproteine sind. Nach der Rezeptorbindung kommt es zur Porenbildung. Das Darmeptihel verliert damit seine Funktionsfähigkeit, und es kommt zum ungehinderten Austausch zwischen Blutflüssigkeit und Darmsaft. Dies hat schliesslich den Tod der Insektenlarve zur Folge. Die Vielfalt von Bacillus thuringiensis Einerseits hat man eine grosse Anzahl von B. thuringiensis Stämmen isoliert und beschrieben. Diese lassen sich mit biochemischen, serologischen und morphologischen Eigenschaften voneinander unterscheiden. Andererseits werden oft stammunabhängige unterschiedliche delta-endotoxine gebildet, die sich in ihren insektiziden Aktivitäten unterscheiden. Die delta-endotoxine sind plasmidkodiert. Dies ist eine Erklärung für die teilweise geringe Übereinstimmung zwischen den Eigenschaften von Bakterium und delta-endotoxinen. Die delta-endotoxine werden als Cry-Proteine bezeichnet und nach Spezifität ihrer insektiziden Aktivitäten unterteilt: Cry-Typ Cry I Cry II Cry III Cry IV Cry V Cry VI Hauptzielinsekten Lepidopteren Lepidopteren und Dipteren (keine grosse Bedeutung) Coleopteren Dipteren Coleopteren und Lepidopteren (keine grosse Bedeutung) Nematoden Die Cry-Proteine werden aufgrund von Aktivitätsunterschieden innerhalb der Hauptzielinsekten weiter unterteilt: CryI CryIA CryIAa CryIAa1. Diese Einteilung der Cry-Proteine basiert nicht nur auf Unterschiede in den spezifischen Aktivitäten sondern auch in den Aminosäurensequenzen, bzw. den DNA-Sequenzen. Die Gene, die den Aminosäuresequenzen zugrunde liegen werden als cry-gene bezeichnet. Zurzeit gibt es rund einhundert verschiedene Cry-Proteine, ( Die Sicherheit der delta-endotoxine von Bacillus thuringiensis Für ein Insektizid ist die Sicherheit der delta-endotoxine ausserordentlich hoch. Die delta-endotoxine sind sehr spezifisch. So wirkt ein Bt-Stamm nur gegenüber wenigen Insektenarten innerhalb einer Familie oder Gattung. Gegenüber nicht-zielinsekten, Wirbeltieren, Warmblütern und Pflanzen wurden keine Nebenwirkungen gefunden. Die Sicherheit ist in vielen Versuchen mit Standardmethoden auch

78 10. ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: BACILLUS THURINGIENSIS 77 an Wirbeltieren bestätigt worden. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat Produkte auf der Basis von B. thuringiensis israelensis zur Bekämpfung von Stechmückenlarven in Behältnissen, die zur Lagerung von Trinkwasser dienen, freigegeben. Zur Anwendung von Bacillus thuringiensis Die Entwicklung von B. thuringiensis zum weltweit akzeptierten Bioinsektizid verlief sehr langsam, obwohl erste Feldversuche zur Bekämpfung von Schädlingen in der Landwirtschaft schon bald nach dessen Entdeckung durchgeführt wurden. Die Anwendungen, insbesondere im Maisanbau zum Schutz vor dem Maiszünsler (Ostrinia nubilalis) verliefen mit unterschiedlichem Erfolg. Erst mit den aufkommenden Problemen mit chemischen Insektiziden eroberten Bt-Produkte langsam ihren Standplatz in Nischen, wo hochwertige Kulturen wie Gemüse zu schützen sind, oder wo der Schutz von Umwelt und Mensch absolute Priorität hat (Einsatz in Naturschutzgebieten oder Bekämpfung von Schädlingen in bewohnten Gebieten). Man schätzt, dass heute rund 1% des gesamten Insektizidmarkts von B. thuringiensis Präparaten abgedeckt wird. Die oben erwähnte B. thuringiensis Subspezies mit der Bezeichnung tenebrionis lässt sich erfolgreich zur Bekämpfung des Kartoffelkäfers einsetzen. Besonders wichtig sind Präparate der Subspezies B. thuringiensis israelensis zur Bekämpfung von Larvenstadien von Stechmücken und Kribbelmücken, deren Adultstadien nicht nur extrem belästigend sein können, sondern auch Überträger von tropischen Krankheiten wie Malaria, Elephantiasis oder Flussblindheit sind. Die WHO hat mit grossem Erfolg ein Bekämpfungsprogramm finanziert, um in Westafrika die Flussblindheit unter Kontrolle zu bringen. Dabei gelangten grosse Mengen von B. thuringiensis israelensis Produkten zum Einsatz. Der Überträger der Flussblindheit ist die Kribbelmücke, Simulium damnosum, deren Larven sich im fliessenden Wasser entwickeln. Mit Hilfe von Helikoptern wurden Flussläufe mit Bti (B. thuringiensis israelensis) behandelt. Die Larven nehmen das delta-endotoxin auf, werden gelähmt, verlieren die Haftung an den Steinen und werden weggespült. Zusammen mit chemischen Insektiziden, die während der Regenzeit eingesetzt wurden und dem Chemotherapeutikum Ivermectin hat die WHO zu Beginn 2003 die Flussblindheit in Westafrika als eliminiert erklärt. Die Bekämpfungsmassnahmen konnten durch Überwachungsprogramme abgelöst werden. Es bleibt noch zu erwähnen, dass B. thuringiensis sich grosstechnisch leicht züchten lässt. Viele Nährmedien, ausgewogen an Kohlehydraten und Stickstoff mit Spurenelementen eignen sich für die Vermehrung und Sporulation mit gleichzeitiger Parasporalkörperbildung. Die Fermentation erfolgt in Bioreaktoren von mindestens 100 m 3 Volumen. Das fermentierte Produkt mit Sporen und Parasporalkörpern wird konzentriert und zu verschiedenen Produkten formuliert. Diese kommen als konzentrierte Flüssigkeiten, als Pulver, als Granulate oder sogar als Tabletten auf den Markt. Insbesondere die Stabilität von Trockenformulierungen ist gut, und verfügen über eine Haltbarkeit von mehreren Jahren.

