Praktikum Zelluläre Biochemie. am Institut für Biochemie. Goethe-Universität Frankfurt am Main Max-von-Laue Str Frankfurt am Main

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1 Praktikum Zelluläre Biochemie am Institut für Biochemie Goethe-Universität Frankfurt am Main Max-von-Laue Str Frankfurt am Main Gruppe A: Gruppe B:

2 2 Inhaltsverzeichnis 1 Allgemeines Abfallentsorgung Zeitplan Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls Bioinformatik Einführung in Origin Anleitung zum Ansetzen von Puffern Der Peptidtransporter TAP Membranpräparation aus Sf9-Insektenzellen (Versuch 1 A) Markierung von Peptiden mit Fluoreszenzfarbstoffen (Versuch 1B) Bestimmung der Bindungsaffinität (K D-Wert) eines Peptids zu TAP (Versuch 1C) Untersuchung der Nukleotidbindung von TAP (Versuch 1D) Peptidtransportassay (Versuch 1E) Glutathion-S-Transferase Überexpression von GST-eGFP (Versuch 2A) Reinigung von GST-eGFP (Versuch 2B) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Versuch 2C) Molekulargewichtsbestimmung mit Gelfiltration (Versuch 2D) Enzymkinetik (Versuch 2E) FRET-Messung (Versuch 2F)

3 Allgemeines 3 1 Allgemeines Das Biochemische Praktikum im Rahmen des Praktikums Zelluläre Biochemie dauert 3 Wochen und läuft für alle Gruppen jeweils von Montag bis Donnerstag ab 9.00 Uhr s.t. (Ausnahmen siehe Zeitplan). Freitag ist jeweils Riedberg-Tag und ist für Vorlesungen reserviert. Für die Gruppen A1 A10 findet das Praktikum vom bis und für die Gruppen B1 B11 vom bis im Institut für Biochemie statt. Vorbereitungs- und Kontrollseminare finden nach Bedarf statt und werden zeitlich günstig in das Praktikum eingepasst. Von den Praktikumsteilnehmern wird erwartet, dass sie sich anhand der Skripte auf der Biochemie Homepage gut auf das Praktikum vorbereiten. Nach dem Ende des Praktikums liefert jede Gruppe (A1,...B1,...) ein ausgedrucktes Gruppenprotokoll getrennt nach Teilversuchen bei den Versuchsbetreuern (TAP 1A 1E und GST 2A-2E) ab (Deadline: ). Jedes Protokoll ist mit einem Deckblatt zu versehen, auf dem der Teilversuch, die Gruppe und die Teilnehmer vermerkt sind, sowie die adresse des Verfassers. Die korrigierten Protokolle werden am persönlich von den Studenten abgeholt. Endgültige Abgabe der verbesserten Endversion beim Betreuer: Bei ungenügender Ausarbeitung muss der Praktikumsteil wiederholt werden. Erst die verbesserte Endversion wird vom Betreuer abgezeichnet und dann bei Dr. Abele archiviert. Der Protokollaufbau richtet sich nach dem einer Publikation: a. Einleitung, b. Material und Methoden, c. Ergebnisse, d. Diskussion. Der Teil Material und Methoden darf sehr kurz sein oder weggelassen werden, muss aber im Falle von Abweichungen vom Skript dringend detailliert geschrieben werden. Am letzten Praktikumstag findet eine Präsentation der Ergebnisse statt. Die Powerpoint- Präsentation umfasst eine Einleitung, in der der Versuch dargestellt wird. Anschließend werden die Ergebnisse vorgestellt und kritisch diskutiert. Bei Versuchen, bei denen unterschiedliche Eigenschaften der Proteine untersucht wurden, werden die Ergebnisse aller Gruppen dargestellt.

4 Allgemeines 4 Als Abschlussprüfung findet ein ca. 30 minütiges Einzelkolloquium in der Woche vom statt. Die Termine werden vor den Weihnachtsferien bekanntgegeben. Praktikumsleitung Prof. Robert Tampé PD. Dr. Rupert Abele Betreuer Andreas Blees Markus Braner Hanna Fischbach Karl Gatterdam Volker Gatterdam Milan Gerovac Elisa Hain Irina Jan Kristin Kiosze Alina Kollmannsperger Anne Nöll Elina Nürenberg Tina Puth Katrin Schanner Sabine Schmidt Michael Urban Agnes Wycisk

5 Abfallentsorgung 5 2 Abfallentsorgung Zu Beginn der Laborarbeit erfolgt eine Unterweisung in die Laborarbeit. Um den anfallenden Abfall sachgerecht zu entsorgen, gibt es einen Entsorgungsplan: Abfallart Entsorgung Ort Wässrige Säuren und Laugen Organische Lösungsmittel z.b. Acetonitril (ohne Feststoffe, Ether und Schwermetalle) Schwermetalle (z.b. Cu, Ni, Fe, Pb, Cd, Hg) Kanalisation (nach Neutralisation) Waschbecken Weißer 5 L Kanister Abzug Raum 1 Schwarzer 10 L Kanister Abzug Glasbruch Spezialbehälter Unter Waschbecken in Raum 1 Acrylamid (polymerisiert) Hausmül Mülleimer Mikrobiell verunreinigt autoklavieren Autoklaviertüten in weißen Ständern (voll? weiße Tonne) + Autoklav Hausmüll Pipetten ab 2 ml Desinfektion in Speziallösung weiße runde Behälter auf dem Boden Leergut (Glas) Ausgespült oder ausgedampft Lösungsmittellager Skalpelle, Kanülen, scharfe Gegenstände (auch mikrobiell verunreinigt) Gelbe Behälter autoklavieren Autoklav 3 Zeitplan Das Praktikum besteht aus zwei großen Blöcken. Zuerst findet am Montag eine allgemeine Einleitung statt (Treffpunkt Biozentrum N100 R1.14 um 9 h). Am Montag und Dienstag wird das Internet als Werkzeug für biochemische Studien vorgestellt und grundlegende Methoden des Laboralltags durchgeführt. Gruppe 1 5 sind morgens an den Computern und nachmittags im Labor und Gruppe 6 11 umgekehrt. Daran schließen sich Experimente mit dem Peptidtransporter TAP an (Versuch 1). In der zweiten Hälfte des Praktikums werden Sie biochemische Studien mit dem Fusionsprotein bestehend aus der Gluthationtransferase und GFP durchführen (Versuch 2). Am letzten Tag findet ein Seminar statt, in dem jede Gruppe einen Versuch aus dem Praktikum darstellt und noch offene Fragen diskutiert werden. Dabei stellt jede Gruppe die Ergebnisse aller Gruppen von diesem Versuch vor.

6 Zeitplan 6 1. Woche 2. Woche Montag Dienstag Mittwoch Donnerstag 9 h Einführung 1 9 h 9 h Vortrag 1 9 h Bioinformatik 3 / Bioinformatik 3 / Gr Gr. 1-4 V 1B Puffer/Medium Puffer/Medium V 1A Gr. 5-8 V 1C Gr. 1 5 Bioinf. Gr. 1 5 Bioinf. Gr V 1D Vorm. Vorm. Gr Bioinf. Gr Bioinf. nachm. nachm. Gr. 1-4 Gr. 1-4 (ab 15 h) GST Expression Vorkultur animpfen (V 2A) 9 h 9 h 9 h 9 h Vortrag 1 Gr. 1-4 V 1E Gr. 1-4 V 1D Gr. 1-4 V 1C Gr V. 2B Gr. 5-8 V 1B Gr. 5-8 V 1E Gr. 5-8 V 1D Gr V 1C Gr V 1B Gr V 1E Gr (ab 15 h) Gr Gr. 5-8 Vorkultur animpfen GST Expression GST Expression Gr. 5-8 (ab 15 h) (V 2A) Vorkultur animpfen 9 h Labor 9 h Labor 9 h Labor 9 h Labor Gr. 1/2 V 2E Gr. 1/2 V 2F Gr. 1/2 V 2C Gr. 9/10 V 2F Auswert Gr. 3/4 V 2C Gr. 3/4 V 2E Auswert Gr. 3/4 V 2F Gr. 11 V 2E Auswert 3. Woche Gr. 5/6 V 2F Gr. 5/6 V 2E Gr. 5/6 V 2D Seminarvorbereitung Gr. 7/8 V 2D Gr. 7/8 V 2F Auswert Gr. 7/8 V 2E Gr. 1-8 Gr. 9/10 Gr. 9/10 V 2D Gr. 9/10 V 2E Ausw 12:30 h Labor Gr. 11 Gr. 11 V 2C Gr. 11 V 2F Auswert Aufräumen 13 h Gr. 1/2 V 2E Auswert Gr. 3/4 V 2E Gr. 5/6 V 2F Auswert Gr. 7/8 V 2F Gr. 9/10 V 2C Gr. 11/12 V 2D 13 h Gr. 1/2 V 2F Auswert Gr. 3/4 V 2D Gr. 5/6 V 2E Auswert Gr. 7/8 V 2C Gr. 9/10 V 2E Gr. 11 V 2F 1 Treffpunkt N100 R Gruppe A in N100 R1.14; Gruppe B in N100 B2 3 Beilsteinzentrum 13 h Gr. 1/2 V 2D Gr. 3/4 V 2F Auswert Gr. 5/6 V 2C Gr. 7/8 V 2E Auswert Gr. 9/10 V 2F Gr. 11 V 2E 13 h Abschlussseminar 2 Gr. 1 V 2F Gr. 2 V 2E Gr. 3 V 2D Gr. 4 V 2C Gr. 5 V 2B Gr. 6 V 2A Gr. 7 V 1E Gr. 8 V 1D Gr. 9 V 1C Gr. 10/11 V 1A/B

7 Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 7 4 Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls Das Abfassen eines Praktikumprotokolls beginnt mit dem Aufschreiben aller Versuchsdetails wie Versuchsdaten und Versuchsbeobachtungen in einem Laborjournal. Protokollieren Sie alles sehr sorgfältig, vertrauen Sie nicht auf Ihr Gedächtnis! Da das Laborjounal ein Dokument ist, ist es empfehlenswert, ein fest gebundenes Heft zu benutzen statt eines Ringbuchs oder einer losen Blattsammlung und die Seiten alle durchzunummerieren. So können Sie es auf Verlangen vorzeigen oder abgeben. Alle Eintragungen in das Laborjournal können stichpunktartig knapp gehalten sein, sofern sie nur eindeutig und vollständig sind. Im Laborjournal aber auch nur hier und sonst nirgends ist auch Laborjargon (LJ) zulässig. Das krasse Gegenteil gilt für das später niederzuschreibende, eigentliche Protokoll! Bei der Erstellung des endgültigen Protokolls sind bestimmte formale und inhaltliche Standards einzuhalten. Form und Inhalt des Protokolls Allgemeines Das Protokoll sollte mit einem Deckblatt beginnen, das Ihnen zur Verfügung gestellt wird. Es trägt den Namen des Praktikums und der Universität, sowie den des(r) Ver-fassers(in) und einige zeitliche Angaben. Strukturelle Übersichtlichkeit und sprachlicher Stil helfen dem Leser des Protokolls, den Gang ihrer Experimente und Gedankengänge nachzuvollziehen. Unübersicht-lichkeit und unnütze kleine Fehler lenken vom Inhalt ab. Deshalb fügen Sie Leerzei-len und Abstände ein, wo es sinnvoll ist. Schreiben Sie Überschriften fett, gegebe-nenfalls in verschiedenen Schriftgrößen. Formulieren Sie wissenschaftlich kurz und prägnant und vermeiden Sie umständliche Darstellungen in Wort und Länge der Sätze. Gliederung einer Bachelorarbeit bzw. eines Protokolls: Jedes Protokoll soll aus den folgenden Abschnitten bestehen: Titelblatt: Hier wird der Titel der Arbeit, die Art der Arbeit, der Name und das Institut, an dem die Arbeit verfasst wurde, aufgeführt.

