Interpretationsanleitung Ventana INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay

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1 Interpretationsanleitung Ventana INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay Thomas M. Grogan, M.D. Abigail S. McElhinny, Ph.D. Isabell R. Loftin, Ph.D. Stephanie L. Warren Michael Sugarman, Ph.D. Rachel Miller Erica Olivas-Brochu Patrick Roche, Ph.D. Eric Walk, M.D. Mary Padilla, M.D. Tobin Jones

2 Abbildungen auf dem Deckblatt: HER2-Cluster und Chr17 (60x), amplifiziert (links) HER2 und Chr17 (60x), nicht amplifiziert (rechts) Diese Interpretationsanleitung ist für die Anwendung des CE IVD INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assays außerhalb der USA vorgesehen.

3 EINLEITUNG 1 Generelle Beschreibung des INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assays 1 Zielsetzung dieser Interpretationsanleitung 1 Leistungsvermögen des HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktails in Ihrem Labor 1 IdENTIfizierUNG des FärbemusTErs 2 HER2-Genstatus 2 Visualisierung und Auszählung von Signalen 6 Eignung des Objektträgers 7 Auswertung eines Objektträgers 9 QuaLITätskontrolle für die ISH-FärbUNG 15 Als interne Positivkontrolle verwendbare Zellkerne (in jedem Gewebeschnitt vorhanden) 15 HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft-Objektträger 15 PräanalyTIsCHE ErwäGUNGEN 17 Fixierung 17 Dicke der Gewebeschicht 19 Weitere Erwägungen 20 VorGEHENsweise bei Problemen 21 QUELLENaNGaben 27 Beispiele für HER2- und Chr17-FärbemusTEr in klinischen Fällen 11 Zusätzliche Beobachtungen 12 Roche We Innovate Healthcare

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5 Einleitung Generelle Beschreibung des Ventana INform HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assays Der INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay dient zur quantitativen lichtmikroskopischen Bestimmung der Amplifikation des HER2-Gens in formalinfixierten paraffineingebetteten Proben von humanem Brust- und Magengewebe (einschließlich des gastroösophagealen Übergangs) mittels einer chromogenen Zweifarbin-situ-Hybridisierung (ISH) nach Färbung in einem Ventana Objektträger-Färbeautomaten. Der INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay wird eingesetzt, um die Eignung des jeweiligen Patienten für eine Behandlung mit Herceptin (Trastuzumab) zu beurteilen. Der INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay ist für die Bestimmung des HER2-Genstatus durch Auszählung der (1) mittels Silber-in-situ-Hybridisierung (SISH) sichtbar gemachten Kopien des HER2-Gens und der (2) mittels chromogener Rot-insitu-Hybridisierung sichtbar gemachten Kopien von Chromosom 17 (Chr17) auf einem einzigen Objektträger. Vor der Auszählung muss die Färbung der als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne durch einen qualifizierten und in der mikroskopischen Interpretation von Gewebeproben (insbesondere von Brust- und Magenkrebs), ISH-Verfahren und der Identifizierung von einzelnen und amplifizierten Kopien des HER2-Gen (erfordert möglicherweise mikroskopische Untersuchungen bei 40- bis 60-facher Vergrößerung) erfahrenen Auswerter evaluiert werden. Zielsetzung dieser Interpretationsanleitung Diese Anleitung soll dem Pathologen ein Hilfsmittel an die Hand geben, um die Bestimmung des HER2-Genstatus durch Interpretation der mithilfe des INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktails erzeugten HER2- und Chr17-Färbemuster zu erleichtern. Die hier aufgeführten Fälle illustrieren die Vielfalt der Färbemuster, wie sie bei Proben von Brust- und Magengewebe nach Färbung mit dem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail auftreten können (Abbildungen 2 bis 11). Diese Mikroskop-Fotografien ermöglichen es neuen Anwendern, sich mit dem gesamten Spektrum der Färbemuster vertraut zu machen. Sie umfassen u. a. Färbebilder des HER2-Gens und von Chromosom 17 (einzelne und mehrere Kopien ebenso wie Cluster), Färbebilder einer Chromosom 17-Polysomie und Bilder möglicherweise auftretender Färbeartefakte. Diese Bilder unterstützen den Anwender auch bei der Beurteilung der Eignung des Objektträgers, der Auszählung der Kopien im Rahmen des Auswertungsalgorithmus und der richtigen Vorgehensweise bei Problemen mit dem Assay. Jedwede im Labor des Endanwenders durchgeführte Färbung muss im Kontext in jedem klinischen Gewebeschnitt vorliegenden, als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne interpretiert werden. Weitergehende Informationen finden Sie in der Packungsbeilage (auch im Internet auf unserer Website sowie in den Abschnitten Qualitätskontrolle und Eignung des Objektträgers dieser Anleitung. Die in dieser Interpretationsanleitung enthaltenen Bilder wurden unter Verwendung des INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assays erstellt. Dieser Assay wurde unter der Leitung von Ventana Medical Systems, Inc. entwickelt und auf Ventana Objektträger-Färbeautomaten validiert. Leistungsvermögen des HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktails in Ihrem Labor Für den INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay empfiehlt es sich, die Gewebeprobe für 6 bis 48 Stunden in neutral gepuffertem 10-prozentigem Formalin (10 % NBF) zu fixieren, in Paraffin einzubetten und anschließend in Schnitte von ca. 4 µm Dicke zu schichten. 1 Aktuelle Studien lassen darauf schließen, dass die Mehrzahl nicht eindeutiger Bestimmungen des HER2- Genstatus auf präanalytische Faktoren wie Unterfixierung, Überfixierung 2 oder verzögerte Fixierung 3 zurückzuführen sind. Auch wenn strikte Anforderungen an die Fixierung gestellt werden können 2, erweist sich die exakte Einhaltung der Fixierungzeiten im Referenzlabor mit einer Vielzahl unterschiedlicher Einsender meist als problematisch. Um mögliche Abweichungen in den untersuchten Geweben selbst ebenso wie bei den präanalytischen Faktoren kompensieren zu können, umfasst dieser Assay verschiedene optionale Schritte sowohl bei der Aufbereitung und Hybridisierung der Gewebeprobe als auch bei der Auswahl der Detektionsreagenzien. Diese optionalen Schritte können dazu beitragen, den Assay weiter optimieren, was beispielsweise für bestimmte Gewebeproben erforderlich ist. Berücksichtigen Sie bitte, dass ein gewisser Teil der Schnitte (max. 6 %) aufgrund von Austrocknung und/oder anderer Artefakte dennoch einer Wiederholungsfärbung bedarf. 4 Austrocknungsartefakte sind leicht zu erkennen (weitergehende Informationen zu den optionalen Protokollschritten, zur Vorgehensweise bei Problemen und zu Färbeartefakten finden Sie im Abschnitt Vorgehensweise bei Problemen ). Außerdem ist bei ISH-Assays von der Verwendung bestimmter Fixative (z. B. Bouin und AFA) abzuraten. Weitergehende Informationen zu den zulässigen Fixativen für den INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay finden Sie im Abschnitt Präanalytische Erwägungen. 1