79 10. ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: BACILLUS THURINGIENSIS 78 Zur Transformation von Kulturpflanzen mit Genen, die für delta-endotoxin codieren Da die delta-endotoxingene auf Plasmiden liegen, war deren Transformation in die Genome von Kulturpflanzen nur eine Frage der Zeit. Interessant war insbesondere die Bekämpfung von Schädlingen, welche bei den wichtigen Kulturpflanzen Mais und Baumwolle innere Organe befallen, und wo die klassische Anwendung von Bt-Produkten versagt. So hatte man nur wenig Erfolg, den Maisstengelbohrer (Ostrinia nubilalis) durch äussere Bt-Applikationen zu bekämpfen. Die Entwicklung dieser Lepidoptere kann nur durch delta-endotoxin blockiert werden, das von den Pflanzen in ihrem Innern exprimiert wird. Bekanntlich hat der Anbau von Bt-Kulturpflanzen grosse Kontroversen ausgelöst. In Ländern wie den USA, Brasilien und Argentinien, China sind Bt-Pflanzen kaum ein Thema mehr. Auf Millionen von Hektaren werden Bt-Pflanzen angebaut. Auch in der EU ist der Anbau von Bt-Mais gestattet. Bisher haben Bt-Pflanzen keine negativen Auswirkungen auf die Umwelt gezeigt. Ebenso hatte bisher der Konsum durch Mensch und Tiere keine negativen Folgen. Das grösste Problem ist die Gefahr der Entwicklung von Resistenz. Um Resistenz zu verhindern oder wenigstens hinauszuzögern ist den US- Farmern vorgeschrieben auf 20% der Maisanbaufläche nicht genetisch veränderte Sorten anzubauen, damit die Maiszünsler ein Refugium zur Erhaltung des ursprünglichen Genpools vorfinden. In einer kürzlichen Veröffentlichung haben chinesische Wissenschafter gezeigt, dass Pflanzenschutz unter Verwendung von Bt-Kulturpflanen sich positiv auf die Kontrolle anderer Insektenschädlinge auswirkt. Räuber- und Parasiten werden geschont, da man auf den Einsatz chemischer Insektzide verzichten kann. So können Räuber und Parasiten gegenüber Schädlingen ihre volle Wirkung entfalten Experimente zu Bacillus thuringiensis Die durchzuführenden Versuche verfolgen drei Ziele. Einmal soll die starke insektentoxische Aktivität des delta-endotoxins gegenüber ihren Zielinsekten gezeigt werden. Zweitens soll die Spezifität der delta-endotoxine der Subspezies israelensis (Produzent von CryIV) uns kurstaki (Cry1) gezeigt werden. Als Testinsekten stehen Larven der Stechmücke Aedes aegypti und Larven des Kohlweisslings (Pieris brassicae) zu Verfügung. Das Schwergewicht liegt bei Versuchen mit Mückenlarven, da diese uns in grosser Zahl zur Verfügung stehen. Versuch 1: Quantitative Bestimmung der insektentoxischen Aktivität von Bacillus thuringiensis israelensis gegenüber Stechmückenlarven Herstellung einer Kultur von Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) Stamm Eine Kultur von Bti-Sporen wird auf Agarplatten ausgestrichen und bei 30 C während 48 h inkubiert. Bis zu diesem Zeitpunkt sollten Sporulation und Toxinbildung beendet sein. Die sporulierte Kultur wird von den Agarplatten abgeschwemmt. Die so erhaltene Stammsuspension enthält etwa 10 8 Sporen/ Parasporalkörper pro ml. Die Zusammensetzung des Sporulationsmediums ist im Anhang aufgeführt. Diese Stammsuspension wird den Studierenden zur Verfügung gestellt.

