Licht und Masse. Light and Mass. Physical Chemistry. Laserspektroskopie und Massenspektrometrie. Laser spectroscopy and mass spectrometry

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1 Jürgen Grotemeyer, Institut für Physikalische Chemie Licht und Masse Laserspektroskopie und Massenspektrometrie Das Verhalten von Molekülen in der Gasphase ist von grundlegendem Interesse in der Chemie und Physik, da hier die intrinsischen Eigenschaften ohne Einfluss anderer Molekülen oder einer Solvatationshülle untersucht werden können. Andererseits können aber auch derartige Einflüsse gezielt erzeugt und nachgewiesen werden. Als besonders elegante Methode hat sich dabei die Laser-Massenspektrometrie erwiesen. Mittels unterschiedlichster Verfahren, wie der resonanten Multiphotonen-Ionisation (ReMPI, R2PI) oder der Matrix-unterstützten Laserdesorptions-Ionisation (MALDI) lassen sich unterschiedlichste Moleküle untersuchen. Und es lassen sich in der klassischen Anwendung der Massenspektrometrie neue analytische Wege beschreiten. Light and Mass Laser spectroscopy and mass spectrometry The behavior of molecules in the gas phase is of general interest in chemistry and physics, because intrinsic features of molecules can be studied without interference of other molecules or influence of the solvation sphere. But these influences can also be produced and investigated. As an elegant method, the combination of lasers and mass spectrometry has been established. With different ionization methods, such as resonant multiphoton ionization (ReMPI, R2PI) or matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) different molecules can be investigated. These techniques allow new analytical applications of mass spectrometry. Multiphotonen-Anregung von Molekülen Um Moleküle massenspektrometrisch untersuchen zu können, müssen sie in elektrisch geladene Spezies überführt werden, die als Ionen bezeichnet werden. Dazu gibt es eine Vielzahl von Verfahren. Als besonders interessant für physikalisch-chemische wie auch analytische Untersuchungen hat sich die resonante Mehrphotonen-Anregung erwiesen. Hierbei nimmt das neutrale Molekül zwei oder mehrere Photonen auf. Dabei überführt das erste Photon das Molekül in einen angeregten Zustand, sofern die Wellenlänge des Photons der Energie des spektralen Überganges im Molekül entspricht (Resonanzbedingung). Das zweite Photon überführt dann das angeregte Molekül in das Molekülion. Deutlich wird aus dieser sehr einfachen Beschreibung, dass diese Methode durch verschiedene wesentliche Eigenschaften gekennzeichnet ist. Zum einen ist dieses die Abstimmbarkeit der Anregungswellenlänge, die dazu führt, dass Moleküle entsprechend ihrer Struktur gezielt angeregt werden können. Da Moleküle unterschiedliche Absorptionsspektren aufweisen, kann die Laserwellenlänge auf Werte eingestellt werden, bei der in einer komplexen Mischung ausschließlich das gewünschte Molekül absorbiert und nachgewiesen werden kann. Diese Möglichkeit ist für die Analytik von Multiphoton activation of molecules To conduct mass spectrometric investigations, the molecules have to be transferred into charged particles. Mass spectrometry has developed several methods for ionization. A very promising technique not only for analytical purposes but also for physical and chemical investigations is the resonant multiphoton activation of atoms and molecules. This technique is founded on the absorption of two or more photons in the neutral molecule. The first photon activates the molecules into an electronic excited state, if the wavelength corresponds to the energy of that state (resonance condition). The absorption of a second photon then transfers the activated molecule into the molecular ion. From this simple description it is evident that this method has several interesting features. The wavelength used for activation can be tuned by scanning the laser. Since molecules have different absorption spectra, this feature leads to a substance selective absorption. Further photons lead to ionization and allow the detection of the molecule as an ion. The absorption spectrum of a molecule is unique for its structure. Therefore, molecules in a complex mixture can be selectively ionized and detected. This feature is of general interest in analytics, because the method allows the direct measurement of one sub- 52

