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Transkript

1 *DE T * (19) Bundesrepublik Deutschland Deutsches Patent- und Markenamt (10) DE T (12) Übersetzung der europäischen Patentschrift (97) EP B1 (21) Deutsches Aktenzeichen: (86) PCT-Aktenzeichen: PCT/CA02/01186 (96) Europäisches Aktenzeichen: (87) PCT-Veröffentlichungs-Nr.: WO 2003/ (86) PCT-Anmeldetag: (87) Veröffentlichungstag der PCT-Anmeldung: (97) Erstveröffentlichung durch das EPA: (97) Veröffentlichungstag der Patenterteilung beim EPA: (47) Veröffentlichungstag im Patentblatt: (30) Unionspriorität: P US (73) Patentinhaber: G.R.M.O. (Groupe de Recherche en Maladies Osseuses) Inc., Sainte-Foy, Quebec, CA (74) Vertreter: Dreiss, Fuhlendorf, Steimle & Becker, Stuttgart (51) Int Cl. 8 : C12N 15/11 ( ) (84) Benannte Vertragsstaaten: AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, SK, TR (72) Erfinder: BROWN, Jacques, Cap-Rouge, QE G1Y 3P3, CA; RAYMOND, Vincent, Sainte-Foy, QE G1W 1J5, CA; MORISSETTE, Jean, Sainte-Foy, QE G1W 4W3, CA; LAURIN, Nancy, Toronto, Ontario M3M 2Z4, CA (54) Bezeichnung: PAGET KNOCHENKRANKHEIT Anmerkung: Innerhalb von neun Monaten nach der Bekanntmachung des Hinweises auf die Erteilung des europäischen Patents kann jedermann beim Europäischen Patentamt gegen das erteilte europäische Patent Einspruch einlegen. Der Einspruch ist schriftlich einzureichen und zu begründen. Er gilt erst als eingelegt, wenn die Einspruchsgebühr entrichtet worden ist (Art. 99 (1) Europäisches Patentübereinkommen). Die Übersetzung ist gemäß Artikel II 3 Abs. 1 IntPatÜG 1991 vom Patentinhaber eingereicht worden. Sie wurde vom Deutschen Patent- und Markenamt inhaltlich nicht geprüft. 1/53

2 Beschreibung GEBIET DER ERFINDUNG [0001] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Materialien zum Nachweis eines menschlichen Gens, das sich am PDB3-Locus auf Chromosom 5q35 befindet: des mit atypischer Proteinkinase C in Wechselwirkung tretenden Proteins p62/sequestosoms 1 (p62/sqstm1), dessen Mutanten die Paget-Knochenkrankheit auslösen. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf therapeutische Verfahren zur Behandlung der Paget-Knochenkrankheit. HINTERGRUND DER ERFINDUNG [0002] Die Paget-Knochenkrankheit (Mendelian Inheritance in Man, MIM ) ist eine lokalisierte monostotische (nur eine Stelle betreffende) oder polyostotische (mehrere Stellen betreffende) progressive metabolische Knochenerkrankung. Die Erkrankung ist durch einen zunehmenden Remodellierungsprozess gekennzeichnet, bei dem eine anomale Knochenresorption mit der osteoblastischen Knochenneubildung gekoppelt bleibt. Der Prozess wird durch eine Zunahme der osteoklasten-vermittelten Knochenresorption initiiert, mit einer darauf folgenden kompensatorischen Zunahme der Knochenneubildung, was zu einem desorganisierten Mosaik aus Geflecht- und Lamellenknochen an den betroffenen Stellen führt. Diese Strukturveränderung erzeugt Knochen, der größer ist, weniger kompakt, gefäßreicher und anfälliger für Verformungen oder Frakturen als normaler Knochen (Siris und Canfield 1990). [0003] Die klinischen Symptome variieren je nach Anzahl und Ort der betroffenen Skelettstellen und der Geschwindigkeit des anomalen Knochenumsatzes von einem Patienten zum anderen. Man glaubt, dass die meisten Patienten asymptomatisch sind, aber etwa 5% der Paget-Patienten Symptome aufweisen, die eine Behandlung erfordern (Kanis 1998). Die häufigsten Beschwerden sind Knochenschmerzen, -vergrößerungen und -verformungen (Kanis 1998). Weitere Manifestationen der Erkrankung schließen eine erhöhte Anfälligkeit für Frakturen, übermäßige Wärme über dem Knochen aufgrund der Hypervaskularität, Taubheit und neurologische Komplikationen, die in den meisten Fällen durch eine Kompression von neuronalem Gewebe in der Nähe des Paget-Knochens ausgelöst werden, sowie eine erhöhte Anfälligkeit für Osteosarkome ein (Hamdy 1995). [0004] Die Paget-Knochenkrankheit tritt für gewöhnlich jenseits der 40 auf (Klein und Norman 1995) und befüllt hauptsächlich das axiale Skelett. In westlichen Ländern ist die Paget-Knochenkrankheit die zweithäufigste metabolische Knochenerkrankung nach der Osteoporose. In den Vereinigten Staaten besitzt die Erkrankung eine geschätzte Häufigkeit von 1 3% der Bevölkerung über 40 und 8 10% der Bevölkerung über 80 (Siris und Canfield 1990). [0005] Die Ätiologie der Paget-Knochenkrankheit ist nach wie vor unbekannt. Es liegen jedoch zwingende Belege vor, dass genetische Faktoren eine wichtige Rolle bei der Ätiologie der Erkrankung spielen. Die Erkrankung ist in Westeuropa (Detheridge et al. 1983), Nordamerika (Rosenbaum und Hanson 1969; Guyer und Chamberlain 1980), Australien (Barker 1984) und Neuseeland (Reasbeck et al. 1983) äußerst verbreitet; am häufigsten tritt sie in Großbritannien auf, insbesondere in Lancashire (Prävalenz > 6,3%) (Barker et al. 1980). Das familiäre Risiko für die Page-Knochenkrankheit wurde von mehreren Autoren evaluiert. Sofaer et al. beobachteten eine um das Zehnfache erhöhte Prävalenz bei den Eltern und Geschwistern von Patienten im Vergleich zu ihren Ehepartnern (Sofaer et al. 1983). In den Vereinigten Staaten berichteten Siris et al. weiterhin über einen betroffenen Verwandten ersten Grades bei 12% der Paget-Patienten und errechneten ein um das Siebenfache erhöhtes Erkrankungsrisiko für Verwandte ersten Grades (Siris et al. 1991). In Spanien beobachteten Morales-Piga et al., dass bei 40% ihrer Indexfälle mindestens ein Verwandter ersten Grades von der Paget-Knochenkrankheit betroffen war (Morales-Piga et al. 1995). Die familiäre Häufung der Paget-Knochenkrankheit wurde ebenfalls häufig dokumentiert (Sofaer et al. 1983; Siris et al. 1991; Morales-Piga et al. 1995; Haslam et al. 1998; Hocking et al. 2000). Bei den bislang untersuchten Verwandtschaftsgruppen schien die Paget-Knochenkrankheit nach einem autosomal-dominanten Vererbungsmuster mit unvollständiger Penetranz vererbt zu werden. [0006] Erste Hinweise deuteten auf eine Kopplung zwischen der Paget-Knochenkrankheit und dem HLA-Locus auf 6p (Fotino et al. 1977; Tilyard et al. 1982). Dieser potentielle Locus wurde als PDB1 bezeichnet (MIM ). Weitere Studien bestätigten jedoch eine Kopplung mit diesem Locus nicht (Breanndan Moore und Hoffman 1988; Nance et al. 2000; Good et al. 2001), was darauf deutet, dass die Rolle des HLA-Locus bei der Ätiologie der Paget-Knochenkrankheit eventuell nur von geringer Bedeutung ist. 2/53

3 [0007] Die familiäre expansile Osteolyse [FEO (MIM )] eine seltene Knochenerkrankung befindet sich laut Kartierung auf Chromosom 18q21 q22 (Hughes et al. 1994). Unter Anwendung eines Kandidatenlocus-Ansatzes und mit Hilfe einer Paget-Großfamilie berichteten Cody et al. über Hinweise auf eine Kopplung zwischen der Paget-Knochenkrankheit und dieser 18q-Region mit einem LOD-Score von 3,40 bei D18S42 (Cody et al. 1997). Dieser Locus wurde als PDB2 bezeichnet (MIM ). Diese Autoren schlugen vor, dass die für FEO und die Paget-Knochenkrankheit verantwortlichen Gene entweder eng miteinander gekoppelt oder Allelvarianten derselben Genmutante sind. Anschließend bestätigten Haslam et al. die Kopplung mit 18q bei fünf Paget-Familien und beobachteten eine genetische Heterogenität bei drei anderen Verwandtschaftsgruppen (Haslam et al. 1998). Jüngere Studien bestätigten die genetische Heterogenität der Erkrankung und deuteten darauf hin, dass die Kopplung zwischen Paget und 18q21 q22 relativ unüblich war (Hocking et al. 2000; Nance et al. 2000; Good et al. 2001). [0008] In jüngster Zeit wurde das Gen für die FEO-Erkrankung als TNFRSF11A-Gen (MIM ), das RANK den Rezeptoraktivator des Nuklear-Faktors-κB codiert, identifiziert (Hughes et al. 2000). Dieselbe heterozygote Insertion (84dup18) wurde im TNFRSF11A-Exon 1 in drei Familien mit FEO oder FEO-ähnlichen Fällen nachgewiesen. Ein Stammbaum japanischen Ursprungs mit atypischer Paget-Knochenkrankeit trug außerdem eine 27 bp-insertion (75dup27) im TNFRSF11A-Gen. Die unüblichen Symptome waren hier z. B. frühes Einsetzen der Erkrankung und Zahnprobleme, was darauf deutet, dass diese Patienten eventuell an einer leichteren Form von FEO oder einer Form der Paget-Knochenkrankheit mit besonders frühem Einsetzen der Erkrankung leiden (Leach et al. 2001). Bei Patienten, bei denen sich typische Fälle der Paget-Knochenkrankheit manifestierten, wurden bislang keine RANK-Mutationen berichtet (Hughes et al. 2000; Sparks et al. 2001). Diese Beobachtungen zeigen, dass die Gene, die die typische Form der Paget-Knochenkrankheit auslösen, noch zu charakterisieren sind. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG [0009] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Materialien zur Isolierung und zum Nachweis eines menschlichen Gens auf dem PDB3-Locus, das die Paget-Knochenkrankheit auslöst. Das Gen codiert das mit atypischer Proteinkinase C in Wechselwirkung tretende Protein p62, das auch als Sequestosom 1 (SQSTM1) bezeichnet wird und dessen Allele die Paget-Knochenkrankheit auslösen. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Keimlinienmutationen bei dem mit atypischer Proteinkinase C in Wechselwirkung tretenden Protein/Sequestosom 1 (p62/sqstm1) sowie auf ihre Verwendung bei der Diagnose und Prädisposition der Paget-Knochenkrankheit. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die präsymptomatische Therapie von Personen, die schädliche Allele des p62/sqstm1-gens tragen. Die Erfindung bezieht sich darüber hinaus auf die Therapie der Paget-Knochenkrankheit bei Personen mit Mutationen des p62/sqstm1-gens (einschließlich Gentherapie, Proteinersatztherapie, Proteinmimetika und -inhibitoren, RNA-Interferenz und Antisense). Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf die präsymptomatische Therapie von Personen, die schädliche Allele des p62/sqstm1-gens tragen. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Testung von Arzneimitteln für die Paget-Knochenkrankheit. Schließlich bezieht sich die Erfindung auf die Untersuchung des p62/sqstm1-gens hinsichtlich Mutationen, die für die Diagnose der Paget-Knochenkrankheit nützlich sind. [0010] Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, das eine Sequenz umfasst, die ein mit atypischer Proteinkinase C in Wechselwirkung tretendes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 62 kd (eine mutierte Form von p62/sqstm1) codiert, das der Diagnose einer Knochenkrankheit dient. Das Nukleinsäuremolekül codiert die in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz oder ein Fragment davon, wobei das Fragment die Aminosäureposition 392 umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform codiert das isolierte Nukleinsäuremolekül ein mutiertes p62/sqstm1-protein, das der Diagnose der Paget-Knochenkrankheit dient. [0011] In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes, mit atypischer Proteinkinase C in Wechselwirkung tretendes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 62 kd (eine mutierte Form von p62/sqstm1) bereit, das der Diagnose einer Knochenkrankheit dient. Dieses Protein hat die in der SEQ-ID-Nr. 4 gezeigte Aminosäuresequenz oder ein Fragment davon, wobei das Fragment die Aminosäureposition 392 umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Protein eine mutierte Form von p62/sqstm1, das der Diagnose der Paget-Knochenkrankheit dient. [0012] In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die sich an ein mutiertes p62/sqstm1-protein binden können, bereit, das folgende Schritte umfasst: (a) Inkubation eines mutierten p62/sqstm1-proteins mit der in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellten Sequenz 3/53

