Einführende Bemerkungen zum Programm

Transkript

1 Einführende Bemerkungen zum Programm Das Programm der Gentechnologischen Versuche in der Schule soll einen Einblick in die Grundlagen der Gentechnologie geben. Gemeinsam werden einige simple Experimente durchgeführt, wie sie in gentechnologisch arbeitenden Labors täglich als Routineverfahren ange wendet werden. Die einzelnen Experimente sind relativ einfach verständlich, unspektakulär, und trotzdem faszinierend. Durch die Kombination und Aneinanderreihung der einzelnen Verfahren werden in der Praxis anspruchsvolle Ziele erreicht. Durch das Kennenlernen einfacher Grundtechniken können folglich auch komplexe An wendungen, welche häufig Thema der öffentlichen Diskussion sind, besser verstanden w erden (z.b. Gentherapie, Gentests, DNA-Fingerprint, etc.). Konkret wird gemeinsam folgendes Programm durchgeführt (vgl. Blatt "Grafische Programmübersicht"): Als erstes soll DNA aus E.coli Bakterien isoliert werden. Diese Bakterien wurden vorhergehend mittels einer speziellen Technik, "Transformation" genannt, dazu gebracht, ein ringförmiges DNA-Molekül, ein sogenanntes "Plasmid", aufzunehmen. Die Sequenz, d.h. die Basenabfolge jenes Plasmids, ist ganz genau bekannt. Nach der Transformation konnten sich die Bakterien in Flüssigkultur stark vermehren, wobei das Plasmid ebenfalls multipliziert wurde. Als nächster Programmpunkt wird die aus den Bakterien isolierte, in Flüssigkeit gelöste DNA mittels Restriktionsenzymen zerschnitten. Es gibt eine grosse Palette von verschiedenen Restriktionsenzymen, jedes erkennt eine spezielle DNA-Sequenz und schneidet den DNA-Doppelstrang an entsprechender Stelle. Da die gesamte Sequenz des Plasmids bekannt ist, kann vorausberechnet werden, in wie viele und wie grosse Teile es beim Einsatz der verschiedenen Enzyme geschnitten werden wird. Nachdem die Enzyme einige Zeit auf die DNA einge wirkt haben, w erden die einzelnen DNA-Fragmente nach ihrer Grösse aufgetrennt. Dazu wird eine Methode namens "Gel-Elektrophorese" ver wendet. Das dazu benötigte Gel giesst man aus einer Agaroselösung, w elche vorher aufgekocht wird (funktioniert w ie beim Herstellen von Pudding). Die geschnittene DNA w ird dann mittels elektrischer Spannung durch das Gel gezogen, je nach Grösse wandern die einzelnen Fragmente unterschiedlich weit. Zuallerletzt kann das Gel unter UV-Licht betrachtet und das so sichtbar gemachte DNA-Bandenmuster analysiert w erden. Dann spätestens wird man sehen, ob die theoretischen Berechnungen mit dem wirklichen Resultat des Experiments übereinstimmen. Das Programm erlaubt den TeilnehmerINNEn also, selber einmal mit Laborutensilien hantieren zu können, ein Versuchsprotokoll durchzugehen und verschiedene molekularbiologische Arbeitstechniken kennenzulernen. Unterstützt von einigen theoretischen Ausführungen wird so auf neutraler Basis Hilfe geboten, besser zu verstehen, wofür der Begriff "Gentechnologie" steht, welche Perspektiven die neue Technologie eröffnet - und - welche Gefahren von ihr ausgehen könnten. Von den TeilnehmerINNEn sollte unbedingt die Gelegenheit genutzt werden, Fragen zu stellen oder Themen zu diskutieren, welche sie beschäftigen und interessieren! 10/5/2007 BB

2 G r a f i s c h e P r o g r a m m ü b e r s i c h t DNA-Plasmid Transformation Selektion Bakterium E.coli Agarplatte mit Ampicilin Vermehrung in Flüssigkultur Bakterien-Proteine (Abfall) DNA-Isolation Isolierte DNA-Plasmide (in Lösung) Restriktions-Enzyme Enzym A Enzym B DNA DNA-Verdau Enzym C Resultierende DNA-Fragmente Auftrennung der DNA-Fragmente nach Grösse Marker Gel-Elektrophorese - Agarose-Gel + DNA - 19/9/2000 BB