2 Physikalische Chemie grundlegendem Interesse, da durch ein derartiges Vorgehen die Trennung eines komplexen Substanzgemisches, beispielsweise durch chromatographische Verfahren, nicht mehr vor dem Nachweis der verschiedenen Bestandteile erfolgen muss. Darüber hinaus hat die Mehrphotonen-Absorption weitere Eigenschaften, die sie im Bereich der massenspektrometrischen Analytik von chemischen Verbindungen interessant macht. So lässt sich sehr einfach durch Begrenzung der Laserintensität der Absorptionsprozess von Photonen im Molekül bzw. Ion begrenzen. Dies hat zur Folge, dass entweder nur das Molekülion gebildet und im Massenspektrometer nachgewiesen wird oder bei Steigerung der Laserintensität das Molekülion weitere Photonen absorbiert und zu chemischen Zerfallsreaktionen angeregt wird. Der Nachweis der gebildeten Fragmente erlaubt eine Strukturbestimmung des Moleküls. Da über die Laserintensität das Ausmaß der Fragmentierung gesteuert werden kann, lassen sich die unterschiedlichen Fragmente gezielt bilden (Bild 1). Für derartige Untersuchungen wird eine Kopplung aus stance in a mixture without using chromatographic separation techniques. Another feature of the multiphoton absorption is the possibility to steer the amount of fragmentation induced in the ionization process. Since the absorption of photons in the molecule is directly linked to the laser intensity, the amount of fragmentation of the molecule can be easily controlled. By using a low laser intensity, only the molecular ion is formed. Increasing the intensity leads to further absorption of photons in the molecular ion. As a result fragmentation reactions are induced in the molecular ion leading to a break up of the molecule. These fragment ions allow the deduction of the structure of the molecule. Since the laser intensity controls the amount of fragmentation, a steering of this value results in different fragment ions. This is an unique feature compared to other mass spectrometric experiments. To conduct a multiphoton absorption experiment, usually a Bild 1 / Figure 1 Grundlegende Erklärung der Resonanten Mehrphotonen-Ionisation mit Nanosekunden-Pulsen. Das erste Photon aktiviert das Molekül in einen angeregten elektronischen Zustand, das zweite Photon induziert die Ionenbildung. Die weitere Absorption von Photonen im Molekülion führt dann zu Fragmentierungsreaktionen. Die resultierenden Massenspektren der Verbindung Tryptophan zeigen den Effekt der sequentiellen Anregung des Moleküls. Principle explanation of resonance enhanced multiphoton ionization with nanosecond laser pulses. The first photon excites the molecule into an activated electronic state, the second photon induces the ionization. Absorption of further photons in the molecular ion leads to fragmentation reactions. 53

3 Laserdesorption, Überschallgasstrahl-Expansion und anschließender Multiphotonen-Ionisation mit Nano- oder Femtosekunden-Laserpulsen eingesetzt. Der Nachweis der erzeugten Ionen erfolgt dann mittels eines Flugzeitmassenspektrometers (Bild 2). Analytisch sind die hoch aufgelösten Absorptionsspektren von organischen Verbindungen von großem Interesse, da sie wertvolle Informationen über die Struktur der Moleküle sowie die resonanten Wellenlängen für die Anregung im Mehrphotonen- Schritt liefern. Hier wird in einem Projekt versucht, eine Bibliothek dieser Spektren für die unterschiedlichsten organischen Verbindungen aufzubauen. Dazu werden diese Spektren im oben skizzierten Versuchsaufbau gemessen und den molekularen Bewegungen zu geordnet. Molekulare Cluster combination of laser desorption and supersonic jet expansion followed by multiphoton ionization with nano- or femtosecond laser pulses is used. The ions are detected with a time-of-flight mass spectrometer (Figure 1). Highly resolved absorption spectra of organic compounds are of great interest, since they result in interesting information on the molecular structures as well as on the resonant wavelengths in the multiphoton activation step. In one experiment conducted in our research group, a library of these spectra from a variety of organic compounds is being built up (Figure 2). Molecular clusters Bild 2 / Figure 2 Der prinzipielle Aufbau eines Flugzeitmassenspektrometers mit resonanter Multiphotonen-Ionisation und Laser-Desorption von neutralen Molekülen in einen Überschallgasstrahl. Das gepulste Ventil erzeugt dabei den