6 Identifizierung des Färbemusters HER2-Genstatus Beim Menschen kodiert das auf Chromosom 17 lokalisierte HER2- Gen für das HER2-Protein. Etwa 15 bis 25 Prozent aller Brustkrebsfälle gehen mit einer Amplifizierung des HER2-Gens einher, wobei sich diese Fälle durch ein aggressives Tumorwachstum auszeichnen. 5-9 Eine Vielzahl klinischer Studien ergab, dass eine Amplifikation und/oder Überexpression des HER2-Gens bei an invasivem Brustkrebs erkrankten Frauen mit einer ungünstigen klinischen Prognose einhergeht und mit verschiedenen negativen Prädiktoren (z. B. negativer Östrogenrezeptorstatus, hoher S-Phasen-Anteil, Lymphknotenbefall, p-53-mutation und hochgradige Zellkernatypie) korreliert Jüngere Studien lassen zudem darauf schließen, dass auch bei einem bestimmten Prozentsatz von Magenkarzinomen eine Überexpression des HER2-Gens vorliegt. 15 Die Abbildungen in dieser Interpretationsanleitung zeigen INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Färbungen von kanzerösem Gewebe der Brust und des Magens (Abbildungen 2 und 3). Sämtliche in dieser Interpretationsanleitung enthaltenen Anweisungen zu präanalytischen Erwägungen, zur Auszählung und zur Vorgehensweise bei Problemen beziehen sich Gewebeschnitte von Brust- und Magenkrebs gleichermaßen. Der INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay wurde entwickelt, um eine gemeinsame Hybridisierung und lichtmikroskopische Darstellung des HER2-Gens und des Chr17-Centromers auf einem einzigen Objektträger zu ermöglichen. Bei diesem Assay erfolgt die Detektion des HER2-Gens mittels einer dinitro- Abbildung 1. phenyl-markierten Sonde (DNP), für die Visualisierung wird ein ultraview SISH DNP (Silber-in-situ-Hybridisierung) Detection Kit verwendet. Die Detektion des Chr17-Centromers erfolgt mittels einer digoxigenin-markierten Sonde (DIG), für die Visualisierung wird ein ultraview Red ISH DIG Detection Kit verwendet. Lichtmikroskopisch stellt sich das HER2-Gen in der Dual ISH-Färbung als isoliertes schwarzes Signal (SISH) und das Chromosom 17 als rotes Signal (Red ISH) dar, und dies in den Kernen gesunder, als interne Positivkontrolle der Färbung dienenden Zellkerne wie in denen entarteter Zellkerne gleichermaßen. Dieses Verfahren gestattet die Bestimmung des HER2-Genstatus im Kontext des Chromosomenstatus mittels Standard-Lichtmikroskopie bei 20-, 40- und/oder 60-facher Vergrößerung. Der HER2-Genstatus ergibt sich aus dem Verhältnis der durchschnittlichen Anzahl von Kopien des HER2-Gens zur durchschnittlichen Anzahl von Kopien von Chromosom 17 in den Zellkernen invasiver Mamma- bzw. Magenkarzinome. Liegt dieses HER2/Chr17-Verhältnis unter 2,0 (Abbildung 2, Fall 1), wird der HER2-Genstatus als nicht amplifiziert klassifiziert. Liegt es bei oder über 2,0 (Abbildung 2, Fall 3), wird der HER2-Genstatus analog als amplifiziert klassifiziert. Grenzfälle mit einem HER2/ Chr17-Verhältnis zwischen 1,8 und 2,2 bedürfen einer besonders sorgfältigen Auswertung. 1 Ventana hat einen quantitativen Auswertungsalgorithmus für die Bestimmung des HER2-Genstatus in mit dem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail gefärbten Gewebeschnitten entwickelt, der im Abschnitt Auswertung eines Objektträgers (Abbildung 7) detailliert erläutert wird. Die Abbildungen 2 bis 4 zeigen verschiedene Fälle, die die mögliche Bandbreite des HER2-Genstatus illustrieren. A. DNP HER2- und Chr17- Sonden-Cocktail DIG DNP-markierte HER2-Sonde DIG-markierte Chr17-Sonde B. ultraview SISH Detection Kit C. ultraview Red ISH DIG Detection Kit 2 3, 4, 5: Silberreagenzien A, B, C SISH-Signal (Punkte) 1: Anti-DNP- Antikörper (Kaninchen) * 2: Anti-Kaninchen- Antikörper (Ziege, HRP) 3, 4, 5: ph-verstärker, Naphthol, Fast Red 1: Anti-DIG- Antikörper (Maus) Red ISH-Signal (Punkte) 2: Anti-Maus- Antikörper (Ziege, AP)

7 Abbildung 2. HER2-Genstatus in repräsentativen Gewebeschnitten von Mamma- und Magenkarzinomen Fall 1. Mammakarzinom mit nicht amplifiziertem HER2-Gen. HE-Färbung (60x) HER2 und Chr17 (60x); Je Tumorzelle sind ein bis zwei SISH- und Red ISH-Signale klar abgrenzbar. Fall 2. Mammakarzinom mit nicht amplifiziertem HER2-Gen, aber mit multiplen HER2- und Chr17-Kopien. HE-Färbung (60x) HER2 und Chr17 (60x); In jeder Tumorzelle liegen im Schnitt mehr als zwei SISH-Signale vor. 3

8 Abbildung 2. HER2-Genstatus in repräsentativen Gewebeschnitten von Mamma- und Magenkarzinomen Fall 3. Mammakarzinom mit amplifiziertem HER2-Gen (SISH-Cluster). HE-Färbung (60x) HER2 und Chr17 (60x); Es liegen SISH-Cluster (HER2) vor, die Zahl der Kopien des HER2-Gens muss vom Auswerter geschätzt werden. In jedem Zellkern liegen ein bis zwei Red ISH-Signale (Chr17) vor. Fall 4. Mammakarzinom mit schwach amplifiziertem HER2-Gen. HE-Färbung (60x) HER2 und Chr17 (60x); In jedem Zellkern sind im Schnitt mehr als zwei Kopien des HER2-Gens erkennbar, aber nur ein bis zwei Kopien von Chromosom 17. Dieser Fall wird als schwach amplifiziert klassifiziert. 4

9 Abbildung 2. HER2-Genstatus in repräsentativen Gewebeschnitten von Mamma- und Magenkarzinomen Fall 5. Magenkarzinom mit nicht amplifiziertem HER2-Gen. HE-Färbung (60x) HER2 und Chr17 (60x). Nur eine Kopie des HER2-Gens (nicht amplifiziert). Fall 6. Magenkarzinom mit multiplen Kopien des HER2-Gens und von Chromosom 17. HE-Färbung (60x) HER2 und Chr17 (60x). In jedem Zellkern liegen mehr als zwei Kopien des HER2-Gens und von Chromosom 17 vor. Fall 7. Magenkarzinom mit amplifiziertem HER2-Gen (SISH-Cluster). HE-Färbung (60x) HER2 und Chr17 (60x); Es liegen SISH-Cluster (HER2) vor, die Zahl der Kopien des HER2-Gens muss vom Auswerter geschätzt werden. In jedem Zellkern liegen ein bis zwei Red ISH-Signale (Chr17) vor. 5