3 G r u n d t e c h n i k e n d e r G e n t e c h n o l o g i e Zelle DNA mittels PCR DNA Vervielfältigen im Bakterium Isolieren DNA DNA gelöst Schneiden Sortieren! Exprimieren! Pflanze Kleben Tier Lesen ATTCGGAC TTCGA... Bakterium Zellkultur 26/3/02 BB

4 Isolation von Plasmid-DNA DNA-Isolation aus einer über Nacht gewachsenen Flüssigkultur von Escherichia coli Bakterien unter der Verwendung eines kommerziellen Chemikalien-Sets der Firma QIAGEN. Bakterien sind infektiös, einige verwendete Chemikalien ätzend. Deshalb Handschuhe tragen und Abfälle (Flüssigkeiten und Material) bitte in spezielle Sammelbehälter geben! 1) Eppendorf Röhrchen mit E.coli Bakterienkultur! Komplett auftauen, dann abzentrifugieren, 3min, 5'000rpm. 2) Überstand mit Pipette absaugen und in Sammelgefäss geben. 3) Bakterien-Pellet in 250µl P1-Puffer 1 gut resuspendieren bis die Lösung homogen ist. 4) 250µl P2-Puffer 2 zugeben, zum Mischen nicht resuspendieren sondern Röhrchen lediglich mehrere Male umdrehen. 5) 350µl N3-Puffer 3 zugeben, sofort wieder mischen durch mehrmaliges Umdrehen des Röhrchens, Mischung wird wolkig (ausfallende Proteine). 6) Zentrifugation der Mischung, 10min, 10'000rpm, während Zentrifugation die blauen QUIagen Säulen vorbereiten. Säule in Auffang-Röhrchen (ohne Deckel) stellen. 7) Wenn Zentrifugation beendet, Überstand auf die Säulen geben (vorsichtig umschütten keine Pipette notwendig). 8) Zentrifugation, 60sek., 10'000rpm, DNA wird auf Säulenmembran gebunden, Durchfluss verwerfen. 9) Waschen der auf Membran gebundenen DNA durch die Zugabe von 0.75ml PE-Puffer 4, Zentrifugation 60sek., 10'000rpm. 10) Durchfluss verwerfen, erneutes Zentrifugieren um letzte Reste des PE-Puffers zu entfernen (Alkoholreste würden spätere Enzymreaktionen behindern!). 11) Säule in neues Eppendorf-Röhrchen stellen. Um DNA zu eluieren (von der Membran zu lösen) 50µl EB-Puffer 5 auf die Membran geben, für eine Minute stehen lassen, dann für 60sek. bei 10'000rpm zentrifugieren. 1 Puffer P1 sorgt für eine stabilen, idealen ph, enthält ausserdem RNase A welche störende RNA zerstört 2 Puffer P2 greift Bakterienzellwand und membran an und durchlöchert sie so, dass nur die relativ kleinen DNA-Plasmide austreten können 3 Puffer N3 denaturiert und fällt Proteine aus 4 Puffer PE enthält viel Alkohol, wäscht Salze und Proteinreste weg, löst aber DNA nicht von der Membran 5 DNA löst sich in Puffer EB und wird durch dessen günstigen ph (8.5) stabilisiert 10/5/2007 BB

5 DNA-Isolation Step by Step! Die Bakterien in der Nährlösung werden zentrifugiert. Anschliessend befinden sie sich im Pellet. P1 P2 Der Überstand wird verworfen und die Bakterien werden in Puffer P1 resuspendiert. Die Lösung ist trüb. Der Puffer P1 sorgt für einen geeigneten ph. N3 Der Überstand, in dem sich das Plasmid befindet, wird auf die Säule geladen. Durch Zentrifugation gelangt die Flüssigkeit in den unteren Teil und die Plasmid-DNA bleibt an der Filtermembran kleben. Die Plasmid-DNA wird mit dem Puffer PE gewaschen. Zum Schluss wir die Plasmid-DNA mit dem Puffer EB wieder von der Membran gelöst und befindet sich nun im Eppendorfröhrchen. Reine DNA ist so klein, dass sie nicht sichtbar ist, deshalb ist die Lösung klar. PE EB verwerfen

