Aktivität der lignocellulolytischen Enzyme in der Rhizosphäre der ausgewählten Holzarten und das Spektrum der an sie gebundenen Ektomykorrhisapilze

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1 Forschung der Möglichkeiten fűr die Minimierung des Gehaltes von organischen chadstoffen in den Wasserquellen im Erzgebirge Aktivität der lignocellulolytischen Enzyme in der Rhizosphäre der ausgewählten Holzarten und das pektrum der an sie gebundenen Ektomykorrhisapilze RNDr. Libor Mrnka, Ph.D Botanische Anstalt Akademie der Wissenschaften der Tschechischen Republik, öffentliche Forschungseinrichtung;

2 Autor: RNDr. Libor Mrnka, Ph.D. Botanische Anstalt Akademie der Wissenschaften der Tschechischen Republik, öffentliche Forschungseinrichtung Zámek 1, Průhonice Übersetzung: I. Dlouhá Korrektur: J. teyrer Photo: Libor Mrnka

3 Inhaltsverzeichnis Ziel dieser Teilarbeit 3 Abstract 3 Aktivitäten der lignocellulolytischen Enzyme 3 pektrum der Ektomykorrhisapilze 5 Molekulare Bestimmung der Ektomykorrhisapilze 7 Zusammenfassung 10 Angewendete Methodik 11 Verzeichnis der verwendeten Literatur und Informationsquellen 13 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 15 2

4 Ziel dieser Teilarbeit Das Ziel der Arbeit war, den Einfluss der ausgewählten Holzarten auf die Aktivität der lignocellulolytischen Enzyme in der Rhizosphäre dieser Holzarten auszuwerten und das pektrum der mit ihnen verbundenen Ektomykorrhisapilze zu bestimmen und weiter die festgestellten Ergebnisse im Bezug auf den Huminstoffkreislauf im Boden zu diskutieren. Abstract Die tudie befasste sich mit der Bestimmung des Einflusses der im Versuchsstandort der Talsperre Fláje vorkommenden Holzarten (Gemeine Fichte, Zitterpappel, Purpur- und Mandel-Weide) auf die Aktivität einiger lignocellulolytischer Enzyme (Laccase, Mangan-Peroxidase, sonstige Peroxidasen und Oxidasen). Es wurde ein statistisch signifikanter Einfluss der Gehölze auf die Aktivität von allen untersuchten Enzymen festgestellt. Die Rhizosphäre der Fichte wies von allen Holzarten die höchsten Aktivitäten der gemessenen Enzyme auf und der ph-wert der Fichten-Rhizosphäre war niedriger, als bei den untersuchten Laubholzarten (obwohl der Unterschied an der ignifikanzgrenze liegt). Anhand dieser Feststellungen zeigen sich die studierten Weiden aus der icht der Minimierung der Huminstofffreisetzung als besser geeignet als die Fichte, obwohl diese Feststellung durch die pezifika der Weidenprobenahmen, wie unten angeführt, belastet ist. Das pektrum der festgestellten Ektomykorrhisapilze war in Übereinstimmung mit der Erwartung und dem für diverse Holzarten unterschiedlichen tandorttyp arm. Auf keiner Holzart wurden mehr als vier Ektomykorrhisapilze festgestellt und bei allen Holzarten betrug die Vorkommenshäufigkeit des dominierenden ymbionten an den Wurzelspitzen über 60 %. Unter den ymbionten dominierten Basidiomycetes und zwar besonders aus der Familie Thelephoraceae. Für einige der identifizierten Gattungen/Arten gibt es in der Literatur Nachweise über ihre Abbaufähigkeiten mit möglicher Implikation für die gemessenen Aktivitäten der lignocellulolytischen Enzyme. Außer der Ektomykorrhisapilze wurde in den Wurzelspitzen aller untersuchten Holzarten molekular das Vorkommen von weiteren saprotrophen und parasitischen Pilzen nachgewiesen, was eine schnelle Bildung und Degradation der Ektomykorrhisapilze-Wurzelspitzen, bzw., ungünstige Bedingungen für die Entwicklung des Wurzelsystems in der untersuchten Umgebung andeutet. Obwohl die saprotrophen Fähigkeiten der Ektomykorrhisapilze allgemein nicht sehr groß sind, wirken sich diese Pilze auf die Gemeinschaft der saprotrophen Pilze und Bakterien und indirekt auch auf den zerlegungs-humifizierenden Prozess aus. Aktivitäten der lignocellulolytischen Enzyme In der Rhizosphäre der ausgewählten Holzarten und im Kontrollboden wurden Aktivitäten von vier grundlegenden lignocellulolytischen Enzymen (Laccase, Mangan-Peroxidase, sonstige Peroxidasen und Oxidasen) zusammen mit aktiver und auswechselbarer Bodenreaktion (ph- Wert) festgestellt. Analysenergebnisse der untersuchten Enzyme werden gesondert unten behandelt. Die Fichten-Rhizosphäre (M) wies eine höhere Laccase-Aktivität auf, als der Kontrollboden (K). Bei den sonstigen Holzarten waren die Unterschiede nicht signifikant, siehe Bild 1. laccase activity (µmol.min -1.g -1 DW) a b Laccase activity K M O VB1 VB2 Bild 1: Aktivität der Laccase in der Rhizosphäre der einzelnen Holzarten (Codes M, O, VB1, VB2, siehe Erläuterungen) und im Kontrollboden (K). Die unterschiedlichen Buchstaben (in Klammern, sofern eine statistisch relevante Differenz nur durch den Fisher's-LD-Test festgestellt wurde) bedeuten eine statistisch relevante Differenz (p < 0,05). Die Rhizosphäre der Rotweide (VB1) weist eine geringere MnP-Aktivität als der Kontrollboden (K) und Fichtenboden (M) auf, siehe Bild 2. Bei den anderen Holzarten sind die Differenzen nicht signifikant. a,b a,(b) a,b 3