10 Visualisierung und Auszählung von Signalen ISH-Signale treten einzeln, zu mehreren oder als Cluster auf (Abbildung 3 und Tabelle 1). Einzelsignale in gesunden Zellkernen dienen als Referenz für das Auszählen der Signale in den entarteten Zellkernen. Abbildung 3. Visualisierung von Signalen Fall 8. Mammakarzinom Einzelne Kopien Ein isoliertes Signal zählt als einzelne Kopie des HER2-Gens oder von Chromosom 17. Die in den als interne Positivkontrolle dienenden Zellkernen erkennbaren isolierten Einzelsignale geben Aufschluss über die Größe der entsprechenden Signale in den entarteten Zellkernen (Abbildungen 2 bis 4). Beachten Sie bitte, dass die einer einzelnen Kopie des HER2-Gens oder von Chromosom 17 entsprechenden isolierten Signale von Patient zu Patient unterschiedlich groß ausfallen können. Zudem sind SISH- Signale (schwarz) üblicherweise kleiner und unauffälliger als Red ISH-Signale (rot). Aus den genannten Gründen ist es zwingend erforderlich, die in den als interne Positivkontrolle dienenden, den entarteten Zellen benachbarten Zellen (physiologische Kontrolle) erkennbaren diskreten Einzelsignale als Referenz für die relative Größe der SISH-Signale zu nutzen. Red ISH-Signale können größer erscheinen als SISH-Signale. Mitunter weisen sie auch eine gestreckte Form auf und können sowohl innerhalb des jeweiligen Zielbereichs als auch von Gewebeprobe zu Gewebeprobe in der Größe variieren. Die als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne sind in benachbarten normalen Stromazellen (z. B. Fibroplasten, Fibrozyten und Endothelzellen) und Leukozyten (z. B. Lymphozyten und Makrophagen) zu finden. HER2 und Chr17 (60x). Nur eine Kopie des HER2-Gens (nicht amplifiziert). Fall 9. Mammakarzinom Multiple Kopien Wie bereits beschrieben geben in den als interne Positivkontrolle dienenden Zellkernen auftretende isolierte schwarze Einzelsignale (SISH) Aufschluss über die Größe der entsprechenden Signale einer einzelnen Kopie des HER2-Gens in entarteten Zellkernen. Die Fälle 2, 4, 6 und 9 in den Abbildungen 2 bis 4 zeigen eine Anzahl von Zellkernen, in denen multiple isolierte Signale zu erkennen sind. HER2 und Chr17 (60x). Multiple Kopien der HER2-Gens (schwach amplifiziert). Fall 10. Mammakarzinom 6 Cluster Unter einem Cluster versteht man eine Vielzahl einander überlappender SISH-Signale im Zellkern, die nicht eindeutig voneinander abgegrenzt werden können. Da diese nur schwer exakt auszählbar sind, kann die Zahl der Kopien des HER2-Gens in einem Cluster nur geschätzt werden. So kann ein kleiner Cluster beispielsweise als 6, ein großer hingegen als 12 oder mehr Signale gewertet werden. Ein einzelner Zellkern kann sowohl multiple kleine und/oder große Cluster als auch Kombinationen kleiner und großer Cluster aufweisen, aber auch Cluster und Einzelsignale. Die Fälle 3, 7 und 10 in den Abbildungen 2 bis 4 zeigen Zellkerne, in denen Cluster zu erkennen sind. HER2 und Chr17 (60x). HER2-Cluster (amplifiziert).

11 Tabelle 1. Visualisierung von Signalen Schwarze HER2-Cluster überlagern ein oder mehrere rote Signale. In 60-facher Vergrößerung kann möglicherweise das Vorliegen oder Fehlen roter Signale eindeutig festgestellt werden. Ist dies nicht möglich, darf ein derartiger Zellkern nicht ausgezählt werden nur Zellkerne mit eindeutig abgrenzbaren roten Signalen dürfen bei der Auszählung Berücksichtigung finden. Auf dem Auszählungsbogen ist zu vermerken, dass HER2-Cluster vorliegen. Liegen in Zellkernen mit SISH-Clustern sichtbare rote Signale in größerer Anzahl vor, sind vorzugsweise diese Zellkerne auszuzählen. Überlappende Zellkerne nicht zählen Keine Signale nicht zählen Nur ein Signal in einer Farbe nicht zählen Sollte sich in den Zellkernen eine Hintergrundfärbung in Form von SISH-Staub zeigen, dürfen diese nur ausgezählt werden, wenn die spezifischen schwarzen Signale eindeutig vom Hintergrund abgrenzbar sind. Signale außerhalb des Zellkerns nicht zählen Ein möglicherweise auftretender roter Schleier darf nicht als Signal fehlinterpretiert werden. Rote Signale können unterschiedliche Intensitäten aufweisen, treten aber stets isoliert auf. Diese Abbildung zeigt zwei (2) diskrete rote (Chr17) und zwei (2) schwarze Signale (HER2). Ein (1) schwarzes (HER2) und ein (1) rotes Signal (Chr17) Zwei (2) schwarze (HER2) und zwei (2) rote Signale (Chr17) Ein (1) schwarzes (HER2) und zwei (2) rote Signale (Chr17). Das schwarze Signal ist eine Dublette. Benachbarte Signale gleicher Farbe werden nur dann als eigenständige Signale gewertet und gezählt, wenn der Abstand zwischen diesen Signalen mindestens dem Durchmesser eines einzelnen Signals entspricht. Kleine SISH-Cluster werden auf Grundlage der Größe eines einzelnen isolierten Referenzsignals in einer benachbarten Stromazelle (kleinere Zelle links) abgeschätzt. Dieser Cluster könnte beispielsweise auf sechs (6) SISH-Signale geschätzt werden, was zusammen mit den beiden isolierten Signalen eine Gesamtzahl von acht (8) schwarzen Signalen ergibt. Die Zahl der roten Signale beträgt zwei (2). Auf dem Auszählungsbogen ist zu vermerken, dass HER2Cluster vorliegen. Vor dem Auszählen der Signale muss die Eignung des Objektträgers verifiziert werden Vor dem Auszählen der HER2- und Chr17-Signale zur Bestimmung des HER2-Genstatus muss unbedingt kontrolliert werden, ob der Gewebeschnitt adäquat gefärbt wurde und den nachstehend aufgeführten Kriterien genügt. Sollte der Gewebeschnitt für die Auszählung der Signale ungeeignet sein, ist anhand der Angaben im Abschnitt Vorgehensweise bei Problemen zu entscheiden, ob eine Wiederholungsfärbung in Frage kommt. Kriterium 1: Die als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne müssen gefärbt sein Der große Cluster muss abgeschätzt werden. Dieser Cluster könnte beispielsweise auf zwölf (12) SISH-Signale geschätzt werden, was zusammen mit den vier (4) isolierten Signalen eine Gesamtzahl von sechzehn (16) schwarzen Signalen ergibt. Die Zahl der roten Chr17Signale beträgt zwei (2). Auf dem Auszählungsbogen ist zu vermerken, dass HER2-Cluster vorliegen. Die HER2- und Chr17-Signale in den kein neoplastisches Wachs- Ein rotes Signal in unmittelbarer Nähe eines schwarzen Signals ist als ein (1) rotes und ein (1) schwarzes Signal zu zählen. In Fällen wie diesem muss möglicherweise eine 60-fache Vergrößerung gewählt werden, um die Signale voneinander abgrenzen zu können. In diesem Beispiel liegen somit vier (4) schwarze und zwei (2) rote Signale vor. Können einander überlappende Signale nicht voneinander abgegrenzt werden, darf der entsprechende Zellkern nicht ausgezählt werden. des Zielbereichs (z. B. Fibroplasten, Endothelzellen, Lymphozy- tum aufweisenden Zellkernen (ein bis zwei klar abgrenzbare HER2- und Chr17-Signale je Zellkern) fungieren als interne physiologische Positivkontrolle und müssen bei 20-, 40- oder 60-facher Vergrößerung zu erkennen sein. Diese eindeutigen Signale finden sich in nicht entarteten Zellen innerhalb und außerhalb ten und andere gesunde Zellen, siehe Abbildung 4). Aufgrund so genannter Truncations-Artefakte an der Schnittebene sind üblicherweise nicht in allen Zellen und nicht in allen Regionen des Gewebeschnitts isolierte HER2- oder Chr17-Signale zu erkennen. Eine exakte Auszählung bedingt jedoch, dass in gesunden Zellen, die innerhalb des auszuzählenden Bereichs oder in dessen unmittelbarer Nachbarschaft liegen, einzelne isolierte Signale zu erkennen sind. 7