8 Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 8 Zusammenfassung: Hier wird auf maximal einer Seite das Thema der Arbeit und die wichtigsten Ergebnisse dargestellt. Abkürzungsverzeichnis: Hier werden alle verwendeten Abkürzungen aufgeführt Inhaltsverzeichnis: Angabe der Kapitel mit Seitenangaben Einleitung: Gibt eine Übersicht über das Thema und leitet zur speziellen Fragestellung hin. Motivation: Hier findet sich die Antwort auf die Frage: Welches Problem wurde untersucht, welche Frage studiert? Material, Methoden, Versuchsdurchführung: Hier findet sich die Antwort auf die Frage: Wie wurde die Frage, das Problem bearbeitet? Ergebnisse: Hier wird die Frage beantwortet: Welche Resultate wurden erzielt? Diskussion: Hier findet sich die Antwort auf die Frage: Was bedeuten diese Resultate? Literaturverzeichnis: Anhang: (wenn nötig) A. Einleitung Die Einleitung wird im Präteritum geschrieben. Halten Sie die Einleitung so kurz wie möglich, aber so informativ wie notwendig. Zur Einleitung gehören auch eventuelle Formelschemata, also z.b. wie das zu isolierende Enzym ein Edukt in das Produkt umwandelt. Die Einleitung endet immer mit der kurzen Beschreibung der Aufgabenstellung auch Motivation genannt. B. Material, Methoden, Versuchsdurchführung Unter Material sind aufzählungsartig unter Angabe des vollen Namens, einer eventuellen Abkürzung, der Bezugsfirma und des Reinheitsgrades die verwendeten Chemikalien, Biochemikalien und andere Hilfsmittel wie z.b. Platten für die Dünnschichtchromatographie anzugeben. Der Teil Methoden wird als einziger im Präsens geschrieben. Methoden müssen nachvollziehbar und vollständig (reproduzierbar) erläutert werden. Änderungen oder Varianten müssen klar herausgestellt werden. In dieses Kapitel gehören auch statistische Auswertungs- und Fit-Methoden und die verwendete Software. Die Versuchsdurchführung wird in der Vergangenheit geschrieben und beschreibt im Detail den tatsächlichen Ablauf der Experimente. Halten Sie sich eng an Ihr Laborjournal und beschreiben Sie, was Sie tatsächlich gemacht haben (nicht etwa, was

9 Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 9 man machen könnte). Denken Sie auch im Sinne Ihrer Nachfolger an wichtige Details wie: Welchen Zentrifugentyp habe ich über welche Zeit mit welchem Rotor bei welcher Drehzahl benutzt. Sehr hilfreich ist hier auch die Angabe der g-zahl! C. Ergebnisse Der Ergebnisteil wird ebenfalls in der Vergangenheit geschrieben. Stellen Sie all Ihre Ergebnisse in Text und, soweit möglich und notwendig, auch in Abbildungen und Tabellen dar. Der Leser muss mühelos Text und Inhalt nachvollziehen können. Untergliedern Sie gegebenenfalls den Ergebnisteil. Klarheit der Darstellung ist ungemein wichtig. Durch unklare Aussagen überlassen Sie die Interpretation dem Leser! Stellen Sie im Text einen Bezug her zu Ihren Abbildungen und Tabellen: Dabei wechseln Sie beim Schreiben in die Gegenwart! Abbildungen und Tabellen werden grundsätzlich nummeriert und die Legende, die selbsterklärend sein soll, mit einer Überschrift versehen. Grundsätzlich müssen die Achsen von Diagrammen vernünftig skaliert, mit der Größe beschriftet und mit einer Einheit versehen werden. Unterschiedliche Symbole müssen erklärt werden. Denken Sie daran, dass die Beschriftungen auch nach Einfügen ins Dokument noch lesbar sein müssen. D. Diskussion Die Diskussion kann, wenn Sie es für sinnvoll halten, mit dem Ergebnisteil zusammengefasst werden. Auch die Diskussion wird im Präteritum geschrieben. Interpretieren und diskutieren Sie Ihre Ergebnisse jeweils unter Verweis auf die entsprechende Textstelle (Abb., Tab.). Lassen Sie sich von der Frage leiten: Wo können aufgrund der gewählten Methodik Fehler in der Durchführung auftreten? Dabei ist Denkarbeit erforderlich! Nicht immer können komische Werte einfach auf fehlerhafte Geräte, fehlerhaftes Material oder mögliche Fehler beim Pipettieren geschoben werden! Bei der Diskussion ist es elementar wichtig, auf bestehende Literatur zurückzugreifen und die erzielten Ergebnisse in einen größeren Kontext zu setzen. E. Literaturverzeichnis Sobald Sie im Text Informationen aus der Literatur verwenden, müssen Sie die entsprechende Literatur zitieren. Im Text nennen Sie dabei nur die Autoren und die

10 Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 10 Jahreszahl (z.b. Tampé 2005). Bei mehr als zwei Autoren schreiben Sie et al. hinter den Erstautor (z.b. Tampé et al. 2006). Die verwendeten Literaturzitate müssen unter Angabe der erforderlichen Details im Literaturverzeichnis aufgeführt werden. Beispiel: BEISMANN-DRIEMEYER, S. und TAMPE, R. (2004): Funktion der Antigen-Transportmaschinerie TAP im zellulären Immunsystem Angew. Chemie 116, Das Literaturverzeichnis kann alphabetisch nach Erstautor aber auch nach Erscheinen im Text sortiert werden. Zur Erstellung des Literaturverzeichnisses empfiehlt sich das Programm Citavi (kostenlos auf der Uni Homepage). Kontrollieren sie das Literaturverzeichnis auf Fehler, denn nicht immer ist alles richtig abgespeichert. Bei der Verwendung von Abkürzungen von Zeitschriften, muss die international anerkannte Liste von Web of Science verwendet werden. Auch da ist wieder zu unterscheiden ob die Abkürzungen mit oder ohne Punkt enden. F. Anhang In manchen Fällen folgt noch ein Anhang, der meistens aus längeren Tabellen mit Messdaten oder größeren Abbildungen besteht. Schluss Versuchen Sie beim Schreiben Ihres Protokolls vollständige und klare Sätze zu formulieren. Lesen Sie den Text nach Fertigstellung auf Plausibilität, Aufbau und Formulierung sowie auf Rechtschreibfehler nochmals durch und/oder bitten Sie jemand um Hilfe! Vermeiden Sie ständige Wiederholungen, das langweilt den Leser. Abbildungen Jede Abbildung muss klar und deutlich sein. Die Beschriftung muss leserlich sein. Bei Diagrammen hat jede Achse einen Titel mit Angabe der untersuchten Größe und Einheit. Jede Abbildung hat eine logische Nummer und auch eine Überschrift. Wobei auf die Abbildung im Text verwiesen wird. In der Legende muss soviel Information vorhanden sein, damit die Abbildung ohne Lesen des Textes verständlich ist. Bei einem Western-Blot muss somit die Menge an geladenem Protein, die Prozentzahl des SDS-Gels sowie die Antikörper spezifiziert werde. Bei einer Säulenchromatographie muss das Laufmittel, der mögliche Gradient, die Säule sowie die Menge an analysiertem Stoff angegeben werden. Auch die Detektionswelllänge und die Flussrate sind zu nennen.

11 Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 11 Bemerkung Wenn es sinnvoll erscheint, sind Abweichungen von diesen Richtlinien erwünscht, Kreativität wird nicht bestraft!

12 Bioinformatik 12 5 Bioinformatik Die Bioinformatik ist mittlerweile ein wichtiger Teil der biochemischen Forschung. Mit Hilfe der Bioinformatik kann gezielt Literatur gesucht werden und DNA- und Proteinsequenzdaten analysiert und verglichen werden. In diesem Teil des Praktikums sollen Sie eine Übersicht über die wichtigsten Server und Programme bekommen, die für die tägliche Arbeit hilfreich sind. Wichtige Internetadressen für Biochemiker: (National Center for Biotechnology informatiom) (Brookhaven Protein data bank) (European Bioinformatics Institute) (EMBL Heidelberg) (ExPASy Proteomics server) (web of science) (webcutter) (Primer Design) (ClustalW/phylogenetischer Baum) (online Zugriff auf Zeitschriften) Aufgabe Literatur: 1. Suchen Sie die Veröffentlichung über TAP von P. Cresswell, die in Nature veröffentlicht wurde. 2. Wieviele Veröffentlichungen über TAP erschienen in Journal of Biologcal Chemistry? 3. Wie oft wurde folgende Veröffentlichung zitiert: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA 98 (13): JUN Suchen Sie verwandte Publikationen. DNA-Sequenz: 1. Suchen Sie die DNA-Sequenz von humanem TAP1. 2. Bestimmen Sie die Schnittstelle mit dem Restriktionsenzym DraIII. 3. Translatieren Sie die Sequenz und schneiden Sie die Proteinsequenz zurecht, so dass ein Protein mit 748 Aminosäuren entsteht (N-Terminus: MASSRCPAPR; C- Terminus: QAPADAPE) Protein-Sequenz: 1. Bestimmen Sie den pi, Molekulargewicht, Extinktionskoeffizienten und die Membrantopologie von TAP1. 2. Finden Sie in ABC-Transporter konservierte Sequenzen. 3. Finden Sie zu TAP1 homologe Proteine aus Säugetieren, Fischen und Vögel. 4. Erstellen Sie einen Sequenzvergleich. 5. Erstellen Sie einen phylogenetischen Baum.

13 Einführung in Origin 13 6 Einführung in Origin Diese Anleitung dient dazu die grundlegenden Eigenschaften von Origin kennen zu lernen. Eine detaillierte Anleitung gibt es als pdf File von OriginLab. Für das Praktikum werden drei verschiedene Funktionen von Origin benötigt. 1. Arbeiten mit Tabellen (Workbooks in Origin) Importieren von Daten Modifizieren von Tabellen Daten exportieren 2. Erstellen von Graphen Erstellen verschiedener Graphen Hinzufügen von Daten in einen Graph Exportieren von Graphen 3. Kurven fitten Linearer Fit Nicht-linearer Fit Erstellen eigener Gleichungen Erstellen eines einfachen Graphen Workbook Das Workbook stellt die oberste Struktur zur Organisation der Daten dar. Jedes Workbook besteht aus mehreren Worksheets und jedes Worksheet enthält Spalten von Daten. Es gibt verschiedene Datenspalten wie X. Y, Z yerror etc.. Um zu verstehen wie man mit dem Workbook umgeht, versuche folgendes: 1. Wähle Datei: Neu: Workbook 2. Wähle Datei: Import: Simple ASCII und öffne in \Samples\Curve Fitting die Datei Gaussian.dat. 3. Das Worksheet bekommt den Namen der Datei und in Sparkline gibt es eine kurze Übersicht über die Kurvenform. Unter Langname wird angegeben was dargestellt wird (stellt auch die Achsenbeschriftung dar). Um die Spalte C als FY-Fehler Spalte zu markieren, mit rechter Maustaste auf den Spaltentitel klicken, Setzen als :Y Fehlerbalken auswählen.

14 Einführung in Origin Um die Daten in einem Graphen darzustellen, werden alle Daten markiert: Zeichnen: Symbol: Punktdiagramm auswählen. 5. Alternativ die Spalten nicht markieren und Zeichnen: Symbol: Punktdiagramm auswählen. Es erscheint folgendes Fenster, in dem die X- und Y-Daten getrennt ausgewählt werden können. 6. Um die Darstellung des Graphen zu verändert, muss man auf eine Achse doppelklicken.

15 Einführung in Origin Um ein erstellten Graphen als Template zu benutzen, muss dieses Format gespeichert werden: Datei: Template Speichern unter. 8. Es gibt zwei Möglichkeiten Graphen zu exportieren: a) Als Grafikdatei, dabei bietet sich das WMF Format an: Datei: Export b) Direkt ins Dokument kopieren, wodurch der Graph auch noch verändert werden kann.

16 Einführung in Origin 16 Erstellen eines Linearen Fits 1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren. 2. Graph erstellen. 3. Linearer Fit erstellen: Analyse: Anpassen: Linearer Fit: Dialog öffnen. Hier können die Fitoptionen eingestellt werden. Bei einem Linearen Fit ist vor allem zu beachten, ob die Gerade durch den Nullpunkt geht oder nicht. 4. Im Worksheet: FitLinear1 werden die Fitparameter und die Statistik aufgelistet. Aus dem Fit werden folgende Parameter erhalten Steigung und Schnittpunkt mit der Y- Achse samt Standardfehler. Zusätzlich wird in der Statistik noch die Qualität des Fits bewertet durch z.b. den Korrelationskoeffizienten. Wichtig ist das Diagramm mit den Residuen zu analysieren, denn hier sieht man am besten systematische Abweichungen, die auf eine falsche Fitfunktion oder Probleme in der Messung schließen lassen. Die Residuen stellen die Abweichung der Datenpunkte von der Fitfunktion dar.

17 Einführung in Origin 17 Erstellen eines Nichtlinearen Fits 1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren. 2. Graph erstellen. 3. Nichtlinearer Fit erstellen: Analyse: Anpassen: Nichtlinearer Fit: Dialog öffnen. Hier können unter Kategorie und Funktion die verschiedenen Gleichungen für die Fitoptionen ausgewählt werden. Hierbei ist vor allem auf die richtige Gleichung und die Gewichtung der Fehler beim Fitten zu achten. 4. Falls Daten wissentlich aus dem Fitprozess genommen werden können, so werden sie maskiert: Daten: Datenpunkte maskieren und im Graph anklicken

18 Einführung in Origin 18 Erstellen einer eigenen Gleichung 1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren. 2. Graph erstellen. 3. Nichtlinearer Fit erstellen: Analyse: Anpassen: Nichtlinearer Fit: Dialog öffnen. Eine Kategorie auswählen und unter Funktion <Neu > anklicken. Den Funktionsname und Funktionstyp definieren. Anschließend die Variablen und Parameter definieren. Es empfiehlt sich auch Konstanten als Parameter zu definieren. Die Funktion wird eingegeben (Form: y=m*x + 5). 4. Vor dem Fitten Parameter anklicken und definieren, ob es sich um veränderliche Parameter handelt oder um Konstanten mit festem Wert.

19 Einführung in Origin 19 Fitten mit logarithmischen Skalen Beim Fitten von Inhibitionskurven, bei denen die X-Achse in log10-skala dargestellt wird, gibt es zwei Möglichkeiten. Entweder werden die Konzentrationen auf der X-Achse in log10- Werte transformiert oder man benutzt eine selber verfasste Gleichung. Die zweite Möglichkeit erlaubt anschließend die X-Achse in einer sinnvolleren logarithmischen Skala darzustellen. Darstellung mit transformierten X-Werten 1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren. 2. Spalte hinzufügen: Spalte: Spalte hinzufügen 3. Transformation der X-Werte: Spalte: Spaltenwerte errechnen. Zur Transformation der A(X)-Werte gibt man nun in das geöffnete Dialogfeld ein: log(col(a)). 4. Erstellen eines Punktdiagramms mit den transformierten X-Werten (C(X2)). 5. Fitten der Daten mit sigmoidaler Funktion: Kategorie Pharmacology; Funktion Doseresp

20 Einführung in Origin 20 Darstellung mit linearer X-Achse 1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten, Langname und Einheiten definieren. 2. Punktdiagramm erstellen. 3. X-Achse in Log10-Darstellung ändern: 4. Die bestehende DoseResp Funktion kopieren (anklicken von f(x), dann duplizieren) und in folgende Funktion ändern: y = A1 + (A2-A1)/(1 + 10^((LOGx0-(log10(x)))*p)),danach speichern 5. Fitten mit dieser Formel.