Überschallgasstrahl, in den Moleküle entweder vor der Düse eingebettet werden oder durch Laser-Desorption eingeführt werden. Danach schließt sich die Ionenquelle an, in der die Mehrphotonen-Anregung durchgeführt wird. Das Flugzeitmassenspektrometer trennt die verschiedenen Ionen entsprechend ihrer Masse. Principal set-up of a time-of-flight mass spectrometer with resonant multiphoton ionization and laser desorption of neutral molecules into a supersonic beam. The pulsed valve forms the supersonic beam from molecules either introduced into the beam prior to the nozzle or by laser desorption. In the ion source, the multiphoton ionization takes place. The time-of-flight mass spectrometer separates the different ions according to their mass. 54

4 Physikalische Chemie Molekulare Cluster sind für das Verständnis intermolekularer Prozesse, speziell in Biopolymeren, von grundlegendem Interesse. Hierbei stehen Fragen wie die Struktur derartiger Cluster oder der Ladungstransfer in den Clustern im Vordergrund, außerdem die Klärung des Protonen-Transfer innerhalb des Clusters sowie der Momomer-Einheiten. Diese Fragestellung ist nicht nur für die massenspektrometrische Analytik von Ionen von Interesse, sondern auch für das Verständnis von Membranprozessen und der Signalleitung in Proteinen. Ein Anwendungsbeispiel ist das Massenspektrum (Bild 3) eines Clusters aus Vanillinsäure und einem Dipeptid, dem Glycyl- Leucin. Deutlich wird aus dem Spektrum der Zerfall des ionisierten Clusters mittels Übertragung eines Protons von der Vanillinsäure auf das Dipeptid. Nach der Übertragung des Protons auf die Aminofunktion des Peptids kommt es zur Verschiebung des Protons entlang der Peptid-Kette. Dieses führt zu Bindungsbrüchen und dem Entstehen von spezifischen Fragmenten, die Aussagen über den Ladungstransport entlang der Peptidkette ermöglichen. Die strukturelle Eindeutigkeit des Protonenüberganges vom Donator auf das Peptid sowie der anschließende Protonentransport entlang der Kette lässt sich auch auf größere Peptide übertragen. Als Resultat können damit erstmalig Aussagen über die Beweglichkeit und die Kinetik des Protonen-Transfers in Biopolymeren gemacht werden. Molekulare Dynamik Die Kopplung der Laseranregung mit der Massenspektrometrie erlaubt es auch, die Zerfallsdynamik von organischen Ionen über einen weiten Zeitbereich, das heißt vom Femto- bis zum Millisekunden-Bereich zu untersuchen. Hierbei stehen Fragen der Energieumverteilung in den durch die Photoanregung gebildeten Ionen sowie deren Fragmentierungsreaktionen im Vordergrund. Dazu wird ein sogenanntes Hybridmassenspektrometer, bestehend aus einer Ionenfalle (Paul'schen Falle) und einem Reflektron-Flugzeit-Massenspektrometer eingesetzt. Die Ionenfalle wird dabei stoßfrei betrieben, das heißt, Ionen können hier bis in den Millisekundenbereich hinein ohne Stöße mit anderen Molekülen gespeichert werden. Anschließend werden sie aus der Falle abgezogen und im Flugzeit-Massenspektrometer nachgewiesen. Damit gelingt es unter anderem die Dynamik des Ionenzerfalls von aromatischen Ionen oder aber von Peptidionen zu untersuchen. Durch die gezielte Ionisation mittels der resonanten Multiphotonen-Absorption lässt sich die Energie, die den neutralen Molekülen mitgegeben wird genau bestimmen. Hierzu werden die lebenszeitabhängigen Massenspektren der gespeicherten Ionen aufgezeichnet. Diese Spektren beinhalten die Molecular clusters are important for the understanding of intermolecular processes, especially in biopolymers. Important questions arise about the structures of these clusters or the charge transfer within the clusters. One particular question is the clarification of the proton transfer within the clusters as well as in the monomeric units. This question is not only important for the mass spectrometric analytics of ions but also important for the understanding of membrane processes or the signal transfer in proteins. As an example the mass spectrum of the cluster from vanillic acid and a dipeptide, glycyl-leucine, is shown in Figure 3. Apparently the spectrum shows not only signals from the vanillic acid and the heterodimer but also a signal for the proton transfer from the ionized vanillic acid to the dipeptide. After this transfer to the amino function of the peptide, the proton can be moved along the peptide chain. This leads to fragmentation reactions and