12 Abbildung 4. Normale Färbung der als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne Fall 11. Mammakarzinom Fall 12. Mammakarzinom A A HER2 und Chr17 (60x); nicht amplifiziertes HER2-Gen A: Als interne Positivkontrolle dienende Zellkerne HER2 und Chr17 (60x); multiple Kopien des HER2-Gens A: Als interne Positivkontrolle dienende Zellkerne Fall 13. Mammakarzinom A Abbildung 4 zeigt exemplarische Fälle mit adäquater Färbung der als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne. Abbildung 5 zeigt exemplarische Fälle von ungeeigneten Gewebeschnitten mit mangelnder SISH- oder Red ISH-Färbung sowohl in den als interne Positivkontrolle dienenden als auch in den entarteten Zellkernen. Gewebeschnitte dieser Art benötigen eine Wiederholungsfärbung, bevor sie ausgezählt werden können. HER2 und Chr17 (60x); amplifiziertes HER2-Gen (SISH-Cluster) A: Als interne Positivkontrolle dienende Zellkerne Abbildung 6 zeigt einen Fall eines aufgrund fehlender Färbung der als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne ungeeigneten Gewebeschnitts. Dieser Gewebeschnitt kann nicht ausgezählt werden und bedarf einer Wiederholungsfärbung. Anweisungen zur Wiederholung der Färbung von ungeeigneten Gewebeschnitten finden Sie im Abschnitt Vorgehensweise bei Problemen. Abbildung 5. Ungeeignete Gewebeschnitte aufgrund mangelhafter SISH- bzw. Red ISH-Färbung Fall 14. Mammakarzinom Fall 15. Mammakarzinom A A HER2 und Chr17 (60x); ungeeigneter Gewebeschnitt aufgrund schwacher/fehlender Red ISH-Färbung der als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne ebenso wie der Kerne der entarteten Zellen. A: Als interne Positivkontrolle dienende Zellkerne. HER2 und Chr17 (60x); ungeeigneter Gewebeschnitt aufgrund mangelhafter SISH- Färbung der als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne ebenso wie der Kerne der entarteten Zellen. A: Als interne Positivkontrolle dienende Zellkerne. 8

13 Abbildung 6. Ungeeigneter Gewebeschnitt aufgrund mangelhafter Färbung der als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne Fall 16. Mammakarzinom A HER2 und Chr17 (60x); ungeeigneter Gewebeschnitt aufgrund mangelhafter SISH- und Red ISH-Färbung der als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne. A: Die als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne weisen eine nur schwache oder gänzlich fehlende SISH- und Red ISH-Färbung auf, obwohl die Kerne der entarteten Zellen mit beiden Sonden gefärbt sind. Dieser Gewebeschnitt ist für eine Auszählung ungeeignet. Auswertung eines Objektträgers Ventana hat einen quantitativen Auswertungsalgorithmus entwickelt, mit dessen Hilfe der HER2-Genstatus mit optimaler Genauigkeit und Effizienz bestimmt werden kann. Nach Festlegung eines geeigneten Zielbereichs bestimmt der Auswerter die Anzahl der HER2- und Chr17-Signale in 20 repräsentativen Zellkernen. Liegt das sich ergebende HER2/Chr17-Verhältnis im Grenzbereich zwischen 1,8 und 2,2, empfiehlt es sich, 20 weitere Zellkerne auszuzählen und den HER2-Genstatus auf Grundlage von insgesamt 40 ausgezählten Zellkernen zu bestimmen. Liegt dieses HER2/Chr17-Verhältnis unter 2,0, wird der HER2-Genstatus als nicht amplifiziert klassifiziert. Liegt es bei oder über 2,0, wird der HER2-Genstatus analog als amplifiziert klassifiziert. Abbildung 7 zeigt diesen Auswertungsalgorithmus in Form eines Flussdiagramms. Kriterium 2: Die Färbung der entarteten Zellen im Zielbereich (Mamma- oder Magenkarzinomzellen) muss eine Auszählung zulassen Unter 20-, 40- und/oder 60-facher Vergrößerung muss im Zielbereich des Gewebeschnitts (Mamma- oder Magenkarzinomzellen) eine Anzahl entarteter Zellen mit auszählbaren HER2- (SISH) und Chr17-Signalen (Red ISH) vorliegen. Aufgrund so genannter Truncations-Artefakte an der Schnittebene kann nicht davon ausgegangen werden, dass jede entartete Zelle Signale aufweist. Dennoch ist es wichtig, dass der Zielbereich eine auszählbare Region akzeptabler Größe enthält. Sollte die Färbung in einem bestimmten Zielbereich zu schwach ausgeprägt zu sein, ist zu kontrollieren, ob ein anderer Zielbereich eine erfolgreiche Auszählung zulässt. Sollten alle größeren Bereiche eine unzureichende Färbung aufweisen, ist der Objektträger als ungeeignet anzusehen und kann nicht ausgezählt werden. Abbildung 7. Flussdiagramm für den Auswertungsalgorithmus Start HER2/Chr17 stained slide Slide adequate? No Yes Identify and select target area Count HER2 and Chr17 signals in 20 nuclei Calculate HER2/Chr17 ratio by dividing the total number of HER2 signals from Target Area 1 by total number of Ch17 signals from Target Area 1 Inadequate Kriterium 3: Die Hintergrundfärbung darf die Auszählung nicht beeinträchtigen Schließlich ist die durch die SISH- und/oder Red ISH-Detektionsreagenzien hervorgerufene Hintergrundfärbung zu beurteilen und zu entscheiden, ob diese die Auszählung der spezifischen SISH- und Red ISH-Signale beeinträchtigt. Eine SISH-Färbung des Hintergrunds manifestiert sich typischerweise als SISH-Staub, der von den spezifischen Signalen klar unterscheidbar ist (Abbildung 21). Eine Red ISH-Färbung des Hintergrunds kann einen roten Schleier von deutlich geringerer Intensität als die spezifischen Signale hervorrufen (Abbildungen 20 und 22). Anweisungen zur Wiederholung der Färbung von Gewebeschnitten mit einer die Auszählung beeinträchtigenden Hintergrundfärbung finden Sie im Abschnitt Vorgehensweise bei Problemen. Is HER2/Chr ? No Report Results Non-Amplified HER2/Chr17 < 2.0 Amplified HER2/Chr17 > 2.0 Yes Count additional 20 nuclei Calculate HER2/Chr17 ratio by dividing the total number of HER2 signals from Target Areas 1 and 2 by the total number of Chr17 signals from Target Areas 1 and 2 9