4 oder einem Fragment davon und einer Prüfsubstanz unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes aus dem p62/sqstm1-protein und der Prüfsubstanz erlauben; und (b) Testung auf Komplexe aus dem mutierten p62/sqstm1-protein und der Prüfsubstanz, auf freie Substanz oder auf nicht komplex-gebundenes mutiertes p62/sqstm1-protein, wobei das Vorliegen von Komplexen anzeigt, dass sich die Prüfsubstanz an das mutierte p62/sqstm1-protein binden kann. [0013] Die Erfindung stellt außerdem Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Aktivität oder Expression des mutierten p62/sqstm1-proteins beeinträchtigt, bereit, das Folgendes umfasst: (a) Inkubation einer Prüfverbindung und eines mutierten p62/sqstm1-proteins mit der in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellten Sequenz oder einem Fragment davon oder einer Nukleinsäure, die ein mutiertes p62/sqstm1-protein codiert, wobei die Nukleinsäure die in der SEQ-ID-Nr. 3 dargestellte Sequenz oder ein Fragment davon aufweist; und (b) Bestimmung des Grades der Aktivität oder Expression des mutierten p62/sqstm1-proteins und Vergleich mit einer Kontrolle, wobei eine Veränderung der Aktivität oder Expression des mutierten p62/sqstm1-proteins im Vergleich zu der Kontrolle anzeigt, dass die Prüfverbindung eine Wirkung auf die Aktivität oder Expression des mutierten p62/sqstm1-proteins besitzt. [0014] In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Erkrankung im Zusammenhang mit einem mutierten p62/sqstm1-protein bereit, das die Testung einer Probe auf (a) ein Nukleinsäuremolekül, das ein mutiertes p62/sqstm1-protein mit der in der SEQ-ID-Nr. 3 dargestellten Sequenz oder einem Fragment davon codiert, oder (b) ein mutiertes p62/sqstm1-protein mit der in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellten Sequenz oder einem Fragment davon umfasst. [0015] Weiterhin wird ein Verfahren zur Behandlung einer Knochenerkrankung offenbart, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Substanz, die die Expression und/oder Aktivität von p62/sqstm1 moduliert, an eine Zelle oder ein Tier, das sie benötigt, umfasst. Die Erfindung stellt darüber hinaus die Verwendung einer wirksamen Menge einer Substanz, die die Expression und/oder Aktivität von p62/sqstm1 moduliert, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Knochenerkrankung bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Knochenerkrankung die Paget-Knochenkrankheit. [0016] In wieder einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein nicht-menschliches Tier bereit, das eine Mutation in dem Gen, das ein p62/sqstm1-protein mit der in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellten Sequenz codiert, trägt, die einem menschlichen P392L-Rest entspricht, wobei das Tier ein Modell für die Knochenkrankheit ist. [0017] Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung hervor. Es ist jedoch davon auszugehen, dass die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele zwar auf bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung hinweisen, jedoch nur mittels Illustrationen dargestellt sind, da verschiedene Änderungen und Modifikationen im Geist und Umfang der Erfindung für den Fachmann aus dieser detaillierten Beschreibung hervorgehen. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN [0018] Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung werden beschrieben, wobei auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen wird, in denen: [0019] Fig. 1 ein Diagramm ist, das die Anordnung genetischer Marker am PD63-Locus in Nachbarschaft zu dem p62/sqstm1-gen (schematische Karte von BACs, die den PDB3-Locus überspannen) und die Position des p62/sqstm1-gens innerhalb des genetisch definierten Intervalls darstellt. Fig. 1 stellt außerdem die p62/sqstm1-transkriptionseinheit dar, die die Position der p62/sqstm1-exons in Relation zu einem in silico konstruierten BAC-Contig zeigt. Die einzelnen Exons sind numeriert; diese Nummern entsprechen den in Fig. 4 dargestellten Sequenzen. [0020] Fig. 2 ein Diagramm ist, das die Aufteilung der Mutation, die die Aminosäure Pro an der Aminosäureposition 392 in der Codiersequenz des p62/sqstm1-proteins innerhalb einer von der Paget-Knochenkrankheit betroffenen Großfamilie in Leu verändert, darstellt. [0021] Fig. 3 ein Diagramm ist, das die cdna-sequenz des mutierten p62/sqstm1 darstellt. Die Figur stellt die Position der Mutation, die die Paget-Knochenkrankheit auslöst, dar. 4/53

5 [0022] Fig. 4 ein Diagramm ist, das einen Teil der Genomsequenz des p62/sqstm1-gens einschließlich der vollständigen Sequenz der acht Exons sowie der Sequenzen der Intron/Exon-Grenzen darstellt. In den Tabellen 1 und 2 sind die Sequenzen der zur Sequenzierung der Exons verwendeten Primer dargestellt. Tabelle 1 stellt die Sequenzen von Mikrosatellitenmarker-Primern für die Genotypisierung in dem p62/sqstm1-lokalisationsintervall dar. Tabelle 2 stellt die Sequenzen von in den Introns des p62/sqstm1-gens zur Sequenzierung des p62/sqstm1-gens entwickelten Primern dar. DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG [0023] Die Erfinder führten eine genetische Kopplungsanalyse in 24 frankokanadischen Großfamilien (479 Personen), bei denen sich die Paget-Knochenkrankheit als autosomaldominantes Merkmal aufteilte, durch. Nach Ausschluss von PDB2 wurde das gesamte Genom der drei aufschlussreichsten Kernfamilien mit 44 Personen untersucht. An sieben Stellen des menschlichen Genoms wurden LOD-Scores von mehr als 1,0 beobachtet. Anschließend wurden mit Hilfe der 24 Familien starke Belege für eine Kopplung mit dem Chromosom 5q35-qter nachgewiesen. Bei Heterogenität erhielt man einen maximalen LOD-Score von 8,58 bei D5S2073 mit θ = 0,1. Denselben charakteristischen Haplotyp trugen alle Patienten in acht Familien, was auf einen Gründereffekt deutet. Ein Rekombinationsereignis in einer Schlüsselfamilie grenzte diese Erkrankungsregion auf ein 6 cm großes Intervall zwischen D5S469 und dem Telomer ein. Die 16 anderen Familien mit sehr niedriger konditionaler Wahrscheinlichkeit einer Kopplung mit 5q35-qter dienten weiterhin der Kartierung eines zweiten Locus auf 5q31. Bei Heterogenität wurde ein maximaler LOD-Score von 3,70 bei D5S500 mit θ = 0,00 nachgewiesen. Rekombinationsereignisse grenzten die 5q31-Region nochmals auf ein 11,7 cm großes Intervall zwischen D5S642 und D5S1972 ein. Diese Beobachtungen belegen daher die Kartierung von zwei neuartigen Loci für die Paget-Knochenkrankheit und liefern weitere Hinweise auf ihre genetische Heterogenität. Die Loci 5q35-qter und 5q31 wurden als PDB3 bzw. PDB4 bezeichnet. [0024] Die Erfinder untersuchten weiterhin viele Gene am PDB3-Locus bezüglich ihrer Beteiligung an der Paget-Knochenkrankheit. Eines dieser vielen Gene, die auf Mutationen hin untersucht wurden, war das mit atypischer Proteinkinase C in Wechselwirkung tretende Protein p62 (p62), auch bekannt als Sequestosom 1 (SQSTM1). Bei 11 Verwandtschaftsgruppen der Familienverbände wurde eine Nukleotidvariation an der Nukleotidposition 1215 des p62/sqstm1-gens, die die Aminosäure Pro an der Aminosäureposition 392 in Leu umwandelt (Pro392Leu), nachgewiesen. Diese nicht-konservative Veränderung flankiert die ubiquitin-assoziierte Domäne (UBA) (Position ) des Proteins. Es stellte sich heraus, dass sich diese Variation mit der Erkrankung in diesen Familien aufteilt. Die Sequenzierung der 112 sporadischen Fälle zeigte, dass 18 Patienten die Variation ebenfalls trugen. Die Sequenzierung von 86 nicht-betroffenen Ehepartnern und 205 Personen aus der Allgemeinbevölkerung zeigte keine Veränderung der p62/sqstm1-wildtypsequenz. Diese Daten belegen daher, dass die Variation C zu T an der Position 1215 des p62/sqstm1-gens de facto eine Mutation ist, die die Paget-Knochenkrankheit auslöst. [0025] Das p62/sqstm1-gen wurde 1995 identifiziert (PNAS 92: (1995)). p62/sqstm1 wurde ursprünglich als Phosphoprotein von 62 Kilodalton (kd), das mit p56lck in Wechselwirkung tritt, beschrieben. Es stellte sich heraus, dass das Protein im Zytosol vorliegt und Ubiquitin bindet. p62/sqstm1 tritt mit verschiedenen Signaltransduktionsmolekülen wie der Tyrosinkinase p56lck und der atypischen Proteinkinase C-zeta in Wechselwirkung. In jüngster Zeit durchgeführte Experimente zeigten, dass p62/sqstm1 als Konvergenzpunkt der IL-1- und TNF-alpha-Signalwege fungiert. Die Wechselwirkung zwischen p62/sqstm1 und RIP koppelt die atypische Proteinkinase C über den TNF-alpha-Signalweg mit der Aktivierung von NF-kappaB (NFκB). In der Tat deuten jüngste Hinweise darauf, dass p62/sqstm1 selektiv mit TRAF6 und RIP in Wechselwirkung tritt und eine wichtige Zwischensubstanz bei der Signalgebung von Interleukin-1 (IL-1) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) zur NFκB-Aktivierung ist (Sanz et al. 1999; Sanz et al. 2000). Die funktionelle Bedeutung von p62/sqstm1 für die NFκB-Aktivierung wurde durch die Beobachtung, dass ein Mangel daran die NFκB-Aktivierung durch TNF-α und IL-1 stark unterdrückt, unterstrichen (Sanz et al. 2000). [0026] Die Sequenz von p62/sqstm1 wurde am 1. November 2000 unter der Zugangsnummer GI bei GenBank hinterlegt. Diese Sequenz wurde am 4. April 2002 durch die Zugangsnummer GI ersetzt. Die Unterschiede zwischen den beiden Sequenzen bestanden in den 5'- und 3'-nicht-translatierten Regionen; die Sequenz des p62/sqstm1-proteins ist dieselbe. In der vorliegenden Anmeldung stammt die Sequenz des Wildtyp-p62/SQSTM1 von der Zugangsnummer GI , wohingegen die Wildtyp-62-Sequenz in der Prioritätsanmeldung (vorläufige US-Anmeldung, Seriennummer 60/308,135, eingereicht am 30. Juli 2001) von der Zugangsnummer GI stammt. Als Ergebnis der korrigierten Sequenz in der vorliegenden Anmeldung wurde die Nukleotidposition der Mutation im Zusammenhang mit der Paget-Knochenkrankheit von nt 1227 in nt 1215 geändert. Die Position der Aminosäureänderung (Position 392) wurde nicht 5/53