the formation of specific fragments, which give evidence of the charge transport in the peptide chain. This process can be proven for a large number of amino acids as well as for an increasing length of the peptide. For the first time, clear statements can be made about the mobility of protons and the kinetics of the proton transfer in biomolecules. Molecular dynamics The coupling of laser activation with mass spectrometry also allows us to measure the fragmentation dynamics of organic ions from femto- into the millisecond time range. In these experiments, the energy redistribution are investigated after photoexcitation in the molecular ions as well as in the fragment ions. To study the reactions of a long-lived ions. a hybrid mass spectrometer consisting of an ion trap (Paul's trap) and a timeof-flight mass spectrometer is used. The trap is operated under collision free conditions. Ions can be stored in this trap for up to 10 milliseconds without undergoing any collision with other molecules. After certain times, the ions can be extracted into the time-of-flight mass spectrometer, where they are detected. With this set-up, the dynamics of the fragmentation reactions of aromatic ions or of peptide ions can be investigated. Due to the selective ionization via the resonant multiphoton absorption the energy applied to the neutral molecules can be measured exactly. The lifetime dependent mass spectra of the stored ions then allows us to measure the fragmentation dynamics. With this set-up, for example, we have investigated the isomerization reactions of alkylbenzenes. The lifetime dependent equilibrium of C 7 H 7 + (tropylium or benzyl structure) could be measured for the first time. Besides this technique aiming for long reaction times, others, 55

5 Bild 3 / Figure 3 Spektrum eines Clusters aus Vanillinsäure und dem Dipeptid Glycyl-Leucin. Die wichtigen Signale, die den Protonen-Transfer und die Verschiebung des Protons über die Peptid-Kette anzeigen, sind markiert. Mass spectrum of a cluster from vanillic acid and the dipeptide glycyl-leucin. The important signals which shows the proton transfer and the movement of the proton across the peptide chain are marked. Zerfallsdynamik von energieselektierten Ionen auf langen Zeitskalen. So gelingt es beispielsweise, die Isomerisierungsreaktionen von Alkylaromaten zu untersuchen und damit Aussagen über das Gleichgewicht der Ionenstrukturen des C 7 H 7 - Ions (Tropylium- oder Benzyl-Struktur) zu erzielen. Neben diesen Untersuchungsmethoden werden auch Techniken wie die Laser-Ionen-Kinetik, die im wesentlichen ein Pump-Probe-Experiment darstellt, entwickelt und eingesetzt. Hierbei wird die gesamte Dynamik eines molekularen Systems innerhalb eines Femtosekunden-Laserpulses gemessen. Diese Technik ist erfolgreich auf Isomerisierungs- und Fragmentierungsreaktionen organischer und metallorganischer Verbindungen angewandt worden. Als weitere Technik für die Untersuchung der molekularen Prozesse hochangeregter Ionen und Neutrale steht auch die Mass Analyzed Threshold Ionization (MATI) zur such as the laser ion kinetics method are applied to the investigation of molecular processes. The latter technique is a special pump- probe experiment which has been developed in our group. It allows us to measure the complete dynamic behavior of a molecular system within a single femtosecond laser pulse. The technique has been successfully applied to the investigation of fragmentation and isomerization reactions of organic and metal organic compounds. For the investigation of molecular processes of highly activated ions and neutrals, mass analysed threshold ionization (MATI) has been developed in a special manner. This technique results in exact values of the ionization energies of the molecules and provides some insight into their vibrational structures. A typical example for a MATI spectrum is depicted in Figure 4. MALDI processes 56