6 DNA-Restriktionsverdau Zerschneiden des DNA-Plasmids mittels der drei Restriktionsenzyme EcoR I, Bgl I und m! Pipettenspitzen nach jedem Schritt wechseln!! Enzyme sind sehr kostbar, bitte vorsichtig und konzentriert pipettieren! 1. Zwei Eppendorf-Röhrchen bereitstellen und beschriften (Gruppennummer, zugegebenes Enzym). 2. Reaktionsmischungen anhand des Schema zusammenpipettieren. Konzentriertes Arbeiten erforderlich!! Reihenfolge befolgen, zuerst das Wasser, zuletzt die Enzyme! Bei der Zugabe der Enzyme die Lösung durch sanftes Auf- und Abpipettieren gut mischen EcoR I µl H 2 O 5 Plasmid-DNA (puc19) 12 NEB 3 2 EcoR I (10U/µl) 1 Endvolumen 20 Bgl I µl H 2 O 5 Plasmid-DNA (puc19) 12 NEB 3 2 Bgl I(10U/µl) 1 Endvolumen 20 µl H 2 O 5 Plasmid-DNA (puc19) 12 NEB 3 2 (10U/µl) 1 Endvolumen Deckel gut verschliessen, Mischungen kurz abzentrifugieren (alle Bestandteile der Mischung werden am Boden des Eppendorf-Röhrchens vereint). 4. Die Reaktionsmischungen in den Eppendorf-Röhrchen für mindestens 30min auf 37 C (ideale Arbeitstemperatur für die verwendeten Enzyme) erwärmen. Gruppen- Nummer Enzyme EcoR I Bgl I EcoR I EcoR I Bgl I Bgl I

7 Gentechnologische Versuche in der Schule - Arbeitsblatt Schnittstellen & Fragmente S c h n i t ts t e l l e n, R e s u l tierende Fragmente Bitte im Plasmid einzeichnen : -Schnittstellen der Enzyme (genaue Position notieren) -Resultierende Fragmente (idealerweise mit verschiedenen Farben) und deren Länge in Basenpaaren (berechnen!) Hinweise: - Alle benötigten Daten können aus den ausgeteilten Unterlagen zum puc19 Plasmid (Kopie NEB-Katalog) entnommen werden - Gesamtlänge des Plasmids: 2686bp - 1kb = 1 Kilobase = 1000 Basenpaare 2.0kb 2.5kb 0 puc-19 EcoRI 0.5kb 2.5kb 0 1.0kb 1.5kb 0.5kb 2.0kb puc-19 BglI 1.0kb 2.5kb 0 1.5kb 2.0kb puc kb 2.5kb 0 1.5kb 1.0kb 2.0kb puc-19 Kombination 0.5kb 1.0kb 1.5kb 9/6/99 BB

8 Sonntag, 31. März :56 Uhr puc19 Map (1 > 2686) Site and Sequence Enzymes : 47 of 523 enzymes (Filtered) Settings : Circular, Certain Sites Only, Standard Genetic Code TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGAC 93 AGCGCGCAAAGCCACTACTGCCACTTTTGGAGACTGTGTACGTCGAGGGCCTCTGCCAGTGTCGAACAGACATTCGCCTACGGCCCTCGTCTG Page 1 AAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATA 186 TTCGGGCAGTCCCGCGCAGTCGCCCACAACCGCCCACAGCCCCGACCGAATTGATACGCCGTAGTCTCGTCTAACATGACTCTCACGTGGTAT TGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGAT 279 ACGCCACACTTTATGGCGTGTCTACGCATTCCTCTTTTATGGCGTAGTCCGCGGTAAGCGGTAAGTCCGACGCGTTGACAACCCTTCCCGCTA CGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC 372 GCCACGCCCGGAGAAGCGATAATGCGGTCGACCGCTTTCCCCCTACACGACGTTCCGCTAATTCAACCCATTGCGGTCCCAAAAGGGTCAGTG GACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGG 465 CTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGTCCGTACGTTCGAACCGCATTAGTACC TCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAA 558 AGTATCGACAAAGGACACACTTTAACAATAGGCGAGTGTTAAGGTGTGTTGTATGCTCGGCCTTCGTATTTCACATTTCGGACCCCACGGATT TGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAA 651 ACTCACTCGATTGAGTGTAATTAACGCAACGCGAGTGACGGGCGAAAGGTCAGCCCTTTGGACAGCACGGTCGACGTAATTACTTAGCCGGTT CGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTA 744 GCGCGCCCCTCTCCGCCAAACGCATAACCCGCGAGAAGGCGAAGGAGCGAGTGACTGAGCGACGCGAGCCAGCAAGCCGACGCCGCTCGCCAT TCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGG 837 AGTCGAGTGAGTTTCCGCCATTATGCCAATAGGTGTCTTAGTCCCCTATTGCGTCCTTTCTTGTACACTCGTTTTCCGGTCGTTTTCCGGTCC AACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGA 930 TTGGCATTTTTCCGGCGCAACGACCGCAAAAAGGTATCCGAGGCGGGGGGACTGCTCGTAGTGTTTTTAGCTGCGAGTTCAGTCTCCACCGCT AACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTG 1023 TTGGGCTGTCCTGATATTTCTATGGTCCGCAAAGGGGGACCTTCGAGGGAGCACGCGAGAGGACAAGGCTGGGACGGCGAATGGCCTATGGAC TCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGC 1116 AGGCGGAAAGAGGGAAGCCCTTCGCACCGCGAAAGAGTTACGAGTGCGACATCCATAGAGTCAAGCCACATCCAGCAAGCGAGGTTCGACCCG TGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCA 1209 ACACACGTGCTTGGGGGGCAAGTCGGGCTGGCGACGCGGAATAGGCCATTGATAGCAGAACTCAGGTTGGGCCATTCTGTGCTGAATAGCGGT CTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACT 1302 GACCGTCGTCGGTGACCATTGTCCTAATCGTCTCGCTCCATACATCCGCCACGATGTCTCAAGAACTTCACCACCGGATTGATGCCGATGTGA AGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCT 1395 TCTTCCTGTCATAAACCATAGACGCGAGACGACTTCGGTCAATGGAAGCCTTTTTCTCAACCATCGAGAACTAGGCCGTTTGTTTGGTGGCGA GGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGAC 1488 CCATCGCCACCAAAAAAACAAACGTTCGTCGTCTAATGCGCGTCTTTTTTTCCTAGAGTTCTTCTAGGAAACTAGAAAAGATGCCCCAGACTG GCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGT 1581 CGAGTCACCTTGCTTTTGAGTGCAATTCCCTAAAACCAGTACTCTAATAGTTTTTCCTAGAAGTGGATCTAGGAAAATTTAATTTTTACTTCA Sonntag, 31. März :56 Uhr puc19 Map (1 > 2686) Site and Sequence Page 2 TTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTT 1674 AAATTTAGTTAGATTTCATATATACTCATTTGAACCAGACTGTCAATGGTTACGAATTAGTCACTCCGTGGATAGAGTCGCTAGACAGATAAA CGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGA 1767 GCAAGTAGGTATCAACGGACTGAGGGGCAGCACATCTATTGATGCTATGCCCTCCCGAATGGTAGACCGGGGTCACGACGTTACTATGGCGCT GACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC 1860 CTGGGTGCGAGTGGCCGAGGTCTAAATAGTCGTTATTTGGTCGGTCGGCCTTCCCGGCTCGCGTCTTCACCAGGACGTTGAAATAGGCGGAGG ATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTG 1953 TAGGTCAGATAATTAACAACGGCCCTTCGATCTCATTCATCAAGCGGTCAATTATCAAACGCGTTGCAACAACGGTAACGATGTCCGTAGCAC GTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCG 2046 CACAGTGCGAGCAGCAAACCATACCGAAGTAAGTCGAGGCCAAGGGTTGCTAGTTCCGCTCAATGTACTAGGGGGTACAACACGTTTTTTCGC GTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACT 2139 CAATCGAGGAAGCCAGGAGGCTAGCAACAGTCTTCATTCAACCGGCGTCACAATAGTGAGTACCAATACCGTCGTGACGTATTAAGAGAATGA GTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGC 2232 CAGTACGGTAGGCATTCTACGAAAAGACACTGACCACTCATGAGTTGGTTCAGTAAGACTCTTATCACATACGCCGCTGGCTCAACGAGAACG CCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGG 2325 GGCCGCAGTTATGCCCTATTATGGCGCGGTGTATCGTCTTGAAATTTTCACGAGTAGTAACCTTTTGCAAGAAGCCCCGCTTTTGAGAGTTCC ATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGA 2418 TAGAATGGCGACAACTCTAGGTCAAGCTACATTGGGTGAGCACGTGGGTTGACTAGAAGTCGTAGAAAATGAAAGTGGTCGCAAAGACCCACT GCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGA 2511 CGTTTTTGTCCTTCCGTTTTACGGCGTTTTTTCCCTTATTCCCGCTGTGCCTTTACAACTTATGAGTATGAGAAGGAAAAAGTTATAATAACT AGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGA 2604 TCGTAAATAGTCCCAATAACAGAGTACTCGCCTATGTATAAACTTACATAAATCTTTTTATTTGTTTATCCCCAAGGCGCGTGTAAAGGGGCT AAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC 2686 TTTCACGGTGGACTGCAGATTCTTTGGTAATAATAGTACTGTAATTGGATATTTTTATCCGCATAGTGCTCCGGGAAAGCAG

9 Enzyme # Locations Enzyme # Locations puc19 DNA: Location of Sites Aat II Acc65 I Acc I Afl III Ahd I AlwN I Apo I Ava I BamH I Ban II Bbe I Bcg I Bpm I Bsa I BsaX I BsoB I BspM I BsrF I BstAP I Ecl136 II EcoO109 I EcoR I Hinc II Hind III Kas I Kpn I Nar I Nde I Pci I Pst I Sac I Sal I Sap I Sbf I Sca I Sfo I Sma I Sph I Ssp I Xba I Xma I Xmn I Acl I Ava II BciV I Bgl I Bmr I BsmB I BsrD I Drd I Eco57 I Fsp I Pvu I Pvu II Tat I Tfi I ApaL I Ase I BsaH I BsaW I BseS I BspH I BsrB I BssS I Bts I Csp6 I Dra I Eae I Ear I Eci I Hae II Msl I Nsp I Rsa I Ban I Bfa I BsmA I Hga I Mly I Ple I Sfc I Sml I Taq I Tsp45 I BsaJ I BseM II BsiE I Bsi HKA I Bsp1286 I Bst F5 I BstN I Fau I Fok I Hpy166 II Hpy99 I HpyCH4 IV PspG I Tai I Bsl I Hinf I MspA1 I Sau96 I BstY I Hph I Mbo II Nci I Tsp509 I There are no restriction recognition sites for the following enzymes: Afe I, Afl II, Age I, Apa I, Asc I, Avr II, Bae I, Bbs I, Bbv C I, Bcl I, Bgl II, Blp I, Bpl I, Bpu10 I, Bsa A I, BsaB I, Bse R I, Bsg I, Bsi W I, Bsm F I, Bsm I, Bsp D I, BspE I, Bsr G I, BssH II, BstB I, Bst E II, BstX I, Bst Z17 I, Bsu 36 I, Btg I, Btr I, Cla I, Dra III, Eag I, EcoN I, EcoR V, Fse I, Hpa I, Mfe I, Mlu I, Msc I, Nae I, Nco I, NgoM IV, Nhe I, Not I, Nru I, Nsi I, Pac I, Pae R7 I, Pfl F I, Pf lm I, Pme I, Pml I, Ppu10 I, PpuM I, PshA I, Psi I, PspOM I, Rsr II, Sac II, San D I, SexA I, Sfi I, Sgf I, SgrA I, SnaB I, Spe I, Srf I, Stu I, Sty I, Swa I, Tli I, Tth 111 I, Xcm I, Xho I Reference Appendix Restriction Maps 289

10 M u s t e r v e r d a u / F r a g m e n t g r ö s s e n Marker Digestion with: EcoRI 1 fragment g/aatttc EcoRI 396EcoRI 2196 BglI 1813 BglI Digestion with : gccnnnn/nggc 2 fragments BglI -> 1813 BglI BglI -> 245 BglI kb kb puc19 1.5kb 1490 Digestion with : c/tnag 6 fragments > > > > > > BglI 0.5kb 1.0kb EcoRI 396 Digestion with : EcoRI c/tnag g/aattc 7 fragments Digestion with : BglI gccnnnn/nggc c/tnag 8 fragments BglI -> > > BglI -> > > > 1813 BglI 1 74 * 171 -> 245 BglI * Fragmente <100 nicht mehr sichtbar auf diesem Gel Digestion with : BglI gccnnnn/nggc EcoRI g/aattc 3 fragments EcoRI -> 1813 BglI BglI -> 245 BglI BglI -> 396 EcoRI EcoRI -> > > > > > 396 EcoRI > /5/07 BB

11 !! Gelelektrophorese Marker Eco RI Bgl I Skala in bp 8!000 5!000 10!000 6!000 4!000 3!000 2!500 2!000 1!500 1!