5 Mn peroxidase activity Oxidase activity MnP activity (µmol.min -1.g -1 DW) a a a,b b a,b Ox activity (µmol.min -1.g -1 DW) a,b b a a a,b 0 K M O VB1 VB2 0 K M O VB1 VB2 Bild 2: Aktivität der Mangan-Peroxidase (MnP) in der Rhizosphäre der einzelnen Holzarten (Codes M, O, VB1, VB2, siehe Erläuterungen) und im Kontrollboden (K). Die unterschiedlichen Buchstaben bedeuten eine statistisch relevante Differenz (p< 0,05). Die Rhizosphäre der Fichte (M) hat eine höhere Peroxidase-Aktivität als die anderen Böden (bei VB2 weist eine signifikante Differenz nur der Fisher s-ld-test auf, nicht aber der Tukey s HD- Test), siehe Bild 3. Bild 4: Aktivität der Oxidasen (Ox) in der Rhizosphäre der einzelnen Holzarten (Codes M, O, VB1, VB2, siehe Erläuterungen) und im Kontrollboden (K). Die unterschiedlichen Buchstaben bedeuten die statistische Differenz (p < 0,05). Die Rhizosphären von allen Holzarten sowie der Kontrollboden waren sauer. Nach der einfaktoriellen ANOVA sind die ph-differenzen zwischen den Holzarten nicht signifikant (obwohl sie sich der ignifikanz annähern; p = 0,061), siehe Bild 5. ph (H 2 O) Peroxidase activity 5.0 Perox activity (µmol.min -1.g -1 DW) b a a,(b) a a K M O VB1 VB2 ph K M O VB1 VB2 Bild 3: Aktivität der unspezifischen Peroxidasen (Perox) in der Rhizosphäre der einzelnen Holzarten (Codes M, O, VB1, VB2, siehe Erläuterungen) und im Kontrollboden (K). Die unterschiedlichen Buchstaben (in Klammern, sofern eine statistisch relevante Differenz nur durch den Fisher's-LD-Test festgestellt wurde) bedeuten eine statistisch relevante Differenz (p < 0,05). Die Rhizosphäre der Fichte (M) hat eine höhere Oxidase-Aktivität als die Rhizosphäre der Zitterpappel (O) und der Rotweide (VB1), siehe Bild 4. Bild 5: Der ph-wert (H2O) in der Rhizosphäre der einzelnen Holzarten (Codes M, O, VB1, VB2, siehe Erläuterungen) und im Kontrollboden (K). Die Rhizosphären weisen einen gering unterschiedlichen Austausch-pH-Wert (0,1M KCl) auf und nach ANOVA sind die Differenzen zwischen den Gruppen nicht signifikant (p = 0,097), siehe Bild 6. Die nonparametrische Kruskal-Wallis ANOVA wies aber einen signifikanten Einfluss der Gehölze nach. 4

6 ph (KCl) 4.2 (a) 3.9 (a,c) (a,b,c) ph 3.6 (b) (b,c) K M O VB1 VB2 Bild 6: Der Austausch-pH-Wert (0,1M KCl) in der Rhizosphäre der einzelnen Holzarten (Codes M, O, VB1, VB2, siehe Erläuterungen) und im Kontrollboden (K). Unterschiedliche Buchstaben (in Klammern, sofern eine statistisch relevante Differenz nur durch den Fisher's-LD-Test festgestellt wurde) bedeuten eine statistische Differenz (p < 0,05). pektrum der Ektomykorrhisapilze Das Bodensubstrat wich bei den einzelnen Holzarten ein wenig ab. Wobei es bei der Fichte (im tandort befinden sich ausgewachsene wahrscheinlich durch natürliche Anflüge entsprossene Bäume) hauptsächlich um ein torfiges teilweise mit Nadelabfall und vereinzelt mit Mineralfraktionen enthaltendes ubstrat ging, waren bei der Zitterpappel (gut angewurzelte heranwachsende Baumanpflanzung, siehe Bild 7) außer dem Torfsubstrat auch Grasnarben und kleine Mengen von Mineralfraktionen vorhanden. Bei beiden Weidenarten hatte der Wurzelballen eine torfige Prägung und das Vorkommen von Mineralfraktionen war nur geringfügig und auf Zeolith ähnliche, wahrscheinlich aus dem ursprünglichen Wurzelballen stammende Partikeln eingeschränkt. Es war nicht möglich, das Maß der Beimischung des ursprünglichen ubstrates festzustellen, aber das Vorkommen von atypischen Mineralpartikeln, die es anzeigen können, wurde bei 2-3 Rotweide-Proben und 1-2 Mandel-Weide-Proben festgestellt. Die Weiden-Anpflanzung weist erkennbare Zuwächse des oberirdischen Teiles, aber geringfügige Zuwächse des nur einzeln aus dem ursprünglichen Wurzelballen in die Umgebungserde penetrierenden Wurzelsystems auf. Die mikroskopische Analyse der feinen Wurzel zeigte bei den untersuchten Baumarten eine ungleichmäßige Beschädigung des Wurzelsystems (Tabelle 1). Das niedrigste Vorkommen der be- Bild 7: Gut entwachsene Zitterpappelsetzlinge Einzäunung (im Hintergrund hochgewachsene Fichten) schädigten (abgebrochenen, nicht turgeszenten, schwer unterscheidbaren oder verwesten) Wurzelspitzen wurde bei der Fichte, das höchste bei den beiden Weidenarten festgestellt. Die Differenz lag an der ignifikanzgrenze (Kruskal Wallis ANOVA p = 0,058). Diese Differenzen können teilweise in der unterschiedlichen Präparationswiderstandsfähigkeit des Wurzelsystems der angeführten Holzarten liegen (unterschiedliche Fragilität der feinen Wurzel beim Durchwaschen). Nichtsdestoweniger war der schlechtere Zustand der Weidenwurzel bei der mikroskopischen Analyse offensichtlich (besonders bei der Rotweide). Holzart % der beschädigten pitzen M 46.5 ± 12.9 O 84.4 ± 18.2 VB ± 18.4 VB ± 35.7 Tabelle 1: Relative Häufigkeit der beschädigten (abgebrochenen, verwesten, nicht turgeszenten oder nicht unterscheidbaren) Wurzelspitzen, ausgedrückt als Verhältnis der beschädigten zu allen analysierten pitzen. Die Daten sind als Mittelwert ± EM (n=5) dargestellt. 5