21 Anleitung zum Ansetzen von Puffern 21 7 Anleitung zum Ansetzen von Puffern Theoretischer Teil Sehr kleine Mengen einer starken Säure oder einer starken Base reichen aus, die Konzentration der Wasserstoffionen in Wasser im schwach sauren, neutralen oder schwach alkalischen Gebiet erheblich zu verändern. Der Zusatz eines Tropfens konzentrieter Säure zu einem Volumen reinen Wassers macht dieses deutlich sauer, beim Zufügen eines Tropfens konzentrierter Alkalilauge wird die Lösung deutlich basisch. Gleichwohl gibt es Lösungen, deren Wasserstoffionenkonzentration sich bei Zusatz auch größerer Mengen starker Säure oder starker Base nur recht wenig ändert. Man bezeichnet solche Lösungen als gepuffert. Pufferlösungen Im Stoffwechsel laufen zahlreiche Reaktionen ab, bei denen H + -Ionen freigesetzt oder verbraucht werden. Andererseits ist ein konstanter ph-wert im Zytoplasma oder in bestimmten Körperflüssigkeiten, wie z.b. dem Blut, lebenswichtig. Schon leichte Abweichungen können zu schweren Krankheitssymptomen führen. Stoffwechsel bedingte ph-änderungen müssen also abgepuffert werden. Im Blut wird diese Funktion von verschiedenen Puffersystemen wahrgenommen. Allgemein werden Lösungen, deren ph-wert sich bei Zugabe von Säure oder Lauge nur wenig verändert, als Pufferlösungen bezeichnet. Sie enthalten ein konjugiertes Säure-Base- Paar, wobei die Säure OHˉ-Ionen neutralisiert, die Base H + -Ionen. Pufferlösungen lassen sich herstellen, indem man schwache Säuren mit ihrem Salz (z.b. Acetatpuffer aus Essigsäure und Natriumacetat) bzw. schwache Basen mit ihrem Salz (z.b. Ammoniumpuffer aus Ammoniumchlorid und Ammoniak) mischt. Sind beide Spezies in genügend großer Konzentration vorhanden, reagiert der Acetatpuffer so: H3O + + CH3COOˉ CH3COOH + H2O Pufferung bei Zugabe starker Säure

22 Anleitung zum Ansetzen von Puffern 22 Die zugegebene starke Säure reagiert vollständig zu HOAc. Dass der ph-wert sich dennoch geringfügig ändert, hat damit zu tun, dass die gebildete Essigsäure wieder zu einem geringen Anteil dissoziieren kann. OHˉ + CH3COOH CH3COOˉ + H2O Pufferung bei Zugabe starker Base Die Pufferwirkung zeigt sich in der Titrationskurve schwacher Säuren und Basen durch das Plateau im Bereich des pk-wertes, ist also der Grund für den geringen Anstieg der Titrationskurve der Essigsäure bei ph 4 bis 6. Ähnlich verläuft die Abpufferung starker Säuren und starker Laugen durch den Ammoniumpuffer: H3O + + NH3 NH4 + + H2O Pufferung bei Zugabe starker Säure OHˉ + NH4 + NH3 + H2O Pufferung bei Zugabe starker Base In dieser Form wird der Ammoniumpuffer allerdings nur in Ausnahmefällen benutzt. Dagegen sind Derivate des Ammoniaks wie z.b. als Triethanolammoniumpuffer und Triethylammoniumpuffer häufig in Gebrauch (s. unten). Puffergleichung Das Verhalten einer Pufferlösung lässt sich auch quantitativ beschreiben. Ausgehend vom Massenwirkungsgesetz für die Dissoziation einer Säure ergibt sich für den Acetatpuffer: K S = + [H ] [CH COO ] 3 [CH COOH] 3 Durch Umformung erhält man: [H ] = K S [CH COOH] 3 [CH COO ] 3

23 Anleitung zum Ansetzen von Puffern 23 Durch Logarithmieren: [CH COOH] 3 ph = pk log S [CH COO ] Die Gleichung zeigt, dass der ph-wert der Pufferlösung vom pks-wert der Essig-säure und vom Verhältnis Essigsäure/Acetat bestimmt wird. In allgemeiner Form ist die Puffergleichung als Henderson-Hasselbalch-Gleichung bekannt. 3 - [ A ] ph = pk S log [HA] Liegt zum Beispiel in einem Acetat-Puffer Essigsäure in einer Konzentration von 0,1 mol/l und Acetat mit 0,5 mol/l vor, so lässt sich mit Hilfe der Puffergleichung der ph-wert bestimmen: 0,5 0,1 ph = 4,8 log = 5,5 Liegen Säure und konjugierte Base in gleicher Konzentration vor, so ist [HA]/[Aˉ] = 1 und die Puffergleichung wird zu ph = pks. Die Pufferlösung kann bei diesem ph-wert Zugaben von Säuren und Basen gleich gut abpuffern Liegt die Säure in zehn-fach höherer Konzentration vor, so gilt ph = pks 1. Der Puffer wirkt dann effektiv gegen die Zugabe von Basen, kann aber nur noch geringe Mengen Säure abpuffern. Als Faustregel gilt deshalb für den optimalen Einsatzbereich von Pufferlösungen: ph = pks ± 1 Da sich der Pufferbereich in der Titrationskurve deutlich abzeichnet, lässt sich an-hand von Titrationskurven der pks-wert schwacher Säuren oder Basen ermitteln (geringste Steigung der Kurve).

24 Anleitung zum Ansetzen von Puffern 24 Beispiel 1: Phosphatpuffer Phosphorsäure dissoziiert über drei Stufen: H3PO4 + H2O H2PO4ˉ + H3O + pks1 = 2,0 H2PO4ˉ + H2O HPO4 2ˉ + H3O + pks2 = 7,2 2ˉ HPO4 + H2O 3ˉ PO4 + H3O + pks3 = 12,3 Die pk-werte machen deutlich, dass die Protonenabgabe nach jeder Stufe schwieriger wird. H3PO4 ist eine mittelstarke Säure, während H2PO4ˉ eine schwache und 2ˉ HPO4 eine sehr schwache Säure ist. Entsprechend sind die Plateaus der Titrationskurve verteilt. Zu Beginn der Titration liegt der ph bei etwa 1,5. Die Lösung enthält fast nur die Spe-zies H3PO4 und H2PO4ˉ. Durch die Zugabe der Natronlauge werden sukzessive die H3PO4- Moleküle in H2PO4ˉ-Ionen überführt, bis beim ersten Äquivalenzpunkt (ÄP1) fast nur noch H2PO4ˉ-Ionen vorliegen. Beim zweiten Äquivalenzpunkt (ÄP2) liegen nur noch 2ˉ-Ionen HPO4 vor und beim dritten (ÄP3) nur noch 3ˉ, PO4 wobei der dritte Äquivalenzpunkt keine markante Steigung aufweist, weil er in den ph-bereich des Titrationsmittels Natronlauge fällt (0,1 M NaOH hat einen ph-wert von 13). Das Pla-teau im Bereich des pks2 basiert auf der Pufferung durch das konjugierte Säure-Base-Paar 2ˉ. H2PO4ˉ/HPO4 In der Praxis wird der Phosphatpuffer häufig verwendet, um neutrale ph-bereiche einzustellen, denn nach ph = pks ± 1 liegt der Pufferbe-reich zwischen ph 6,2 und 8,2.

25 Anleitung zum Ansetzen von Puffern 25 Beispiel 2: Kohlensäurepuffer Kohlendioxid (CO2) und Wasser sind die mengenmäßig wichtigsten Endprodukte des Stoffwechsels. In Wasser gelöstes Kohlendioxid reagiert zur zweiprotonigen Kohlen-säure (1), die in einer Nachfolgereaktion dissoziiert (2). (1) CO2 + H2O H2CO3 pk = 3,1 (2) H2CO3 + H2O HCO3ˉ + H3O + pks1 = 3,3 Gesamtreaktion: CO2 + 2 H2O HCO3ˉ + H3O + pk = 6,4 Das Gleichgewicht der ersten Reaktion liegt auf der linken Seite (pk = 3,1). Löst man also Kohlendioxid in Wasser, so liegt es vorwiegend als CO2 und nur zu einem gerin-gen Teil als H2CO3 vor. Reaktion (1) und (2) lassen sich zusammenziehen und die pk-werte addieren. Das Gleichgewicht der Gesamtreaktion liegt noch stärker auf der linken Seite: gelöstes Kohlendioxid reagiert als schwache Säure. Die konjugierte Base ist das Hydrogen-carbonat. Kohlendioxid und Hydrogencarbonat bilden ein Puffersystem mit einem ph-optimum bei ph = 6,4. ph = 6,4 log [HCO ] - 3 [CO ] 2 Das Kohlendioxid-Hydrogencarbonat-Puffersystem ist das bedeutendste Puffersystem des Blutes, das auf einen ph von 7,4 gepuffert ist. Das Konzentrationsverhältnis der Puffersubstanzen bei ph 7,4 lässt sich somit berechnen: - [HCO ] 10 (ph pk S ) = 10 = [CO ] 1 Da die Reaktionskonstante aber temperaturabhängig ist, der pks der Gesamtreaktion im Blut bei 37 C 6,1 statt 6,4 bei 25 C beträgt, wird das Konzentrationsverhältnis dann zu: - 1,3 [HCO 3 ] = = [CO ] 1 2 2

26 Anleitung zum Ansetzen von Puffern 26 Es liegt also ein Überschuss an Hydrogencarbonat vor, so dass das Puffersystem vor allem gegen H3O + -Ionen wirkt. Da CO2 ein Gas ist, steht das gelöste CO2 im Gleich-gewicht mit dem CO2 der Luft in der Lunge. Hier zeigt sich eine Besonderheit dieses Puffersystems. Es kann nämlich nicht nur H3O + -Ionen am Entstehungsort abpuffern, sondern auch das Reaktionsprodukt aus dem Gleichgewicht entfernen: H3O + + HCO3ˉ CO2 + 2 H2O Der senkrechte Pfeil deutet an, dass das Kohlendioxid die Lösung verlässt und in die Gasphase geht (das System verlässt). Man spricht deshalb auch von einem offenen Puffersystem. Praktischer Teil 1. 1 M Tris-hydroxymethyl-aminomethan (TRIS) ph 8,0 (HO-CH2-)3C-NH2 + H3O + (HO-CH2-)3C-NH3 + + H2O FgTRIS 121,14 pk 8,1 Menge: 0,5 L Einwage:? g Tris ph einstellen mit HCl 2. 1 M Tris-hydroxymethyl-aminomethan (TRIS) ph 7,5 (HO-CH2-)3C-NH2 + H3O + (HO-CH2-)3C-NH3 + + H2O FgTRIS 121,14 pk 8,1 Menge: 0,5 L Einwage:? g Tris ph einstellen mit HCl

27 Anleitung zum Ansetzen von Puffern 27 3.a Dinatriumhydrogenphosphat/NaCl/KCl Zunächst muss eine 1 M KCl-Lösung hergestellt werden. FgKCl 74,55 Menge: 100 ml Einwage:? g KCl Na2HPO4 14,2 g Molarität:? M NaCl 81,82 g Molarität:? M KCl (1 M) 13,25 ml Molarität:? M Auffüllen auf 1000 ml mit Wasser. FgNaCl 58,44 FgNa2HPO4 141,96 3.b Natriumdihydrogenphosphat/NaCl/KCl NaH2PO4 x H2O 2,84 g Molarität:? M NaCl 13,36 g Molarität:? M KCl (1 M) 2,65 ml Molarität:? M Auffüllen auf 200 ml mit Wasser. FgNaH2PO4 x H2O 137,99 3.c 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) ph 7,4 Der 10x PBS-Puffer wird hergestellt, indem ein vorgelegtes Volumen von 1000 ml Puffer Nr. 3a mit Puffer Nr. 3b auf ph 7,4 eingestellt wird mm Phosphatpuffer (ph 6,5): 300 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung (Na2HPO4) 500 ml 0,1 ml Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung (KH2PO4) KH2PO4 wird vorgelegt und der ph von 6,5 mit 0,1 M Na2HPO4 eingestellt

28 Anleitung zum Ansetzen von Puffern ,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ph 8,0 (HOOC-CH2-)2N-CH2-CH2-N(-CH2-COOH)2 EDTA + Mg 2+ Mg 2+ EDTA + 2 H + FgEDTA 292,24 Menge: 0,4 L Einwage:? g EDTA ph einstellen mit NaOH mm HEPES ph 7,4 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure FgHEPES 238,3 pk 7,5 Menge: 0,1 L Einwage:? g Hepes ph einstellen mit NaOH 7. TBS ph 8.0: 50 mm Tris? g FgTRIS 121, mm NaCl? g FgNaCl 58,44 ph 8.0 eiskalt! Menge: 4 L

29 Anleitung zum Ansetzen von Puffern Regenerationspuffer 1 (GST Versuch) 0,5 M Tris? g FgTRIS 121,14 0,5 M NaCl? g FgNaCl 58,44 ph 8.5 Menge: 0,5 L Regenerationspuffer 2 (GST Versuch) 0.5 M Tris? g 0,5 M NaCl? g ph 4.5 Menge: 0,5 L 9. Elutionspuffer GST Versuch TBS (Puffer 8) + 10 mm GSH (Kühlschrank) Einwage:? g GSH FgGSH 307,32 ph 8.0 muss neu eingestellt werden, eiskalt Menge: 200ml; IM KÜHLSCHRANK LANGERN

30 Anleitung zum Ansetzen von Puffern LB Medium je Liter: 5g Hefeextrakt 5g NaCl 10g Trypton/Pepton Mischung Menge: insgesamt 3,6 Liter, aufteilen in: 6 x 250ml Kolben (mit Schikane) mit je 100 ml LB-Medium 6 x 2l Kolben (mit Schikane) mit je 500ml LB-Medium Autoklavieren!