6 geändert. Die Sequenz der Mutation in dem Nukleotid (C T) und in der Aminosäuresequenz (Pro Leu) bleibt gleich. I. Erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül [0027] Es wird hierin ein isoliertes Nukleinsäuremolekül offenbart, das eine Sequenz umfasst, die ein mit atypischer Proteinkinase C in Wechselwirkung tretendes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 62 kd codiert. Dieses Protein wird hierin im Allgemeinen als p62/sqstm1 bezeichnet. Die Begriffe p62/sqstm1", p62" und Sequestosom 1" (oder SQSTM1) sind Synonyme und können in der vorliegenden Anmeldung untereinander austauschbar verwendet werden (GenBank-Zugangsnummer GI , MIM-Nummer: und PubMed-ID: ). [0028] Die Erfindung schließt mutierte Formen von p62/sqstm1 im Zusammenhang mit der Paget-Knochenkrankheit und anderen Knochenerkrankungen, bei denen die mutierte Form eine in der SEQ-ID-Nr. 3 dargestellte Nukleinsäuresequenz aufweist, ein. Die in der SEQ-ID-Nr. 3 dargestellte Sequenz unterscheidet sich von der in der SEQ-ID-Nr. 1 dargestellten Sequenz (Wildtyp-p62/SQSTM1-Sequenz) darin, dass sich an Position 1215 T anstelle von C befindet. [0029] Der Begriff isoliert" bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die bei Herstellung durch rekombinante DNA-Techniken im Wesentlichen frei von Zellmaterial oder Kulturmedium bzw. bei chemischer Synthese im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen chemischen Substanzen ist. Der Begriff Nukleinsäure" soll DNA und RNA einschließen; diese kann entweder doppelsträngig oder einzelsträngig sein. [0030] In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die p62/sqstm1 mit der in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenz codiert, bereitgestellt. [0031] In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine isolierte Nukleinsäuresequenz bereit, die Folgendes umfasst: (a) eine Nukleinsäuresequenz wie in der SEQ-ID-Nr. 3 dargestellt, bei der T auch U sein kann; (b) eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz (a) komplementär ist; (c) eine Nukleinsäuresequenz, die eine erhebliche Sequenzhomologie zu einer Nukleinsäuresequenz (a) oder (b) aufweist; (d) eine Nukleinsäuresequenz, die ein Analog einer Nukleinsäuresequenz (a), (b) oder (c) ist; oder (e) eine Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz (a), (b), (c) oder (d) hybridisiert. [0032] Der Begriff Sequenz mit erheblicher Sequenzhomologie" meint diejenigen Nukleinsäuresequenzen, die leicht oder unerheblich von den Sequenzen (a) oder (b) abweichen, d. h. die Sequenzen funktionieren im Wesentlichen auf dieselbe Weise und können zum Nachweis, zur Untersuchung oder zur Behandlung der Paget-Knochenkrankheit eingesetzt werden. Die Abweichungen können lokalen Mutationen oder Strukturmodifikationen zugeschrieben werden. Nukleinsäuresequenzen mit erheblicher Homologie sind z. B. Nukleinsäuresequenzen, die zu mindestens 65%, noch bevorzugter zu mindestens 85% und am bevorzugtesten zu 90 95% mit den in der SEQ-ID-Nr. 1 oder der SEQ-ID-Nr. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenzen identisch sind. [0033] Der Begriff Sequenz, die hybridisiert" meint eine Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sequenz (a), (b), (c) oder (d) hybridisieren kann. Geeignete stringente Hybridisierungsbedingungen", die die DNA-Hybridisierung fördern, sind dem Fachmann bekannt bzw. finden sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), Es können z. B. folgende Bedingungen herrschen: 6,0 Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45 C, anschließend Waschen mit 2,0 SSC bei 50 C, 0,2 SSC bei 50 C bis 65 C oder 2,0 SSC bei 44 C bis 50 C. Die Stringenz kann basierend auf den im Waschschritt angewandten Bedingungen ausgewählt sein. Die Salzkonzentration im Waschschritt kann z. B. aus einer hohen Stringenz von etwa 0,2 SSC bei 50 C ausgewählt sein. Darüber hinaus kann die Temperatur im Waschschritt bei hochstringenten Bedingungen bei etwa 65 C liegen. [0034] Der Begriff eine Nukleinsäuresequenz, die ein Analog ist" meint eine Nukleinsäuresequenz, die im Vergleich zu der Sequenz (a), (b) oder (c) modifiziert wurde, wobei die Modifikation die Nützlichkeit der Sequenz wie hierin beschrieben nicht verändert. Die modifizierte Sequenz oder das Analog kann im Vergleich zu der Sequenz (a), (b) oder (c) verbesserte Eigenschaften aufweisen. Ein Beispiel für eine Modifikation zur Herstellung eines Analogs ist der Ersatz einer der natürlich vorkommenden Basen (d. h. Adenin, Guanin, Cytosin 6/53

7 und Thymidin) der in der SEQ-ID-Nr. 1 oder der SEQ-ID-Nr. 3 dargestellten Sequenz durch eine modifizierte Base wie z. B. Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl, 2-Propyl und andere Alkyladenine, 5-Halouracil, 5-Halocytosin, 6-Azauracil, 6-Azacytosin und 6-Azathymin, Pseudouracil, 4-Thiouracil, 8-Haloadenin, 8-Aminoadenin, 8-Thioladenin, 8-Thiolalkyladenine, 8-Hydroxyladenin und andere 8-substituierte Adenine, 8-Haloguanine, 8-Aminoguanin, 8-Thiolguanin, 8-Thiolalkylguanine, 8-Hydroxylguanin und andere 8-substituierte Guanine, andere Aza- und Deazauracile, Thymidine, Cytosine, Adenine oder Guanine, 5-Trifluormethyluracil und 5-Trifluorcytosin. [0035] Ein weiteres Beispiel für eine Modifikation ist der Einbau modifizierter Phosphor- oder Sauerstoffheteroatome in das Phosphatgrundgerüst bzw. kurzkettiger Alkyl- oder Cycloalkylzuckerverbindungen oder kurzkettiger heteroatomarer oder heterozyklischer Zuckerverbindungen in das in der SEQ-ID-Nr. 1 oder der SEQ-ID-Nr. 3 dargestellte Nukleinsäuremolekül. Die Nukleinsäuresequenzen können z. B. Phosphorthioate, Phosphotriester, Methylphosphonate und Phosphordithioate enthalten. [0036] Ein weiteres Beispiel für ein Analog eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls ist eine Peptidnukleinsäure (PNA), bei der das Desoxyribose-(oder Ribose-)phosphatgrundgerüst in der DNA (oder RNA) durch ein Polyamidgrundgerüst ersetzt ist, das dem von Peptiden ähnelt (P. E. Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497). Es hat sich herausgestellt, dass PNA-Analoge gegenüber einer Zersetzung durch Enzyme beständig sind und eine längere Lebensdauer in vivo und in vitro aufweisen. PNAs binden sich außerdem aufgrund der fehlenden Ladungsabstoßung zwischen dem PNA-Strang und dem DNA-Strang stärker an eine komplementäre DNA-Sequenz. Andere Nukleinsäureanaloge können Nukleotide enthalten, die Polymergrundgerüste, zyklische Grundgerüste oder azyklische Grundgerüste enthalten. Die Nukleotide können z. B. Morpholino-Grundgerüststrukturen aufweisen (US-Patent Nr. 5,034,506). Die Analoge können auch Gruppen wie z. B. Reportergruppen oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen oder pharmakodynamischen Eigenschaften der Nukleinsäuresequenz enthalten. [0037] Es ist davon auszugehen, dass die Erfindung Nukleinsäuremoleküle einschließt, die Trunkationen der erfindungsgemäßen Proteine sowie Analoge und Homologe der erfindungsgemäßen Proteine und deren Trunkationen wie nachfolgend beschrieben codieren. Es ist weiterhin davon auszugehen, dass die Erfindung Varianten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, die durch abwechselnden Spleißen einer mrna, die einer erfindungsgemäßen cdna entspricht, entstehen, einschließt. [0038] Isolierte und gereinigte Nukleinsäuremoleküle mit Sequenzen, die von der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz infolge einer Degeneration des genetischen Codes abweichen, sind ebenfalls im Umfang der Erfindung eingeschlossen. Solche Nukleinsäuren codieren funktionell gleichwertige Proteine, unterscheiden sich aber von den zuvor genannten Sequenzen infolge einer Degeneration des genetischen Codes in der Sequenz. [0039] Ein DNA umfassendes erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül kann durch Herstellung einer markierten Nukleinsäuresonde basierend auf allen oder einem Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und Verwendung dieser markierten Nukleinsäuresonde zur Durchsuchung einer geeigneten DNA-Bibliothek (z. B. einer cdna- oder Genom-DNA-Bibliothek) isoliert werden. Eine Genombibliothek kann z. B. mittels Durchsuchung der Bibliothek mit der markierten Sonde unter Anwendung von Standardtechniken der Isolierung von DNA, die ein neuartiges erfindungsgemäßes Protein codiert, dienen. Mittels Durchsuchung einer cdna- oder Genom-DNA-Bibliothek isolierte Nukleinsäuren können mit Hilfe von Standardtechniken sequenziert werden. [0040] Ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül, bei dem es sich um DNA handelt, kann auch durch selektive Amplifikation einer Nukleinsäure, die ein neuartiges erfindungsgemäßes Protein codiert, unter Anwendung von PCR-Verfahren (PCR = Polymerasekettenreaktion) und cdna oder Genom-DNA isoliert werden. Es können synthetische Oligonukleotid-Primer aus der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz zur Verwendung bei der PCR entwickelt werden. Mit Hilfe dieser Oligonukleotid-Primer und Standard-PCR-Amplifikationstechniken kann eine Nukleinsäure aus cdna oder Genom-DNA amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Es ist davon auszugehen, dass cdna durch Isolierung der gesamten zellulären-mrna mittels einer Vielzahl von Techniken, z. B. durch Anwendung des Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahrens von Chirgwin et al., Biochemistry, 18, (1979), aus mrna hergestellt werden kann. Die cdna wird anschließend mittels reverser Transkriptase (z. B. Moloney-MLV reverse Transkriptase, erhältlich von invitrogen, Carlsbad, CA oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) aus der mrna synthetisiert. 7/53

8 [0041] Ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül, bei dem es sich um RNA handelt, kann durch Klonieren einer cdna, die ein neuartiges erfindungsgemäßes Protein codiert, in einen geeigneten Vektor, der die Transkription der cdna zur Erzeugung eines RNA-Moleküls, das ein erfindungsgemäßes Protein codiert, erlaubt, isoliert werden. Eine cdna kann z. B. einem Bakteriophagen-Promotor (z. B. einem T7-Promotor) nachgeschaltet in einen Vektor kloniert und in vitro mit T7-Polymerase transkribiert werden; die entstandene RNA kann mittels Standardtechniken isoliert werden. [0042] Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann auch chemisch mittels Standardtechniken snythetisiert werden. Es sind verschiedene Verfahren zur chemischen Synthese von Polydesoxynukleotiden bekannt, z. B. die Festphasensynthese, die wie die Peptidsynthese vollautomatisch mittels im Handel erhältlicher DNA-Synthesevorrichtungen erfolgt (siehe z. B. Itakura et al., US-Patent Nr. 4,598,049; Caruthers et al., US-Patent Nr. 4,458,066 und Itakura, US-Patente Nr. 4,401,796 und 4,373,071). [0043] Die Bestimmung dessen, ob ein bestimmtes Nukleinsäuremolekül ein erfindungsgemäßes neuartiges Protein codiert, kann durch Expression der cdna in einer geeigneten Wirtszelle mittels Standardtechniken und Testen der Aktivität des Proteins nach den hierin beschriebenen Verfahren erfolgen. Eine cdna mit der Aktivität eines so isolierten erfindungsgemäßen neuartigen Proteins lässt sich nach Standardtechniken, z. B. durch Didesoxynukleotidkettenabbruch oder chemische Maxam-Gilbert-Sequenzierung sequenzieren, um die Nukleinsäuresequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des codierten Proteins zu bestimmen. [0044] Das Startkodon und nicht-translatierte Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können mit Hilfe für diesen Zweck entwickelter, derzeit verfügbarer Computersoftware, z. B. PC/Gene (Intelli- Genetics Inc., CA) bestimmt werden. Regulationselemente können mittels herkömmlicher Techniken identifiziert werden. Die Funktion dieser Elemente kann bestätigt werden, indem diese Elemente zur Expression eines Reportergens verwendet werden, das mit den Elementen operativ gekoppelt ist. Diese Konstrukte können mit Hilfe von Standardverfahren in kultivierte Zellen eingeschleust werden. Neben der Identifizierung von Regulationselementen in DNA können solche Konstrukte auch zur Identifizierung von Proteinen, die mit den Elementen in Wechselwirkung treten, nach im Stand der Technik bekannten Techniken eingesetzt werden. [0045] Die Sequenz eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls kann in Relation zu ihrer normalen Darstellung für die Transkription umgekehrt werden, so dass ein Antisense-Nukleinsäuremolekül entsteht, das hierin genauer beschrieben wird. Vorzugsweise wird eine Antisense-Sequenz durch Umkehrung einer Region, die dem Startkodon oder einer nicht-konservierten Region vorangeht, konstruiert. Insbesondere können die in den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen enthaltenen Nukleinsäuresequenzen oder ein Fragment davon in Relation zu ihrer normalen Darstellung für die Transkription umgekehrt werden, so dass Antisense-Nukleinsäuremoleküle entstehen. [0046] Die Erfindung stellt außerdem Nukleinsäuren bereit, die Fusionsproteine aus einem erfindungsgemäßen neuartigen Protein und einem ausgewählten Protein oder einem selektierbaren Markerprotein (siehe unten) umfassen. [0047] Darüber hinaus werden Teile der Nukleinsäuresequenz, die Fragmente, funktionelle Domänen oder antigene Determinanten des p62/sqstm1- oder mutierten p62/sqstm1-proteins codieren, bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die Verwendung von Teilen der Sequenz als Sonden und PCR-Primer für p62/sqstm1 und verwandte Proteine sowie zur Bestimmung funktioneller Aspekte der Sequenz bereit. [0048] Der Fachmann kann nun mit Hilfe von Standardhybridisierungstests oder PCR-Techniken p62/sqstm1-gene oder -cdna identifizieren und isolieren, die Allelvarianten der offenbarten p62/sqstm1-sequenz sind. II. Erfindungsgemäße neuartige Proteine [0049] Die Erfindung erwägt weiterhin allgemein ein isoliertes, mit atypischer Proteinkinase C in Wechselwirkung tretendes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 62 kd. Das Protein weist die in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz oder ein Fragment davon, das die Aminosäureposition 392 umfasst, auf. Außerdem wird ein isoliertes p62/sqstm1 mit einer Aminosäuresequenz wie in Fig. 3 dargestellt (SEQ-ID-Nr. 2) offenbart. [0050] Die Erfindung schließt damit mutierte Formen von p62/sqstm1 für die Diagnose der Paget-Knochenkrankheit und anderer Knochenerkrankungen ein. In einer Ausführungsform besitzt das mutierte p62/sqstm1 8/53

9 eine in Fig. 3 oder der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz. Die in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellte Sequenz unterscheidet sich von der in der SEQ-ID-Nr. 2 dargestellten Wildtypsequenz in der Aminosäureposition 392, an der das Prolin im Wildtyp in Leucin in der mutierten Form umgewandelt ist. [0051] Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann ein erfindungsgemäßes Protein verschiedene Strukturformen des primären Proteins einschließen, die die biologische Aktivität beibehalten. Ein erfindungsgemäßes Protein kann z. B. in Form saurer oder basischer Salze oder in neutraler Form vorliegen. Darüber hinaus lassen sich einzelne Aminosäurereste durch Oxidation oder Reduktion modifizieren. [0052] Neben der Aminosäuresequenz voller Länge kann das erfindungsgemäße Protein auch Fragmente oder Trunkationen des Proteins wie hierin beschrieben umfassen, vorausgesetzt es schließt die in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellte Aminosäureposition 392 ein. Trunkierte Proteine oder Fragmente können Peptide aus mindestens 5, vorzugsweise 10 und noch bevorzugter 15 Aminosäureresten der in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellten Sequenz umfassen. [0053] Die Erfindung stellt weiterhin Polypeptide aus mindestens einer funktionellen Domäne oder mindestens einer antigenen Determinante eines p62/sqstm1-proteins oder eines mutierten p62/sqstm1-proteins bereit. Diese Fragmente enthalten die Mutation von Prolin nach Leucin an Position 392. Das Fragment des p62/sqstm1-proteins kann auch die ubiquitin-assoziierte Domäne an der Aminosäureposition einschließen. [0054] Weiterhin werden hierin Analoge des Proteins und/oder Trunkationen davon offenbart, die z. B., jedoch nicht ausschließlich eine Aminosäuresequenz mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, -insertionen, -deletionen und/oder -mutationen einschließen können. Aminosäuresubstitutionen können konserviert oder nicht-konserviert sein. Bei konservierten Aminosäuresubstitutionen sind eine oder mehrere Aminosäuren der erfindungsgemäßen Proteine durch Aminosäuren mit ähnlichen Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobieeigenschaften ersetzt. Werden nur konservierte Substitutionen erzeugt, sollte das entstandene Analog funktionell gleichwertig sein. Bei nicht-konservierten Substitutionen sind eine oder mehrere Aminosäuren der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Aminosäuren mit nicht-ähnlichen Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobieeigenschaften ersetzt. [0055] Darüber hinaus werden auch eine oder mehrere Aminosäureinsertionen in die Aminosäuresequenzen des Proteins offenbart. Aminosäureinsertionen können aus einzelnen Aminosäureresten oder aufeinander folgenden Aminosäuren einer Länge von 2 bis 15 Aminosäuren bestehen. Aminosäureinsertionen können z. B. der Zerstörung von Zielsequenzen dienen, so dass das Protein nicht mehr aktiv ist. Dieses Verfahren kann in vivo zur Inhibition der Aktivität eines Proteins eingesetzt werden. [0056] Deletionen können in der Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren oder diskreter Abschnitte der Aminosäuresequenz des p62/sqstm1-proteins bestehen. Die deletierten Aminosäuren können benachbart sein oder nicht. Die Untergrenze der Länge des entstandenen Analogs mit einer Deletionsmutation beträgt etwa 10 Aminosäuren, vorzugsweise 100 Aminosäuren. [0057] Die hierin offenbarten Analoge eines Proteins können durch Einschleusung von Mutationen in die das Protein codierende Nukleotidsequenz hergestellt werden. [0058] Mutationen können durch Synthese von Olinukleotiden, die eine mutierte Sequenz enthalten, die von Restriktions-Sites flankiert ist, die eine Ligation an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen, an bestimmten Loci eingeschleust werden. Nach der Ligation codiert die entstandene rekonstruierte Sequenz ein Analog mit der gewünschten Aminosäureinsertion, -substitution oder -deletion. [0059] Alternativ können ortsspezifische Oligonukleotid-Mutageneseverfahren eingesetzt werden, um ein verändertes Gen mit bestimmten, gemäß der erforderlichen Substitution, Deletion oder Insertion veränderten Kodons bereitzustellen. Eine Deletion oder Trunkation eines erfindungsgemäßen Proteins kann auch durch Einsatz an die gewünschte Deletion angrenzender, herkömmlicher Restriktionsendonuklease-Sites konstruiert werden. Nach der Restriktion können Überhänge gefüllt und die DNA erneut ligiert werden. Beispielhafte Verfahren zur Erzeugung der zuvor aufgeführten Veränderungen sind bei Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) offenbart. [0060] Weiterhin sind hierin Homologe der Aminosäuresequenz des p62/sqstm1-proteins, des mutierten p62/sqstm1-proteins und/oder Trunkationen davon offenbart. Solche Homologe sind Proteine, deren Amino- 9/53

10 säuresequenzen aus Aminosäuresequenzen bestehen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (siehe Diskussion der stringenten Hybridisierungsbedingungen hierin) mit einer Sonde zur Gewinnung eines erfindungsgemäßen Proteins hybridisieren. Homologe eines solchen Proteins weisen dieselben Regionen, die für das Protein charakteristisch sind, auf. [0061] Ein homologes Protein schließt ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 70%, vorzugsweise zu 80 95% mit der Aminosäuresequenz des p62/sqstm1-proteins oder des mutierten p62/sqstm1-proteins identisch ist, ein. [0062] Die Erfindung erwägt außerdem Isoformen der erfindungsgemäßen Proteine. Eine Isoform enthält dieselbe Anzahl und Art von Aminosäuren wie ein erfindungsgemäßes Protein, jedoch eine unterschiedliche Molekularstruktur. Die erfindungsgemäß erwogenen Isoformen weisen dieselben Eigenschaften auf wie ein hierin beschriebenes erfindungsgemäßes Protein. [0063] Die vorliegende Erfindung schließt weiterhin ein erfindungsgemäßes Protein ein, das mit einem ausgewählten Protein oder einem selektierbaren Markerprotein konjugiert ist, so dass Fusionsproteine entstehen. Die p62/sqstm1-cdna-sequenz wird z. B. in einen Vektor inseriert, der eine Nukleotidsequenz enthält, die ein anderes Peptid codiert (z. B. GST-Glutathionsuccinyltransferase). Das Fusionsprotein wird exprimiert und aus prokaryontischen (z. B. Bakterien oder Baculoviren) oder eukaryontischen Zellen gewonnen. Das Fusionsprotein kann dann durch Affinitätschromatographie basierend auf der Fusionsvektorsequenz gereinigt und das p62/sqstm1-protein durch enzymatische Spaltung des Fusionsproteins gewonnen werden. [0064] Die erfindungsgemäßen Proteine (einschließlich Trunkationen, usw.) lassen sich mit Hilfe rekombinanter DNA-Verfahren herstellen. Dementsprechend können erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle mit einer Sequenz, die ein erfindungsgemäßes Protein codiert, nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in einen geeigneten Expressionsvektor, der eine gute Expression des Proteins garantiert, eingebaut werden. Mögliche Expressionsvektoren sind z. B., jedoch nicht ausschließlich Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren (z. B. replikationsdefekte Retroviren, Adenoviren und adeno-assoziierte Viren), so lange der Vektor mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel ist. Der Ausdruck für die Transformation einer Wirtszelle geeignete Vektoren" bedeutet, dass die Expressionsvektoren ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül und Regulationssequenzen, die auf der Basis der für die Expression einzusetzenden Wirtszellen ausgewählt sind und operativ mit dem Nukleinsäuremolekül gekoppelt sind, enthalten. Operativ gekoppelt" soll bedeuten, dass die Nukleinsäure mit den Regulationssequenzen in einer Weise gekoppelt ist, die die Expression der Nukleinsäure erlaubt. [0065] Die Erfindung erwägt daher einen erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder ein Fragment davon sowie die notwendigen Regulationssequenzen für die Transkription und Translation der inserierten Proteinsequenz enthält. Geeignete Regulationssequenzen können von einer Vielzahl von Quellen, z. B. Bakterien-, Pilz- oder Virusgenen abgeleitet sein (siehe z. B. die von Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990 beschriebenen Regulationssequenzen). Die Auswahl geeigneter Regulationssequenzen hängt von der ausgewählten Wirtszelle ab und kann vom Fachmann leicht durchgeführt werden. Beispiele für solche Regulationssequenzen sind ein Transkriptionspromotor und -verstärker, eine RNA-Polymerase-Bindungssequenz oder eine ribosomale Bindungssequenz, z. B. ein Translationsstartsignal. Darüber hinaus können je nach der ausgewählten Wirtszelle und dem verwendeten Vektor auch andere Sequenzen, z. B. ein Replikationsursprung, weitere DNA-Restriktions-Sites, Verstärker und Sequenzen, die die Fähigkeit zur Auslösung der Transkription verleihen, in den Expressionsvektor eingebaut sein. Es ist außerdem davon auszugehen, dass die notwendigen Regulationssequenzen von dem nativen Protein und/oder seinen flankierenden Regionen bereitgestellt werden können. [0066] Die Erfindung stellt weiterhin einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein in den Expressionsvektor in Antisense-Ausrichtung kloniertes erfindungsgemäßes DNA-Nukleinsäuremolekül umfasst. Das heißt, das DNA-Molekül ist operativ mit einer Regulationssequenz auf eine Weise gekoppelt, die die Expression eines RNA-Moleküls, das entgegen einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz ausgerichtet ist (Antisense), durch Transkription des DNA-Moleküls erlaubt. Es können operativ mit der Antisense-Nukleinsäure gekoppelte Regulationssequenzen ausgewählt werden, die die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls steuern. [0067] Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können auch ein selektierbares Markergen enthalten, das die Auswahl von Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Molekül transformiert oder transfiziert sind, erleichtert. Beispiele für selektierbare Markergene sind Gene, die Proteine 10/53

11 wie z. B. G418 und Hygromycin, das eine Resistenz gegen bestimmte Arzneimittel verleiht, β-galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase oder Leuchtkäfer-Luciferase codieren. Die Transkription des selektierbaren Markergens wird durch Veränderungen der Konzentration des selektierbaren Markerproteins wie z. B. β-galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase oder Leuchtkäfer-Luciferase überwacht. Codiert das selektierbare Markergen ein Antibiotikaresistenz wie z. B. Neomycinresistenz verleihendes Protein, können Transformantenzellen mit G418 ausgewählt werden. Zellen mit einem eingebauten selektierbaren Markergen überleben, die anderen Zellen sterben ab. Dadurch kann die Expression der erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren sichtbar gemacht und untersucht werden und insbesondere die Wirkung einer Mutation auf Expression und Phänotyp bestimmt werden. Es ist davon auszugehen, dass selektierbare Marker auf einem separaten Vektor aus der Nukleinsäure von Interesse eingeschleust werden können. [0068] Die rekombinanten Expressionsvektoren können auch Gene enthalten, die eine Fusionseinheit codieren, die eine verstärkte Expression und eine verstärkte Löslichkeit des rekombinanten Proteins ermöglicht und die Reinigung eines rekombinanten Zielproteins unterstützt, indem sie als Ligand bei der Affinitätsreinigung agiert. Dem rekombinanten Zielprotein kann z. B. eine proteolytische Spaltungs-Site hinzugefügt werden, um eine Trennung des rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit nach der Reinigung des Fusionsproteins zu erlauben. [0069] Rekombinante Expressionsvektoren lassen sich in Wirtszellen einschleusen, so dass eine transformierte Wirtszelle entsteht. Dementsprechend schließt die Erfindung eine Wirtszelle ein, die einen erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektor umfasst. Der Begriff transformierte Wirtszelle" soll prokaryontische und eukaryontische Zellen einschließen, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektor transformiert oder transfiziert sind. Die Begriffe transformiert mit", transfiziert mit", Transformation" und Transfektion" sollen die Einschleusung einer Nukleinsäure (z. B. eines Vektors) in eine Zelle nach einer von vielen im Stand der Technik bekannten möglichen Techniken einschließen. Prokaryontische Zellen können z. B. mittels Elektroporation oder calciumchlorid-vermittelter Transformation mit einer Nukleinsäure transformiert werden. Die Nukleinsäure kann mittels herkömmlicher Techniken wie z. B. Calciumphosphat- oder calciumchlorid-copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, Lipofektin, Elektroporation oder Mikroinjektion in Säugetierzellen eingeschleust werden. Geeignete Verfahren zur Transformation und Transfektion von Wirtszellen finden sich in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und anderen Laborlehrbüchern. [0070] Geeignete Wirtszellen schließen eine große Vielzahl an prokaryontischen und eukaryontischen Wirtszellen ein. Die erfindungsgemäßen Proteine können z. B. in Bakterienzellen wie E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtilus, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus), Hefezellen oder Säugetierzellen exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen finden sich in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, [0071] Zur rekombinanten Erzeugung von p62/sqstm1-proteinen kann z. B. E. coli eingesetzt werden, unter Verwendung des T7-RNA-Polymerase/Promotor-Systems mit zwei Plasmiden oder durch Markieren plasmid-codierter Proteine oder mittels Expression durch Infektion mit M13-Phagen-mGPI-2. E. coli-vektoren können auch mit Phagen-Lambda-Regulationssequenzen, durch Fusionsproteinvektoren (z. B. lacz und trpe), maltosebindende Proteinfusionen und Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteine eingesetzt werden. [0072] Alternativ kann das p62/sqstm1-protein in Insektenzellen mittels Baculovirus-Vektoren oder in Säugetierzellen mittels Vaccinia-Viren exprimiert werden. Zur Expression in Säugetierzellen kann die cdna-sequenz an heterologe Promotoren wie z. B. den Affenvirus (SV40)-Promotor im psv2-vektor gebunden und in Zellen wie z. B. COS-Zellen eingeschleust werden, um eine vorübergehende oder langfristige Expression zu erzielen. Der stabile Einbau des Chimärengenkonstrukts kann in Säugetierzellen durch biochemische Selektion, z. B. Neomycin und Mycophenolsäure aufrecht erhalten werden. [0073] Die p62/sqstm1-dna-sequenz kann mittels Verfahren wie Restriktionsenzymverdauung, Auffüllen mit DNA-Polymerase, Deletion mittels Exonuklease, Verlängerung mittels endständiger Desoxynukleotidtransferase, Ligation synthetischer oder klonierter DNA-Sequenzen, ortsspezifischer Sequenzveränderung unter Anwendung spezifischer Oligonukleotide in Kombination mit PCR verändert werden. [0074] Die cdna-sequenz oder Teile davon oder ein Minigen aus einer cdna mit einem Intron und seinem eigenen Promotor wird mittels herkömmlicher Techniken in eukaryontische Expressionsvektoren eingeschleust. Diese Vektoren erlauben die Transkription der cdna in eukaryontischen Zellen, indem sie Regulationssequenzen bereitstellen, die die Transkription der cdna initiieren und verstärken und ihre korrekte Splei- 11/53

12 ßung und Polyadenylierung sicherstellen. Es kann auch der endogene p62/sqstm1-genpromotor verwendet werden. Unterschiedliche Promotoren in den Vektoren haben unterschiedliche Aktivitäten, die den Expressionsgrad der cdna verändern. Darüber hinaus können bestimmte Promotoren die Funktion modulieren, z. B. der glucocorticoid-responsive Promotor aus dem Mäuse-Brusttumorvirus. [0075] Einige der aufgelisteten Vektoren enthalten selektierbare Marker oder neobakterielle Gene, die die Isolierung von Zellen durch chemische Selektion erlauben. Stabile Langzeitvektoren können in Zellen durch Einsatz von Virusregulationselementen als episomale, sich frei replizierende Einheiten aufrecht erhalten werden. Es können auch Zelllinien erzeugt werden, in deren Genom-DNA der Vektor eingebaut ist. Auf diese Weise wird das Genprodukt kontinuierlich erzeugt. [0076] Vektoren werden nach verschiedenen Verfahren wie z. B. Calciumphosphat, Strontiumphosphat, Elektroporation, Lipofektion, DEAE-Dextran, Mikroinjektion oder Protoplastenfusion in Empfängerzeller eingeschleust. Alternativ kann die cdna durch Infektion mittels viraler Vektoren eingeschleust werden. [0077] p62/sqstm1-proteine können auch aus Zellen oder Geweben wie z. B. Säugetierzellen oder -geweben, in denen das Protein normalerweise exprimiert wird, isoliert werden. [0078] Das Protein kann nach herkömmlichen, im Stand der Technik bekannten Reinigungsverfahren wie z. B. Chromatographieverfahren, Hochleistungsflüssigchromatographieverfahren oder Präzipitation gereinigt werden. [0079] Zur Isolierung eines p62/sqstm1-proteins, das nachfolgend nach Standardverfahren gereinigt wird, können z. B. Anti-p62/SQSTM1-Antikörper (wie nachfolgend beschrieben) eingesetzt werden. [0080] Die erfindungsgemäßen Proteine können auch durch chemische Synthese mit Hilfe von in der Proteinchemie bekannten Techniken wie z. B. Festphasensynthese (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85: ) oder Synthese in homogener Lösung (Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, Hrsg. E. Wansch, Band 15 I und II, Thieme, Stuttgart) hergestellt werden. III. Anwendungszwecke [0081] Die vorliegende Erfindung schließt alle Anwendungszwecke des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls und der erfindungsgemäßen p62/sqstm1-proteine ein, z. B., aber nicht ausschließlich die Herstellung von Antikörpern und Antisense-Oligonukleotiden, die Herstellung von Testsystemen zur Untersuchung von p62/sqstm1 und mutierten Formen davon, die Isolierung von Substanzen, die die p62/sqstm1-expression und/oder -aktivität modulieren, sowie die Verwendung der p62/sqstm1-nukleinsäuresequenzen und -Proteine und deren Modulatoren für diagnostische und therapeutische Anwendungszwecke. Einige dieser Anwendungszwecke sind nachfolgend näher beschrieben. (a) Antikörper [0082] Die Isolierung des p62/sqstm1-proteins und des mutierten p62/sqstm1-proteins ermöglicht die Herstellung von Antikörpern, die für p62/sqstm1 und/oder mutiertes p62/sqstm1 spezifisch sind. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung einen Antikörper bereit, der sich an der Aminosäureposition 392 an ein mutiertes p62/sqstm1-protein mit der in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenz oder einem Fragment davon, das die Aminosäureposition 392 umfasst, bindet. Antikörper, die nur mit mutiertem p62/sqstm1 reagieren, können vorteilhafterweise zur Diagnose der Paget-Knochenkrankheit oder anderer Knochenerkrankungen eingesetzt werden. Es können Antikörper hergestellt werden, die sich an ein ganz bestimmtes Epitop in der mutierten Region des Proteins binden. [0083] Zur Herstellung der Antikörper können herkömmliche Verfahren angewandt werden. Unter Verwendung eines p62/sqstm1-peptids können z. B. polyklonale Antiseren oder monoklonale Antikörper nach Standardverfahren hergestellt werden. Ein Säugetier (z. B. eine Maus, ein Hamster oder ein Kaninchen) kann mit einer immunogenen Form des Peptids, die eine Antikörperreaktion in dem Säugetier auslöst, immunisiert werden. Techniken zur Verleihung von Immunogenität an ein Peptid schließen die Konjugation an Träger oder andere im Stand der Technik bekannte Verfahren ein. Das Protein oder Peptid kann z. B. in Gegenwart eines Hilfsstoffes verabreicht werden. Der Progress der Immunisierung kann durch Nachweis von Antikörpertitern im Plasma oder Serum überwacht werden. Zur Evaluation der Antikörperspiegel können Standard-ELISA- oder andere Immunassay-Verfahren mit dem Immunogen als Antigen eingesetzt werden. Nach der Immunisierung 12/53

13 können Antiseren gewonnen und ggf. polyklonale Antikörper aus den Seren isoliert werden. [0084] Zur Erzeugung monoklonaler Antikörper können Antikörper produzierende Zellen (Lymphozyten) aus einem immunisierten Tier geerntet und mittels Standardverfahren zur Fusion somatischer Zellen mit Myelomzellen fusioniert werden, so dass diese Zellen unsterblich werden und Hybridomzellen liefern. Solche Techniken sind im Stand der Technik bekannt, z. B. die ursprünglich von Kohler und Milstein (Nature 256, (1975)) entwickelte Hybridomtechnik sowie andere Techniken wie die Human-B-Zellen-Hybdridomtechnik (Kozbor et al., Immunol. Today 4, 72 (1983)), die EBV-Hybridomtechnik zur Erzeugung menschlicher monoklonaler Antikörper (Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) Allen R. Bliss, Inc., Seiten 77 96) und die Durchsuchung kombinatorischer Antikörperbibliotheken (Huse et al., Science 246, 1275 (1989)). Die Hybridomzellen können immunchemisch auf die Erzeugung von Antikörpern, die mit dem Peptid spezifisch reagieren, untersucht und die monoklonalen Antikörper isoliert werden. [0085] Daher erwägt die Erfindung auch Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper mit einer Spezifität für p62/sqstm1 und/oder mutiertes p62/sqstm1 wie hierin beschrieben sezernieren. [0086] Der Begriff Antikörper", wie er hierin verwendet wird, soll auch Fragmente davon einschließen, die spezifisch mit mutiertem p62/sqstm1 reagieren. Die Antikörper können mittels herkömmlicher Techniken fragmentiert und die Fragmente auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben auf ihre Nützlichkeit untersucht werden. F(ab')2Fragmente können z. B. durch Behandlung der Antikörper mit Pepsin erzeugt werden. Das entstandene F(ab')2-Fragment kann weiter behandelt werden, so dass Fab'-Fragmente entstehen. [0087] Chimärenantikörperderivate, d. h. Antikörpermoleküle, die eine nicht-humane (Tier) variable Region und eine humane konstante Region kombinieren, werden im Umfang der Erfindung ebenfalls erwogen. Chimärenantikörpermoleküle können z. B. die antigen-bindende Domäne aus einem Antikörper einer Maus, einer Ratte oder einer anderen Spezies mit humanen konstanten Regionen einschließen. Zur Herstellung von Chimärenantikörpern, die die immunglobulin-variable Region enthalten, die das Genprodukt der erfindungsgemäßen p62/sqstm1-antigene erkennt, können herkömmliche Verfahren eingesetzt werden (siehe z. B. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985); Cabilly et al., US-Patent Nr. 4,816,567, Boss et al., US-Patent Nr. 4,816,397; Tanaguchi et al., europäische Patentveröffentlichung EP171496; europäische Patentveröffentlichung , UK-Patent GB B). Es wird erwartet, dass Chimärenantikörper beim Menschen weniger immunogen sind als der entsprechende Nichtchimärenantikörper. [0088] Monoklonale oder Chimärenantikörper, die mit einem erfindungsgemäßen Protein wie hierin beschrieben spezifisch reagieren, können durch Erzeugung von Chimären mit humanen konstanten Regionen, bei denen Teile der variablen Regionen, insbesondere die konservierten Rahmenregionen der antigen-bindenden Domäne menschlichen Ursprungs sind und nur die hypervariablen Regionen nicht-menschlichen Ursprungs sind, weiter humanisiert werden. Solche Immunglobulinmoleküle können nach im Stand der Technik bekannten Techniken hergestellt werden (z. B. Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, (1983); Kozbor et al., Immunology Today 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol. 92, 3 16 (1982) und PCT-Veröffentlichung WO92/06193 oder EP ). Humanisierte Antikörper können auch kommerziell hergestellt werden (Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Großbritannien). [0089] Spezifische Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit p62/sqstm1-proteinen reagieren, können auch mittels Durchsuchung von Expressionsbibliotheken, die in Bakterien exprimierte Immunglobulingene oder Teile davon codieren, mit aus den Nukleinsäuremolekülen von p62/sqstm1 erzeugten Peptiden hergestellt werden. Es können z. B. vollständige Fab-Fragmente, VH-Regionen und FV-Regionen in Bakterien mittels Phagenexpressionsbibliotheken exprimiert werden (siehe z. B. Ward et al., Nature 341, (1989); Huse et al., Science 246, (1989) und McCafferty et al., Nature 348, (1990)). Alternativ können Antikörper oder Fragmente davon mittels einer SCID-hu-Maus, z. B. des von Genpharm entwickelten Modells erzeugt werden. (b) Antisenese-Oligonukleotide [0090] Die Isolierung eines Nukleinsäuremoleküls, das p62/sqstm1 und mutiertes p62/sqstm1 codiert, ermöglicht die Erzeugung von Antisense-Oligonukleotiden, die die Expression und/oder Aktivität von p62/sqstm1 und/oder mutiertem p62/sqstm1 modulieren können. [0091] Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Antisense-Oligonukleotid bereit, das zu einer 13/53

14 Nukleinsäuresequenz, die mutiertes p62/sqstm1 codiert, komplementär ist. Im Gegensatz dazu ist ein Beispiel für eine Nukleinsäuresequenz, die normales p62/sqstm1 codiert, in der SEQ-ID-Nr. 1 und in GenBank unter der Zugangsnummer NM003900, XM oder GI dargestellt. [0092] In einer anderen Ausführungsform codiert die Nukleinsäuresequenz ein mutiertes p62/sqstm1, das mit der Paget-Knochenkrankheit oder einer anderen Knochenerkrankung assoziiert ist. Vorzugsweise ist die Nukleinsäuresequenz wie in der SEQ-ID-Nr. 3 dargestellt. [0093] Der Begriff Antisense-Oligonukleotid", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine Nukleotidsequenz, die zu ihrem Ziel komplementär ist. [0094] Der Begriff Oligonukleotid" bezieht sich auf ein Oligomer oder Polymer aus Nukleotid- oder Nukleosidmonomeren mit natürlich vorkommenden Basen, Zuckern und Zuckerbindungen (Grundgerüst). Der Begriff schließt außerdem modifizierte oder substituierte Oligomere ein, die nicht natürlich vorkommende Monomere oder Teile davon, die ähnlich funktionieren, umfassen. Solche modifizierten oder substituierten Oligonukleotide können natürlich vorkommenden Formen aufgrund von Eigenschaften wie z. B. verbesserter Aufnahme in Zellen oder erhöhter Stabilität in Gegenwart von Nukleasen vorgezogen werden. Der Begriff schließt außerdem Chimärenoligonukleotide ein, die zwei oder mehr chemisch unterschiedliche Regionen enthalten. Chimärenoligonukleotide können z. B. mindestens eine Region aus modifizierten Nukleotiden, die günstige Eigenschaften (z. B. erhöhte Nukleasebeständigkeit, erhöhte Aufnahme in Zellen) verleihen, enthalten oder zwei oder mehr erfindungsgemäße Oligonukleotide können zusammen ein Chimärenoligonukleotid bilden. [0095] Die erfindungsgemäßen Antisense-Oligonukleotide können Ribonuklein- oder Desoxyribonukleinsäuren sein und natürlich vorkommende Basen wie Adenin, Guanin, Cytosin, Thymidin und Uracil enthalten. Die Oligonukleotide können auch modifizierte Basen wie Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl, 2-Propyl und andere Alkyladenine, 5-Halouracil, 5-Halocytosin, 6-Azauracil, 6-Azacytosin und 6-Azathymin, Pseudouracil, 4-Thiouracil, 8-Haloadenin, 8-Aminoadenin, 8-Thioladenin, 8-Thiolalkyladenine, 8-Hydroxyladenin und andere 8-substituierte Adenine, 8-Haloguanine, 8-Aminoguanin, 8-Thiolguanin, 8-Thiolalkylguanine, 8-Hydroxylguanin und andere 8-substituierte Guanine, andere Aza- und Deazauracile, Thymidine, Cytosine, Adenine oder Guanine, 5-Trifluormethyluracil und 5-Trifluorcytosin enthalten. [0096] Andere erfindungsgemäße Antisense-Oligonukleotide können modifizierte Phosphor- oder Sauerstoffheteroatome im Phosphatgrundgerüst bzw. kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkylzuckerverbindungen oder kurzkettige heteroatomare oder heterozyklische Zuckerverbindungen enthalten. Die Antisense-Oligonukleotide können z. B. Phosphorthioate, Phosphotriester, Methylphosphonate und Phosphordithioate enthalten. In einer Ausführungsform der Erfindung bestehen Phosphorthioat-Bindungen zwischen den vier bis sechs 3'-terminalen Basen. In einer anderen Ausführungsform verbinden Phosphorthioatbindungen alle Nukleotide. [0097] Die erfindungsgemäßen Antisense-Oligonukleotide können auch Nukleotidanaloge umfassen, die sich als therapeutische oder experimentelle Reagentien eventuell besser eignen. Ein Beispiel für ein Oligonukleotidanalog ist eine Peptidnukleinsäure (PNA), bei der das Desoxyribose(oder Ribose)-Phosphatgrundgerüst in der DNA (oder RNA) durch ein Polyamidgrundgerüst ersetzt ist, das dem von Peptiden ähnelt (P. E. Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497). Es hat sich herausgestellt, dass PNA-Analoge gegenüber Zersetzung durch Enzyme beständig sind und in vivo und in vitro eine längere Lebensdauer aufweisen. PNAs binden sich außerdem aufgrund der fehlenden Ladungsabstoßung zwischen dem PNA-Strang und dem DNA-Strang stärker an eine komplementäre DNA-Sequenz. Andere Oligonukleotide können Nukleotide mit Polymergrundgerüsten, zyklischen Grundgerüsten oder azyklischen Grundgerüsten enthalten. Die Nukleotide können z. B. Morpholino-Grundgerüststrukturen aufweisen (US-Patent Nr. 5,034,506). Oligonukleotide können auch Gruppen wie Reportergruppen oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonukleotids oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Antisense-Olugonukleotids enthalten. Antisense-Oligonukleotide können auch Zuckermimetika aufweisen. [0098] Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle können mittels chemischer Synthese und enzymatischer Ligationsreaktionen nach im Stand der Technik bekannten Verfahren konstruiert werden. Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuremoleküle oder ein Fragment davon können mittels natürlich vorkommender Nukleotide oder verschiedenartig modifizierter Nukleotide, die entwickelt wurden, um die biologische Stabilität der Moleküle zu erhöhen bzw. die physikalische Stabilität des mit mrna oder dem nativen Gen gebildeten Duplex zu erhöhen (z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide) chemisch synthetisiert werden. Die Antisense-Sequenzen können biologisch mittels eines in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder abgeschwächten Virus in die Zellen eingeschleusten Expressionsvektors erzeugt werden, in dem unter 14/53

15 Steuerung durch eine hocheffiziente Regulationsregion Antisense-Sequenzen hergestellt werden, deren Aktivität durch den Zelltyp, in den der Vektor eingeschleust wird, bestimmt werden kann. [0099] Die Antisense-Oligonukleotide können mittels Techniken aus dem Stand der Technik wie z. B. Vektoren (Retrovirusvektoren, Adenovirusvektoren und DNA-Virusvektoren) oder physikalischer Techniken wie Mikroinjektion in Gewebe oder Zellen eingeschleust werden. Die Antisense-Oligonukleotide können direkt in vivo verabreicht werden oder der in vitro-transfektion von Zellen, die anschließend in vivo verabreicht werden, dienen. In einer Ausführungsform kann das Antisense-Oligonukleotid an Makrophagen und/oder Endothelzellen in einer Liposomformulierung verabreicht werden. (c) Diagnostische Tests [0100] Die Erkenntnis der Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass mutiertes p62/sqstm1 an der Pagent-Knochenkrankheit beteiligt ist, erlaubt die Entwicklung diagnostischer Tests zum Nachweise der Pagen-Knochenkrankheit und anderer Knochenerkrankungen. [0101] Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Krankheit im Zusammenhang mit mutiertem p62/sqstm1-protein bereit, das das Testen einer Probe auf (a) ein Nukleinsäuremolekül, das ein mutiertes p62/sqstm1-protein mit der in der SEQ-ID-Nr. 3 dargestellten Sequenz oder einem Fragment davon codiert, oder (b) ein mutiertes p62/sqstm1-protein mit der in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellten Sequenz oder einem Fragment davon umfasst. In einer Ausführungsform ist die Krankheit im Zusammenhang mit dem mutierten p62/sqstm1-protein die Paget-Knochenkrankheit. (i) Nukleinsäuremoleküle [0102] Die Nukleinsäuremoleküle, die mutiertes p62/sqstm1 wie hierin beschrieben codieren, oder Fragmente davon ermöglichen es dem Fachmann, Nukleotidsonden zur Verwendung für den Nachweis von Nukleotidsequenzen, die mutiertes p62/sqstm1 codieren, oder Fragmenten davon in Proben, vorzugsweise biologischen Proben wie z. B. Zellen, Geweben und Körperflüssigkeiten zu konstruieren. Die Sonden können für den Nachweis des Vorliegens einer Krankheit im Zusammenhang mit mutiertem p62/sqstm1 oder die Überwachung der Progredienz einer solchen Krankheit nützlich sein. Solche Krankheiten schließen die Paget-Knochenkrankheit ein. [0103] Desweiteren wird hierin ein Verfahren zum Nachweis eines Nukleinsäuremoleküls, das mutiertes p62/sqstm1 codiert, in einer Probe offenbart, das das Kontaktieren der Probe mit einer Nukleotidsonde, die unter Hybridisierungsbedingungen, die die Bildung des Hybridisierungsproduktes erlauben, mit dem Nukleinsäuremolekül zu einem Hybridisierungsprodukt hybridisieren kann, und das Testen auf das Hybridisierungsprodukt umfasst. [0104] Die in dem diagnostischen Test verwendete Nukleotidsonde hybridisiert mit mutiertem p62/sqstm1 (das die Mutation Prolin zu Leucin an Position 392 enthält), nicht aber mit dem Wildtyp-p62/SQSTM1. Ein Beispiel für Sonden, die in dem obigen Verfahren verwendet werden können, sind Fragmente der in Fig. 3 oder der SEQ-ID-Nr. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenzen. Eine Nukleotidsonde kann mit einer nachweisbaren Substanz wie z. B. einer radioaktiven Markierung, die ein adäquates Signal liefert und eine ausreichende Halbwertszeit aufweist, z. B. 32P, 3H, 14C oder dergleichen markiert werden. Andere nachweisbare Substanzen, die eingesetzt werden können, sind z. B. Antigene, die von einem spezifischen markierten Antikörper erkannt werden, fluoreszierende Verbindungen, Enzyme, für ein markiertes Antigen spezifische Antikörper und Chemilumineszenz. Eine geeignete Markierung kann entsprechend der Hybridisierungsrate und Bindung der Sonde an die nachzuweisende Nukleinsäure und der Menge der für die Hybridisierung verfügbaren Nukleinsäure ausgewählt werden. Markierte Sonden können mit Nukleinsäuren auf festen Unterlagen wie z. B. Nitrozellulosefiltern oder Nylonmembranen, wie sie allgemein von Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe) beschrieben werden, hybridisiert werden. Die Nukleotidsonden können dem Nachweis von Genen, vorzugsweise in menschlichen Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül hybridisieren, vorzugsweise von Nukleinsäuremolekülen, die mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül unter stringenten Hybridisierungsbedingungen wie hierin beschrieben hybridisieren, dienen. [0105] In einer Ausführungsform kann der Hybridisierungstest eine Southern-Analyse sein, bei der die Patientenprobe auf eine DNA-Sequenz getestet wird, die mit einer mutierten p62/sqstm1-spezifischen Sonde hybridisiert. In einer anderen Ausführungsform kann der Hybridisierungstest eine Northern-Analyse sein, bei der die Patientenprobe auf eine RNA-Sequenz getestet wird, die mit einer mutierten p62/sqstm1-spezifischen 15/53

16 Sonde hybridisiert. Die Southern- und Northern-Analysen können mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren durchgeführt werden (siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., Hrsg. John Wiley & Sons). [0106] Nukleinsäuremoleküle, die ein mutiertes p62/sqstm1-protein codieren, können mittels PCR-Verfahren (PCR = Polymerasekettenreaktion) sowie cdna und Genom-DNA in einer Probe selektiv amplifiziert werden. Aus der in der SEQ-ID-Nr. 3 dargestellten Nukleotidsequenz können synthetische Oligonukleotid-Primer zur Verwendung bei der PCR entwickelt werden. Eine Nukleinsäure kann mittels Oligonukleotid-Primern und Standard-PCR-Amplifikationstechniken aus cdna oder Genom-DNA amplifiziert werden. Die amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die cdna kann durch Isolierung der gesamten zellulären mrna durch eine Vielzahl von Techniken, z. B. das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al., Biochemistry, 18, (1979), aus mrna hergestellt werden. Die cdna wird anschließend mittels reverser Transkiptase (z. B. Moloney-MLV reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) aus der mrna synthetisiert. [0107] Patienten können routinemäßig mit Hilfe von Sonden zum Nachweis des Vorliegens eines mutierten p62/sqstm1-gens nach einer Vielzahl von Techniken untersucht werden. Die zur Diagnose verwendete Genom-DNA kann aus Körperzellen, wie sie z. B. im Blut vorliegen, Gewebebiopsien, Operationsproben oder Autopsiematerial gewonnen werden. Die DNA kann isoliert und direkt zum Nachweis einer spezifischen Sequenz verwendet werden oder vor der Analyse mittels PCR amplifiziert werden. Es kann auch RNA oder cdna verwendet werden. Der Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz kann durch Hybridisierung mittels spezifischer Oligonukleotide, direkte DNA-Sequenzierung, Restriktionsenzymverdauung, RNase-Schutz, chemische Abspaltung und ligase-vermittelten Nachweis erfolgen. Für mutierte Sequenzen spezifische Oligonukleotide können chemisch synthetisiert, radioaktiv mit Isotopen oder nicht-radioaktiv mit Biotin-Tags markiert und mit einzelnen DNA-Proben, die auf Membranen oder anderen festen Unterlagen immobilisiert sind, mittels Dot-Blot oder Übertragung von Gelen nach der Elektrophorese hybridisiert werden. Die Gegenwart oder Abwesenheit dieser mutierten Sequenzen wird dann mit Hilfe von Verfahren wie Autoradiographie, Fluorimetrie oder Kolorimetriereaktion sichtbar gemacht. [0108] Es können geeignete PCR-Primer erzeugt werden, die z. B. für die Amplifikation von Teilen der erfindungsgemäßen Sequenz, die identifizierte Mutationen enthalten, nützlich sind. [0109] Die direkte DNA-Sequenzierung zeigt Sequenzunterschiede zwischen normaler und mutierter p62/sqstm1-dna. Klonierte DNA-Segmente können als Sonden zum Nachweis spezifischer DNA-Segmente eingesetzt werden. Zur Verstärkung der Empfindlichkeit dieses Verfahrens kann PCR eingesetzt werden. Bei der PCR handelt es sich um eine durch sequenzspezifische Primer gesteuerte enzymatische Amplifikation mit wiederholten Zyklen von DNA-Wärmedenaturierung, Glühen der komplementären Primer und Verlängerung der geglühten Primer mit einer DNA-Polymerase. Dies führt zu einem exponentiellen Anstieg der Ziel-DNA. [0110] Es können auch andere Nukleotidsequenzamplifikationstechniken eingesetzt werden, z. B. ligationsvermittelte PCR, verankerte PCR und enzymatische Amplifikation, wie für den Fachmann ersichtlich. [0111] Sequenzveränderungen können auch zufällige Restriktionsenzymerkennungs-Sites erzeugen, die bei Anwendung einer geeigneten Enzymverdauung und anschließender Gel-Blot-Hybridisierung deutlich werden. DNA-Fragmente mit dieser Site (normal oder mutiert) werden durch Größenzunahme oder -abnahme bzw. durch Zunahme oder Abnahme der Anzahl der entsprechenden Restriktionsfragmente nachgewiesen. Genom-DNA-Proben können ebenfalls vor der Behandlung mit dem geeigneten Restriktionsenzym amplifiziert werden und die Fragmente unterschiedlicher Größe werden unter UV-Licht in Gegenwart von Ethidiumbromid nach der Gelelektrophorese sichtbar gemacht. [0112] Genetische Tests auf der Basis von DNA-Sequenzunterschieden können mittels Nachweis einer Veränderung der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragmenten in Gelen erfolgen. Kleine Sequenzdeletionen und -insertionen können durch hochauflösende Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. Kleine Deletionen können auch als Veränderungen des Migrationsmusters von DNA-Heteroduplexen in einer nicht denaturierenden Gelelektrophorese nachgewiesen werden. Alternativ kann eine Mutation mit Substitution einer einzelnen Base entsprechend der differentiellen Primer-Länge in der PCR nachgewiesen werden. Die PCR-Produkte des normalen und mutierten Gens könnten differentiell in Acrylamidgelen nachgewiesen werden. 16/53

17 [0113] Nukleaseschutztests (S1 oder ligase-vermittelt) zeigen ebenfalls Sequenzveränderungen an spezifischen Stellen. Alternativ kann zur Bestätigung oder zum Nachweis eines Polymorphismus oder Restriktionskartierungsveränderungen ligatierte PCR, ASO, REF-SSCP und SSCP eingesetzt werden. Bei REF-SSCP und SSCP handelt es sich um Tests der Mobilitätsverschiebung, die auf der Konformationsänderung infolge von Mutationen basiert. [0114] DNA-Fragmente können auch mit Hilfe von Verfahren sichtbar gemacht werden, bei denen die einzelnen DNA-Proben nicht auf Membranen immobilisiert sind. Die Sonden- und Zielsequenzen können in Lösung sein oder die Sondensequenz kann immobilisiert sein. Spezifische einzelne Genotypen können auch mittels Autoradiographie, radioaktivem Zerfall, Spektrophotometrie und Fluorimetrie identifiziert werden. [0115] Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann der Abschnitt des DNA-Segments, der über eine Mutation Aufschluss gibt, mittels PCR amplifiziert werden. Zum Nachweis der Mutation Prolin zu Leucin an der Aminosäureposition 392 kann z. B. die DNA um die Nukelotidposition 1215 herum amplifiziert werden. Das aus Peripherblut oder anderen Gewebeproben eines Patienten gewonnene DNA-Segment, das eine spezifische Mutation unmittelbar umgibt, kann mittels konstruierter Oligonukleotid-Primer untersucht werden. Diese Region wird dann mittels PCR amplifiziert und die Produkte werden mittels Elektrophorese getrennt und auf eine Membran übertragen. Anschließend werden markierte Sonden mit den DNA-Fragmenten hybridisiert und eine Autoradiographie durchgeführt. (ii) Proteine [0116] Das mutierte p62/sqstm1-protein kann mit Hilfe von Antikörpern, die sich wie zuvor im Detail beschrieben an das Protein binden, in einer Probe nachgewiesen werden. Dementsprechend umfasst das Verfahren zum Nachweis eines mutierten p62/sqstm1-proteins in einer Ausführungsform das Kontaktieren der Probe mit einem Antikörper, der sich an mutiertes p62/sqstm1 bindet und nach der Bindung an das mutierte p62/sqstm1 in der Probe nachgewiesen werden kann. [0117] Mutiertes p62/sqstm1 kann in verschiedenen biologischen Materialen mit Hilfe von Antikörpern, die spezifisch mit mutiertem p62/sqstm1 reagieren, oder Derivaten davon, z. B. Enzymkonjugaten oder markierten Derivaten nachgewiesen werden; diese können in jedem bekannten Immunassay, das auf Bindungswechselwirkungen zwischen einer antigenen Determinante des mutierten p62/sqstm1 und den Antikörpern basiert, eingesetzt werden. Beispiele für solche Assays sind Radioimmunassays, Enzymimmunassays (z. B. ELI- SA), Immunfluoreszenz, Immunpräzipitation, Latexagglutination, Hämagglutination und histochemische Tests. Daher können die Antikörper dem Nachweis und der Quantifizierung von mutiertem p62/sqstm1 in einer Probe zur Bestimmung seiner Rolle bei bestimmten zellulären Ereignissen oder pathologischen Zuständen sowie der Diagnose und Behandlung solcher pathologischen Zustände, vorzugsweise der Paget-Knochenkrankheit dienen. [0118] Insbesondere können die erfindungsgemäßen Antikörper in immunhistochemischen Analysen, z. B. auf zellulärer und subzellulärer Ebene, zum Nachweis von mutiertem p62/sqstm1 eingesetzt werden, um dieses bestimmten Zellen und Geweben sowie spezifischen subzellulären Orten zuzuordnen und den Expressionsgrad zu quantifizieren. [0119] Für den Nachweis von mutiertem p62/sqstm1 können im Stand der Technik bekannte zytochemische Techniken zur Lokalisation von Antigenen mittels Licht- und Elektronenmikroskopie eingesetzt werden. Im Allgemeinen kann ein erfindungsgemäßer Antikörper mit einer nachweisbaren Substanz markiert werden und mutiertes p62/sqstm1 kann basierend auf dem Vorliegen der nachweisbaren Substanz im Gewebe lokalisiert werden. Beispiele für nachweisbare Substanzen sind verschiedene Enzyme, fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele für geeignete Enzyme sind Meerrettich-Peroxidase, Biotin, alkalische Phosphatase, β-galactosidase oder Acetylcholinesterase; Beispiele für geeignete fluoreszierende Materialien sind Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel für ein lumineszierendes Material ist Luminol; und Beispiele für geeignete radioaktive Materialien sind radioaktives Iod I-125, I-131 oder 3-H. Antikörper können auch an elektronendichte Substanzen wie z. B. Ferritin oder kolloidales Gold gekoppelt sein, die mittels Elektronenmikroskopie leicht sichtbar gemacht werden. [0120] Es können auch indirekte Verfahren angewandt werden, bei denen die primäre Antigen-Antikörper-Reaktion durch Einschleusung eines zweiten Antikörpers, der für den Antikörper, der mit mutiertem p62/sqstm1 reagiert, spezifisch ist, amplifiziert wird. Handelt es sich bei dem Antikörper, der für mutiertes p62/sqstm1 17/53

18 spezifisch ist, z. B. um einen Kaninchen-IgG-Antikörper, kann der zweite Antikörper mit einer nachweisbaren Substanz (wie hierin beschrieben) markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-Gammaglobulin sein. [0121] Bei Verwendung einer radioaktiven Markierung als nachweisbare Substanz kann mutiertes p62/sqstm1 mittels Autoradiographie lokalisiert werden. Die Ergebnisse der Autoradiographie lassen sich durch Bestimmung der Partikeldichte in den Autoradiogrammen mittels verschiedener optischer Verfahren oder durch Zählung der Körnchen quantifizieren. (d) Experimentelle Systeme [0122] Für viele Studien des p62/sqstm1-gens und der p62/sqstm1-genprodukte einschließlich der Erzeugung großer Mengen des normalen und mutierten Proteins zur Isolierung und Reinigung können eukaryontische Expressionssysteme eingesetzt werden, um Zellen, die das p62/sqstm1- oder mutierte p62/sqstm1-protein exprimieren, als funktionelles Testsystem für Antikörper gegen das Protein zu verwenden, die Wirksamkeit von Pharmazeutika zu prüfen und die Funktion des normalen vollständigen Proteins, spezifischer Abschnitte des Proteins oder natürlich vorkommender und künstlich erzeugter mutierter Proteine zu untersuchen. [0123] Die Expressionsvektoren, die p62/sqstm1 oder eine mutierte p62/sqstm1-cdna-sequenz oder Teile davon enthalten, können mit Hilfe der genannten Techniken in eine Vielzahl von Säugetierzellen anderer Spezies oder in Nicht-Säugetierzellen eingeschleust werden. [0124] Der rekombinante Klonierungsvektor umfasst gemäß der vorliegenden Erfindung die ausgewählte DNA der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen zur Expression in einem geeigneten Wirt. Die DNA ist in dem Vektor operativ mit einer Expressionssteuerungssequenz in dem rekombinanten DNA-Molekül gekoppelt, so dass das p62/sqstm1-protein exprimiert werden kann. Die Expressionssteuerungssequenz kann aus der Gruppe bestehend aus Sequenzen, die die Expression von Genen prokaryontischer oder eukaryontischer Zellen steuern, deren Viren und Kombinationen davon ausgewählt sein. Die Expressionssteuerungssequenz kann aus der Gruppe bestehend aus dem lac-system, dem trp-system, dem tac-system, dem trc-system, wichtigen Operator- und Promotorregionen von Phagen-Lambda, der Steuerungsregion des fd-hüllproteins, frühen und späten Promotoren von SV40, von Polyomen abgeleiteten Promotoren, Adenovirus, Retrovirus, Baculovirus, Affenvirus, 3-Phosphoglyceratkinase-Promotor, Hefesäurephosphatase-Promotoren, Hefe-α-Paarungsfaktoren und Kombinationen davon ausgewählt sein. [0125] Mittels Expression des p62/sqstm1-gens in heterologen Zellsystemen können auch Struktur-Funktions-Beziehungen belegt sowie Zelllinien zum Zwecke von Arzneimitteltests bereitgestellt werden. Die Einschleusung einer p62/sqstm1-dna-sequenz in einen Plasmidexpressionsvektor zur Transfektion von Zellen ist ein nützliches Verfahren, um den Einfluss des Proteins auf verschiedene zelluläre biochemische Parameter wie z. B. die Identifikation von Substraten sowie Aktivatoren und Inhibitoren des Gens zu testen. Plasmidexpressionsvektoren, die die gesamte Codiersequenz für p62/sqstm1 oder für Teile davon enthalten, können für Mutageneseexperimente in vitro eingesetzt werden, die funktionell wichtige Teile des Proteins identifizieren. [0126] Die DNA-Sequenz kann in Studien manipuliert werden, um die Expression des Gens und seines Produkts zu verstehen. Die Veränderungen in der Sequenz können das Expressionsmuster hinsichtlich relativer Quantität, Gewebespezifität und funktioneller Eigenschaften verändern. [0127] Darüber hinaus werden hierin Verfahren zur Untersuchung der Funktion des mutierten p62/sqstm1-proteins, das durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle codiert wird, offenbart. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen rekombinanten Moleküle mit spezifischen Deletions- oder Insertionsmutationen in dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül können Zellen, Gewebe und nicht-menschliche Tiere, bei denen das Protein nicht oder nur teilweise exprimiert wird, entwickelt werden. Ein rekombinantes Molekül kann der Deaktivierung oder Veränderung des endogenen Gens durch homologe Rekombination dienen, so dass eine Zelle, ein Gewebe oder ein Tier mit entsprechendem Mangel entsteht. Solche mutierten Zellen, Gewebe oder Tiere können der Definition von spezifischen Zellpopulationen, Entwicklungsmustern und in vivo-prozessen dienen, die normalerweise von dem durch das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül codierten Protein abhängen. [0128] Zur Bestätigung der Bedeutung des p62/sqstm1-proteins für die Paget-Knochenkrankheit kann eine p62/sqstm1-knockout-maus erzeugt werden. Eine gezielte Rekombinationsstrategie kann z. B. der Deaktivierung des endogenen p62/sqstm1-gens dienen. Es kann ein Gen, das Stopkodons in alle Leseraster ein- 18/53

19 schleust und die biologische Aktivität des Protein ausschaltet, in eine Genomkopie des Proteins inseriert werden. Das mutierte Fragment kann in embryonale Stammzellen eingeschleust werden und es können Kolonien für die homologe Rekombination mit positiven (Neomycin)/negativen (Gancyclovir, Thyimidinkinase) Resistenzgenen ausgewählt werden. Zum Nachweis einer Keimlinienübertragung können zwei Klone, die das gestörte Gen auf einem Allel tragen, in Blastozyten von C57BI/6-Mäusen injiziert und in B6/SJL-Pflegemütter übertragen werden. Es können Chimären mit den C57BI/6-Mäusen gepaart und die Nachkommen analysiert werden, um für die Mutation homozygote Tiere zu ermitteln (p62/sqstm1 / ). Die Auswirkungen der Mutation auf die Paget-Knochenkrankheit oder andere Knochenerkrankungen im Vergleich zu nicht-mutierten Kontrollen können bestimmt und das Überleben und das histologische Erkrankungsmuster analysiert werden. [0129] Die UBA-Domäne wird innerhalb anderer Spezies (Mäuse und Ratten) einschließlich des P392-Restes konserviert. Dementsprechend stellt die Erfindung auch die Konstruktion eines nicht-humanen Tieres, das die Punktmutation trägt, die das P392L-mutierte p62/sqstm1-protein codiert, bereit, wobei die Mutation dem in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellten menschlichen p62/sqstm1-protein entspricht. Solche mutierten Zellen, Gewebe oder Tiere können als Modell für Knochenerkrankungen, insbesondere für die Paget-Knochenkrankheit eingesetzt werden. (e) p62/sqstm1-modulatoren [0130] Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Antikörpern und Antisense-Oligonukleotiden können auch andere Substanzen, die die Expression oder Aktivität von p62/sqstm1 modulieren, sowie Substanzen, die mutierte Formen von p62/sqstm1 modulieren, identifiziert werden. (i) Substanzen, die sich an p62/sqstm1 binden [0131] Substanzen, die die Aktivität von p62/sqstm1 beeinträchtigen, können basierend auf ihrer Fähigkeit, sich an p62/sqstm1 und/oder mutiertes p62/sqstm1 zu binden, identifiziert werden. [0132] Substanzen, die sich an p62/sqstm1 binden können, können durch Umsetzung des p62/sqstm1 mit einer Substanz, die sich potentiell an p62/sqstm1 binden kann, und Testung auf Komplexe, auf freie Substanz oder auf nicht-komplexgebundenes p62/sqstm1 oder auf eine Aktivierung von p62/sqstm1 identifiziert werden. Insbesondere können Proteine, die mit p62/sqstm1 in Wechselwirkung treten, mittels eines Hefe-2-Hybrid-Testsystems identifiziert werden (Fields, S. und Song, O., 1989, Nature, 340: ). Ein weiteres einsetzbares Analysesystem ist ELISA. [0133] Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die sich an mutiertes p62/sqstm1 binden können, bereit, das folgende Schritte umfasst: (a) Umsetzung eines mutierten p62/sqstm1-proteins mit der in der SEQ-ID-Nr. 4 dargestellten Sequenz oder einem Fragment davon und einer Prüfsubstanz unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen p62/sqstm1 und der Prüfsubstanz erlauben; und (b) Testung auf Komplexe aus dem mutierten p62/sqstm1 und der Prüfsubstanz, auf freie Substanz oder auf nicht komplex-gebundenes mutiertes p62/sqstm1, wobei das Vorliegen von Komplexen anzeigt, dass sich die Prüfsubstanz an das mutierte p62/sqstm1 binden kann. [0134] Bedingungen, die die Bildung von Komplexen aus der Substanz und p62/sqstm1 erlauben, können bezüglich Faktoren wie Beschaffenheit und Menge der Substanz und des Proteins ausgewählt werden. [0135] Der Substanz/Protein-Komplex, freie Substanz oder nicht komplex-gebundene Proteine können mittels herkömmlicher Isoliertechniken, z. B. Aussalzung, Chromatographie, Elektrophorese, Gelfiltration, Fraktionierung, Absorption, Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Agglutination oder Kombinationen davon isoliert werden. Zur Vereinfachung des Tests der Komponenten kann ein Antikörper gegen p62/sqstm1 oder die Substanz oder markiertes p62/sqstm1 oder eine markierte Substanz eingesetzt werden. Die Antikörper, Proteine oder Substanzen können mit einer nachweisbaren Substanz wie zuvor beschrieben markiert sein. [0136] p62/sqstm1 oder die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Substanz kann unlöslich gemacht werden. p62/sqstm1 oder die Substanz kann z. B. an einen geeigneten Träger gebunden werden. Beispiele für geeignete Träger sind Agarose, Cellulose, Dextran, Sephadex, Sepharose, Carboxymethylcellulosepolystyrol, Filterpapier, Ionenaustauschharz, Kunststofffolie, Kunststoffschlauch, Glasperlen, Polyamin-Methylvinyether-Maleinsäure-Copolymer, Aminosäurecopolymer, Ethylen-Maleinsäure-Copolymer, Nylon, Seide, usw. Der Träger kann z. B. in Form eines Schlauches, einer Testplatte, einer Perle, einer Scheibe, einer Kugel 19/53

20 usw. vorliegen. [0137] Das unlöslich gemachte Protein oder die Substanz kann durch Umsetzung des Materials mit einem geeigneten unlöslichen Träger mittels bekannter chemischer oder physikalischer Verfahren, z. B. Cyanogenbromid-Kopplung hergestellt werden. [0138] Die Proteine oder die Substanz können auch auf der Oberfläche einer Zelle nach den hierin beschriebenen Verfahren exprimiert werden. [0139] Die Erfindung erwägt außerdem die Testung auf einen Antagonisten oder Agonisten der Wirkung von p62/sqstm1. [0140] Es ist davon auszugehen, dass die Agonisten und Antagonisten, die nach den erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden können, auf eine oder mehrere der Bindungsstellen auf dem Protein oder der Substanz wirken können, z. B. Agonistenbindungsstellen, konkurrierende Antagonistenbindungsstellen, nicht-konkurrierende Antagonistenbindungsstellen oder allosterische Stellen. [0141] Die Erfindung ermöglicht auch die Durchsuchung nach Antagonisten, die die Wirkung eines Agonisten von p62/sqstm1 inhibieren. Daher kann die Erfindung als Test auf eine Substanz, die um dieselbe Bindungsstelle wie p62/sqstm1 konkurriert, dienen. (ii) Peptidmimetika [0142] Hierin werden weiterhin Peptidkmimetika der erfindungsgemäßen p62/sqstm1- und mutierten p62/sqstm1-proteine offenbart. Ein von einer mutierten Domäne von p62/sqstm1 abgeleitetes Peptid tritt z. B. auf eine Weise direkt oder indirekt mit einem assoziierten Molekül in Wechselwirkung, dass es die native Bindung des mutierten Proteins nachahmt. Das Peptidmimetikum kann von der UBA-Domäne von p62/sqstm1 abgeleitet sein. Solche Peptide können z. B. konkurrierende Inhibitoren, Verstärker, Peptidmimetika und dergleichen sein. All diese Peptide sowie Moleküle, die zu diesen Peptiden im Wesentlichen homolog, komplementär oder anderweitig funktionell oder strukturell gleichwertig sind, können für erfindungsgemäße Zwecke verwendet werden. [0143] Peptidmimetika sind Strukturen, die bei Wechselwirkungen zwischen Molekülen als Substitute für Peptide dienen (Review siehe Morgan et al. (1989), Ann. Reports Med. Chem. 24: ). Peptidmimetika schließen synthetische Strukturen ein, die Aminosäuren und/oder Peptidbindungen enthalten können, jedoch die strukturellen und funktionellen Merkmale eines erfindungsgemäßen Peptids, Verstärkers oder Inhibitors beibehalten. Peptidmimetika schließen außerdem Peptoide, Oligopeptoide (Simon et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367) und Peptidbibliotheken mit Peptiden einer vorgegebenen Länge ein, die alle möglichen Sequenzen von Aminsoäuren, die einem erfindungsgemäßen Peptid entsprechen, darstellen. [0144] Peptidmimetika können basierend auf Informationen, die durch systematischen Ersatz von L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren, Ersatz von Seitenketten durch Gruppen mit unterschiedlichen elektronischen Eigenschaften und durch systematischen Ersatz von Peptidbindungen durch Amidbindungen gewonnen werden, entwickelt werden. Lokale Konformationsbeschränkungen können ebenfalls eingeschleust werden, um die Konformationsvorgaben für die Aktivität eines Kandidaten-Peptidmimetikums zu bestimmen. Die Mimetika können isosterische Amidbindungen oder D-Aminosäuren zur Stabilisierung oder Begünstigung von Umkehrkonformationen und zur Unterstützung der Stabilisierung des Moleküls einschließen. Aminosäurereste können mit Hilfe zyklischer Aminosäureanaloge auf bestimmte Konformationszustände beschränkt werden. Die Mimetika können auch Mimetika sekundärer Strukturen von Inhibitorpeptiden einschließen. Diese Strukturen können die dreidimensionale Ausrichtung von Aminsoäureresten in die bekannten sekundären Proteinkonformationen modellieren. Peptoide Oligomere N-substituierter Aminosäuren können ebenfalls als Motive für die Erzeugung chemisch vielfältiger Bibliotheken neuartiger Moleküle eingesetzt werden. [0145] Die erfindungsgemäßen Peptide können auch der Identifizierung von Leitverbindungen bei der Arzneimittelentwicklung dienen. Die Struktur der hierin beschriebenen Peptide kann durch eine Anzahl von Verfahren wie NMR und Röntgenkristallographie leicht bestimmt werden. Ein Vergleich der Strukturen von Peptiden, die sich in der Sequenz ähneln, in ihrer biologischen Aktivität, die sie in Zielmolekülen entwickeln, jedoch unterscheiden, kann Informationen über die Beziehung zwischen Struktur und Aktivität des Ziels liefern. Mit Hilfe der in der Untersuchung der Beziehung zwischen Struktur und Aktivität gewonnenen Informationen können entweder modifizierte Peptide oder andere kleine Moleküle oder Leitverbindungen, die auf vorausgesagte Eigen- 20/53