14 Übersicht über die Auswertung Nach Festlegung eines geeigneten Zielbereichs mit adäquater Färbung dürfen ausschließlich solche Karzinomzellen ausgezählt werden, die sowohl SISH- (HER2) als auch Red ISH- Signale (Chr17) aufweisen. Bereiche mit schwachen oder zur Gänze fehlenden SISH- und/oder Red ISH-Signalen, Bereiche ohne adäquat gefärbte gesunde, als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne, Bereiche mit komprimierten oder einander überlappenden Zellkernen, Bereiche mit übermäßiger SISH- und/oder Red ISH-Hintergrundfärbung sowie Bereiche mit nekrotischen Zellen sind für die Auszählung der Signale nicht geeignet. Des Weiteren sind solche Zellkerne von der Auszählung der Signale auszuschließen, die nicht als repräsentativ für die Gesamtheit der entarteten Zellen des Zielbereichs anzusehen sind. So dürfen beispielsweise die Signale außergewöhnlich großer (mindestens doppelt so groß wie andere Kerne entarteter Zellen im Zielbereich) und außergewöhnlich kleiner (höchstens halb so groß wie andere Kerne entarteter Zellen im Zielbereich) Zellkerne nicht ausgezählt werden. Weist der Zielbereich eine genetische Heterogenität hinsichtlich der Anzahl der Kopien des HER2-Gens auf, sind nur solche Zellkerne auszuzählen, die als repräsentativ für die Gesamtheit der entarteten Zellen des Zielbereichs mit der höchsten durchschnittlichen Signalzahl angesehen werden können. Weitergehende Informationen zum Aspekt Heterogenität finden Sie im Abschnitt Zusätzliche Beobachtungen. Zur Auswertung eines mit dem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail gefärbten Gewebeschnitts gehen Sie wie folgt vor: 1. Bestimmen Sie in dem HE-gefärbten Gewebeschnitt geeignete Zielbereiche mit Karzinomzellen. 2. Bestimmen Sie in dem zugehörigen HER2 Dual ISH-gefärbten Gewebeschnitt einen Zielbereich mit Karzinomzellen, bei dem die folgenden Bedingungen erfüllt sind: Die Mehrzahl der Zellen des ausgewählten Bereichs weist sowohl SISH- als auch Red ISH-Hybridisierungssignale auf, die nicht durch eine unspezifische Hintergrundfärbung überdeckt werden. Sämtliche den auszuwertenden Karzinomzellen benachbarten Bereiche enthalten gesunde Zellen, die als interne Positivkontrolle dienen können (Hinweis: Bei Xenografts funktionert die Verwendung gesunder Zellen als interne Positivkontrolle nicht, da Xenografts aus in Mäusen vermehrten humanen Tumorzelllinien bestehen. Bei den nicht entarteten Zellen handelt es sich somit um Mauszellen mit HER2- und Chr17-Sequenzen der Maus, die von den entsprechenden Sonden nicht erkannt werden.) Die Kerne verschiedener normaler Zellen (z. B. Fibroplasten, Endothelzellen, Lymphozyten und andere kein neoplastisches Wachstum aufweisende Zellen) weisen ein oder zwei HER2- und Chr17-Signale auf. 3. Zählen Sie innerhalb des Zielbereichs 20 repräsentative Zellkerne entarteter Zellen aus, die den folgenden Anforderungen genügen: Die Zellkerne sind nicht relevant größer oder kleiner als der Durchschnitt. Die Zellen zeigen keine oder nur minimale Überlappung mit anderen Zellen. Bei einander überlappenden SISH- und Red ISH-Signalen muss möglicherweise eine 60-fache Vergrößerung gewählt werden, um die Signale eindeutig voneinander abgrenzen zu können. Die Zellkerne sind weder stark angedaut noch blasenförmig ( bubbled ). Die Zellkerne befinden sich nicht in Bereichen mit unspezifischer, die Auszählung möglicherweise beeinträchtigender Färbung. Informationen zur Behandlung von Gewebeschnitten mit derartigen Zellkernen finden Sie im Abschnitt Vorgehensweise bei Problemen. Beachten Sie hierzu auch die Ausführung unter Präanalytische Erwägungen. Bestimmen Sie die die Anzahl der HER2- und Chr17- Signale in 20 repräsentativen Zellkernen. Vermerken Sie, ob HER2-Cluster vorliegen, und schätzen Sie auf Grundlage der Größe eines einzelnen, isolierten Referenzsignals die Anzahl der in einem solchen Cluster enthaltenen HER2-Signale ab. Beachten Sie bitte, dass vorzugsweise solche Zellkerne mit SISH- Clustern auszuzählen sind, die sichtbare rote Signale in größerer Anzahl aufweisen. 4. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der HER2- und Chr17- Signale und berechnen Sie deren Verhältnis (Quotient). Liegt das sich ergebende HER2/Chr17-Verhältnis im Grenzbereich zwischen 1,8 und 2,2, müssen 20 weitere Zellkerne ausgezählt und der HER2-Genstatus auf Grundlage von insgesamt 40 ausgezählten Zellkernen bestimmt werden. 10

15 Beispiele für HER2- und Chr17-Färbemuster in klinischen Fällen Die folgenden Fotografien (Abbildungen 8 bis 11) illustrieren die Vielfalt der Färbemuster, wie sie bei Proben von Brust- und Magengewebe nach Färbung mit dem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail auftreten können. Diese Fotografien ermöglichen es neuen Anwendern, sich mit dem gesamten Spektrum der möglichen Färbemuster vertraut zu machen. Jedwede im Labor des Endanwenders durchgeführte Färbung muss im Kontext der als interne Positivkontrolle dienenden Zellkerne oder der gemeinsam mit den klinischen Fällen durchgelaufenen Kontrollen (siehe Abschnitt Qualitätskontrolle ) interpretiert werden. Spektrum typischer Färbemuster Abbildung 8. Fälle mit nicht amplifiziertem HER2-Gen, mit multiplen Kopien und mit amplifiziertem HER2-Gen Fall 17. Mammakarzinom HE-Färbung (60x) HER2 und Chr17 (60x). Nur eine Kopie des HER2-Gens (nicht amplifiziert). Fall 18. Mammakarzinom HE-Färbung (60x) HER2 und Chr17 (60x); Multiple Kopien des HER2-Gens und von Chromosom 17 (erhöhte Sorgfalt beim Auszählen erforderlich). 11

16 Abbildung 8. (Fortsetzung) Fall 19. Mammakarzinom HE-Färbung (60x) HER2 und Chr17 (60x). HER2-Cluster (amplifiziert). Zusätzliche Beobachtungen Über das Spektrum typischer Färbemuster (Abbildung 8) hinausgehende Beobachtungen hinsichtlich der HER2- oder Chr17- Färbung können von klinischer Bedeutung sein und müssen im histologischen Befund aufgeführt werden. Abbildung 9. Genetische Heterogenität Fall 20. Mammakarzinom Heterogenität Gewebeproben von Mamma- oder Magenkarzinomen können eine genetische Heterogenität hinsichtlich der Anzahl der Kopien des HER2-Gens aufweisen. Diese zeichnet sich dadurch aus, dass die Anzahl der HER2-Signale von Zellkern zu Zellkern stark schwankt, von isolierten Einzelsignalen über multiple Signale bis hin zu Clustern (Abbildung 9). A B Eine genetische Heterogenität kann zwischen den Karzinomzellen eines Zielbereichs, aber auch zwischen den Zellen verschiedener Zielbereiche desselben Gewebeschnitts beobachtet werden. Hierbei empfiehlt es sich, für die Auszählung solche Zellkerne auszuwählen, die eine große Anzahl von HER2-Signalen aufweisen. Zudem ist die Heterogenität hinsichtlich der Anzahl der Kopien des HER2-Gens auf dem Auszählungsbogen zu vermerken. HER2 und Chr17 (60x). Heterogenität hinsichtlich der Anzahl der Kopien des HER2- Gens innerhalb eines Zielbereichs. A: Hohe Anzahl von Kopien des HER2-Gens, augenscheinliche Chromosom 17-Polysomie. B: Niedrige Anzahl von Kopien des HER2-Gens. Invasive Mammakarzinome vs. in-situ-karzinome (DCIS) Aus klinischer Sicht ist die Auszählung der HER2- und Chr17- Signale, d. h. die Bestimmung des HER2-Genstatus, nur bei invasiven Karzinomen von Relevanz. Bei der Auswertung von Gewebeschnitten der Brust darf daher keine Auszählung der Signale in gefärbten in-situ-karzinomzellen erfolgen. Es empfiehlt sich, zunächst im HE-gefärbten Gewebeschnitt einen geeigneten Zielbereich festzulegen und diesen dann im korrespondierenden Dual ISH-gefärbten Gewebeschnitt auszuzählen (Abbildung 10). 12