80 10. ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: BACILLUS THURINGIENSIS 79 Insekten: Eigelege der Stechmücke Aedes aegypti wurden von Dr. Pie Müller, Schweizerisches Tropen und Public-Health Institut in Basel, auf Filterrondellen erhalten und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur gelagert. Das Filterpapier mit den Eiern wird in eine Glasschale, die mit etwa 5 cm hoch mit Wasser gefüllt wird, gelegt. Innerhalb weniger Stunden sollten die von blossem Auge kaum sichtbaren Larven schlüpfen. Als Nahrung wird fein gemahlenes Fischfutter eingestreut. Die Larven durchlaufen je nach Temperatur (23-30 C) innerhalb von 7-10 Tagen die vier Stadien, bevor sie sich verpuppen und dann als adulte Stechmücken schlüpfen würden. Den Studierenden erhalten vorgezüchtete Mückenlarven im 3. oder frühen 4. Stadium. Ausführung: Als Versuchsgefässe dienen Schottflaschen in die je 100 ml Hahnenwasser abzufüllen sind. Die Ausgangssuspension mit der oben erwähnten Sporenonzentration von rund 10 8 /ml ist nun so zu verdünnen, dass Endkonzentrationen zum Testen der Mückenlarven zwischen 10 5 /ml und 10 1 /ml erreicht werden. Dabei sind alle in der unten stehenden Tabelle aufgeführten Zwischenstufen zu testen. Jede 2er-Gruppe prüft 4 Konzentration sowie eine toxinfreie Wasserkontrolle gemäss nachstehender Tabelle. Hinzu kommt eine Bti-freie Kontrolle. Sind die verschiedenen Sporenkonzentrationen hergestellt, so werden jeder Schottflasche mit 100 ml Suspension 10 Larven von Aedes aegypti zugefügt. Dazu wird das Ende einer blauen Pipettenspitze mit einer Schere so abgeschnitten, dass die Larven mit der Gilson-Pipette ohne Schaden zu nehmen mit etwas Wasser aufgesogen und in die Schottflaschen übertragen werden können. Um Kontaminationen zur vermeiden, werden die Larven zuerst der Kontrolle zugesetzt; und dann ist mit der höchsten Verdünnung fortzufahren. Auswertung: Der Versuch wird nach 4 Stunden ausgewertet. Es ist hier anzufügen, dass normalerweise die Mortalität erst nach einer Expositionsdauer von 24 h bei 30 C bestimmt wird. Die von jeder 2er- Gruppe erhaltenen Resultate werden gesammelt und zur Bestimmung der Mittelwerte in eine gemeinsame Tabelle eingetragen. Auswertung Bti-Versuch: Larvenstadium: % Mortalität nach 4 Stunden Konzentration Mortalität Mortalität Mortalität Mortalität Mortalität Durchschnitt (Sporen/ ml) 1.0 x x x x x x x x x x x x 10 2

81 10. ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: BACILLUS THURINGIENSIS 80 Entscheidend ist diejenige Dosis (Anzahl Sporen/Toxinkristalle pro ml), die benötigt wird um 50 % der Mückenlarven abzutöten (LD 50 ). Werden die Mortaliäten auf der nachstehenden Probitdarstellung eingetragen, so sollte eine Gerade resultieren. Wie die folgende Darstellung zeigt, basiert die Probitdarstellung auf dem Integral der Gausschen Normalverteilung. Die probit-transformation dient zur graphischen Linearisierung und Prüfung auf Normalverteilung experimenteller Daten sowie zur Schätzung der Parameter. Bei der Prüfung von Insektiziden steigt die konzentrationsabhängige Mortalität sehr langsam an. Sie erreicht einen Peak bei 50%. Die Mortalitätsraten von Überlebenden bei höheren Konzentrationen nehmen langsam ab. Theoretisch werden 100% Mortalität nie erreicht. Treten in den Kontrollen Mortalität auf, sind die Resultate mit Abbott s Formula (nach Schneider- Orelli) zu korrigieren ( Die Beziehung zwischen Gausscher Normalverteilung und Probit: Normalverteilung und Integral der Normalverteilung sowie Probit-Transformation

82 10. ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: BACILLUS THURINGIENSIS 81 Probit Darstellung (Wahrscheinlichkeitsnetz mit linearer x-achse: Beziehung zwischen Mortalität und Wirkstoffkonzentration.

83 10. ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: BACILLUS THURINGIENSIS 82 Probit Darstellung (Wahrscheinlichkeitsnetz mit logarithmischer x-achse: Beziehung (Beispiel) zwischen Mortalität und Wirkstoffkonzentration. Versuch 2: Prüfung der spezifischen insektentoxischen Aktivität von zwei verschiedenen Subspecies von Bacillus thuringiensis Die Aktivität der delta-endotoxine von B. thuringiensis kurstaki und B. thuringiensis israelensis wird an Larven des Kohlweisslings, Pieris brassicae, geprüft. Dieser Versuch wird von jeder Assistentengruppe durchgeführt.

84 10. ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: BACILLUS THURINGIENSIS 83 Vorgehen: Suspensionen der beiden Bacillus thuringiensis Subspezies kurstaki und israelensis werden auf Rondellen von Kohlblättern mit 2 cm Durchmesser aufgesprüht. Als Kontrolle dienen Rondellen, die mit der entsprechenden Menge Wasser benetzt wurden. Die Rondellen werden in Petrischalen gelegt. Jeder Schale werden 1-3 Larven von Pieris brassicae zugesetzt. Man lässt die Insekten ad libitum fressen. Auswertung: Nach 4 Stunden soll bestimmt werden wie viel Kotpartikel von den Larven ausgeschieden wurde. B. thuringiensis subspecies Anzahl Kotpartikel kurstaki israelensis FRAGE 10.1: Was könnte die molekulare Grundlage der beobachteten Spezifität der getesteten B. thuringiensis-toxine sein? ANTWORT: FRAGE 10.2: Ist die beobachtete Spezifität der Bt-Toxine eher ein Vor- oder ein Nachteil bezüglich ihres Einsatzes als Bioinsektizide? ANTWORT: Persönliche Notizen:

85 11. MYKOLOGIE MYKOLOGIE Einführung und Uebersicht Pilze sind eukaryontische Mikroorganismen, die phylogenetisch neben Pflanzen, Tieren, Bakterien und Archaeen ein eigenes Reich ( The fifth kingdom ) bilden. Es handelt sich dabei um heterotrophe Organismen, die ökologisch eine wichtige Rolle als Destruenten von totem organischem Material (Saprophyten) sowie als Symbionten (Mycorrhiza) und Parasiten (Mycosen) von Pflanzen (und Tieren) spielen. Die mit dieser Ernährungsweise einhergehende, effiziente Sekretion von Eiweissen (Enzymen) wird in der Biotechnologie ausgenutzt. Weitere wichtige Merkmale der Pilze sind ihre chitinhaltige Zellwand und die Verbreitung durch Sporen. Als Eukaryonten sind die Pilze als einzige Mikroorganismen neben der asexuellen zur sexuellen Vermehrung fähig. Deshalb zeichnen sich Pilze durch eine extreme und oft verwirrende Vielfalt von Lebenszyklen und -formen aus (siehe auch Kap. 7 Versuch 1: Kreuzung von Bäckerhefe). Die Klassifikation erfolgt dabei nach den Formen der sexuellen Sporenbildung (siehe unten). In der Lebensmittelmikrobiologie spielen Pilze eine wichtige Rolle bei der Erschliessung (leichtere Verdaubarkeit) und Haltbarmachung von Lebensmitteln (Bier, Wein, Käse, Sojaprodukte). Andererseits werden jährlich riesige Mengen von Lebensmitteln durch Pilze zerstört (Früchte, Getreide). Zudem gibt es Pilze die Toxine produzieren (z.b. Aflatoxin), die beim Menschen und Nutztieren nachhaltige Schäden verursachen können. Dieser Kurs hat zum Ziel, einige Pilze mit ihren Strukturen im Mikroskop kennenzulernen und sich mit ihrer speziellen Lebensweise vertraut zu machen Morphologie Vegetatives Wachstum Pilze wachsen entweder mehrzellig als Hyphen oder durch Sprossung oder Teilung von einzelnen Zellen. Filamentöse (mehrzellige) Pilze Bei den Hyphen handelt es sich um Zellfäden mit einer Dicke von 1-20 µm, die von einer Zellwand umgeben sind. Meist sind die Hyphen durch Querwände (Septum, Mz.: Septa) unterteilt. Eine Hyphenzelle kann einen einzigen oder mehrere Kerne enthalten, die im Mikroskop jedoch nur mit speziellen Färbungen sichtbar werden. (Abb. 11.1A). Hyphen verzweigen sich und bilden ein Geflecht, das man als Myzel bezeichnet wird und von Auge meist sichtbar ist (Abb. 11.1B). Myzelwachstum findet ausschliesslich an der Spitze der Hyphen statt (Spitzenwachstum). Als Thallus bezeichnet man den ganzen Pilzkörper, der aus dem vegetativen Myzel mit differenzierten Vermehrungsorganen besteht.

86 11. MYKOLOGIE 85 Abb Filamentöses Pilzwachstum (mehrzellig). A: Hyphenstück mit Septen und Zellkernen (punktiert); B: Myzel gebildet aus verzweigten Hyphen. Hefeartige (einzellige) Pilze Ein Beispiel dafür sind Hefen. Ausserdem wachsen einige filamentöse Pilze (z.b. Rhizopus sp., Mucor sp.) in bestimmten Entwicklungsstadien oder unter besonderen ökologischen Bedingungen als Einzelzeller ("hefeartig") (Hefe-Myzel-Dimorphismus). Einzellige Pilze vermehren sich durch Sprossung oder Teilung. Bei der Sprossung (Saccharomyces cerevisiae) entwickeln sich aus der Mutterzelle Tochterzellen, die dann unter Hinterlassen von Narben abgetrennt werden. (Abb. 11.2A, 2B). Bei der Spalthefe (Schizosaccharomyces pombe) verläuft die Zellteilung ähnlich wie bei Bakterien durch Teilung (Abb. 11.2C). Abb Hefeartiges Pilzwachstum (einzellig). a: Multipolare Sprossung (Saccharomyces); b: bipolare Sprossung (Saccharomycodes); c: Zellteilung (Schizosaccharomyces). 1: Mutterzelle, 2: Tochterzelle, 3,4: Sprossnarben.