31 Der Peptidtransporter TAP 31 8 Der Peptidtransporter TAP Der Peptidtransporter TAP (transporter associated with antigen processing) spielt eine zentrale Rolle in der adaptiven Immunantwort (Abbildung 1). TAP transportiert Peptide, die vornehmlich durch proteasomale Degradation von endogenen Proteinen erzeugt wurden, vom Zytosol ins Endoplasmatische Rekikulum. Dort binden diese Peptide an MHC (major histocompatibility complex) I Moleküle. Peptidbeladene MHC I Moleküle werden an die Zelloberfläche transportiert, um dort cytotoxischen T-Zellen die antigene Fracht zu präsentieren. Erkennt eine T-Zelle ein MHC I gebundenes Peptid so führt dies zur Eliminierung dieser Virus infizierten oder entarteten Zelle. Abbildung 1: MHC I abhängige Antigenpräsentation. Bei der klassischen MHC I Antigenpräsentation werden endogene Proteine vornehmlich durch das Proteasom degradiert. Die Peptide werden mit Hilfe von TAP ins Lumen des ER transportiert und dort auf MHC I Moleküle geladen. Anschließend werden die MHC I- Peptidkomplexe an der Zelloberfläche cytotoxischen T-Zellen präsentiert. Die Faltung, Assemblierung und Beladung der MHC I Moleküle wird durch mehrere Chaperone gesteuert. TAP gehört der Familie der ABC-Transporter an. TAP bildet einen Heterodimer bestehend aus TAP1 und TAP2 (Abbildung 2). Jede Untereinheit ist aus einer N-terminalen Transmembrandomäne (TMD) und einer C-terminalen Nukleotidbindungsdomäne, die sich im Zytosol befindet, aufgebaut. Die TMD von TAP1 besteht aus 10 und von TAP2 aus 9 Transmembranhelizes. Die TMD bildet sowohl die Translokationspore und die

32 Der Peptidtransporter TAP 32 Peptidbindungsregion. Die NBD bindet über konservierte Sequenzmotive ATP und treibt durch die ATP-Hydrolyse den Peptidtransport an. TAP1 TAP2 Transmebrandomäne N-Domäne Kerndomäne Kerndomäne N-Domäne N ER Lumen N Zytosol Peptidbindungsregion Nukleotidbindungsdomäne C C Abbildung 2: Topologiemodell des TAP-Komplexes. TAP besteht aus den zwei Halbtransportern TAP1 und TAP2, die je aus einer TMD und einer NBD aufgebaut sind. Die sechs C-terminalen Transmembranhelices bilden die Kerndomäne. Die äußeren Helices sind nicht essentiell für die Transportfunktion, sondern sind an der Rekrutierung von Tapasin beteiligt. Die Peptidbindungsregion ist gelb dargestellt. Eine Vorraussetzung für den Peptidtransport ist die Bindung des Peptids an TAP. Im Gegensatz zum Peptidtransport, der die ATP-Hydrolyse zwingend erfordert, ist die Peptidbindung ATP-unabhängig. TAP bindet vorzugsweise Peptide mit einer Länge von 8 16 Aminosäuren, wobei die höchste Transporteffizienz für 8 12 Aminosäuren lange Peptide erzielt wird. Allerdings werden auch Peptide mit einer Länge bis zu 40 Aminosäuren so wie sterisch anspruchsvolle Peptide, die Modifikationen an den Seitenketten tragen, von TAP erkannt und transportiert. Mit Hilfe von kombinatorischen Peptidbibliotheken wurde die Peptidspezifität von TAP im Detail untersucht. Demnach sind für die Erkennung der Peptide die drei N-terminalen und die C-terminale Aminosäuren von Bedeutung. Da die Spezifität des C-terminalen Restes sowohl für das Immunproteasom, TAP und auch MHC I übereinstimmt, geht man von einer Koevolution dieser drei Faktoren der Antigenpräsentation aus. Die unterschiedliche Spezifität von MHC I und TAP bzgl. des N-Terminus des Peptids führt dazu, dass im ER-Lumen ein Trimmen durch Exopeptidasen erfolgt. Der mittlere Bereich des Peptides, welcher vornehmlich an der T-Zellrezeptorbindung beteiligt ist, kann höchst divergent sein in Bezug auf MHC I und TAP-Bindung. Dadurch wird gewährleistet, dass eine kleine Menge von

33 Der Peptidtransporter TAP 33 Peptidtransportern und MHC I Molekülen eine sehr große Peptiddiversität darstellen kann, um den Körper vor einem viralen Angriff zu schützen. Im Rahmen dieses Praktikums sollen die enzymatischen Eigenschaften von TAP, wie z.b. die Kinetik der Peptidbindung, die ATP-Bindung und der ATP-getriebene Transport charakterisiert werden. Dazu müssen TAP-haltige Membranen aus Insektenzellen isoliert werden und die Peptide für die kinetischen Untersuchungen mit Fluorophoren markiert werden.

34 Der Peptidtransporter TAP Membranpräparation aus Sf9-Insektenzellen (Versuch 1 A) Humanes TAP, bestehend aus TAP1 und TAP2, wird mit Hilfe des Baculovirus, der die Gene für TAP1 und TAP2 trägt, in Sf9 Insektenzellen exprimiert. Bei dem Baculovirus handelt es sich um ein DNA-Virus, der der Familie der Baculoviridae angehört. Dieses Virus befällt Endothelzellen des Mitteldarms von bestimmten Insekten wie Spodoptera frugiperda. Das Baculovirusgenom besteht aus einer zirkulären, doppelsträngigen, 130 kb langen DNA. Die Gene für TAP1 und TAP2 befinden sich auf dem Baculovirusgenom hinter dem Polyhedrinund P10-Promotor. Beides sind starke Promotoren, die schon kurz nach der Infektion angeschaltet werden. Ca. 24 h nach der Infektion ist TAP im Western Blot nachweisbar. Die Ernte der Zellen erfolgt ca. 48 h nach der Infektion. Längere Expressionszeiträume sind ungünstig, da proteolytische Degradationsprodukte von TAP auftreten. Die Insektenzellen werden bei einer Zelldichte von 1.8 * 10 6 Zellen pro ml mit einer MOI 3-5 (muliplicity of infection, gibt das Verhältnis von Virus zu Zellen an) infiziert. Die Zellen werden nach 48h geerntet, einmal mit PBS gewaschen und das Zellpellet bei -20 C gelagert. Um biochemische Versuche mit TAP durchführen zu können, werden TAP-haltige Membranen hergestellt. Dabei werden die Zellen mechanisch aufgeschlossen, nicht aufgeschlossene Zellen, Zelltrümmer und Nuclei werden durch Zentrifugation bei niedrigen g-zahlen entfernt. Anschließend werden die Membranen durch eine Ultrazentrifugationsschritt aufkonzentriert und bei -80 C gelagert. Material 20 mm Tris/HCl, ph 7,4 1 M DTT 2,5 M Sucroselösung 1 PBS (Phosphate buffered saline) 137 mm NaCl 2,7 mm KCl 10 mm Na2HPO4 2 mm KH2PO4 ph 7,0

35 Der Peptidtransporter TAP 35 Protease-Inhibitoren 250 mm Benzamidin in H2O 100 mm PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) in Isopropanol Protokoll Alle Schritte werden auf Eis oder bei 4 C (Zentrifugationen) durchgeführt. Das Pellet einer 300 ml Sf9-Insektenzellkultur wird auf Eis aufgetaut und in 20 ml Tris-Puffer aufgenommen, 1% (v/v) Proteaseinhibitoren und 1 mm DTT werden zugegeben. Die Zellen werden in einem Dounce-Homogenisator durch Hoch-und Runterziehen (40 ) des Pistills (tight) aufgeschlossen. Die Suspension wird mit 2,5 M Sucroselösung zu einer Endkonzentration von 250 mm Sucrose versetzt, noch 3x gedouncet und in ein 50 ml Falconröhrchen überführt. Nicht aufgeschlossene Zellen und Zelltrümmer werden mittels Zentrifugation pelletiert (4 min bei 200 g und 8 min bei 700 g). Der Überstand wird in ein UZ-Röhrchen überführt und 20 min bei x g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 2 ml 1 PBS resuspendiert µl Aliquots werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 C gelagert. Protein-Bestimmung: BCA-Assay (Versuch 1A) Die Konzentration des Gesamtproteins wird mit Hilfe eines Bicinchoninsäure (BCA) Assays bestimmt. Der sensitive, kolorimetrische Nachweis von Proteinen bei diesem Assay resultiert aus der Reduktion von Cu 2+ zu Cu + durch die Peptidbindung und bestimmte Aminosäuren. BCA bildet mit dem reduzierten Kupfer einen Farbkomplex, dessen Absorption bei 584 nm gemessen wird. Der BCA-Test wird nach Anleitung des Herstellers (Fa. Pierce) durchgeführt. Die Standardkurve mit 7 Punkten wird wie folgt zusammenpipettiert: Verdünnung PBS BSA-Quelle BSA Endkonzentration µg/ml A 1000 µl 53 µl stock [2 mg/ml] 100 µg/ml B 100 µl 300 µl Verdünnung A 75 µg/ml C 375 µl 375 µl Verdünnung A 50 µg/ml D 375 µl 375 µl Verdünnung C 25 µg/ml E 375 µl 375 µl Verdünnung D 12,5 µg/ml F 375 µl 375 µl Verdünnung E 6,25 µg/ml G 375 µl - 0 µg/ml

36 Der Peptidtransporter TAP 36 Die zu messenden Proben werden in verschiedenen Konzentrationen vermessen: 1:10, 1:100, 1:200, 1:500 und 1:1000 verdünnt in PBS. Die Anzahl der einzelnen Messungen des BCA- Testes wird berechnet und die Färbelösung laut folgender Formel angesetzt (pro Messung werden 150 µl Färbelösung benötigt). Alle Proben und Standardpunkte werden in Duplikaten vermessen. Ansatz der Färbelösung 25 Teile Komponente A 24 Teile Komponente B 1 Teil Komponente C Gesamt 50 Teile Aufgrund von Pipettierfehlern wird empfohlen, 10 % mehr Färbelösung als benötigt anzusetzen. 150 µl angesetzte Färbelösung und 150 µl verdünnte Probe werden in einer Mikrotiterplatte gemischt. Die Platte wird mittels Parafilm vor Verdunstung geschützt und für 30 min bei 37 C inkubiert. Anschließend werden die Absorptionen am Fluostar bei einer Wellenlänge von 584 nm ermittelt und die Proteinkonzentration berechnet. Peptid-Bindungsassay mittels Fluorescein-markiertem Peptid (Versuch 1A) Der Peptid-Bindungsassay mittels Fluorescein-markiertem Peptid dient der Quantifizierung von TAP in den Membranen. Aufgrund der Tatsache, dass in Membranen gegen einen großen Hintergrund von Proteinen gearbeitet wird, bietet dieser Assay die Möglichkeit, die Menge an TAP über die Menge an TAP-spezifisch gebundenem Peptid zu bestimmen. Die Spezifität der Bindung wird durch einen 400fachen Überschuss an unmarkiertem Kompetitor Peptid bestimmt. Material Peptide Fluoreszenz Peptid (RRYC(F)KSTEL) C4F 30 µm Kompetitor Peptid (RRYQKSTEL) R9LQK 3.5 mm 1 PBS (Phosphate buffered saline) 137 mm NaCl 2,7 mm KCl 10 mm Na2HPO4 2 mm KH2PO4 ph 7,0

37 Der Peptidtransporter TAP 37 Lyse-Puffer 1xPBS ph 7.0 SDS 1% (w/v) Platte (Fluoplate) 96-well schwarz, für Fluoreszenz Messungen Protokoll 1. TAP Bestimmung mittels Zentrifugationsassay (3fach-Bestimmung) Tabelle 1 Bindung Kompetitor TAP1/2 100 µl 100 µl C4F Peptid [30 µm] 2.5 µl 2.5 µl Kompetitor Peptid [R9LQK, 3.5 mm] µl PBS 47.5 µl 39µl 1. zu 150 µl TAP-haltigen Membranen werden 500 µl PBS gegeben. 2. Wie in Tabelle 1 dargestellt, alle Komponenten bis auf TAP-haltige Membranen (wie in 1 verdünnt) zusammenpipettieren (Die Messung erfolgt in Triplikaten). 3. Durch Zugabe der TAP-haltigen Membranen die Bindung starten min auf Eis inkubieren. 5. Bindungsansatz durch Zugabe von 1 ml eiskaltem PBS verdünnen und anschließend sofort bei rpm und 4 C für 8 min abzentrifugieren. 6. Pellets in 100 µl eiskaltem PBS resuspendieren und anschließend nochmals mit 900 µl PBS verdünnen (zügig arbeiten). 7. Zentrifugation bei rpm bei 4 C für 8 min. 8. Pellets in 300 µl Lyse-Puffer bei Raumtemperatur resuspendieren und 10 min inkubieren.