17 Abbildung 10. Invasives Mammakarzinom vs. in-situ-karzinom Fall 21. Mammakarzinom A B HE-Färbung (10x); in-situ-karzinom und invasives Mammakarzinom. (A) HER2 und Chr17 (60x). in-situ-karzinom, HER2-Gen nicht amplifiziert Chromosom 17-Aneusomie Monosomie Als Monosomie bezeichnet man einen Zustand, bei dem ein Chromosom in einem Zellkern im Schnitt nur einmal (statt wie HER2 und Chr17 (10x); in-situ-karzinom (A) und invasives Mammakarzinom (B). (B) HER2 und Chr17 (60x). Invasives Karzinom, HER2-Gen nicht amplifiziert Polysomie Als Polysomie bezeichnet man einen Zustand, bei dem ein Chromosom in einem Zellkern im Schnitt mindestens einmal öfter vorhanden ist als in normalen Zellkernen.13 Bei einer Chro- üblich zweimal) vorhanden ist. mosom 17-Polysomie enthalten die Zellkerne somit drei oder So weisen beispielsweise die Zellkerne in Fall 22 im Schnitt mit dem Zustand während der Interphase verwechselt werden, zwei (2) Kopien des HER2-Gens auf, Chromosom 17 kann jedoch in größerer Zahl nachgewiesen werden. Chromosom mehr Kopien von Chromosom 17 (Abbildung 11). Dies darf nicht während der sich in Teilung befindliche diploide Zellen jeglicher Art drei bis vier Kopien von Chromosom 17 aufweisen. 17 wurde somit vervielfältig, jedoch trat dabei ein genetischer Verlust des HER2-Allels auf. Der Befund zu Fall 19 könnte die Anmerkung Monoallelische Deletion enthalten. Die Zellkerne in Fall 23 enthalten multiple Kopien des HER2-Gens, gleichzeitig ist aber auch eine Chromosom 17-Polysomie zu erkennen. 13

18 Abbildung 11. Chromosom 17-Aneusomie Fall 22. Mammakarzinom HER2 und Chr17 (60x); Monoallelische Deletion. In einer geringen Zahl der Fälle zeigt sich ein Verlust des HER2-Gens auf einer oder mehreren Kopien von Chromosom 17. Zudem kann eine Chromosom 17-Polysomie vorliegen. Das HER2/Chr17-Verhältnis liegt daher unter 1,0, als genetische Ursache ist Monoallelische Deletion zu nennen. Fall 24. Mammakarzinom HER2 und Chr17 (60x). Amplifiziertes HER2-Gen, perizentromere Chromosom 17-Amplifikation Perizentromere Chromosom 17-Amplifikation Fall 23. Mammakarzinom HER2 und Chr17 (60x). Multiple isolierte Kopien des HER2-Gens, Chromosom 17-Polysomie. Fälle wie dieser müssen mit größter Sorgfalt ausgezählt werden. Fall 24b Chr17 (60x). Isolierte Red ISH-Signale ebenso wie perizentromere Chromosom 17-Amplifikation. Fall 24c Die Literatur kennt verschiedene Berichte zu augenscheinlicher Amplifikation, Cluster-Bildung oder Polysomie von Chromosom 17 (mit oder ohne offensichtliche HER2-Cluster) In Fall 24 beispielsweise ist das HER2-Gen offensichtlich amplifiziert, wobei jedoch auch die Red ISH-Signale von Chromosom 17 Cluster bilden (Abbildung 11). Auch wenn in diesem Fall sowohl die HER2- als auch die Chr17-Signale als Cluster auftreten, darf nicht einfach angenommen werden, dass es sich hierbei um einen Fall mit nicht amplifiziertem HER2-Gen und einem HER2/Chr17-Verhältnis von etwa 1,0 handelt. In Fällen mit offenkundiger Amplifikation von Chromosom 17 muss der Auswerter die Signale beider Sonden sorgfältig auswerten. Bei der Erstellung des histologischen Befunds sind in solchen Fällen außerdem auch die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung zu berücksichtigen. Unserer Erfahrung nach liegt bei einem Großteil der Fälle mit HER2- und Chr17-Clustern eine Tendenz zu einer Überexpression des Prote14 ins vor (3+ nach IHC-Färbung, siehe Abbildung 11, Fall 24c). HER2 und Chr17 (60x). HER2/neu 4B5-Färbung, 3+ in der immunhistochemischen Färbung, HER2-Überexpression.

19 Qualitätskontrolle für die ISH-Färbung Als interne Positivkontrolle verwendbare Zellkerne (in jedem Gewebeschnitt vorhanden) Wie im Abschnitt Eignung des Objektträgers erläutert dienen die HER2- (SISH) und Chr17-Signale (Red ISH) normaler, nicht entarteter Zellen (ein bis zwei Signale je Zelle) auf demselben Objektträger als interne Positivkontrolle. Gewebeschnitte ohne derartige nicht entartete Zellen sind für die Bestimmung des HER2-Genstatus ungeeignet. Diese spezifischen HER2- und Chr17-Signale können in vielerlei Zellen auftreten, z. B. in Fibroplasten, Endothelzellen, Lymphozyten und kein neoplastisches Wachstum aufweisenden Brustepithelzellen. Bedingt durch eine mögliche genetische Heterogenität und Truncations-Artefakte an der Schnittebene sind nicht notwendigerweise in allen gesunden Zellen einzelne Gen- oder Chromosomkopien erkennbar. Da in jeder menschlichen Zelle Kopien des HER2-Gens und von Chromosom 17 vorliegen, gibt es keine echte interne Negativkontrolle. Auf Wunsch kann bei jedem Färbevorgang eine Positivkontrolle mit durchlaufen. Diese Kontrollpräparate ermöglichen eine effektive Kontrolle der einwandfreien Funktion von Reagenzien und Färbeautomat, und ermöglichen die Einrichtung optimaler Färbebedingungen, die zwingende Voraussetzung für das Färben klinischer Gewebeschnitte sind. Für die Verwendung als Positivkontrolle eignen sich auch Biopsate, die auf die gleiche Weise wie die zu untersuchenden klinischen Gewebeschnitte präpariert wurden. Positivkontrollen dieser Art können sich als hilfreich erweisen, da sie als Qualitätskontrolle für alle Schritte des Verfahrens dienen, von der präanalytischen Aufbereitung der Gewebeprobe bis zum eigentlichen Färbevorgang. Positivkontrollen, die auf andere Weise als die klinischen Gewebeschnitte präpariert wurden, können als Kontrolle für die Reagenzien, den Färbeautomaten und die Durchführung der Färbung dienen, nicht aber als Kontrolle für die Fixierung und die Aufbereitung der Gewebeprobe. HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft-Objektträger HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft-Objektträger sind für die Verwendung bei der initialen Installation des Assays sowie bei den zur Behebung von Problemen mit dem HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail auf Ventana BenchMark Färbeautomaten erforderlichen Aktivitäten vorgesehen. HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft-Objektträger tragen drei unterschiedliche formalinfixierte paraffineingebettete Xenograft-Schnitte (Abbildung 12). Die Auswahl der Zelllinien für diesen Objektträger (Calu-3, ZR-75-1 und MCF-7) erfolgte auf Grundlage ihrer in der einschlägigen Literatur dokumentierten molekularen Charakterisierung hinsichtlich der Anzahl der HER2-Genkopien und der Proteinniveaus. Diese Zelllinien repräsentieren das gesamte Spektrum der in klinischen Gewebeschnitten auftretenden HER2-Färbemuster. Beachten Sie bitte, dass diese Xenografts eingestreut zwischen den humanen Karzinomzellen auch Zellen des Trägers (Maus) aufweisen. Diese Zellen weisen keine spezifische Färbung auf, da Mauszellen weder das humane HER2-Gen noch das humane Chromosom 17 enthalten. Xenograft-Objektträger können auch bei der Behebung von Problemen eingesetzt werden, wenn der Färbeautomat oder die Reagenzien als mögliche Ursache in Betracht kommen. Abbildung 12. Schematische Darstellung des HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft-Objektträgers + + Calu 3 ZR-75-1 MCF 7 HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slide 15

20 Abbildung 13. Charakteristische Färbemuster der Zelllinien auf dem HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft-Objektträger Calu-3 (amplifiziertes HER2-Gen) ZR-75-1 (etwa drei Kopien des HER2-Gens im Zellkern) MCF 7 (etwa zwei Kopien des HER2-Gens im Zellkern) 16