87 11. MYKOLOGIE 86 Sporenbildung Pilze sichern sich das langfristige Überleben und die räumliche Verbreitung durch Sporen. Der komplizierte Differenzierungsprozess führt entweder zu asexuellen oder sexuellen Sporen. Bei der Bildung der asexuellen Sporen findet kein Wechsel der Kernphase statt. Die sexuelle (geschlechtliche) Sporenbildung geht mit einem Wechsel der Kernphase einher. Der Kernphasenwechsel basiert auf Befruchtung und schliesst eine Meiose mit ein. Je nach Pilzart kennt man nur die asexuelle oder sexuelle oder dann beide Vermehrungsarten. Daher ist ein Pilz oft unter zwei Namen bekannt: ein Name wird für die asexuelle Form (Anamorph), der andere für die sexuelle (Teleomorph) verwendet. Beide Formen charakterisieren eine Pilzart (Holomorph). Beispiel: Fusarium graminearum und Gibberella zeae bezeichnen den gleichen Pilz. Allerdings wird der Name Fusarium verwendet, um die asexuelle Sporulationsform zu bezeichnen, während mit Gibberella die sexuelle Form bezeichnet wird. Man sagt in diesem Falle, dass Fusarium die anamorphe Form von Gibberella ist. Formen der asexuellen Sporenbildung Endogene Sporenbildung: Diese basiert auf Sporangien in deren Innern sich die Sporangiosporen bilden (z. B. bei Rhizomucor miehei, Rhizopus sp. = Zygomycota). Sporangien entstehen am Ende von zu Sporangienträgern (Sporangiophoren) differenzierten Hyphen. Oft ragt eine blasenförmige Ausstülpung (Kolumella) in das Sporangium (Abb. 11.3A). Der deutsche Name Köpfchenschimmel leitet sich von dieser speziellen Morphologie der Sporangiophoren ab. Abb. 11.3: Formen der asexuellen Sporenbildung. A. Sporangium mit endogener Sporenbildung (Rhizopus nigricans). 1: Sporangienträger; 2: Sporangium mit Sporangiosporen (3); 4: Kolumella. B. Konidienträger mit exogener Sporenentwicklung (Penicillium sp.). 5: Konidienträger; 6: Metulae (Verzweigung 1.Grades); 7: konidiogene Zelle (in diesem Falle Phialide genannt, Verzweigung 2. Grades); 8: Konidien (in Ketten); die sich aus der Phialidenspitze (9) bilden. Exogene Sporenbildung: An Konidienträgern bilden sich Konidiosporen. Die Morphogenese der Konidien kann verschiedenartig erfolgen. Hier sei das Beispiel von Penicillium (anamorphe Form z.b.

88 11. MYKOLOGIE 87 von Talaromyces) erwähnt. Bei Penicillium verzweigen sich die Konidienträger in der Scheitelregion zu einem dichten Pinsel (daher der deutsche Name Pinselschimmel ); an den Enden entwickeln sich Ketten von Konidien (Abb. 11.3B). Formen der sexuellen Sporenbildung Wir unterscheiden im Wesentlichen drei Formen der sexuellen Sporenbildung: Zygosporen (Rhizomucor miehei). Die Zygosporenbildung erfolgt endogen in einem Zygosporangium (Abb. 11.4A). Ascosporen (Sordaria macrospora). Die Ascosporenbildung endogen in einem Ascus (Abb. 11.4B). Basidiosporen (Coprinus cinereus). Die Basidiosporenbildung erfolgt exogen an einer Basidie (Abb. 11.4C). In den letzten beiden Fällen kommt es nach der Befruchtung nicht direkt zur Kernverschmelzung. Die beiden verschieden-geschlechtlichen Zellkerne bleiben getrennt und vermehren sich mitotisch. Man nennt diesen Zustand (Karyophase) dikaryotisch. Bei Ascomyceten ist diese Phase auf die ascogenen Hyphen innerhalb des Fruchtkörpers (Ascom mit Asci) beschränkt, deren Bildung unmittelbar an die Plasmogamie anknüpft. Basidiomyceten können sich in diesem Zustand als dikaryotisches Myzel vegetativ vermehren und es kommt erst unter bestimmten Umweltbedingungen zur Bildung des sexuellen Fruchtkörpers (Basidiom mit Basidien). Die zweite Phase der Befruchtung erfolgt im Ascus resp. in der Basidie, wo es zur Verschmelzung der beiden Zellkerne kommt. Der entstandene diploide Kern teilt sich anschliessend meiotisch. Je nachdem, ob anschliessend eine Mitose folgt, resultieren 4 (bei Basidiomycota) oder 8 (bei Ascomycota) haploide Kerne. Abb. 11.4: Formen der sexuellen Sporenbildung. A. Ascus mit 8 endogenen Ascosporen (Sordaria macrospora); B. Basidie mit vier exogen an Sterigmen entstehenden Basidiosporen (Coprinus cinereus). C. Zygospore mit endogener Bildung einer Meiospore, die dann mitotisch zu einem Sporangium (Zygosporangium) auskeimt (Rhizomucor miehei).