38 Der Peptidtransporter TAP Jeweils 250 µl der lysierten TAP-haltigen Membranen bzw. 250 µl der Standardreihe in ein Well der Fluoreszenz-Platte überführen und die Fluoreszenz am ELISA-Reader vermessen ( λex/em = 485/520 nm) 2. Erstellen der Standardkurve Tabelle 2 C4F Endkonz. 0 nm 2 nm 4 nm 8 nm 10 nm Lysis-Puffer 600 µl 596 µl 592 µl 584 µl 580 µl C4F Peptid (300 nm) 0 4 µl 8 µl 16 µl 20 µl Auswertung Bestimmung der TAP-Konzentration: Anhand der Standardkurve soll die Menge an TAP (Mw TAP1/2: 150 kda) bestimmt werden a. Konzentration in mol/l b. in Gewichtsprozenten der Gesamtproteinmenge

39 Der Peptidtransporter TAP Markierung von Peptiden mit Fluoreszenzfarbstoffen (Versuch 1B) Zur biochemischen Charakterisierung von TAP werden Fluoreszenz-markierte Peptide verwendet. Die Markierung des Peptides, welches ein Cystein enthält, erfolgt über dessen nukleophilen Angriff an den mit einer reaktiven Gruppe (z. B. Iodoacetamido, Maleimido) funktionalisierten Fluorophor. Zur Entfernung freien Farbstoffs und nicht markiertem Peptid wird im Anschluss an die Reaktion das Reaktionsgemisch über eine reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) aufgereinigt. Die vereinigten Elutionsfraktionen werden zur Entfernung des Lösungsmittels lyophyilisiert (gefriergetrocknet). Die Qualität des aufgereinigten Produkts wird mittels analytischer HPLC und MALDI-TOF-MS (matrix assisted laser desorption ionisation time of flight mass spectrometry) verifiziert. Material 10x PBS ph M NaCl 27 mm KCl 100 mm Na2HPO4 20 mm KH2PO4 Tricinpuffer 100 mm Tricin ph 9.0 PBS/DMF (Dimethylformamid) PBS ph % (v/v) DMF Fluorophor 50 mm in 100 % DMF lösen Peptid 3.5 mm Peptid in PBS/DMF lösen RP-HPLC HPLC Anlage der Firma Jasco Säule: PerfectSil-300ODS-C18 5 µm Protein & Peptid Säule (4.6 x 250 mm)

40 Der Peptidtransporter TAP 40 Äquilibrierung der Säule und Entwicklung eines Elutionsgradienten Linearer Gradient von 5 auf 100 % Acetonitril (ACN) in 20 min + Waschschritt: Eluent A: H2O % TFA (trifluoroacetic acid) Eluent B: ACN % TFA Flussrate: 1 ml/min 0 20 min linearer Gradient % B (1 ml/min) min 100 % B (1 ml/min) min linearer Gradient % B (1.5 ml/min) min 5 % B (1.5 ml/min) Ein alternatives Programm zur Reinigung des Reaktionsgemisches muss anschließend etabliert werden, um eine optimale Trennung der Substanzen zu gewährleisten. Protokoll Zu Beginn des Praktikumsversuches werden sowohl die Peptidsequenz als auch die chemische Zusammensetzung des Fluorophors bekannt gegeben und der entsprechende Reaktionsansatz berechnet. Nach Lösen der Edukte werden der frisch angesetzten Peptidlösung 10 µl und der Fluorophorlösung 1 µl entnommen. Diese werden mit je 400 µl Wasser verdünnt und zur späteren Zuordnung der einzelnen Peaks lichtgeschützt aufbewahrt. Die verbleibenden Eduktlösungen werden zur Vermeidung von Nebenreaktionen (Welche?) möglichst schnell gemischt und für ca. 60 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss erfolgt die Reinigung des Reaktionsgemisches mittels RP-HPLC. Zunächst muss ein geeigneter Elutionsgradient etabliert werden, um das Produkt von den Edukten zu trennen. Dazu werden pro Lauf 10 µl des Reaktionsansatzes auf die Säule aufgetragen. Nach der Etablierung eines Gradienten werden mit diesem zusätzlich die Edukte analysiert, um die Peaks den einzelnen Substanzen zweifelsfrei zuordnen zu können und eine Quantifizierung der Produktmenge über die Peakflächen zu ermöglichen. Abschließend wird der Rest des Reaktionsgemisches mit dem etablierten Gradienten aufgetrennt und das Säuleneluat in 0.5 ml Fraktionen gesammelt. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht lyophylisiert. Am nächsten Tag wird das Peptid in 100 µl Wasser gelöst und dessen Konzentration über die Absorption des Fluorophors bestimmt. Dazu werden eine 1:10 und 1:100 Verdünnung in Tricin-Puffer ph 9 hergestellt (jeweils 20 µl) und mit Hilfe eines UV/VIS-Spektrometers die Absorption gemessen. Zur Verifizierung werden nochmals 20 µl des markierten Peptids mittels HPLC analysiert und die Masse mittels MALDI-TOF-MS an einem Voyager-DE (PerSeptive Biosystems) Massenspektrometer bestimmt. Dazu werden 0.5 µl des markierten Peptids mit

41 Der Peptidtransporter TAP µl gesättigter -Cyano-4-hydroxyzimtsäure in Wasser/Acetonitril/TFA (33:67:0.1) auf dem Probenteller gemischt. Durch Verdunstung bilden sich Kristalle für die MALDI-TOF- MS (Die Massenbestimmung findet nicht während des Praktikums statt). Auswertung Bestimmen Sie die Ausbeute der Markierungsreaktion über zwei verschiedene Ansätze! a) Integration der Peakflächen von Produkt und Edukten b) Konzentrationsbestimmung des Produktes über UV/VIS-Spektroskopie

42 Der Peptidtransporter TAP Bestimmung der Bindungsaffinität (KD-Wert) eines Peptids zu TAP (Versuch 1C) Der Peptidtransporter TAP transportiert Peptide vom Zytosol ins Lumen des Endoplasmatischen Retikulums. Die höchste Transporteffizienz wird für Peptide mit einer Länge von 8 12 Aminosäuren beobachtet. Die Spezifität der Peptide beschränkt sich auf die drei N-terminalen und den C-terminalen Aminosäurenrest(e). Bevor die Peptide jedoch transportiert werden, binden sie an TAP. In diesem Praktikumsversuch soll in einem Bindungssättigungsexperiment mit den zuvor isolierten TAP-haltigen Membranen die Bindungsaffinität (KD-Wert) eines Peptids zu TAP bestimmt werden. Dazu wird die Peptidbindung an TAP in Abhängigkeit von der Peptidkonzentration untersucht. Um das Peptid detektieren zu können, wurde es mit dem Fluorophor Fluoreszein markiert, der sich mit Hilfe eines Fluoreszenzspektometers sehr empfindlich nachweisen lässt. Als Peptid wurde ein Nonamer (RRYQC (Fluoreszein) STEL) ausgewählt, da dies der optimalen Peptidlänge für TAP entspricht. Material 10x PBS ph 7.0 1,37M NaCl 27mM KCl 100mM Na2HPO4 20mM KH2PO4 Bindungspuffer 1x PBS Peptide C4F: RRYC (Fluoreszein) KSTEL R9LQK: RRYQKSTEL TAP TAP-haltige Membranen Zum Absättigen der Filtermembranen 0,3% PEI-Lösung (Poly-ethylenimin) Solubilisierungspuffer 1xPBS/1% SDS

43 Der Peptidtransporter TAP 43 Protokoll Bindungssättigungsexperiment: Auf einer 96-well Platte werden die TAP-haltigen Membranen, das Fluoreszein-markierte Peptid (C4F) und das unmarkierte Kompetitorpeptid bei 4 C zusammengegeben und mit Bindungspuffer auf das gleiche Volumen gebracht. Die Zugabe des 400-fachen molaren Überschusses von unmarkiertem Kompetitorpeptid (RRYQKSTEL) ermöglicht die Unterscheidung zwischen unspezifischer Bindung (an Gefäßwände, an die Lipidschicht der Membranen) und spezifischer Assoziation an TAP. Durch 20 min Inkubation der Proben auf Eis wird die Einstellung des Bindungsgleichgewichtes abgewartet. Währenddessen werden Filterplatten mit einem Porendurchmesser von 1 µm erst mit 200 µl 0,3%iger PEI-Lösung (lädt Filtermembran positiv) für 10 min inkubiert anschließend abgesaugt. Dann werden die Proben mit 100 µl Bindungspuffer verdünnt. So bleibt die Menge an Membranen, die in der 96-well Platte zurückgebliebenen sind möglichst gering. Anschließend können die Proben auf die vorbereiteten Filterplatten übertragen und ungebundenes Peptid abgesaugt werden. Die zurückbleibenden Membranen werden dreimal durch Zugabe und Absaugen von 100 µl kaltem Bindungspuffer gewaschen. Diese Arbeitsschritte sind wegen der einsetzenden Dissoziation bereits gebundener Peptide sehr zeitkritisch und werden daher mit einer Multi- Kanal-Pipette durchgeführt. Danach wird die Filterplatte von dem Filtrationsapparat abgenommen. Durch Zugabe von 250 µl Solubilisationspuffer (enthält 1% SDS, daher bei Zimmertemperatur aufbewahren) wird TAP denaturiert (Achtung: Schaumbildung vermeiden) und die gebundenen Peptide innerhalb von 5 Minuten freigesetzt. Aus den 250 µl Solubilisat werden 200 µl entnommen und auf eine schwarze Fluoreszenzmicrotiterplatte überführt. Um die exakte Menge an gebundenem Fluoreszein-Peptid zu quantifizieren, werden Eichlösungen zubereitet und je 200 µl in die Fluoreszenzmicrotiterplatte pipettiert. Für alle Proben wird mit einem Elisa-Reader (Ex/Em: 485/520 nm) die Fluoreszenz bestimmt. Pipettierschemata: Von allen Konzentrationen werden Triplikatbestimmungen angefertigt. Das Pipettierschema soll sich anhand folgender Endkonzentrationen von Fluoreszenz-Peptid, Kompetitor-Peptid (400 x Überschuss, jedoch min. 1µl von der 4,2mM Stocklösung) und TAP-haltigen Membranen (40 µg Gesamtproteinmenge/ well ) erstellt werden. Das

44 Der Peptidtransporter TAP 44 Gesamtvolumen beträgt 50 µl. Die Stocklösung des C4F Peptids beträgt 10 µm. Aus dieser Stocklösung müssen X weitere Verdünnungen (C4F X nm) angesetzt werden, um die im Pipettierschema angegebenen C4F Konzentration (3-300 nm) pipettieren zu können. Pipettierschema Bindungssättigungsexperiment Probe C4F Kom- TAP C4F C4F C4F C4F C4F R9LQK Bindung- Endkonz. petitor 5mg/ml X X X X X 4,2 mm spuffer [nm] R9LQK [µl] nm nm nm nm nm [µl] Pipettierschema Bindungssättigungsexperiment Eichgerade: Konzentration [nm] Fluoreszein-Peptid [µl] # - 3 # 15 # 30 # 45 # 60 # Solubilisationspuffer [µl] # aus Stocklösung: 100 nm Auswertung 1. Stellen Sie eine Eichbeziehung zwischen der Fluoreszenzintensität im Emissionsmaximum und der C4F-Peptidkonzentration her. 2. Wie ist der Kd-Wert für das untersuchte Peptid?

45 Der Peptidtransporter TAP Untersuchung der Nukleotidbindung von TAP (Versuch 1D) Als Mitglied der ABC-Transporterfamilie besitzt TAP die Eigenschaft ATP zu hydrolysieren, um den Transport von Peptiden über die ER-Membran zu energetisieren. Eine Voraussetzung für die ATP-Hydrolyse ist die ATP-Bindung. Sowohl TAP1 als auch TAP2 besitzen eine Nukleotidbindungsdomäne (NBD). Beide NBDs bilden zusammen zwei ATP-Bindestellen, die durch hochkonservierte Motive charaktrisiert sind. In diesem Versuch wird die Affinität von TAP für verschiedene Nukleotiddi- und triphosphate mittels Kompetitionsexperimenten bestimmt. Dabei wird über Immunoblotting die Nukleotid abhängige Kompetition von TAP von ATP-Agarose quantifiziert. Material Membran TAP-haltige Membranen (12,5 mg Gesamtprotein) Solubilisierung-Puffer (10 ml) 20 mm HEPES ph mm NaCl 1 mm KCl 5 mm MgCl2 2% NP-40 15% Glycerin Wasch-Puffer (50 ml) 20 mm HEPES ph mm NaCl 1 mm KCl 5 mm MgCl2 0.2% NP-40 15% Glycerin ATP-Agarose (32 mg) C8-immobilisierte ATP-Agarose Stocklösungen 200 mm HEPES ph 7,4 1,5 M NaCl 1 M MgCl2 1 M KCl 100% NP-40 86% Glycerin ( = 1,23 g/ml)

46 Der Peptidtransporter TAP 46 Protokoll Wichtig: Alle folgenden Schritte werden auf Eis durchgeführt! Sowohl die Puffer als auch die Zentrifuge müssen kalt sein. Solubilisierung: Zu TAP-haltigen Membranen (12,5 mg Gesamtprotein) wird das gleiche Volumen PBS gegeben und die Membrane werden auf Eis aufgetaut. Anschließend werden die Membranen 8 min bei 4 C und rpm zentrifugiert. Das Pellet wird in 2,5 ml Solubilisierung-Puffer resuspendiert und mindestens 30 min auf Eis inkubiert (Achtung: Luftblasen vermeiden!). Anschließend wird der Solubilisierungs-Ansatz 30 min bei 4 C und rpm im TLA-110 Rotor (Tisch-Ultrazentrifuge) zentrifugiert. Vorbereiten der ATP-Agarose: Während der Zentrifugation wird die ATP-Agarose vorbereitet. Es werden 3,5 mg ATP- Agarose pro Ansatz benötigt, d.h. insgesamt werden 28 mg auf einer Feinwaage abgewogen. Die Gesamtmenge an ATP-Agarose wird in H2O aufgenommen und 30 min inkubiert (1 ml pro 3,5 mg). Die Beads werden dann zweimal mit 4 ml Wasch-Puffer gewaschen (2 200x g, 4 C). Anschließend werden die Beads gleichmäßig auf die verschiedenen Ansätze verteilt. Dazu werden die Beads in 4 ml Waschpuffer aufgenommen und jeweils 500 µl auf ein Reaktionsgefäß gegeben (wichtig: immer auf Eis und nie austrocknen lassen). Vorbereiten der Nukleotide: Es müssen 8 verschiedene Ansätze mit verschiedenen Nukleotidkozentrationen vorbereitet werden. Das Gesamtvolumen eines Ansatzes beträgt 300 µl. Von diesen 300 µl sind 250 µl Solubilisat der Rest besteht aus Wasch-Puffer und Nukleotid. Es soll der IC50-Wert für verschiedene Nukleotide bestimmt werden (ATP, ADP, CTP und GTP) jeweils eine Gruppe wird einen IC50 Wert bestimmen. Nachdem die Zentrifugation für das Solubilisat abgeschlossen ist, kann das Solubilisat abgenommen werden und jeweils 250 µl auf den Nukleotidansatz gegeben werden. Inzwischen werden die Beads nochmals abzentrifugiert und der Überstand verworfen (Achtung keine Beads mit abnehmen). Nach 15 min werden die Nukleotidansätze auf die vorbereiteten Beads gegeben 1 h bei 4 C rotierend inkubiert. Die Ansätze werden danach 3 mal mit 500 µl Wasch-Puffer gewaschen (jeweils 2 min bei 200x g zentrifugieren). Die Beads werden in 50 µl 3x SDS-Ladepuffer resuspendiert und 20 min bei 65 C inkubiert. Danach werden die Beads bei 21000x g abzentrifugiert. 15 µl des

47 Der Peptidtransporter TAP 47 Überstands der Proben und 4 µl vom Marker werden auf das Gel geladen, das Gel gefahren und TAP durch den Western-Blot sichtbar gemacht. Folgende Konzentrationen im jeweiligen Ansatz werden benötigt: Enkonzentration Nukleotid [µm] c (Nukleotid) V (Nucleotid) V (Wasch-P.) V(Solubilisat) 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl V (gesamt) 300 µl Kleinere Volumina als 1 µl können nicht exakt pipettiert werden. Es sollten nicht mehr als zwei Vorverdünnungen vom Nukleotid gemacht werden. c - Konzentration; V Volumen SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese Der elektrophoretischen Trennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen dienen diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele. SDS ist ein anionisches Detergenz, das die Eigenladung von Proteinen überdeckt, so dass Komplexe mit konstanter negativer Ladung pro Masseneinheit entstehen. So können Proteine in einem Polyacrylamidgel nach ihrem Molekulargewicht getrennt werden. Materialien BioRad-System SDS-PAGE Gießapparatur 30% Acrylamid/Bisacrylamid (Verhältnis 37,5/1)) Trenngelpuffer: 1,5 M Tris/ HCl, 0,4 % SDS, ph 8,8 Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris/ HCl 0,4 % SDS, ph 6,8 10% APS (Ammoniumperoxidsulfat) TEMED Lauf-Puffer: 25 mm Tris/HCl 192 mm Glycin 0.1% (w/v) SDS ph 8.8

48 Der Peptidtransporter TAP 48 Protokoll Zur Vorbereitung der SDS-Gele werden die Gießkammern entsprechend der Herstellerangaben vorbereitet. Zuerst wird die Lösung des Trenngels laut Pipettierschema angesetzt, in die beiden Gießkammern bis zu 2/3 der Gesamthöhe pipettiert und anschließend mit 1 ml Ethanol überschichtet, um alle Luftblasen zu entfernen und eine scharfe Abschlusskante des Trenngels zu erreichen. Nachdem das Gel vollständig polymerisiert ist, wird das Ethanol entfernt, die vorbereitete Sammelgellösung aufgetragen und die Probenkämme eingefügt. Die fertigen Gele werden (eingeschlagen in feuchte Papiere und Lagerung in einer kleinen Plastiktüte) über Nacht im Kühlschrank gelagert. Pipettierschema für 2 SDS-PAGE Gele 7*8,5 cm des Biorad-Systems: Trenngel 10% Sammelgel 5% H2O 3,95 ml 2,7 ml Acrylamid/Bisacrylamid 3,1 ml 650 µl Trenngelpuffer 3,95 ml - Sammelgelpuffer - 1,1 ml APS 10% 40 µl 30 µl TEMED 20 µl 10 µl Immunoblot Material SDS-PAGE Nitrocellulose-Membran (8 x 10 cm) Filterpapier (4 Stück a 10 x 10 cm) Transfer-Puffer 25 mm Tris/HCl 192 mm Glycin 0.03% (w/v) SDS 20% (v/v) Methanol ph x TBS 200 mm Tris 2.5 M NaCl 5% Milch-TBS-T 1x TBS 0,1% Triton X-100 3% Milchpulver

49 Der Peptidtransporter TAP 49 ECL1 9 ml H2O 1 ml 1 M Tris/HCl, ph 8,0 100 µl 250 mm Luminol (in DMSO) 44 µl 90 mm Coumarinsäure (in DMSO) ECL2 9 ml H2O 1 ml 1 M Tris/HCl, ph 8,0 6,4 µl 30% H2O2 Antikörper 1: 20 anti-tap1 (148.3) in 5% Milch-TBS-T 1:20000 anti-maus Meeretichperoxidase gekoppelter Antikörper in TBS-T Protokoll Nitrocellulosemembran und Filterpapiere und das Gel werden zunächst in Transferpuffer getränkt. Die Anode und Kathode (untere und obere Elektrodenplatte) des Semi-Dry-Blots werden vor dem Auflegen der Filterpapiere mit dem Transferpuffer angefeuchtet. Auf zwei Filterpapiere werden die Membran und anschließend das Gel aufgelegt. Zum Schluss wird eine weitere Lage von zwei Filterpapieren auf das Gel aufgelegt. Die obere Elektrodenplatte schließt den Aufbau ab. Achtung! Luftblassen zwischen den einzelnen Schichten des Blots lassen sich gut durch vorsichtiges Rollen mit einem 50 ml Falcon herausdrücken. Die Dauer des Elektrotransfers beträgt 90 min bei 100 ma pro Gel. Anschließend werden die Membranen 1 h bei Raumtemperatur (RT) in 5% Milch-TBS-T inkubiert. TAP1 wird mit dem Hybridomüberstand nachgewiesen. Dabei wird die Membran mit dem Antikörper mindestens 1 h bei RT (besser über Nacht bei 4 C) inkubiert. Anschließend wird die Membran 3 x 5 min mit TBS-T gewaschen und 1 h mit dem Ziege-Anti-Maus-HRP-Konjugat (Fc spezifisch), bei RT inkubiert. Schließlich werden die Membranen 3 x 5 min mit TBS-T gewaschen und mit ECL1- und ECL2-Lösung 1 min inkubiert. Abschließend werden die Membranen in einem Lumi-Imager (Roche) ausgewertet und die Daten mit dem Computerprogramm Origin mit einer sigmoidalen Kurve gefittet.

50 Der Peptidtransporter TAP 50 Gleichung: Y B A B 10 ( LogIC50 X 1 * n ) A: maximales Signal B: Hintergrund IC50: Halbmaximale Verdrängung X: Logarithmus zur Basis 10 der ATP Konzentration n: Hill-Koeffizient Auswertung Bestimmen Sie den IC50 Wert für die Nukleotide. Im Protokoll müssen der Western-Blot, eine Tabelle mit den quantifizierten Banden und der Graph mit dem Fit dargestellt werden. Molekulargewichte des Markers:

51 Der Peptidtransporter TAP Peptidtransportassay (Versuch 1E) Der in vitro Peptidtransportassay basiert auf der Glykosylierung des transportierten Peptids im Lumen des Endoplasmatischen Reticulums (ER), sowie dessen spezifische Bindung an Concanavalin A-Sepharose und anschließender Trennung von nicht transportiertem Peptid. Der Transport wird in Abhängigkeit von der ATP-Konzentration ( mm), Peptid- Konzentration (0.1-2 µm), Temperatur (4-40 C), Kationen und ph (ph 5-9) untersucht. Durch Ermittlung der Fluoreszenz im ELISA-Reader wird der Peptidtransport quantifiziert. Material Peptid: RRYQNSTCL (NST-f) 1 PBS (Phosphate buffered saline) 137 mm NaCl 2,7 mm KCl 10 mm Na2HPO4 2 mm KH2PO4 ph 7,0 Stopp-Puffer 1xPBS 10 mm EDTA (ph 8,0) Lyse-Puffer 50 mm Tris/HCl, ph mm NaCl 5 mm KCl 1 mm CaCl2 1 mm MnCl2 1% NP-40 Elutionspuffer Lyse-Puffer 200 mm Methyl α-d-mannopyranoside (15 ml Lyse-Puffer versetzt mit mg Methyl α -D-Mannopyranoside)

52 Der Peptidtransporter TAP 52 Gruppe 1, 2, 6: Gruppe 4, 5: Gruppe 3, 7: Gruppe 8, 9: Gruppe 10, 11: ATP-Konz. ( 0; 0,1; 0,2; 0,3; 1; 3; 6; 10 mm) Peptid-Konz. (0.1; 0,2; 0,5; 1; 1,5; 2 µm) Temperatur (4, 12, 24, 32, 40 C) ph (ph 5: MES-Puffer; ph 6: Na-Phosphatpuffer; ph 7: HEPES-Puffer; ph 8: Tris-Puffer; ph 9: CHES-Puffer) Kationen (statt 5 mm MgCl2 im Puffer: NiCl2, CuCl2, MnCl2, CaCl2) Protokoll Das Pipettierschema für den Transportassay sieht folgender Weise aus: Transport Negativ Kontrolle Membranen 20 µl 20 µl ATP [30mM] 5 µl - MgCl2 [100 mm] 2.5 µl 2,5 µl 1x PBS 17.5 µl 22,5 µl NST-f peptid [10 µm] 5 µl 5 µl Der Reaktionsansatz wird bis auf das Peptid in 1,5 ml Reaktionsgefäße vorgelegt (auf Eis!). Je nach untersuchtem Parameter bietet es sich an, einen Mastermix anzusetzen. Der Transport wird durch Zugabe vom NST-f Peptid gestartet und erfolgt für 3 min bei 32 C. Anschließend wird durch Zugabe von 1 ml eiskaltem Stopp-Puffer der Transport gestoppt. Nach Zentrifugation für 8 min bei rpm und 4 C wird der Überstand verworfen und das Pellet in zunächst 100 µl Lyse-Puffer resuspendiert und mit weiteren 800 µl versetzt. Die Reaktionsansätze werden nach einer Inkubation von 15 min bei Raumtemperatur für 8 min bei rpm zentrifugiert. In der Zwischenzeit werden ConA-beads (50%ige Suspension (w/v)) in ein kleines Falcon überführt und 2 x mit Lysepuffer gewaschen ( x g). Der Überstand der lysierten Membranen wird zu 50 µl gewaschenen ConA-beads pipettiert und 1 h bei 4 C bzw. 30 min bei RT überkopf rotiert. Die Reaktionsansätze werden für 2 min bei 1000 rpm und 4 C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die ConA-beads werden zweimal mit je 1 ml Lyse-Puffer gewaschen, mit 300 µl Elutionspuffer versetzt und 30 min bei RT inkubiert. Die beads werden für 2 min bei 1000 rpm pelletiert, 250 µl der Elution in eine schwarze Microtiterplatte pipettiert und im ELISA-Reader quantifiziert (λex/em=485/520 nm).

53 Glutathion-S-Transferase 53 9 Glutathion-S-Transferase Zellen sehen sich einer ständigen Konfrontation von toxischen Substanzen ausgesetzt, die endogen produziert oder aus der Umgebung aufgenommen werden. Zur Abwehr dieser Toxine haben sich Abwehrmechanismen entwickelt wie zum Beispiel das sofortige Ausschleusen von Zytostatika durch entsprechende Pumpen oder die Transformation der Zytostatika mit anschließender Extrusion. Bei der Biotransformation wird die Detoxifizierung in drei Phasen untergliedert (Abb. 2.1): In Phase I und II werden die zumeist hydrophoben toxischen Substanzen in wasserlösliche Metabolite mit geringerer Toxizität umgewandelt, die dann in Phase III durch spezielle Transportsysteme aus der Zelle ausgeschleust werden. In Phase I werden die Zytostatika vornehmlich durch das Cytochrom P450 System oxidiert. Phase II Enzyme katalysieren im Folgenden die Konjugation von wasserlöslichen Substraten an die aktivierten Toxine. Meistens geschieht dies mittels Kopplung von Glutathion durch verschiedene Glutathion-S-Transferasen (GST). Abb.: 2.1: Schematische Darstellung der Detoxifizierung von Benzopyren: Benzopyren diffundiert durch die Membran, wo es in mehreren Schritten zum Epoxid oxidiert wird. Nach der Aktivierung wird das Toxin durch GST mit Glutathion markiert, wodurch es wasserlöslicher wird und von verschiedenen Transportsystemen als Substart erkannt wird (entnommen aus Sheehan et al. 2001). GSTs stellen dimere Enzyme dar, die hauptsächlich im Zytosol vorkommen. Es werden aber mit geringerer Häufigkeit mikrosomale GSTs gefunden. Die GSTs bilden sowohl Homo- als auch Heterodimer. Neben ihrer detoxifizierenden Eigenschaft sind GSTs auch noch an anderen Reaktionen wie zb. Isomerisierung von Retinolsäure und der Prostaglandinsynthese

54 Glutathion-S-Transferase 54 beteiligt oder fungieren als Peroxidasen. Zudem nehmen GSTs durch die Bindung an eine Vielzahl verschiedener zellulärer Komponenten regulatorische Funktionen ein. Wie schon erwähnt, bilden die GSTs dimere Enzyme, wobei jede Untereinheit ein katalytisches Zentrum trägt (Abb. 2.2). Trotz zweier katalytischer Zentren konnte keine Kooperativität festgestellt werden. Zur Addition oder Substitution muss die Thiolgruppe des Glutathions in seiner anionischen Form vorliegen. Zur Stabilisierung des Thiolatanions des Glutathions findet man im katalytischen Zentrum eine Base, die je nach Klasse von GST ein Tyrosin oder Serin sein kann. Humane GSTs werden in die vier Klassen Alpha, Mu, Pi und Theta eingeteilt. Neuerdings wurden auch noch die Klassen Omega und Kappa definiert. Weitere Klassen werden in Invertebraten gefunden. A B Abbildung 2.2: Struktur der Glutathion-S-Transferase: A) Kristallstruktur der murinen Glutathion-S-Transferase in Komplex mit 4-Hydroxynon-2-enal in einer Untereinheit und Glutathion in der anderen Untereinheit (PDB Code: 1B48). B) Modellierte Struktur des Fusionsproteins GST-eGFP. Schistosomen sind Helminthen, die die parasitische Krankheit Schistosomiasis (Bilharziose) verursachen, an der weltweit mehr als 275 Millionen Menschen erkrankt sind. Die GSTs von Schistosoma japonicum wurde detailliert untersucht, da angenommen wird, dass diese

55 Glutathion-S-Transferase 55 Enzyme an der Resistenz gegen Praziquantel, das meist benutzte Medikament gegen diese Krankheit, beteiligt sind. Im Praktikum arbeiten wir mit der 26 kda Glutathion-S-Transferase aus Schistosoma japonicum (SJ26). Dieses 218 Aminosäure umfassende Protein ist über einen kurzen Linker mit einem egfp (enhanced green fluorescence protein) am C-Terminus verbunden (Abb. 2.2). Dieses Fusionsprotein umfasst 486 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 55,7 kda. In der modellierten Struktur bildet sowohl das GST wie auch das GFP einen Dimer. Die Fluoreszenz von egfp vereinfacht die Detektion des Proteins und dient zur Charakterisierung der Substratbindung über fluorescence resonance energy transfer (FRET). Literatur: Sheehan D., Meade G., Foley V.M., Dowd C.A.; 2001; Structure, function and evolution of glutathione transferases: implications for classification of non-mammalian members of ancient enzyme superfamily. Biochem. J.; 360; p. 1-16

56 Glutathion-S-Transferase Überexpression von GST-eGFP (Versuch 2A) Für die Überexpression werden kompetente BL21(DE3) Zellen mit dem Plasmid peggsh6 (Abb. 2.3) transformiert. N-terminal des GST-eGFP-Gens befindet sich ein TAC-Promotor. Dieser kann durch Zugabe von IPTG (Isopropyl- -D-thiogalactopyranosid) induziert werden, wodurch es zu einer Überexpression von GST-eGFP kommt. Abbildung 2.3: Vektorkarte des Expressionsvektors peggsh6. Die Expression steht unter dem starken IPTG induzierbaren T7-Polymerase abhängigen TAC-Promotor. GST ist über einen Linker, der eine Thrombin- und TEV (tobacco etch virus) Schnittstelle enthält, mit egfp verbunden, das am Ende einen His 6-Tag trägt. Als weitere offene Leseraster findet man das Gen für die -Lactamase (bla) und den Lac-Repressor (laciq). E. coli hat eine optimale Wachstumsrate bei einer Temperatur von 37 C und einer Schüttelgeschwindigkeit von 180 rpm. Nach Erreichen einer optischen Dichte (OD600) von 0,8 in LBAmp-Medium (Selektionsmarker Ampicillin) werden die Zellen mit IPTG induziert. Die eigentliche Proteinexpression nach Induktion erfolgt bei 28 C, da bei dieser Temperatur eine höhere Ausbeute an korrekt gefaltetem Protein und weniger Abbauprodukte zu erwarten sind. Die Zellen werden für 5 h kultiviert und anschließend durch Zentrifugation geerntet. Ansetzen der Medien und der Vorkultur Materialien Autoklavierter 250 ml Erlenmeyerkolben Autoklaviertes LB-Medium

57 Glutathion-S-Transferase 57 Autoklavierte Zahnstocher Ampicilin [100 mg/ml] Schüttler für die Zellkultur, Temperatur 37 C und 28 C Medienzusammensetzung: LB (Luria Betani)-Medium 5 g Hefeextrakt 5 g NaCl 10 g Trypton/Pepton Mischung Ad 1 l H2O, autoklavieren Das Antibiotikum Ampicillin wird in einer Endkonzentration von 100 µg/ml zu dem abgekühlten Medium gegeben. Protokoll Sterile Bedingungen Alle Arbeiten werden an der Flamme ausgeführt! Alle geöffneten Gefäße und Deckel sollten in unmittelbarer Nähe der Flamme liegen! Zahnstocher nicht mit der Hand berühren! Am Abend wird der autoklavierte 250 ml Erlenmeyerkolben unter sterilen Bedingungen mit 50 ml Ampicillin-haltigem LB-Medium gefüllt, mit Hilfe eines Zahnstochers (Zahnstocher mit abgeflammter Pinzette anfassen) in dem vorbereiteten Medium angeimpft und über Nacht bei 37 C und einer Schüttelgeschwindigkeit von 180 rpm inkubiert. Proteinexpression in E. coli Materialien Autoklavierte 2 l Kolben mit 500 ml LB-Medium Ampicillin [100 mg/ml] IPTG Stammlösung [1 M] 50 ml Übernachtkultur Sterile Pipetten 1 und 10 ml Photometer, Fluoreszenzküvetten und Absorptionsküvetten Fluoreszenzspektrometer 500 ml Zentrifugenbecher Sorvall Zentrifuge 50 ml Falcons Pufferzusammensetzung 100 ml 1x PBS, ph 7,4

58 Glutathion-S-Transferase 58 Protokoll Am Morgen werden 500 ml LB-Medium mit der vorbereiteten Übernachtkultur angeimpft. Hierzu wird dem autoklavierten LB-Medium Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 µg/ml unter sterilen Bedingungen zugegeben. Das Medium wird mit dem gesamten Inhalt der Übernachtkultur (V = 50ml) angeimpft. Die Kulturen werden bei 37 C und 180 rpm inkubiert. In Zeitabständen von 20 min wird eine Probe von der Kultur entnommen und im Photometer bei einer OD von 600 nm vermessen. Die Genexpression wird bei Erreichen einer OD600 von 0,7 bis 0,8 mit IPTG in einer Endkonzentration von 0,5 mm induziert. Vor der Induktion wird zusätzlich zur OD600 Bestimmung die GFP-Fluoreszenz (Ex = 470 nm; Em = 511 nm) gemessen. Nach der Induktion werden jede Stunde die optische Dichte sowie die GFP-Fluoreszenz einer 1:10 Verdünnung (in LB-Medium) gemessen. Nach 5 Stunden Inkubation bei 28 C und 180 rpm werden die Zellen durch Zentrifugation (6.000x g, 20 min, 4 C) geerntet (Sorvall Zentrifuge, GS-3 Rotor). Die Pellets (Überstand nach Zentrifugation vollständig entfernen) werden in 1x PBS (40 ml) resuspendiert, in 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und für 20 min bei 6.000x g und 4 C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und die Zellen bei -20 C gelagert. Auswertung Das Wachstumsverhalten der Kulturen vor und nach Induktion ist in einem Diagramm (OD600 gegen Zeit) festzuhalten. Ebenso wird ab dem Zeitpunkt der Induktion die Emission bei 511 nm im Diagramm mit angegeben (zweite y-achse). Diese Kurven sollen im Protokoll diskutiert werden.

59 Glutathion-S-Transferase Reinigung von GST-eGFP (Versuch 2B) Um mit GST-eGFP biochemische Experimente durchführen zu können, ist es wichtig das überexprimierte Protein aus E. coli Zellen zu isolieren. Hierzu werden die Zellen zunächst mit Ultraschall aufgeschlossen. GST-eGFP wird über die Glutathionagarose (GSH-Agarose) gereinigt, wobei das Glutathion über seine Cysteinseitenkette mit einem 12-atomigen Spacer an die Agarose gebunden ist. Zuerst wird GST-eGFP an die GSH-Agarose gebunden, im Anschluss folgen mehrere Waschschritte, wodurch niederaffin-assoziierte Proteine abgetrennt werden. Die Elution findet mit 10 mm reduziertem Glutathion statt. Das Gluthation wird durch eine Gelfiltration entfernt, da das Glutathion mit den funktionalen Assays interferiert. WICHTIG: Es wird zwar bei Raumtemperatur gearbeitet, aber es werden nur kalte Lösungen verwendet und das Protein wird immer auf Eis gelagert. Reinigung mittels GSH-Agarose Materialien: E. coli Zellpellet mit GST-eGFP PMSF [200 mm] Stab-Ultraschall Zentrifuge (Sorvall), Zentrifugatinosröhrchen (Rotor: A8.24) Equilibrations/Wasch Puffer Elutions Puffer Gravity-flow Column (Biorad, 20 ml Fassungsvolumen) Konzentrator (Centriprep, molecular weight cut off (MWCO) 30 kda) Pufferzusammensetzung 1 l TBS ph 8,0 (filtriert durch 0,22 µm Filter): 50 mmtris 150 mmnacl ph 8,0, Filtrieren 25 ml Elutions Puffer: TBS + 10 mm red.gsh ph 8,0 (Erneute ph Einstellung!) 50 ml Regenerationspuffer 1 0,5 M Tris 0,5 M NaCl; ph 8,5 50 ml Regenerationspuffer 2 0,5 M Tris 0,5 M NaCl; ph 4,5 10% NaN3

60 Glutathion-S-Transferase 60 Protokoll Die vorbereiteten Zellpellets werden aufgetaut (Gesamtvolumen mit TBS-Puffer auf 25 ml auffüllen, damit die Zentrifugationsröhrchen vollständig gefüllt sind) und mit dem Protesaseinhibitor PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) in einer Endkonzentration von 1 mm versetzt. Die Zellen werden im Eisbad 7 min beschallt (outputcontrol 5, duty cycle 50). Anschließend werden die Zelltrümmer und unaufgeschlossene Zellen durch Zentrifugation entfernt (A8.24 Rotor, 20 min, rpm, 4 C). Die Reinigung des Proteins aus dem Zelllysat erfolgt mittels GSH-Agarose. Dazu wird eine Gravity-flow Column vorbereitet. Es werden 2 ml GSH-Agarose auf die Säule gepackt (gut resuspendieren vor der Entnahme) und der Aufbewahrungspuffer entfernt (niemals trocken laufen lassen!). Die Säule wird mit 20 ml TBS equilibriert. 20 ml des Zelllysats werden auf die Säule gegeben und diese für 20 min im Kühlraum im Überkopfrotor inkubiert. Anschließend wird der Durchfluss gesammelt und die Säule dreimal mit je 20 ml TBS gewaschen. Das Säulenmaterial, welches GST-eGFP gebunden hat, wird mit 4 ml Elutionspuffer resuspendiert und anschließend fraktionierend (5 Fraktionen mit je ca. 750 µl) eluiert. Anschließend wird für eine zweite Reinigung das Säulenmaterial mit 20 ml TBS gewaschen und der Durchfluss der ersten Reinigung nochmals an die Säule gebunden und wie erwähnt gewaschen und eluiert. Regeneration der GSH-Agarose Die GSH-Agarose kann bis zu fünfmal wieder verwendet werden ohne an Proteinausbeute oder -reinheit zu verlieren. Zwischen jeder Verwendung muss die GSH-Agarose regeneriert werden. 10 ml Regenerationspuffer 1 (0,5 M Tris; 0,5 M NaCl; ph 8,5) 10 ml H2O (milliq) 10 ml Regenerationspuffer 2 (0,5 M Tris; 0,5 M NaCl; ph 4,5) 10 ml H2O (milliq) Zur Lagerung der GSH-Agarose werden 5 ml H2O (milliq) mit 0,05 % NaN3 dazugegeben, Lagerung bei 4 C. Nach einer zweiten Aufreinigung werden die entsprechenden Eluate vereinigt und für eine anschließende Gelfiltration mittels CentriPrep aufkonzentriert. Die Eluate werden in das große Gefäß des Konzentrators gegeben und bei 1000x g für 10 min zentrifugiert (wichtig: Deckel des Konzentrators und der Zentrifuge weglassen!). Da das aufkonzentrierte Protein

61 Glutathion-S-Transferase 61 ein maximales Volumen von ca. 750 µl für eine folgende Umpufferung haben sollte, kann dieser Vorgang bis zum gewünschten Volumen wiederholt werden. WICHTIG: Nach zwei Reinigungen wird die regenerierte GSH-Agarose dem Betreuer übergeben. Während dieses Versuchs ist es wichtig, Proben für eine folgende Bradford- Proteinkonzentrationsbestimmung und eine SDS-PAGE aufzuheben. Vom Lysat, dem Flowthrough (FT), allen Waschschritten (W1-W3), von der vereinigten Elution (EL) und des aufkonzentrierten Proteins (Konz) werden Aliquots (1/50) entnommen. Von den Proben wird die Absorption bei 488 nm gemessen und der Rest bei -20 C gelagert. Umpufferung mittels Gelfiltration Materialien Aufkonzentriertes Eluat von der GSH-Agarose-Aufreinigung Gravity Flow Säule (Biorad, 20 ml Fassungsvolumen) 5 g Sephadex G 25 (Sepharose) 25 ml Becherglas TBS 20% Ethanol mit MEK vergällt Nanodrop Flüssiger Stickstoff 5 g Säulenmaterial werden mit H2O zum Quellen in einem Becherglas vermischt. Nach 30 min wird der Überstand dekantiert (entfernen von kaputtem Säulenmaterial). Daraufhin wird zweimal mit Wasser aufgefüllt, gewartet bis sich das Material gesetzt hat und wieder der Überstand dekantiert. Mit dem Material wird die Gravity Flow Säule beladen (am besten in einem Schritt). Die Säule sollte nachdem sich das Material gesetzt hat ca. 15 ml beinhalten. Nachdem die Säule mit 50 ml TBS equilibriert wurde, wird das konzentrierte GST-eGFP auf die Säule aufgetragen (langsam, Material darf nicht aufgeschlemmt werden). Dabei ist wichtig, dass fast keine Flüssigkeit mehr über dem Säulenbett steht. Die Proteinfraktion sollte langsam in das Säulenmaterial hineinlaufen. Eluiert wird mittels TBS, das Eluat wird fraktionierend in 1,5 ml Eppendorf Gefäßen gesammelt (Fraktionsgröße 0,5 ml). Das Protein kann visuell auf der Säule verfolgt werden, so dass nicht alles fraktioniert werden muss. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und die Konzentration über die Absorption von egfp bei 488 nm mittels Nanodrop bestimmt (ε488=61.000/m*cm). Zusätzlich wird auch die egfp-konzentration im Zelllysat und Durchfluss bestimmt. Nach der Elution wird die Säule

62 Glutathion-S-Transferase 62 zuerst mit 30 ml H2O und anschließend mit 30 ml 20% Ethanol gewaschen. Die Lagerung erfolgt in 20% Ethanol. Falls die Konzentration unter 10 µm liegt, wird das Protein nochmals ankonzentriert. Zuletzt wird das Protein aliquotiert (Aliqouts zwischen 50 µl und 500 µl), schockgefrostet und bei -80 C gelagert (Ein Aliquot wird für eine SDS-PAGE verwendet). Protein-Bestimmung: Bradford-Assay Um die Prorteinkonzentration im Zelllysat, Durchfluß und umgepufferter Fraktion zu bestimmen wird ein Bradford-Test durchgeführt. Hierfür wird eine Standardkurve mit 6 Punkten wie folgt pipettiert: A [1 mg/ml] B [500 µg/ml] C [250 µg/ml] D [125 µg/ml] E [62,5 µg/ml] F [0 µg/ml] H2O 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 100 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl BSA - [2 mg/ml] [1 mg/ml] [500 µg/ml] [250 µg/ml] [125 µg/ml] Zunächst wird H2O in alle beschriftete Eppendorfgefäße vorgelegt. Im Anschluss wird in die erste Probe BSA [2 mg/ml] pipettiert (gut mischen). 50 µl dieser Lösung werden in die nächste Verdünnungsstufe pipettiert, mit einer neuen Pipettenspitze gemischt und wieder 50 µl in die nächste Verdünnungsstufe (usw.). 10 µl des jeweiligen Standards werden in eine Mikrotiterplatte vorgelegt. Das Protein wird 1:10, 1:20 und 1:50 in H2O verdünnt (Gesamtvolumen ca. 50 µl). Im Anschluss werden 10 µl jeder Verdünnung in die Mikrotiterplatte pipettiert (alle Messpunkte werden in Dreifachbestimmung durchgeführt). 300 µl Bradfordreagenz werden zügig zu allen Proben zugegeben. Nach 10 min Inkubation bei RT werden die Proben bei 595 nm im Fluostar vermessen. Auswertung Die Eichgerade mit Gleichung und Bestimmtheitsmaß werden in einem Diagramm dargestellt und daraus die Proteinkonzentration der einzelnen Fraktionen berechnet, mit der der Konzentration an GST-eGFP verglichen und die Anreicherung von GST-eGFP bestimmt.

63 Glutathion-S-Transferase SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Versuch 2C) Der elektrophoretischen Trennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen dienen diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele. SDS ist ein anionisches Detergenz, das die Eigenladung von Proteinen überdeckt, so dass Komplexe mit konstanter negativer Ladung pro Masseneinheit entstehen. So können Proteine in einem Polyacrylamidgel nach ihrem Molekulargewicht getrennt werden. Materialien 30 % Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1) Tris-HCl [1,5 M], SDS [0,4%] ph 8,8 Tris-HCl [0,5 M], SDS [0,4%] ph 6,8 APS (Ammoniumperoxodisulfat) [10%] TEMED [99%, p.a.] BioRad-System SDS-PAGE Gießapparatur Protokoll Zur Vorbereitung der SDS-Gele werden die Gießkammern entsprechend der Herstellerangaben vorbereitet. Zuerst wird die Lösung des Trenngels laut Pipettierschema angesetzt, in die beiden Gießkammern bis zu 2/3 der Gesamthöhe pipettiert und anschließend mit 1 ml Ethanol überschichtet, um alle Luftblasen zu entfernen und eine scharfe Abschlusskante des Trenngels zu erreichen. Nachdem das Gel vollständig polymerisiert ist, wird das Ethanol entfernt, die vorbereitete Sammelgellösung aufgetragen und die Probenkämme eingefügt. Die fertigen Gele werden (einschlagen in feuchte Papiere und Lagerung in einer kleinen Plastiktüte) über Nacht im Kühlschrank gelagert. Pipettierschema für 2 SDS-Page Gele 7*8,5 cm des Biorad-Systems: Sammelgel 5% Trenngel 12% Acrylamid/Bisacrylamid 650 µl 3,76 ml Tris/SDS ph 8,8 [1,5 M] - 2,82 ml Tris/SDS ph 6,8 [0,5 M] 1,1 ml - H2O 2,7 ml 2,82 ml APS [10%] 30 µl 40 µl TEMED 10 µl 20 µl

64 Glutathion-S-Transferase 64 Um überprüfen zu können, ob GST-eGFP in der Expression vorhanden ist, wird eine SDS- PAGE durchgeführt. Materialien Proteinproben in SDS-Ladepuffer (10-fach) SDS-PAGE Standard Spannungsgeber Laufpuffer für SDS-PAGE (10-fach) Coomassie-Färbelösung Coomassie-Entfärbelösung Zusammensetzung der Puffer und Lösungen: Laufpuffer für SDS-Page (10-fach) 250 mm Tris-HCl 1,92 M Glycin Einstellung des ph-wertes auf 8,3 1% SDS Coomassie-Färbelösung 0,25% (w/v) Coomassie R Brilliant Blue in Coomassie-Entfärbelösung lösen Coomassie-Entfärbelösung SDS-PAGE-Ladepuffer 50% H2O 40% Ethanol 10% Eisessig 500 mm Tris-HCl, ph 8,0 44 % (v/v) Glycerin 15 % (w/v) SDS 0,5 mg/ml Bromphenolblau 1 M DTT Probenvorbereitung Probe Marker Lysat FT W1 W2 W3 Eluat Konzentrat Umgepuffert Volumen [µl] - Um die Reinigung mittels SDS-PAGE sinnvoll darzustellen, werden entsprechende Aliquots der einzelnen Schritte aufgetragen. Damit aber ein gleichmäßiges Laufverhalten erzielt wird, sollen in alle Taschen 15 µl aufgetragen werden. Deswegen werden die Volumina mit TBS ergänzt. Zudem empfiehlt es sich immer die doppelte Menge anzusetzen, um

65 Glutathion-S-Transferase 65 Pipettiertverluste auszugleichen. Nachdem die Proben mit Ladepuffer versetzt wurden, werden sie für 10 min bei 95 C inkubiert. Protokoll Die Gelelektrophorese-Kammern werden nach Herstellerangabe zusammengebaut und mit Laufpuffer (1-fach) gefüllt. Je 20 µl der denaturierten Proteinproben werden auf das SDS- Gele aufgetragen. Als Standard werden 5 µl eines Proteinmarkers mit auf das Gel aufgetragen, mit dessen Hilfe das Molekulargewicht von GST-eGFP identifiziert wird. Die Trennung der Proteine erfolgt bei 150 V. Nach der Gelelektrophorese werden die Gele in Coomassie-Färbelösung für 20 min bei Raumtemperatur und leichtem Schütteln gefärbt. Anschließend wird das nicht gebundene Coomassie durch Entfärbelösung weggewaschen, so dass die Proteinbanden sichtbar werden. Anschließend wird das Gel gewässert und zur Dokumentation gescannt. Auswertung Das SDS-Gel soll sinnvoll beschriftet dargestellt werden und die Bande des GST-eGFP soll identifiziert werden.

66 Glutathion-S-Transferase Molekulargewichtsbestimmung mit Gelfiltration (Versuch 2D) Materialien Aufgereinigts GST-eGFP Superdex 200-Säule (PrepGrade, V = 24 ml) TBS ph 8,0 (filtriert und frisch entgast durch Ultraschall (20 min im Ultraschallbad)) H2O (milliq, entgast) Äkta System (Prime) Lösung für die Eichgerade Aceton Protokoll Für die Gelfiltration wird eine Gelfiltrationssäule (Superdex 200, Säulenvolumen 24 ml) mit filtriertem TBS bei einem Fluss von 1,0 ml/min equilibriert. Anschließend werden 200 µg GST-eGFP injiziert und das Chromatogramm bei einer Wellenlänge von 280 nm aufgezeichnet. Für die Eichgerade werden β-amylase (200 kda), Albumin (66 kda) und die Carboanhydrase (29 kda) verwendet. Alle 3 Komponenten werden in einer Lösung bereitgestellt (200 µg/ml). Zur Bestimmung des Totvolumens wird Bluedextran (2000 kda) gesondert injiziert (200 µg/ml). Um die Qualität der Säule (der Säulenpackung) zu bestimmen, wird ein Effizienztest durchgeführt (Bestimmung der theoretischen Böden und Peaksymmetrie). Dazu wird in die Säule 200 µl Aceton (0,4 %) mit einer linearen Flussrate von 1,0 ml/min injiziert. Die theoretischen Böden und die Peaksymmetrie werden mit den folgenden Formeln berechnet: V 1000,5 54 e m W h L N 2 b A s a N/m: Anzahl der theoretischen Böden pro Meter Ve: Elutionsvolumen in ml Wh: Peakbreite bei halber Höhe in ml L: Gelbetthöhe in mm As: Peaksymmetrie a/b: linker/rechter Abstand zur Senkrechten des Maximums des Acetonpeaks bei 10% der Gesamthöhe

67 Glutathion-S-Transferase 67 Auswertung Chromatogramme der Gelfiltrationsläufe erstellen und diskutieren Kalibrierungsgerade aus dem Chromatogramm des Eichlaufs erstellen Berechnung des Molekulargewichtes von GST-eGFP Berechnung der theoretischen Böden und der Peaksymmetrie der Säule

68 Glutathion-S-Transferase Enzymkinetik (Versuch 2E) In diesem Versuchsteil soll die Enzymkinetik von GST-eGFP in Abhängigkeit von Glutathion, 1-Chloro-2,4-Dinitrochlorobenzol und Inhibitoren analysiert werden, um somit Km und vmax zu bestimmen. GST-eGFP katalysiert die nukleophile Substitution von 1-Chloro-2,4-dinitrobenzol an reduziertes Glutathion Dabei entsteht S-(2,4-Dinitrobenzyl)-Glutathion (Abb. 2.4), das photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm nachweisbar ist. Abbildung 2.4: Reaktionsgleichung der durch GST-eGFP katalysierten Reaktion. Nukleophile Substitution von 1-Chloro-2,4-Dinitrobenzol an reduziertes Glutathion. Es entsteht S-(2,4-Dinitrobenzyl)-Glutathion. Materialien Aufgereinigtes GST-eGFP Phosphatpuffer (ph 6,5):