6 Physikalische Chemie Verfügung. Hiermit lassen sich Aussagen über die Ionisationsenergien von Molekülen sowie ihre Vibrationsstruktur gewinnen. Ein typisches Beispiel für ein MATI-Spektrum der Verbindung p- Xylol ist in Bild 4 dargestellt. MALDI-Prozesse One of the most important ionization methods for the investigation of large biomolecules is matrix assisted laser desorption ionization (MALDI). Despite the fact that this technique is being widely used in mass spectrometry for more than a decade, the physical processes leading to the desorption of Bild 4 / Figure 4 Eine Methode zur Bestimmung der Struktur von hochanregten Molekülen ist die Mass Analyzed Threshold Ionization, die neben den Vibrationsfrequenzen auch die Ionisationsenergie des Moleküls exakt bestimmt. In dieser Abbildung sind zwei MATI-Spektren unterschiedlicher Zustände der Verbindung p-xylol dargestellt. Mass Analysed Threshold Ionization (MATI) is a method for the investigation of highly activated molecules. It allows us to precisely measure the ionization energy of molecules as well as their vibrational modes. This figure shows two MATI spectra of different electronic states of p-xylene. Eines der wichtigsten Ionisationsverfahren zur Untersuchung von großen Biomolekülen ist die Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Ionisation (MALDI). Obwohl sie seit mehr als einer Dekade bekannt und im weiten Umfang in den Lebenswissenschaften eingesetzt wird, sind die physikalischen Prozesse, die zur Desorption von großen Molekülen unter gleichzeitiger Ionisation führen, nicht vollständig bekannt. So existieren beispielsweise unterschiedlichste Matrixsubstanzen large molecules and their simultaneous ionization are not fully understand. It is well-known that there is no general matrix suited for all kinds of analyte molecules but the matrix has to be chosen carefully to obtain good and reliable mass spectra. No general instruction for choosing the correct matrix can be given up to now. It is known from experiments that some matrices favor the desorption process while others give high ion yields. One possibility to obtain detailed information about the 57

7 für die verschiedensten Analytmoleküle, wobei eine Klassifizierung dieser Matrizes bislang nicht erfolgt ist. Empirisch weiß man, dass bestimmte Matrizes optimal den Desorptionsvorgang unterstützen, andere besonders gut den Ionisationsprozess fördern. Eine Möglichkeit, detaillierte Aussagen über die Desorptions- und Ionisationsprozesse zu erhalten, besteht in dem Ansatz, die Lumineszenz im simultanen Anregungsschritt zu messen. Der experimentelle Zugang besteht hier in einer Kopplung eines Monochromators mit einer CCD-Kamera an die MALDI-Ionenquelle. Misst man das Emissions- und Absorptionsspektrum der Matrix- Materialien im Bereich der Festkörper-Gasphasen-Grenze, so erhält man Aussagen über die für die photoinduzierten Prozesse zur Verfügung stehende Energie. Diese Größe kann man mit den Eigenschaften der Matrizes, wie Desorptions- und Ionisationseigenschaften korrelieren, und erhält somit eine Klassifizierung der verschiedenen Matrix-Substanzen hinsichtlich ihrer Einsatzmöglichkeiten in der Massenspektrometrie. Literaturangaben / References [1] C. Weickhardt, F. Moritz, J. Grotemeyer, Time-of-Flight Mass Spectrometry: State-of-the-Art in Chemical Analysis and Molecular Science, Mass Spectrom. Rev. 15, 139 (1996). desorption and ionization process is measuring the luminescence in the activation step. Experimentally, a CCD camera is coupled directly to the MALDI ion source. The measurement of the emission and absorption spectra of the various matrix compounds at the border of solid state to gas phase yield the energy which can be used for the desorption and ionization of the analyte. This value can be correlated with the desorption and ionization properties of the matrix. As a result, a classification of the different matrix materials for their use in MALDI experiments. Ansprechpartner / Contact: Prof. Dr. Jürgen Grotemeyer Institut für Physikalische Chemie Christian-Albrechts-Universität zu Kiel Olshausenstr. 40 D Kiel Tel: Fax: grote@phc.uni-kiel.de URL: [2] A. Uphoff, J. Grotemeyer, TOF and ReTOF Mass Spectrometers, in: Enzyclopedia of Mass Spectrometry (P. Armentrout, Ed.), Vol. 9, pp. 519, [3] F. Gunzer, J. Grotemeyer, New Features in the Mass Analyzed Threshold Ions (MATI) Spectra of Alkyl Benzenes, Phys. Chem. Chem. Phys. 4, 5966 (2002). [4] A. Meffert, J. Grotemeyer, Dissociative Proton Transfer in Cluster Ions: Clusters of Aromatic Carboxylic Acids with Amino Acids, Int. J. Mass Spectrom. 210 (2001). [5] C. Zechmann, T. Muskat, J. Grotemeyer, Wavelength and Time- Resolved Luminescence Spectroscopy for Investigation of the Matrix Assisted Laser Desorption Process (MALDI), Europ. J. Mass Spectrom. (2002). 58