89 11. MYKOLOGIE 88 Versuch 1: Bestimmung der Zellzahl einer Hefekolonie Ziel: Um sich eine bessere Vorstellung der Grösse von Mikroorganismen und der Koloniegrössen einzelliger Mikroorganismen zu machen, soll die Zellzahl einer Kolonie von Hefezellen mittels einer sogenannten Neubauer-Zählkammer (improved) sowie durch Ausplattieren von entsprechenden Verdünnungen ermittelt werden. Material: Pro Zweiergruppe: - Hefekolonie (Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae) auf YPD-Agarplatte (Hefe-Vollmedium) - Neubauer(improved)-Zählkammer mit speziellem Deckglas (BITTE KAMMER UND DECKGLAS NACH GEBRAUCH WASCHEN UND WIEDER IN PLASTIKSCHACHTEL VERRÄUMEN!) - 3 unbeimpfte YPD-Agarplatten - Petrischalen mit Ethanol und Drigalsky-Spatel zum Plattieren Vorgehen Zählkammer: 1. Die Zellen einer einzelnen Hefekolonie werden in einem sterilen Eppendorfgefäss in 500 l sterilem Wasser resuspendiert und eine 1:10 Verdünnung dieser Suspension hergestellt. 2. Ein Deckglas wird auf die auf den äusseren Stegen mit Wasser befeuchtete Zählkammer aufgebracht, so dass sich Interferenzlinien (Newtonsche Ringe) bilden. 3. ca. 10 l der verdünnten Zellsuspension werden mittels Kapillarwirkung zwischen Deckglas und Zählkammer pipettiert. 4. Die Zellen von 5 Gruppenquadraten innerhalb des zentralen Zählquadrates (vgl. Abb. 5.1) werden ausgezählt (Zellen auf linken und oberen Rändern der Gruppenquadrate werden mitgezählt) der Mittelwert ermittelt. Diese Zahl mal 250 ergibt die Zellzahl pro l. Errechnen Sie daraus die Zahl der Zellen für die ganze Kolonie.

90 11. MYKOLOGIE 89 Abb. 11.5: Neubauer (improved) Zählkammer mit Aufbau des Zählfeldes. Man beachte die Grössenangaben die Seitenlänge des kleinsten Quadrates beträgt 20 µm! Vorgehen Ausplattieren: 1. Es werden in 10er Schritten eine 1:100, eine 1:1000 und eine Verdünnung obiger Zellsuspension in 500 l sterilem Wasser hergestellt und jeweils 250 ul jeder Verdünnung mittels Drigalsky-Spatel auf eine YPD-Agarplatte verteilt. 2. Die Agarplatten werden übers Wochenende bei 30 C inkubiert. 3. Die errechnete Gesamtzahl der gewachsenen Kolonien entspricht der Zahl der (lebenden) Zellen in der Kolonie. Resultate: Zählkammer: Hefezellen pro Kolonie Ausplattieren: Hefezellen pro Kolonie FRAGE 11.1: Liefern beide Methoden notwendigerweise dasselbe Ergebnis? ANTWORT: FRAGE 11.2: Wie gross schätzen sie entsprechend die Zellzahl einer Bakterienkolonie derselben Grösse? Begründen sie ihre Schätzung. ANTWORT:

91 11. MYKOLOGIE 90 Versuch 2: Mikroskopie pilzlicher Erscheinungsformen Ziel: Erkennen der in den Abb bis dargestellten Erscheinungsformen. Zu mikroskopierende Pilze (Reich: EUMYCOTA) und deren Merkmale: Abteilung: ASCOMYCOTA (SCHLAUCHPILZE) 1. Saccharomyces cerevisiae (Sc) (Bäcker-, Bier- oder Weinhefe) Material: 2 verschiedene Agarplatten (YPD und HSpo) mit Trockenhefe von der Migros Präparation: Zellsuspension in Wasser unter Mikroskop mit Phasenkontrast und 400x Vergrösserung Merkmale: asexuelle Vermehrung durch Sprossung (YPD), sexuelle Vermehrung durch 4 Ascosporen in nacktem Ascus (Spo) 2. Sordaria macrospora (Sm) Material: Agarplatte mit Myzel und schwarzen, stecknadelkopfgrossen Fruchtkörpern Präparation: Ernten von Fruchtkörpern unter Binokular, gequetschte Fruchtkörper in Wasser unter Mikroskop mit Phasenkontrast und 100x bis 400x Vergrösserung Merkmale: keine Vermehrung durch asexuelle Sporen bekannt, sexuelle Vermehrung durch 8 Ascosporen in in Fruchtkörper (Perithezium) eingebettetem Ascus

92 11. MYKOLOGIE Aspergillus oryzae (Ao) (Grünschimmel) Material: Agarplatte und Agarobjektträger Präparation: Agarplatte unter Binokular, Agarobjektträger unter Mikroskop mit Phasenkontrast und 400x Vergrösserung Merkmale: unterteiltes (septiertes) Myzel, asexuelle Vermehrung durch Konidiosporen Abteilung: ZYGOMYCOTA (JOCHPILZE) 4. Mucor rouxii (Mr) Material: Agarplatte und Agarobjektträger Präparation: Agarplatte unter Binokular, Agarobjektträger unter Mikroskop mit Phasenkontrast und 400x Vergrösserung Merkmale: unseptiertes Myzel, asexuelle Vermehrung durch Sporangiosporen

93 11. MYKOLOGIE Phycomyces blakesleeanus (Pb) (Oelpilz) Material: Agarplatte mit 2 Kreuzungspartnern (AxB) Präparation: Agarplatte unter Binokular Merkmale: asexuelle Vermehrung durch Sporangiosporen, sexuelle Vermehrung durch Zygosporen Abteilung: BASIDIOMYCOTA (HUT- ODER STÄNDERPILZE) 6. Sarcodon imbricatus (Habichtspilz) Material: getrocknete Fruchtkörper Präparation: einzelner, rehydrierter und gequetschter Stachel in 3% KOH unter Mikroskop mit Phasenkontrast und 400x Vergrösserung Merkmale: Schnallenbildung an Septen, keine Vermehrung durch asexuelle Sporen bekannt, sexuelle Vermehrung durch 4sporige Basidien an stachelförmiger Fruchtschicht (Hymenium) von hutförmigem Fruchtkörper