7 Das pektrum der mikroskopisch differenzierten Ektomykorrhiza-Morphotypen war bei allen Gastgehölzen in Übereinstimmung mit der 2012 durchgeführten vorläufigen Analyse ziemlich arm und nicht höher als fünf Morphotypen pro eine Holzart. Bei der Fichte wurden vier Morphotypen differenziert, deren Abbildungen auf dem Bild 8 und die relative Vorkommenshäufigkeit auf dem Bild 9 dargestellt sind. Die molekulare Analyse (detaillierter siehe Abschnitt Molekulare Bestimmung der Ektomykorrhisapilze) identifizierte als Mykobionten bei einschlägigen Morphotypen folgende Pilze: M1, Tomentela sublilacina; M2, nicht identifiziert (anhand der morphologischen Kriterien als Cenococcum geophilum bestimmt); M4, Russula paludosa; M5, Cortinarius sp. Bei der Zitterpappel wurden vier Morphotypen differenziert, deren Abbildungen auf dem Bild 10 und die relative Vorkommenshäufigkeit auf dem Bild 11 dargestellt sind. Molekulare Analyse (detaillierter siehe Abschnitt Molekulare Bestimmung der Ektomykorrhisapilze) identifizierte als Mykobionten bei einschlägigen Morphotypen folgende Pilze: O1, Pisolithus sp.; O2, nicht identifiziert (anhand der morphologischen Kriterien als Cenococcum geophilum bestimmt); O3, nicht identifiziert; O5, nicht identifiziert. Mit Rücksicht auf die morphologischen Merkmale bei O5 (nicht gezweigte pitzen event. mit schwachen Andeutungen einer monopodialen gefiederten Verzweigung, ohne Rhizomorphe, mit kurzen extraradikalen Hyphen und bräunlich gefärbter Oberfläche mit silbernen Tönen), die dem O1 ähneln, halte ich es für wahrscheinlich, dass es sich um ein älteres tadium des O1 handelt. Bild 8: Mikroskopisch differenzierte Morphotypen der ektomykorrhizen ymbiosen der Gemeinen Fichte (Maßstab rechts unten) 8,8 ± 3,1 9,8 ± 8,5 4,0 ± 4,0 Tomentella sublilacina Cenococcum geophilum Russula paludosa Cortinarius sp. Bild 10: Mikroskopisch differenzierte Morphotypen der ektomykorrhisen ymbiosen der Zitterpappel (Maßstab rechts unten) nicht mykorrhise 77,4 ± 9,2 Bild 9: Relative Häufigkeit der identifizierten Ektomykorrhisa-ymbiosepilze am Wurzelsystem der Gemeinen Fichte. Die Daten sind als Prozentmittelwert aus der Gesamtzahl der analysierten Wurzelspitzen ± EM (n=5) dargestellt. 6

8 2,4 ± 1,4 22,8 ± 12,0 Pisolithus sp. Cenococcum geophilum mft3 14,3 ± 14,3 4,3 ± 1,0 1,3 ± 1,3 Tomentella ellisii Thelephora terrestris 5,3 ± 2,4 mft5 Cenococcum geophilum 60,1 ± 13,8 9,4 ± 6,1 nicht mykorrhise nicht mykorrhise 60,1 ± 13,8 Bild 11: Relative Häufigkeit der identifizierten Ektomykorrhisa-ymbiosepilze am Wurzelsystem der Zitterpappel. Die Daten sind als Prozentmittelwert aus der Gesamtzahl der analysierten Wurzelspitzen ± EM (n=5) dargestellt. Beide Weidenarten unterscheiden sich durch ihre Morphotypen kaum. Insgesamt wurden drei Weiden- Morphotypen differenziert, wobei die Abbildungen der zwei dominierenden auf dem Bild 12 und die relative Vorkommenshäufigkeit auf dem Bild 13 und 14 dargestellt sind. Die molekulare Analyse (detaillierter siehe Abschnitt Molekulare Bestimmung der Ektomykorrhisapilze) identifizierte als Mykobionten bei einschlägigen Morphotypen folgende Pilze: VB1, Tomentella ellisii; VB2, Thelephora terrestris; VB3, nicht identifiziert (anhand der morphologischen Kriterien als Cenococcum geophilum bestimmt). Die Wurzelsysteme der beiden Weiden enthielten auch eine kleinere Fraktion von nicht mykorrhizen feinen Wurzeln mit reichem Wurzelfilz. Bild 13: Relative Häufigkeit der identifizierten Ektomykorrhisa-ymbiosepilze am Wurzelsystem der Rotweide. Die Daten sind als Prozentmittelwert aus der Gesamtzahl der analysierten Wurzelspitzen ± EM (n=5) dargestellt. 6,0 ± 4,0 10,1 ± 7,7 66,4 ± 16,7 Tomentella ellisii Thelephora terrestris nicht mykorrhise Bild 14: Relative Häufigkeit der identifizierten Ektomykorrhisa-ymbiosepilze am Wurzelsystem der Mandel-Weide. Die Daten sind als Prozentmittelwert aus der Gesamtzahl der analysierten Wurzelspitzen ± EM (n=5) dargestellt. Molekulare Bestimmung der Ektomykorrhisapilze Bild 12: Mikroskopisch differenzierte Morphotypen der ektomykorrhisen ymbiosen der untersuchten Weiden (Maßstab rechts unten) Die Ergebnisse der molekularen Analyse der Wurzelspitzen mit Ektomykorrhisapilzen, die zu den mikroskopisch differenzierten Morphotypen gehören, sind in der Tabelle 2 zusammengefasst. Insgesamt wurden 31 equenzen gewonnen. Davon bildeten die in vier Familien gehörenden Ektomykorrhisapilze (Thelephoraceae, Russulaceae, Cortinariaceae und clerodermataceae) nicht ganze 26 % und alle gehören zu den höheren Pilzen (Basidiomycetes). Der anhand von morphologischen Kriterien identifizierte rezent-taxonomisch in die Familie Gloniaceae [Pleosporomycetidae incertae sedis] (patafora et al. 2012) 7

9 eingestufte Pilz Cenococcum geophilum war der einzige askomyzente Ektomykorrhisa-ymbiont. Die sonstigen identifizierten Pilze haben nach den verfügbaren Informationen eine saprotrophe oder endophytisch/parasitische Lebensweise. Bei den aprotrophen und Endophyten ging es um folgende Pilze: Trametes gibbosa, Trametes sp., Pholiota squarrosoides, Cadophora luteo-olivacea, Cladosporium sp., Debaromyces sp., Filobasidium/Cryptococcus sp. und Penicillium sp. Von den parasitären/pathogenen Pilzen wurden folgende identifiziert: Alternaria sp., Phoma sp., Melampsoridium betulinum und Cercospora sp. Der Nachweis einiger dieser Pilze in den Wurzelspitzen (Melampsoridium betulinum, Cercospora sp.) ist überraschend, weil es sich vor allem um Blattpathogene handelt; das wurde wahrscheinlich durch eine Amplifikation von poren/ Hyphen dieser Pilze, die im Bodensubstrat vorkamen und von dem die pitzen nicht vollkommen befreit wurden, verursacht. Die hohe Frequenz von saprotrophen und pathogenen Pilzen beweist, dass sich eine Reihe von pitzen schon in der Verwesung befanden. Mit Rücksicht darauf, dass für die molekulare Analyse charakteristische und gesund aussehende pitzen der gegebenen Morphotypen ausgesucht wurden, bezeugt das die nicht sehr günstigen Bedingungen für die Einwurzelung der untersuchten Holzarten. Holzart Morphotyp Isolat equenzlänge equenzüberlager. Max. Identität bp % % IZA ( Ende) (Ende) M M1 M2 M4 Zugriff- Nr. GenBank JQ , HM , HM IZA EU , FJ , KC IZA HM , JX , JQ Identität (taxonomische Einstufung) Tomentella sublilacina (Thelephoraceae, Thelephorales, Incertae sedis, Agaricomycetes, Agaricomycotina, Cercospora sp. (Mycosphaerellaceae, Capnodiales, Dothideomycetidae, Dothideomycetes, Pezizomycotina, Ascomycota) Epicoccum nigrum (Pleosporaceae, Pleosporales, Pleosporomycetidae, Dothideomycetes, Pezizomycotina, Ascomycota) Ökol. Einstuf. IZA AM uncultured ascomycete - IZA HQ , KC , KC Cladosporium/Davidiella sp. (Davidiellaceae, Capnodiales, Dothideomycetidae, Dothideomycetes, Pezizomycotina, Ascomycota) P/ IZA (228 Ende) HQ , GQ , GQ IZA FJ , EF , JQ trobilurus sp. (Physalacriaceae, Agaricales, Agaricomycetidae, Agaricomycetes, Agaricomycotina,? (Tubeufiaceae, Pleosporales, Pleosporomycetidae, Dothideomycetes, Pezizomycotina, Ascomycota) IZA DQ trobilurus sp. (Physalacriaceae, Agaricales, Agaricomycetidae, Agaricomycetes, Agaricomycotina, IZA HM , JQ , JN IZA JX , JQ , AJ IZA KC , FJ , KC IZA JQ , JF , GQ Trametes sp. (Polyporaceae, Polyporales, Incertae sedis, Agaricomycetes, Agaricomycotina, Russula paludosa (Russulaceae, Russulales, Incertae sedis, Agaricomycetes, Agaricomycotina, Trametes gibbosa (Polyporaceae, Polyporales, Incertae sedis, Agaricomycetes, Agaricomycotina,? Debaromyces sp. (Incertae sedis, accharomycetales, accharomycetidae, accharomycetes, accharomycotina, Ascomycota) E P P E 8

10 Holzart Morphotyp Isolat equenzlänge equenzüberlager. Max. Identität bp % % IZA (112 Ende) M O M5 O1 O2 O3 O4 O5 Zugriff- Nr. GenBank JQ , JQ , JQ IZA GQ , GQ , GQ IZA JN , EU , JN IZA AF , AF , FJ IZA GQ , GQ , GQ IZA GQ , HQ , AM IZA HM , FR IZA FJ , JF , FJ IZA JN , NR_ , EU IZA EU , JX , JX IZA JN , KC , JN IZA HM , FR IZA JX , FJ , AY Holzart Morphotyp Isolat equenzlänge equenzüberlager. Max. Identität bp % % IZA (110 Ende) VB VB1 VB2 Zugriff- Nr. GenBank DQ , FJ , AB IZA HQ , KC , JN IZA GU , JX , FJ IZA DQ , HQ , JN IZA HM , JF , FJ IZA FJ , DQ , HM Tabelle 2: Die molekulare Identifizierung von charakteristischen Vertretern der differenzierten Ektomykorrhisa-Morphotypen wurde anhand einer PCR- Amplifikation und folgender sequentieller Untersuchung der ribosomalen DNA (Teil U-IT1-5,8-IT- 2-LU) durchgeführt. Einzelne Proben (DNA-Isolate) sind mit einem IZA-Code gekennzeichnet und es werden ihre equenz (im Falle einiger equenzen mit schlechterer Qualität infolge der Koamplifikation von mehreren Pilzen wurde für die Identifizierung auch selbstständig der Endteil der angeführte equenz verwendet), die Überdeckung der equenz mit den wahrscheinlichsten equenzen aus der GenBank-Datenbank (% der Frequenzlänge), das 9 Identität (taxonomische Einstufung) Ökol. Einstuf. Cortinarius sp. (Cortinariaceae, Agaricales, E Agaricomycetidae, Agaricomycetes, Agaricomycotina, trobilurus sp. (Physalacriaceae, Agaricales, Agaricomycetidae, Agaricomycetes, Agaricomycotina, Melampsoridium betulinum (Pucciniastraceae, P Pucciniales, Incertae sedis, Pucciniomycetes, Pucciniomycotina, Pisolithus sp. (clerodermataceae, Boletales, E Agaricomycetidae, Agaricomycetes, Agaricomycotina, trobilurus sp. (Physalacriaceae, Agaricales, Agaricomycetidae, Agaricomycetes, Agaricomycotina, Pisolithus sp. (clerodermataceae, Boletales, E Agaricomycetidae, Agaricomycetes, Agaricomycotina,?Pezizomycotina, Ascomycota - Pholiota squarrosoides (trophariaceae, Agaricales, Agaricomycetidae, Agaricomycetes, Agaricomycotina, Filobasidium/Cryptococcus sp. (Incertae sedis, Tremellomycetes, Agaricomycotina, Alternaria sp. (Pleosporaceae, Pleosporales, Pleosporomycetidae, Dothideomycetes, Pezizomycotina, Ascomycota) Trametes gibbosa (Polyporaceae, Polyporales, Incertae sedis, Agaricomycetes, Agaricomycotina,?Pezizomycotina, Ascomycota - Phoma sp. (Incertae sedis, Pleosporales, Pleosporomycetidae, Dothideomycetes, Pezizomycotina, Ascomycota) Identität (taxonomische Einstufung) Ähnlichkeitsmaß mit diesen equenzen (max. Identität %), die Zugriffsnummern der 3 ähnlichsten equenzen der GenBank-Datenbasis, die Probenidentität (für die Artenzugehörigkeit wurde das gewöhnlich verwendete Kriterium der 97%igen Ähnlichkeit mit den identifizierten Taxonen der GenBank-Datenbasis am besten eines Voucher-Charakters) angeführt. ollte die Ähnlichkeit niedrigere Werte erreichen, ist die angeführte taxonomische Zugehörigkeit mit nichtfetten chriftzeichen dargestellt. In der letzten palte ist die ökologische trategie (E = Ektomykorrhisapilz-ymbiont, = aprotroph, P = Pathogen/Parasite) angeführt.? P P Ökol. Einstuf. Tomentella ellisii (Thelephoraceae, Thelephorales, E Incertae sedis, Agaricomycetes, Agaricomycotina,? (Pezizomycotina, Ascomycota) - Cadophora luteo-olivacea (Incertae sedis, Helotiales, Leotiomycetidae, Leotiomycetes, Pezizomycotina, Ascomycota) Tomentella ellisii (Thelephoraceae, Thelephorales, Incertae sedis, Agaricomycetes, Agaricomycotina, Penicillium sp. (Trichocomaceae, Eurotiales, Eurotiomycetidae, Eurotiomycetes, Pezizomycotina, Ascomycota) Thelephora terrestris (Thelephoraceae, Thelephorales, Incertae sedis, Agaricomycetes, Agaricomycotina, E E

11 Zusammenfassung Enzymatische Aktivitäten Die gemessenen Aktivitäten der lignocellulolytischen Enzyme wichen bei dem Kontrollboden und der Rhizosphäre der ausgewählten Holzarten (Gemeine Fichte, Zitterpappel, Rotweide und Mandel-Weide) signifikant ab. Den Einfluss der Gehölze auf lignocellulolytische Bodenaktivitäten verzeichneten auch weitere Verfasser (z. B. bei der Rot-Erle im Bestand der Douglasie, Westamerikanische Hemlocktanne und itka-fichte, siehe elmants et al. 2005). Unsere tudie wies die höchsten Aktivitäten dieser Enzyme in der Fichten- Rhizosphäre nach. Im Gegenteil die Weiden-Rhizosphären (bzw. auch Zitterpappeln- Rhizosphären) verzeichneten niedrigere Aktivitäten, auf dem Level eines nichtbewaldeten Kontroll-Bodens (im Falle der Rotweide bei der Mangan-Peroxidase sogar noch unter ihm). Werden wir einen überwiegenden Effekt der lignocellulolytischen Enzyme in Richtung zu der Huminstoff-Depolimerisation voraussetzen, sollte die Weiden-Rhizosphäre (bzw. auch Zitterpappeln-Rhizosphäre) theoretisch kleinere Mengen an Fulvinsäuren als die Fichten-Rhizosphäre freisetzen. Es sind aber zwei Faktoren in Betracht zu nehmen, die die Auswertung der Ergebnisse von enzymatischen Aktivitäten beeinflussen können. Erstens wurden Holzarten verschiedenen Alters abgenommen (entwachsene Fichten vs. junge Zitterpappeln und zwei aisonen im tandort wachsende Weiden). Obwohl wir Wurzelproben von gleichaltrigen Gehölzen abnehmen wollten, war das nicht möglich, weil es im tandort keine Fichten-Verpflanzung gab und junge Fichtesamenpflanzen wahrscheinlich durch Wilddruck und die Graspflanzen-Konkurrenz nicht vorkamen. Der zweite Faktor im Falle der Weiden war der schlechtere Zustand ihres Wurzelsystems und der näher nicht quantifizierbare Anteil des ursprünglichen (mit dem Ballen bei der Pflanzung der Weiden eingebrachten) Baumschulensubstrats in der analysierten Rhizosphäre. Der schlechtere Zustand des Ballensystems der Weiden war anhand des im Vergleich mit der Fichte oder Zitterpappel höheren Vorkommens der beschädigten Wurzelspitzen und des kleinen Wurzeldurchwuchses aus dem ursprünglichen aatballen in den Umgebungsboden merkbar. Es handelte sich um eine überraschende Feststellung, weil seit der Anpflanzung zwei Vegetationsperioden vergangen sind, der oberirdische Teil sichtlich zugenommen hat und die etzlinge demnach im guten physiologischen Zustand erscheinen. Was den ph-wert betrifft, wurden bei der Rhizosphäre der Zitterpappel und der beiden Weiden höhere Austausch-pH-Werte (die gleiche Entwicklung wurde auch bei dem aktiven ph- Wert sichtbar) gemessen, als bei der Fichte-Rhizosphäre und bei dem Kontrollboden. Der ph- Wert hat einem markanten Einfluss auf die Aktivität der lignocellulolytischen Enzyme und der Literatur nach liegt der optimale ph-wert bei der Laccase zwischen 4,2-4,5, während bei der Mangan-Peroxidase erst um die 5 (Koroleva et al. 2002). Bei dem mehr sauren Fichten-Boden (der darüber hinaus die höchste Laccasen-Aktivität in unserer tudie aufwies) ist also eine höhere Laccasen-Aktivität auch in situ vorauszusetzen. Aus der icht der Minimierung der Huminstofffreisetzung in die Umgebung zeigen sich theoretisch perspektiver die Laubbaumarten aus der Familie alicaceae, besonders die Weiden als die Gemeine Fichte. Diese chlussfolgerung sollte aber in einem längeren Zeitraum geprüft werden, in dem die Abnahme von neu wachsenden Weidenwurzeln außerhalb des ursprünglich ausgesetzten Ballens garantiert oder die Prüfung an Verpflanzungen der wurzelnackten Weidensetzlinge oder der im tandort natürlich verjüngten Weiden durchgeführt wird. Wurzel-Kolonisierung der Ektomykorrhisa- ymbionten In Übereinstimmung mit den vorläufigen vorjährigen Ergebnissen und der Literatur (z. B. Robertson et al. 2006) war das pektrum der Ektomykorrhisa-ymbionten bei allen Gastholzarten im Moor Flájské rašeliniště arm. Unter den ymbionten dominierten in erdrückender Mehrzahl Basidiomycetes (> 95 %). Die häufigsten von ihnen waren die Pilze der Familie Thelephoraceae, die auf mehr als zwei Dritteln der gesamten Mykorrhiza-Wurzelspitzen durch die Ektomykorrhisa gebildet wurden. Die Pilze dieser Familie sind in borealen und temperaten Waldökosystemen sehr häufig und den Abschätzungen nach können sie 30 % von allen Ektomykorrhisa-Morphotypen in den schwedischen borealen Wäldern repräsentieren (Buée et al. 2007). Unter ihnen waren wie die nach der Literatur in hochgewachsenen Beständen dominierenden Arten (Tomentella sublilacina), wie auch die für Pionierstandorte oder Baumschulen charakteris- 10

12 tischen Arten (Thelephora terestris, Tomentella ellisii). Unsere Feststellung, dass T. sublilacina an den ausgewachsenen Fichten dominierte, wobei die T. terestris und T. ellisii wieder an jungen ausgesetzten Weiden, entspricht den Literaturdaten. Obwohl die meisten tomentelloiden Pilze zu dem Kontakt-Explorationstyp gehören und aus der Literatur entnommen werden kann, dass sie vor allem in mineralischen Horizonten vorkommen, bilden einige tomentelloide Pilze Rhizomorphe, zählen zum Explorationstyp der Medium-Distance und kommen in organischen Horizonten vor, die saprotrophe Aktivität aufweisen können (Jakucs und Erős-Honti 2008, Lilleskov und Bruns 2003). Wie Kanufre und Zancan (1998) angeben, wurde bei einigen Vertretern der tomentelloiden Pilze (Thelephora terestris) das Vorkommen von einer ganzen Reihe digestiver extrazellulärer Enzyme (Cellulasen, Oxidasen, Polyphenol Oxidasen, Laccasen) nachgewiesen. Ähnlich sind mit diesen Enzymen wenigstens einige Arten der F. Cortinarius ausgestattet, die zu dem Explorations-ubtyp "Fringe Medium Distance" gehören und Nährstoffe durch wasserabstoßende Rhizomorphe auch aus größerer Entfernung gewinnen können (Agerer 2006, Courty et al. 2006). Die auf Weiden dominierende Tomentella ellisii wird unter den Pioniersymbionten angeführt (Huang. 2012). In der Arbeit Buée et al. (2007) wiesen wie T. sublilacina als auch T. ellisii niedrige Aktivitäten der Laccasen sowie der weiteren gemessenen Degradationsenzyme auf und es sieht also nicht aus, dass sie im größeren Maße zu den durch uns festgestellten Aktivitäten der Bodenenzyme beitragen würden. Im Gegenteil weisen einige Arten der Gattung Russula eine starke Laccasen-Aktivität auf (Buée et al. 2007). ollte das auch bei der an den Fichten-Wurzelspitzen festgestellten R. Paludosa sein, kann sich dieser Pilz hypothetisch an der erhöhten in der Fichten-Rhizosphäre festgestellten Laccasen-Aktivität beteiligen. R. Paludosa ist ein typischer obwohl nicht alzu häufiger ymbiont der feuchten Nadelholzwälder auf sauren vertorften Böden (Vasas 2002) und besitzt auch Gene für die Zellstoffdegradation (Weber et al. 2012). Der nächste der festgestellten Ektomykorrhisa- ymbionten, Cenococcum geophilum, ist ein asexualer zu dem Kontaktexplorationsarten zählender Askomycet, der mit seiner weitgehenden Verbreitung, dem Gastgeberspektrum und häufigem Vorkommen auf degradierten oder gestörten tandorten bekannt ist (Douhan und Rizzo 2005). Auch bei diesem Pilz wurde in ymbiose mit der Douglasie durch Durall et al. (1994) Cellulaseaktivität nachgewiesen. Der am meisten überraschende Befund war die Entdeckung des Ektomykorrhisapilzes Pisolithus sp. ("long distance" Explorationsart, die das Bodenprofil auch in die Entfernung von Duzenden cm penetrieren kann) auf einer Zitterpappel. Die Zitterpappel wich von den anderen Holzarten auch damit ab, dass sie tomentelloide ymbionten vermisste (ihr Vorkommen kann aber nicht ganz ausgeschlossen werden, denn einige auf der Zitterpappel vorkommende Morphotypen konnten molekular nicht nachgewiesen werden). Die Arten der Gattung Pisolithus kommen typisch auf armen und eher trockenen tandorten vor und bilden Ektomykorrhizen mit einer Reihe von Holzarten, einschl. den Pappeln aus der ektion Leuce (Cripps 2001). Das Vorkommen des Pilzes Pisolithus sp. auf der Zitterpappel auf sumpfigen Moor kann über eine Inokulation der etzlinge in der Baumschule oder eine Kontamination bei der molekularen Bestimmung (nicht sehr wahrscheinlich) zeugen. Obwohl die Produktion der lignocellulolytischen Enzyme durch die Ektomykorrhisa-ymbionten im Vergleich mit der aprotrophen beschränkt und immer noch Gegenstand von Auseinandersetzungen (Baldrian 2009) ist, wirken sich die Ektomykorrhisapilze ohne Zweifel auf die Zusammenstellung der Gemeinschaft der umliegenden Bodenbakterien (Izumi et al. 2006) und der aprotrophen (Lindahl et al. 2010) aus. Die in der Rhizosphäre der ausgewählten Holzarten festgestellten unterschiedlichen Aktivitäten der lignocellulolytischen Enzyme können so mit unterschiedlichen Gemeinschaften der Ektomykorrhisa-ymbionten auf ihren Wurzeln auch indirekt, durch die Gemeinschaft der saprotrophen Bakterien und Pilze zusammenhängen. Angewendete Methodik: Bestimmungsmethodik für enzymatische Analysen Wurzel- und Bodenproben wurden am im tandort Fláje abgenommen. Die Abnahmestellen sind auf dem Bild 15 schematisch dargestellt. Aus den Wurzeln der ausgewählten Holzarten wurde vor dem Auswaschen schonend die Rhizosphäre abgenommen und bei -20 C tiefgefroren. Die Aktivitäten der lignocellulolytischen Enzyme in der Rhizosphäre und im Kontrollboden wur- 11

13 den nach Šnajdr J. et al. (2008) gemessen. Homogenisierte Bodenproben wurden in 100 mm Phosphatpuffer, ph 7 (16:1 w/v) bei 4 C 2 tunden unter regelmäßigen Vortexieren extrahiert und über ein Filterpapier Whatman #5 gefiltert. Danach wurden die Proben mit ephadex G-25 Medium kolon (PD-10-Kolonne, Pharmacia, chweden) gemäß dem Herstellerprotokoll entsalzt, um die niedermolekularen Hemmstoffe abzuscheiden. Die entsalzten Proben wurden bei -12 C bis zur Durchführung der Enzymanalysen gelagert. Die Laccaseaktivität (EC ) wurde als die ABT-Oxidationsgeschwindigkeit (2,2-Azinobis- 3-ethylbenzothiazoline-6-ulfosäure) im Zitrat- Phosphat-Puffer (100 mm Zitrat, 200 mm Phosphat) (ph 5,0) bei einer Wellenlänge 420 nm gemessen. Die Aktivität der Mangan-Peroxidase (MnP, EC ) und der weiteren Peroxidasen und Oxidasen wurde im uccinat-lactat- Puffer (100 mm, ph 4,5) gemessen. MBTH (3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone) und DMAB (3,3-Dimethylaminobenzoesäure) wurden mit Hilfe von Enzymen oxidativ verkettet und die entstehende weinrote Indamin-Farbe spektrofotometrisch bei 595 nm identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit Aktivitäten von ohne Mn oder Peroxid gemessenen Proben korrigiert (in diesem Fall wurde MnO 4 durch eine äquimolare EDTA- Lösung und der Peroxid durch deionisiertes Wasser ersetzt). Eine Aktivitätseinheit ist als Enzymmenge definiert, die 1 μmol des Reaktionsproduktes pro Minute bildet. Die gesamten spektrofotometrische Messungen wurden mit einem UV VI-Mikroplatten-Lesegerät (Infinite, TECAN, Österreich) durchgeführt und die Werte auf g Bodentrockenmasse bezogen. tatistische Analysen wurden mit dem Programmpaket tatistica 10.0 (tatoft, UA) durchgeführt. Die einfaktorielle treuanalyse (ANO- VA) mit folgendem Tukey s HD-Test oder dem Fisher s LD Post-Hoc-Test wurde für die Prüfung der statistischen ignifikanz verwendet (p < 0,05). Entnahme Weide 2 K1 Entnahme Zitter pappel Entnahme Fichte K2 Bild 15. Karte der Entnahmestellen. Die Vierecke stellen die einzelnen Umzäunungen entlang des grau gekennzeichneten Weges dar und die angebrachten tandorte. Die Lilapunkte stellen die Entnahmestellen der Holzarten und die blauen Rhomboide die Entnahmestellen der Kontrollproben dar. Bestimmungsmethodik der Wurzelspiztzenkolonisierung mit Ektomykorrhisapilzen Die Wurzelproben mit dem Bodenballen wurden nach der Entnahme ( ) im Kühlschrank gelagert und innerhalb von 86 tunden bearbeitet. Nach dem Durchwaschen unter fließendem Wasser wurden die feinen Wurzeln bis zu der Durchführung der mikroskopischen Analyse im 25%igem Äthanol gelassen. Die Bestimmung der einzelnen Morphotypen wurde unter einem tereomikroskop (Olympus ZX-ILLD200) ohne Färbung nach Agerer (1991) und Agerer ( ) durchgeführt. Für die eparation der Ektomykorrhisaspitzen in Morphotypen wurden folgende Kriterien ausgewertet: Farbe, Verzweigungstyp, Oberflächenstruktur, Vorkommen von emanierenden Hyphen, Rhizomorphen, Zystidien, Lactiferen u. ä. Die ausgewählten repräsentativen pitzen von jedem Morphotyp wurden bis zu den molekularen Analysen im 25%igem Äthanol gelagert. Molekulare Analyse Die DNA wurde aus repräsentativen pitzen der mikroskopisch separierten Morphotypen extrahiert. Pro gegebenen Morphotyp (1 Isolation = 1-3 pitzen) wurden 2-6 Isolationen durchgeführt; die Isolationen erfolgten mit dem MO-BIO Ultraclean microbial DNA isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc., UA) in Übereinstimmung mit den Herstelleranweisungen. Die isolierte DNA K5 K4 K3 Entnahme Weide 1 12

14 wurde mit 10 mm Tris-Puffer (ph 8,0) eluiert und bei -20 C tiefgefroren. Die PCR-Amplifikation der ribosomalen IT-equenzen wurde mit IT1F-IT4-Primeren (allgemeine Pilzprimere) oder IT1F-LBW-Primeren (spezifische Pilzprimere für die Basidiomycetes) durchgeführt. PCR-Parameter: 1 Zyklus 4 min bei 94 C, folgend 35 Zyklen allmählich 30 s bei 94 C, 30 s bei 56 C und 110 s bei 72 C, abgeschlossen mit finalem extensivem Zyklus 10 min bei 72 C. Reaktionsgemischzusammensetzung 25 μl: 2 μl Template- DNA, 25 pmol Primere, 1.25 U of Taq DNA polymerase (Fermentas), 250 μm dntp, 1 Reaktionspuffer (Fermentas) und 2 mm MgCl2. Die PCR- Produkte wurden mit Hilfe von Elektrophorese auf 1,5%iges Agarose-Gel aufgeteilt und nach der Färbung mit einer GelRed-Lösung (Biotium Inc., Kanada) am UV-Transiluminator visualisiert. Nach einer Nachreinigung der PCR-Produkte mit dem QIAquick PCR Purification kit (Quiagen, UA) wurden diese mit klassischer anger-methode (GATC Biotech, Deutschland) sequenziert. Die equenzen wurden mit einer equenz-canner-oftware in 1.0 (Applied Biosystems) manuell editiert und mit den equenzen in der v GenBank-Datenbasis anhand eines BLAT-Algorithmus verglichen. Literatur: Agerer R Colour atlas of Ectomycorhizae. 1st-7th Editionn Einhorn Verlag, chwäbish Gmünd, Germany Agerer R Characterization of ectomycorrhiza. In: Techniques for the study of mycorrhiza, vol. 23 Methods Microbiology (Norris J.R. Read D.J. Varma A.K., Eds.), pp Agerer R Fungal relationships and structural identity of their ectomycorrhizae. Mycol. Progress 5: Baldrian P Ectomycorrhizal fungi and their enzymes in soils: is there enough evidence for their role as facultative soil saprotrophs? Oecologia 161: Buée M., Courty P.E., Mignot D., Garbaye J oil niche effect on species diversity and catabolic activities in an ectomycorrhizal fungal community. oil Biology & Biochemistry 39 : Courty P.E., Pouysegur R., Buée M., Garbaye J Laccase and phosphatase activities of the dominant ectomycorrhizal types in a lowland oak forest. oil Biology & Biochemistry 38: Cripps C.L Mycorrhizal Fungi of Aspen Forests: Natural Occurrence and Potential Applications. UDA Forest ervice Proceedings RMR-P-18, Douhan G.W., Rizzo D.M Phylogenetic divergence in a local population of the ectomycorrhizal fungus Cenococcum geophilum. New Phytologist 166: Durall D.M., Todd A.W., Trappe J.M Decomposition of 14C-labelled substrates by ectomycorrhizal fungi in association with Douglas fir. New Phytologist 127: Huang J., Nara K., Lian Ch. et al Ectomycorrhizal fungal communities associated with Masson pine (Pinus massoniana Lamb.) in Pb Zn mine sites of central south China. Mycorrhiza (2012) 22: Izumi H., Anderson I.C., Alexander I.J., et al Endobacteria in some ectomycorrhiza of cots pine (Pinus sylvestris). FEM Microbiol Ecol. 56: Jakucs E., Erős-Honti Z Morphological-anatomical characterization and identification of Tomentella ecto- 13

15 mycorrhizas. Mycorrhiza 18: Kanufre C.C., a Zancan G.T Physiology of exolaccase production by Thelephora terrestris. FEM Microbiology Letters 161: Koroleva O.V., tepanova E.V., Gavrilova V.P. et al Laccase and Mn-Peroxidase Production by Coriolus hirsutus train 075 in a Jar Fermentor. Journal of Bioscience and Bioengineering 93: Lilleskov E., Bruns T.D Root colonization dynamics of two ectomycorrhizal fungi of contrasting life history strategies are mediated by addition of organic nutrient patches. New Phytologist 159: Lindahl B.D., de Boer W., Finlay R.D Disruption of root carbon transport into forest humus stimulates fungal opportunists at the expense of mycorrhizal fungi. The IME Journal 4: Robertson.J., Tackaberry L.E., Egger K.N., Massicotte H.B Ectomycorrhizal fungal communities of black spruce differ between wetland and upland forests. Canadian Journal of Forest Research 36: elmants P.C., Hart.C., Boyle.I., tark J.M Red alder (Alnus rubra) alters community-level soil microbial function in conifer forests of the Pacific Northwest, UA. oil Biology and Biochemistry 37: patafora J.W., Owensby C.A., Douhan G.W. et al Phylogenetic placement of the ectomycorrhizal genus Cenococcum in Gloniaceae (Dothideomycetes). Mycologia 104: Šnajdr J., Valášková V., Merhautová V., et al Activity and spatial distribution of lignocellulose-degrading enzymes during forest soil colonization by saprotrophic basidiomycetes. Enzyme and Microbial Technology 43: Vasas G., Interesting macrofungi in Hungary, IV. Three rare Russula species (Basidiomycetes, Russulales). tudia bot. hung. 33: Weber c.f., Balasch M.M., Gossage Z., et al oil Fungal Cellobiohydrolase I Gene (cbhi) Composition and Expression in a Loblolly Pine Plantation under Conditions of Elevated Atmospheric CO 2 and Nitrogen Fertilization. Appl. Environ. Microbiol. 78:

16 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen: M, Gemeine Fichte [Picea abies (L.) Karsten] O, Zitterpappel [Populus tremula L.] VB1, Rotweide [alix rubra Huds.] VB2, Mandel-Weide [alix pentandra L.] MnP, Mangan dependent Peroxidase Perox, sonstige unspezifische Peroxidasen Ox, sonstige unspezifische Oxidasen 15

17 Hinweise 16

18 Hinweise 17

19

20 Dieses Werk ist im Rahmen des Programms zur Förderung der grenzübergreifenden Zusammenarbeit zwischen der Tschechischen Republik und dem Freistaat achsen Projekt Erforschung der Möglichkeiten zur Minimierung der organischen chadstoffe in den Trinkwasserressourcen im Erzgebirge entstanden.