21 Präanalytische Erwägungen Die sachgerechte präanalytische Aufbereitung der Gewebeprobe ist für jeden in-situ-hybridisierungs-assay von entscheidender Bedeutung. 1-3 Für den Ventana INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay empfiehlt es sich, die Gewebeprobe entsprechend der ASCO/CAP-Richtlinien 1 für 6 bis 48 Stunden in neutral gepuffertem 10-prozentigem Formalin (10 % NBF) zu fixieren, in Paraffin einzubetten und anschließend in Schnitte von ca. 4 µm Dicke zu schichten. Der INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay umfasst verschiedene zusätzliche optionale Aufbereitungsschritte, die dazu beitragen können, den Assay entsprechend der Vorgehensweise und Möglichkeiten des jeweiligen Labors zu optimieren und Probleme mit bestimmten suboptimal gefärbten Gewebeschnitten/Objektträgern zu beheben. Es empfiehlt sich für jedes Labor, Färbungen repräsentativer Kontrollpräparate durchzuführen, die unter den gleichen Bedingungen wie die zu untersuchenden klinischen Gewebeschnitte aufbereitet wurden. Diese Vorgehensweise befähigt das individuelle Labor, die Färbebedingungen optimal an die in diesem Labor konkret praktizierte Vorgehensweise zur Aufbereitung von Gewebeproben anzupassen. Präparate, die auf andere als die von Ventana empfohlene Weise präanalytisch aufbereitet wurden, können möglicherweise mit dem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail nicht ordnungsgemäß gefärbt werden. Aktuelle Studien gelangten zu der Erkenntnis, dass die Mehrzahl nicht eindeutiger Bestimmungen des HER2-Genstatus (unter Verwendung der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) auf präanalytische Faktoren wie Unterfixierung, Überfixierung 2 oder verzögerte Fixierung 3 zurückzuführen sind. Die strikte Einhaltung des Fixierungsprotokolls (z. B. durch Verwendung eines dedizierten Prozessors zwecks Einhaltung einer Mindestfixierzeit von sechs Stunden) führte in diesen Studien zu einer 64-prozentigen Reduktion der Anzahl nicht eindeutiger Fälle (von 10,8 % auf 3,4 %). 2 Fixierung Bei in neutral gepuffertem 10-prozentigem Formalin (10 % NBF) fixierten, in Paraffin eingebetteten und in Schnitte von ca. 4 µm Dicke geschichteten Gewebeproben empfiehlt sich eine Vorbehandlung mit Ventana ISH Protease 3 (16-Minuten-Zyklus, entsprechend der Standardvorgehensweise, Abbildung 14a). In Zinkformalin oder alkoholischem Formalin fixierte Gewebeschnitte eignen sich ebenfalls für den Assay, und auch bei in Prefer fixierten Gewebeschnitten lassen sich mit diesem Assay einzelne Gen- und Chromosom-Kopien detektieren. Beachten Sie jedoch, dass die Gewebemorphologie bei Prefer-fixierten Präparaten mit fortschreitendem Alter Beeinträchtigungen aufweisen kann. Bei auf andere Weise fixierten MCF7-Tumor-Xenograften konnte Ventana feststellen, dass eine Unterfixierung (< 6 Stunden) zu einem Signalverlust (ähnlich wie bei einer Hämatoxylin-Gegenfärbung zu beobachten) und einer Verstärkung von Störsignalen führte. Des Weiteren ist bei diesem Assay von der Verwendung eines Bouin- oder AFA-Fixativs abzuraten. Bei Gewebeproben, die über einen Zeitraum von mehr als sechs Stunden mit diesen Fixativen fixiert wurden, lässt sich nur eine schwache oder überhaupt keine Färbung erzielen (Abbildung 14c). 14 Beachten Sie bitte, dass auch eine mögliche genetische Heterogenität und Abweichungen bei der Aufbereitung der einzelnen Gewebeproben Auswirkungen auf die Signalintensität, d. h. die Größe der SISH- und der Red ISH-Signale haben können. Die Signalintensität kann daher sowohl von Fall zu Fall als auch von Gewebeschnitt zur Gewebeschnitt desselben Falls variieren. Bei jedem Objektträger fungieren daher die innerhalb des Zielbereichs oder in seiner unmittelbaren Nachbarschaft liegenden Stromazellen als Referenz für die Signalgröße. Diese Zellen müssen ein bis zwei HER2- und Chr17-Signale aufweisen, damit sich der jeweilige Gewebeschnitt für die Bestimmung des HER2-Genstatus eignet. Weitergehende Informationen zur Fixierung für eine ISH-Färbung finden Sie in den ASCO/CAP-Richtlinien zur Bestimmung des HER2-Genstatus. 1 17

22 Abbildung 14a. Auswirkung der Dauer der 10 % NBF-Fixierung auf die SISH- und Red ISH-Färbung 1 Stunde 3 Stunden 6 Stunden 12 Stunden 24 Stunden 48 Stunden MCF7-Xenograft, 10 % NBF (60x) Eine zu kurz (ein bis sechs Stunden) in neutral gepuffertem 10-prozentigem Formalin (10 % NBF) fixierte, d. h. unterfixierte Gewebeprobe ermöglicht keine optimale Färbung und zeigt eine schwach ausgeprägte, stark angedaute Zellkernmorphologie (Abbildung 14a). Dies kann mühelos bei geringer Helligkeit an der bei kürzeren Fixierzeiten augenfälligen schwächeren Gegenfärbung beobachtet werden (Abbildung 14b). Die empfohlene Fixierzeit für eine Fixierung in 10 % NBF beträgt 6 bis 48 Stunden. Abbildung 14b. Auswirkung der Dauer der 10 % NBF-Fixierung auf die Hämatoxylin-Gegenfärbung 18 1 Stunde 3 Stunden 6 Stunden 12 Stunden 24 Stunden 48 Stunden MCF7-Xenograft, 10 % NBF (4x)

23 Abbildung 14c. Auswirkung der Dauer der AFA-Fixierung auf die SISH- und Red ISH-Färbung 1 Stunde 3 Stunden 6 Stunden 12 Stunden 24 Stunden 48 Stunden MCF7-Xenograft, AFA (60x) Bei Verwendung eines Bouin- oder AFA-Fixativs ist nur nach einer kurzen Fixierzeit (etwa drei Stunden) eine akzeptable Färbung zu realisieren (Abbildung 14c). In dieser Hinsicht gelten bei diesen Fixativen somit genau die umgekehrten Bedingungen wie bei der Fixierung in 10 % NBF. Dicke der Gewebeschicht Stunden in Formalin) auftreten, wobei in diesem Fall ein unspezi- Gewebeschnitte von mehr als 4 µm Dicke bedürfen einer in- fischeres, verschwommeneres Bubbling zu beobachten ist. Bei tensiveren Protease-Vorbehandlung, beispielsweise mit Ven- einer Fixierungszeit von drei Stunden kann diesem Bubbling tana ISH Protease 3 (mindestens zwanzig Minuten) oder mit mit einer veränderten Zellaufbereitungs-/Protease-Behandlung Ventana ISH Protease 2 (mindestens vier Minuten). Mit einer abgeholfen werden, bei einer Fixierungszeit von nur einer Stunde solchen verlängerten Protease-Inkubation kann die DNA auch führt jedoch vermutlich keine Abhilfemaßnahme zum Erfolg. in dickeren Gewebeschnitten freigelegt werden. Wenn bei dünneren Gewebeschnitten eine übermäßige Hintergrundfärbung oder Andauung zu beobachten ist, ist möglicherweise Abbildung 15. Beispiel für Nuclear Bubbling Fall 25. Mammakarzinom eine behutsamere Protease-Vorbehandlung angebracht (z. B. Protease 3 für vier Minuten, siehe Abschnitt Vorgehensweise bei Problemen ). Aufgrund eines Paraffinüberschusses im Gewebe können Gewebeschnitte von mehr als 4 µm Dicke zudem ein stärkeres Nuclear Bubbling aufweisen (Abbildung 16). Diese Gewebeschnitte müssen daher vor der Färbung im Färbeautomaten in Alkohol- und Xylen-Bädern entparaffinisiert werden. Alternativ kann auch die Option Verlängerte Entparaffinisierung gewählt werden (Abbildung 24). Wie in Abbildung 15 erkennbar kann Nuclear Bubbling auch bei Unterfixierung der Gewebeprobe (z. B. ein bis drei HER2 und Chr17 (60x); Nuclear Bubbling 19

24 Abbildung 16. Einfluss der Schichtdicke auf die Färbung Fall 26. Mammakarzinom A HER2 und Chr17 (60x); Gewebeschnitt mit der empfohlenen Schichtdicke von 4 µm HER2 und Chr17 (60x); Gewebeschnitt mit einem Doppelten der empfohlenen Schichtdicke (d. h. 8 µm Schichtdicke) A: Nuclear Bubbling. Beachten Sie bitte, dass das Nuclear Bubbling bei größeren Schichtdicken aufgrund eines Paraffinüberschusses zunimmt. Weitere Erwägungen Art der Gewebeprobe Die Art der für die Untersuchung mit dem Assay vorgesehenen Gewebeprobe (z. B. durch Feinnadelpunktion oder durch Exzisionsbiopsie gewonnenes Gewebe) muss unbedingt berücksichtigt werden. Sollten Abweichungen bei der Qualität der Färbung auftreten, müssen die ISH-Vorbehandlung und/oder die Detektionsbedingungen möglicherweise für jede Probenart separat optimiert werden. Abbildung 17. Schwach ausgeprägte Zellkernmorphologie aufgrund unzureichender Fixierung und anschließender starker Protease-Andauung Fall 27. Mammakarzinom A Generelle Qualität der Gewebeprobe Weist die Gewebeprobe Quetschartefakte, Nekrosen oder eine generell schlechte Morphologie auf, führt die Färbung möglicherweise zu einem nur suboptimalen Ergebnis. Es empfiehlt sich, die Gewebsmorphologie jedes einzelnen Schnitts anhand des korrespondierenden HE-gefärbten Schnitts zu evaluieren. Zellkernmorphologie vs. Signalintensität Bei Präparaten, die anders als auf die empfohlene Weise aufbereitet wurden, führt oftmals eine einfache Optimierung der ISH-Protease-Behandlung zu einem optimalen Färbeergebnis. Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, dass die Anwendung von ISH Protease 2 oder 3 über einen längeren Zeitraum nachteilige Auswirkungen auf die Zellkernmorphologie haben und zu einer Abschwächung der Gegenfärbung des Zellkerns führen kann. Signalintensität und Zellkernmorphologie/-gegenfärbung müssen daher in solchen Fällen sorgsam gegeneinander abgewogen werden. Eine zu scharfe Protease-Vorbehandlung kann zudem zu einer Abschwächung der HER2- und/oder Chr17-Färbung führen. Bei einer zu schwach ausgeprägten Gegenfärbung kann die Verlängerung des Hämatoxylin II-Färbezyklus von den empfohlenen acht auf zwölf Minuten eine Intensivierung der Gegenfärbung bewirken. 20 HER2 und Chr17 (60x); Starke Andauung. A: stark angedaute Zellkerne Eine starke Protease-Andauung mit resultierender schwach ausgeprägter Zellkernmorphologie (Abbildung 17) ist üblicherweise auf Unterfixierung (weniger als sechs Stunden) zurückzuführen. Aufgrund der Andauung des Zellkernmaterials kann dies zu einer Abschwächung der Signalintensität führen. Die Einhaltung der Standard-Fixierzeiten entsprechend der ASCO/ CAP-Richtlinien 4 senkt erwiesenermaßen die Fehlerrate bei der in-situ-hybridisierung. 2

25 Vorgehensweise bei Problemen Dieser Abschnitt behandelt die verschiedenen Möglichkeiten zur Verbesserung suboptimaler Färbeergebnisse durch Auswahl entsprechender Softwareoptionen. Tabelle 3 enthält eine Übersicht über diese Softwareoptionen und ihre Auswirkungen auf das Färbeergebnis. Schwache oder fehlende Färbung Weist der Gewebeschnitt keine oder eine für die Auszählung der Signale unzureichende HER2- und Chr17-Färbung auf, liegen üblicherweise Probleme mit der präanalytischen Vorbereitung des Präparats vor (Abbildungen 14a bis 14c). Stellen Sie sicher, dass Art und Dauer der Fixierung und die Dicke des Gewebeschnitts den Vorgaben für das Assay entsprechen. Sind die Zellkerne intakt, so intensivieren Sie die Aufbereitung (d. h. längere Inkubationszeiten). Weist ein Präparat nur für eine der beiden Sonden des Cocktails eine adäquate Färbung auf (z. B. einwandfreie HER2- Färbung, aber nur schwache oder gänzlich fehlende Chr17- Färbung), liegt möglicherweise ein Problem mit den an der mangelhaften Färbung beteiligten Reagenzien vor. In diesem Fall ist zu kontrollieren, ob möglicherweise eine Blockierung der Spender vorliegt und ob die Bulk-Container ordnungsgemäß für den Färbeprozess befüllt wurden. Des Weiteren ist zu überprüfen, ob das richtige Dehydrierungsprotokoll angewendet wurde, da Alkoholbäder, Azeton und eine verlängerte Xylen-Inkubation das Red ISH-Signal auflösen. Sind die SISH- Signale schwach oder verblasst, muss verifiziert werden, dass ein die Signale erhaltendes kompatibles Eindeckmittel (siehe Tabelle 4) verwendet wurde. Können die genannten Faktoren ausgeschlossen werden, besteht in der Software die Möglichkeit, die präanalytische Aufbereitung durch Verlängerung der Protease-Inkubationszeit und/oder der Zellaufbereitungszeit zu optimieren. Diese Maßnahmen stellen üblicherweise die effektivste Methode zur Rettung einer schwachen Färbung dar (Abbildung 18). Eine Verlängerung der präanalytischen Aufbereitungszeiten ist jedoch nur zulässig, wenn die Zellkerne intakt erscheinen und die Karzinomzellen eine Gegenfärbung aufweisen. Erscheinen die Zellkerne stark angedaut und ist dies als Ursache des Signalverlusts anzusehen, ist die Protease-Inkubationszeit zu verkürzen (z. B. Protease 3 für acht bis zwölf Minuten). Weisen die Gewebeschnitte weiterhin eine unzureichende Färbung auf oder ist nur für eine der beiden Färbungen eine Hintergrundfärbung erkennbar, empfiehlt sich eine Anpassung der verschiedenen Inkubationszeiten des jeweiligen Detektionssystems. So kann die SISH-Signalstärke (HER2) beispielsweise durch acht- oder zwölfminütige Anwendung des Silber-Chromogens oder durch Verlängerung der SISH- Multimer-Inkubationszeit gesteigert werden. Bei Bedarf kann die Red ISH-Multimer- und/oder die Rot-Chromogen-Inkubationszeit ebenfalls verlängert werden (Abbildung 19). Durch Verlängerung der Inkubationszeiten für die Detektionsreagenzien lassen sich Signalgröße und -intensität effektiv steuern, doch trägt sie auch zu einer verstärkten Hintergrundfärbung bei (Tabelle 3 gibt Aufschluss über die verfügbaren Softwareoptionen und ihre Auswirkungen auf das Färbeergebnis). Durch Verkürzung der Inkubationszeiten kann die nichtspezifische Hintergrundfärbung vermindert werden. Abbildung 18. Beispiel für eine erfolgreiche Wiederholungsfärbung mit verlängerter Detektionsreagenzien- Inkubationszeit Fall 28. Mammakarzinom HER2 und Chr17 (60x); schwache Färbung HER2 und Chr17 (60x); verlängerte Inkubationszeit für das Rot- und das Silber- Chromogen. 21