94 11. MYKOLOGIE Agaricus bisporus (Champignon) Material: Agarplatte, frische reife Fruchtkörper (nach Verfügbarkeit) Präparation: Sporenabdruck und Mikroskopie (Phasenkontrast und 400x Vergrösserung) der Basidiosporen durch Resuspension eines Stücks Lamelle in sterilem Wasser. Merkmale: keine Vermehrung durch asexuelle Sporen bekannt, sexuelle Vermehrung durch zweisporige Basidien an blättriger (lamellenartiger) Fruchtschicht (Hymenium) von hutförmigem Fruchtkörper Hinweise zur Präparation: 3% KOH wird benutzt zur Rehydrierung von getrockneten Proben (siehe No. 6) Versuch 3: Verbreitung durch Sporen Ziel: Die Verbreitung von Pilzen durch asexuelle Sporen soll durch Ausplattieren von Sporensuspensionen auf Nährmedien demonstriert werden. Material: - sporulierte Schrägagarkulturen von Aspergillus oryzae (asexuelle Konidiosporen) und Phycomyces blakesleeanus (B) (asexuelle Sporangiosporen) - pro Pilz 3 unbeimpfte CMA (Corn Meal Agar)-Platten - Petrischalen mit Ethanol und Drigalsky-Spatel zum Plattieren Vorgehen: 1. Herstellung der Sporensuspensionen: Schrägagarkulturen mit 1 ml sterilem Wasser überschichten und kräftig schütteln. 2. Sporensuspension in steriles Eppendorfgefäss dekantieren.

95 11. MYKOLOGIE Von den beiden Sporensuspension je eine 1:100, eine 1:1000 und eine 1:10000 Verdünnung in sterilem Wasser herstellen. Die konzentrierten Suspensionen nicht verwerfen, werden für Versuch 5 bzw. Versuch 6 benötigt. 4. Je 100 l der Verdünnungen mittels Drigalsky-Spatel auf CMA-Platten plattieren. 5. Platten während 3 Tagen bei Raumtemperatur (Aspergillus) bzw. 18 C (Phycomyces) inkubieren. Auswertung: Berechnen Sie anhand der Zahl von Pilzkolonien die Zahl der asexuellen Sporen pro ml Sporensuspension: Aspergillus oryzae: Sporen / ml Phycomyces blakesleeanus: Sporen / ml Physiologie Temperatur, Feuchtigkeit und Licht sind wichtige Faktoren, die das Wachstum und die Entwicklung von Pilzen beeinflussen. Temperatur Man unterscheidet zwischen psychrophilen (kälteliebenden) Arten, die noch bei Temperaturen unter 0 C wachsen, mesophilen, die bei mittleren Temperaturen, und thermophilen Pilzen, die noch oberhalb von 40 C wachsen. Versuch 4: Bestimmung von minimalen, optimalen, und maximalen Wachstumstemperaturen Ziel: Die optimalen Wachstumstemperaturen von drei verschiedenen Pilzen sollen bestimmt werden. Material: - Platten mit den entsprechenden Pilzkulturen (siehe untenstehenden Tabelle) - Rondellen wurden mit einem Korkbohrer auf den Platten vorgestanzt. - Unbeimpfte CMA-Platten Ausführung: Je eine Pilzrondelle wird auf die Mitte einer frischen Maisagar (CMA) Platte übertragen. Pro Pilz wird eine Petrischale bei Temperaturen von 10, 25 und 37 C während einer Woche inkubiert. Auswertung: Die Durchmesser der Pilzkolonien werden nach 4 Tagen gemessen. Die gemessenen Werte werden in die beiliegende Tabelle eingetragen. Sind genügend Daten vorhanden, lässt sich das temperaturabhängige Wachstumsverhalten der einzelnen Pilze graphisch darstellen.

96 11. MYKOLOGIE 95 Durchmesser (cm) der Pilzkolonie Pilz Code 10 C 25 C 37 C Coprinus Cp psychromorbidus (Basidiomyzet) Gibberella zeae Gz (Ascomyzet) Rhizomucor miehei (Zygomyzet) Rm FRAGE: Wo in der Natur würden sie erwarten, den Pilz Rhizomucor miehei anzutreffen? Substratfeuchtigkeit/Luftfeuchtigkeit Pilze benötigen für ihr Wachstum genügend Feuchtigkeit. Wassermangel führt zur Reduktion des Metabolismus und damit zur Verlangsamung der Substratbesiedlung. Wasser liegt in manchen Lebensmitteln (Substraten) in gebundener Form vor und steht den Pilzen nicht zur Verfügung. Deshalb kommt der Luftfeuchtigkeit eine entscheidende Bedeutung zu. Pilze, die noch sehr niedrige Feuchtigkeitswerte tolerieren, werden als xerotolerant bezeichnet, solche, die solche bevorzugen, als xerophil. Licht und Schwerkraft Obwohl Pilze chemoorganotroph sind und keine Photosynthese betreiben, besitzen sie Lichtrezeptoren, die z.b. die Entwicklung der Sporenbildung regulieren. Pilze fühlen auch die Schwerkraft und richten ihre sporenbildenden Strukturen entsprechend aus. Der Zygomyzet Phycomyces blakesleeanus ist ein bekanntes Modell für die physiologischen Auswirkungen von Licht und Schwerkraft bei Pilzen. Versuch 5: Phototropismus und Lichtregulation der Sporenbildung Material: - Sporensuspension von Phycomyces blakesleeanus (B) aus Versuch 2-3 Reagenzgläser mit je 3 ml CMA-Agar (pro 2er-Gruppe) - Alufolie

97 11. MYKOLOGIE 96 Vorgehen: - Jedes Reagenzglas wird 0.1 ml Sporensuspension beimpft. Ein Reagenzglas wird mit Alufolie eingepackt bis oben nur noch ein ca. 5 mm breiter Streifen freibleibt. Die anderen RG werden ganz (inkl. Deckel) mit Alufolie eingepackt. Bei einem der beiden RG wird auf einer Seite auf halber Höhe ein rundes Loch (Durchmesser 5 mm) aus der Alufolie herausgeschnitten. Die Reagenzgläser werden bei konstantem Licht bei 23 C senkrecht (um Einflüsse der Schwerkraft auszuschliessen) inkubiert. Auswertung: Vergleichen Sie die bei unterschiedlichen Bedingungen inkubierten Reagenzgläser miteinander. Zeichnen sie die beobachtete Morphologie des Pilzes in das untenstehende Schema (Mond steht für Dunkelheit, Sonne für Licht). Wie äussert sich der Phototropismus bzw. die lichtabhängige Entwicklung des Pilzes? FRAGE 11.3: Weshalb ist wohl die Sporenproduktion von Pilzen Licht- und Schwerkraft-reguliert? ANTWORT: Gasaustausch Nicht nur die asexuelle, sondern auch die sexuelle Sporenbildung von Pilzen ist von Umwelteinflüssen abhängig. Neben dem Licht spielt die CO 2 -Konzentration bei der Bildung von Fruchtkörpern durch Asco- und Basidiomyzeten eine grosse Rolle.

98 11. MYKOLOGIE 97 Aufschluss von Substraten durch Exoenzyme Pilze können fast alle natürlich vorkommenden C-Verbindungen, auch komplexe und unlösliche Substrate wie Zellulose und Lignin (Hauptbestandteile von pflanzlichen Zellwänden), mit Hilfe von Exoenzymen abbauen und nehmen deshalb eine herausragende Rolle beim C-Kreislauf ein. Gewisse C- Verbindungen wie Stärke, Lipide und Proteine können auch durch Bakterien abgebaut werden. Die löslichen Abbauprodukte werden von den Hyphen als Nährstoff- und Energiequellen aufgenommen. Die verschiedenen Pilzarten produzieren verschiedene Exoenzyme und unterscheiden sich daher in ihren Fähigkeiten Naturstoffe abzubauen. Das folgende Experiment soll dies demonstrieren. Versuch 6: Nachweis der amylolytischen und proteolytischen Aktivität Material: - pro 2er-Gruppe je 1 Stärkeagar- und Milchagar-Platte - Petrischalenkulturen von Aspergillus oryzae (Ascomyzet), Agaricus bisporus (Basidiomyzet), Phycomyces blakesleeanus (Zygomyzet) mit vorgestanzten Rondellen - Kaliumjodid-Lösung (1g kristallines Jod, 2g KJ, 300 ml destilliertes Wasser) Ausführung: Die Rondellen, die als Impfmaterial verwendet werden, sind bereits mit einem Korkbohrer vorgestanzt worden. Die Stärkeagar- und Milchagar-Platten werden mit je einem Impfstück, das mit dem Pilzrasen nach unten in die Mitte der Schale gelegt wird, gemäss untenstehendem Schema beimpft (Platten vor Beimpfen auf Unterseite beschriften - nach Beimpfen NICHT mehr drehen, da sonst das Impfstück abfallen könnte!). Die Platten werden während 6 Tagen bei 4 C inkubiert, um ein zu starkes Wachstum der Pilze, das die Auswertung des Experimentes stören kann (Höfe wegen Ueberlagerung mit Pilzkolonie nicht sichtbar), zu vermeiden. Auswertung: Stärkeagar: Die Agarschicht der inkubierten Platte wird sorgfältig vom Boden der Petrischale gelöst und mit der Pilzschicht nach unten in den Deckel der Schale gekippt. Der Agar wird mit Kaliumjodid- Lösung übergossen. Die Stärke verfärbt sich blau. Wo Stärke bis zur Glucose hydrolysiert wurde, bleibt der Agar farblos. Rotbraune Zonen zeigen einen teilweisen Abbau der Stärke bis zu Erythrodextrin an. Milchagar: Das Milcheiweiss in den Milchplatten ist als Trübung erkennbar. Eine Klärung um die Pilzkolonie zeigt einen Abbau des Milcheiweisses an. Zeichne die beobachteten Höfe auf untenschehendem Schema ein:

99 11. MYKOLOGIE 98 Welche Schlüsse ziehen sie bezüglich der bevorzugten Substrate der jeweiligen Pilze? FRAGE 11.4: Welches sind die Vorteile einer filamentösen, multizellulären gegenüber einer unizellulären Wachstumsform? ANTWORT: