VaccZyme Anti-tetanus toxoid IgG Enzyme Immunoassay Kit. For in-vitro diagnostic use Product code: MK010.4

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1 VaccZyme Anti-tetanus toxoid IgG Enzyme Immunoassay Kit For in-vitro diagnostic use Product code: MK010.4 Product manufactured by: The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. Telephone: +44 (0) Fax: +44 (0) VaccZyme is a trademark of The Binding Site Group Ltd. 1 INTENDED USE This assay is intended for the in-vitro measurement of specific IgG antibodies against tetanus toxoid (T.Tox.) present in serum and plasma. Sufficient materials are supplied to allow a maximum of 89 samples to be tested in singlicate, with a calibration curve and control on each of 10 plates. 2 BACKGROUND Anti-tetanus toxoid antibodies are raised in response to vaccination with tetanus toxoid protein. A patient s response to the immunisation may be assessed, subsequently, by the serological determination of their anti-tetanus toxoid antibody levels using this quantitative enzyme immunoassay technique. 3 PRINCIPLE OF THE ASSAY Microwells are pre-coated with tetanus toxoid antigen. The calibrators, control and diluted patient samples are added to the wells and antibodies recognising the tetanus toxoid antigen bind during the first incubation. After washing the wells to remove all unbound proteins, purified peroxidase labelled rabbit anti-human IgG ( chain specific) conjugate is added. The conjugate binds to the captured human antibody and the excess unbound conjugate is removed by a further wash step. The bound conjugate is visualised with 3,3,5,5 tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product, the intensity of which is proportional to the concentration of antibody in the sample. Phosphoric acid is added to each well to stop the reaction. This produces a yellow end point colour, which is read at 450nm. 4 PRECAUTIONS 4.1 WARNING All donors of human serum supplied in this kit have been serum tested and found negative for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibodies to human immunodeficiency virus (HIV1 and HIV2) and hepatitis C virus. The assays used were either approved by the FDA (USA) or cleared for in vitro diagnostic use in the EU (Directive 98/79/EC, Annex II); however these tests cannot guarantee the absence of infective agents. Proper handling and disposal methods should be established as for all potentially infective material, including (but not limited to) users wearing suitable protective equipment and clothing at all times. Only personnel fully trained in such methods should be permitted to perform these procedures. This product contains sodium azide and ProClin 300 and must be handled with caution; suitable gloves and other protective clothing should be worn at all times when handling this product. Do not ingest or allow contact with the skin (particularly broken skin or open wounds) or mucous membranes. If contact does occur wash with a large volume of water and seek urgent medical advice. Explosive metal azides may be formed on prolonged contact of sodium azide with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of water to prevent azide build up. The buffers and serum supplied in this kit contain various enzyme inhibitors as listed below. These are hazardous and should be handled with care. INHIBITOR CONCENTRATION Kathon 0.02% Sodium Azide 0.099% ProClin % Bromonitrodioxane 0.002% Methylisothiazone 0.002% ProClin is a trademark of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA Kathon is an irritant and may cause sensitisation by skin contact. The stop solution contains 3M phosphoric acid, which is an irritant. Avoid contact with skin or eyes. Reagent spills should be cleaned up appropriately, observing local and environmental regulations. 4.2 CAUTION This product should only be used by appropriately trained personnel. Strict adherence to the protocol is recommended. Any deviation may affect assay performance, and the results obtained. Pay attention to specific Notes and warnings throughout these Instructions for Use. Reagents from different batch numbers of kits are NOT interchangeable. If large numbers of tests are performed care should be taken to ensure that all reagents are from the SAME batch. All strips used must be taken from the same foil pouch. Substitution of any component may lead to incorrect results. Insert Code: E th October 2010, Page 1 of 10 To avoid reagent contamination, only use new or clean plastic / glassware. Never return unused reagents to the bottles. Do not leave reagent bottles uncapped; any resulting evaporation or contamination will lead to inconsistent results. TMB substrate must not be exposed to light or water. Microbially contaminated, haemolysed or lipaemic serum and specimens containing particulate matter should not be used. Inaccurate sample dilution cannot be checked, as the kit control is ready to use. The use of calibrated pipettes and appropriate internal QC samples is recommended. When using automated assay systems, sample diluters and other automated equipment, follow the manufacturer s instructions carefully. Particular attention should be given to the setup of the equipment and installation and connection to external services. All settings for automatic washers and readers must be followed carefully and equipment must be maintained and serviced according to the manufacturer s instructions. 4.3 STORAGE AND STABILITY The kit should be stored at 2-8 C and should not be frozen. Inappropriate storage temperatures will affect the results. Wash buffer diluted into a clean container can be stored at room temperature for a maximum of 4 weeks. The expiry date of the kit is shown on the outer label. 5 SAMPLE COLLECTION AND STORAGE 5.1 COLLECTION OF PLASMA SAMPLES Sodium citrate should be used as an anti-coagulant for the collection of blood. The plasma may be stored at 2-8 C for up to 14 days prior to assay, or for prolonged storage kept undiluted at -20 C or below. Repeated thawing and freezing should be avoided. 5.2 COLLECTION OF SERUM SAMPLES Blood samples should be collected by venepuncture, allowed to clot naturally and the serum separated. The serum may be stored at 2-8 C for up to 48 hours prior to assay, or for prolonged storage kept undiluted at 20 C or below. Repeated thawing and freezing should be avoided. Serum samples should not be heat-inactivated, as this may give false positive results. 6 MATERIALS 6.1 MATERIALS SUPPLIED Instruction Leaflet: Giving full assay details QC Certificate: Indicating the expected performance of the batch T. Tox. Coated Wells: 10 breakapart plates coated with tetanus toxoid derived from the toxin of Clostridium tetani. Each plate is packaged in a re-sealable foil bag containing two desiccant pouches Sample Diluent: 19 bottles containing 50mL of buffer for sample dilution. Coloured yellow, ready to use Wash Buffer: 9 bottles containing 50mL of a 20-fold concentrated buffer for washing the wells T. Tox. IgG Calibrators: 5 x 6 bottles each containing 1.2mL of diluted human serum, with the following concentrations of anti-tetanus toxoid antibody: , , , , 0.1, 0.3 IU/mL. Ready to use T. Tox. IgG Control: 5 bottles containing 1.2mL of diluted human serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use T. Tox IgG Conjugate: 10 bottles containing 12mL of purified peroxidase labelled antibody to human IgG. Coloured red, ready to use TMB Substrate: 10 bottles containing 14mL TMB substrate. Ready to use Stop Solution: 10 bottles containing 14mL of 3M phosphoric acid. Ready to use. 6.2 ADDITIONAL MATERIALS AND EQUIPMENT - not supplied Automatic microplate plate washer: this is recommended, however, plate washing can be performed manually Plate reader: capable of measuring optical densities at 450nm referenced on air Distilled or deionised water: this should be of the highest quality available Calibrated micropipettes: for dispensing 1000, 100 & 10μL Multichannel pipette: recommended for dispensing 100μL volumes of conjugate, substrate and stop solution Glass/plastic tubes: for sample dilution. 6.3 PRE-ASSAY STEPS 1. Bring the kit to room temperature The kit is designed for room temperature operation (20-24 C). Remove sufficient reagents for use from storage and stand at room temperature for approximately 60 minutes. Wells must not be removed from the foil bag until they have reached room temperature. Note: The kits may be maintained at room temperature for up to 1 week. 2. Kit components Gently mix each kit component before use. 3. Wash buffer dilution Add 50mL of the wash buffer concentrate to 950mL of distilled water (1/20 dilution) into a clean container and mix. Smaller volumes can be diluted as appropriate. Note: Diluted wash buffer can be stored at room temperature for up to 4 weeks, therefore only dilute the appropriate amount. 4. Sample dilution By changing the sample dilution it is possible to run this assay at two different measuring ranges. Select the required measuring range and use the appropriate dilution indicated in the table below: Required assay Volume Dilution range Sample Diluent IU/mL 1:200 5μL 1.0mL Step 1 5μL of sample 200μL IU/mL 1:1000 Step 2 10μL of diluted sample 250μL To utilise the IU/mL measuring range samples are diluted in a two step process. The first step is a 1:40 dilution, the second a 1:25, making a total dilution of 1:1000.

2 Number of samples 5. Strip and frame handling Place the required number of wells in the strip holder. Position from well A1, filling columns from left to right across the plate. When handling the plate, squeeze the long edges of the frame to prevent the wells falling out. Note: Return unused wells to the foil bag immediately with the two desiccant pouches and re-seal tightly to minimise exposure to moisture. Take care not to puncture or tear the foil bag, see below. WARNING: Exposure of wells to moisture or contamination by dust or other particulate matter will result in antigen degradation, leading to poor assay precision and potentially false results. 7 ASSAY METHOD Maintain the same dispensing sequence throughout the assay. 1. Sample addition Dispense 100μL of each calibrator, control and diluted (1:200 or 1:1000) sample into the appropriate wells of the plate provided. Assay runs involving more than one plate (from the same batch) must include the control on each plate. Note: Samples should be added as quickly as possible to the plate to minimise assay drift, and the timer started after the addition of the last sample. Incubate at room temperature for 30 minutes. 2. Washing The washing procedure is critical and requires special attention. An improperly washed plate will give inaccurate results, with poor precision and high backgrounds. After incubation remove the plate and wash wells 3 times with μL wash buffer per well. Wash the plate either by using an automatic plate washer or manually as indicated below. After the final automated wash, invert the plate and tap the wells dry on absorbent paper. Plates can be washed manually as follows: a. Flick out the contents of the plate into a sink. b. Tap the wells dry on absorbent paper. c. Fill each well with μL of wash buffer using a multichannel pipette. d. Gently shake the plate on a flat surface. e. Repeat a-d twice. f. Repeat a and b. 3. Conjugate addition Dispense 100μL of conjugate into each well, blot the top of the wells with a tissue to remove any splashes. Note: To avoid contamination, never return excess conjugate to the reagent bottle. Incubate at room temperature for 30 minutes. 4. Washing Repeat step Substrate (TMB) addition Dispense 100μL of TMB substrate into each well, blot the top of the wells with a tissue to remove any splashes. Note: To avoid contamination never return excess TMB to the reagent bottle. Incubate at room temperature in the dark for 30 minutes. 6. Stopping Dispense 100 μl of stop solution into each well. This causes a change in colour from blue to yellow. 7. Optical density measurement Read the optical density (OD) of each well at 450nm on a microplate reader, within 30 minutes of stopping the reaction. 8 RESULTS AND QUALITY CONTROL 1. Quality control In order for an assay to be valid, all the following criteria must be met: Calibrators and control must be included in each run The value obtained for the control should be in the range specified on the QC Certificate. The curve shape should be similar to the calibration curve, shown on the QC Certificate. If the above criteria are not met, the assay is invalid and the test should be repeated. 2. Calculate mean optical densities (For assays run in duplicate only) For each calibrator, control and sample calculate the mean OD of the duplicate readings. The percentage coefficient of variation (%C.V.) for each duplicate OD should be less than 15%. 3. Plot calibration curve The calibration curve can be plotted either automatically or manually as follows by plotting the anti-tetanus toxoid antibody concentration on the log scale against the OD on the linear scale for each calibrator: Note: The calibration curve should not be extrapolated outside the stated measuring range of the assay. Automatic - use appropriately validated software, and the curve fit that best fits the data. Manual - using log/linear graph paper, draw a smooth curve through the points (not a straight line or point to point). 4. Treatment of anomalous points If any one point does not lie on the curve, it can be removed provided that the overall expected curve shape is maintained (this is normally done automatically when using curve-fitting software). If the absence of this point means that the curve has a shape dissimilar to that of the sample calibration curve, or more than one point appears to be anomalous, then the assay should be repeated. 5. Calculation of the control value The level of the anti-tetanus toxoid antibody in the control is read directly from the calibration curve and is therefore appropriate for both measuring ranges. The value should fall within the range given on the QC Certificate. Insert Code: E th October 2010, Page 2 of Calculation of antibody levels in diluted samples Read the level of the anti-tetanus toxoid antibody in the diluted samples from the calibration curve. Multiply the value by the dilution factor (i.e. 200 or 1000) to obtain the anti-tetanus toxoid antibody level in the neat sample. 7. Assay calibration The assay is calibrated against the NIBSC tetanus antitoxin reference preparation TE3, which is supplied by the National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC: 8. Limitations This assay is intended as a screening assay for use within a validated quality control protocol. 9 TYPICAL VALUES Anti-tetanus toxoid IgG antibody levels were measured in serum from 200 normal adult blood donors (of unknown vaccination and immune status). The results displayed below, are provided for illustration only, and should not be used to calculate a normal range < Anti-T. Tox IgG IU/mL 10 PERFORMANCE CHARACTERISTICS 10.1 PRECISION The intra- and inter-assay precision was measured using three samples within the range of the calibration curve. The concentration, standard deviations (SD) and % C.V. for each sample are given below: INTRA-ASSAY PRECISION (1:1000 sample dilution) n=20 Concentration (IU/mL) SD %C.V. Sample Sample Sample INTRA-ASSAY PRECISION (1:200 sample dilution) n=20 Concentration (IU/mL) SD %C.V. Sample Sample Sample INTER-ASSAY PRECISION (1:1000 sample dilution) n=6 Concentration (IU/mL) SD %C.V. Sample Sample Sample INTER-ASSAY PRECISION (1:200 sample dilution) n=6 Concentration (IU/mL) SD %C.V. Sample Sample Sample ANALYTICAL SENSITIVITY Assay sensitivity was confirmed by assaying two samples in multiple replicates with values 1.4 and 2.0 times the lowest calibrator point. Statistical analysis by the Student s t test, confirmed that these samples were significantly different from each other (p<0.0001). ANALYTICAL SENSITIVITY Sample Lowest Sample 1 Sample 2 dilution calibrator value Conc. IU/mL % C.V. Conc. IU/mL % C.V. 1: IU/mL : IU/mL PROZONE No prozone was observed when serial dilutions of three samples containing 2165, 5856 and 9511 IU/mL of anti-t.tox antibody were assayed at the 1:1000 sample dilution with the higher measuring range LINEARITY Linearity was tested across the calibration range using 3 test samples, R 2 values were , and with a 1:1000 sample dilution and , , with a 1:200 sample dilution. Note: The calibration curve should not be extrapolated outside the stated measuring range of the assay.

3 10.5 MEASURING RANGE The measuring range of the assay is shown in the table below: MEASURING RANGE Sample dilution Measuring range 1: IU/mL 1: IU/mL 10.6 INTERFERING SUBSTANCES Various serum types were assayed to test the possible effect of interfering substances using an Interference Check A plus kit (Kokusai, Japan). Substance Bilirubin F (free) Bilirubin C (conjugate) Haemolysed haemoglobin Chyle Rheumatoid factor Concentration 19.1mg/dL 19.6mg/dL 484mg/dL 2130 Units 50 IU/mL No interference was observed with free or conjugated bilirubin, haemoglobin, lipid or rheumatoid factor. 11 REFERENCES 1. Berger M. Immunoglobulin G subclass determination in diagnosis and management of antibody deficiency syndromes. The Journal of Paediatrics, 1987:2: Gergen P. J et al. A population-based serologic survey of immunity to tetanus in the United States. The New England Journal of Medicine, 1995; 332: Bjorkholm B. et al. Immune status and booster effects of low doses of tetanus toxoid in Swedish medical personnel, Scandinavian Journal of Infectious Diseases, 1994; 26: Ramsay M. E. B et al. Persistence of antibody after accelerated immunisation with diphtheria / tetanus / pertussis vaccine. British Medical Journal, 1991; 30 2: Schauer U. et al. Levels of antibody specific to Tetanus toxoid, Haemophilus influenzae type b, and Pneumococcal Capsular Polysaccharide in healthy children and adults. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Mar 2003: VaccZyme Enzym-Immunoassay zur Bestimmung von Tetanus Toxoid-IgG-Antikörpern Zur in-vitro Diagnostik Bestell-Nr.: MK010.4 Hergestellt von: The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK. Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A D Schwetzingen, Deutschland Telefon: +49 (0) Fax: +49 (0) office@bindingsite.de VaccZyme ist ein Warenzeichen von The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK. 1 VERWENDUNGSZWECK Mit diesem in-vitro Testkit können spezifische Antikörper gegen IgG-Tetanus-Toxoid (TTox) in humanem Serum oder Plasma bestimmt werden. Der Kit enthält ausreichend Material, um maximal 89 Proben in Einzelbestimmung, sowie eine Kalibrationskurve und Kontrolle auf jeder der 10 Mikrotiterplatte zu messen. 2 EINFÜHRUNG Anti-Tetanus-Toxoid-Antikörper werden als Reaktion auf die Impfung mit dem Tetanus-Toxoid-Protein gebildet. Der Impferfolg kann anschließend durch die serologische Bestimmung des anti-tetanus-toxoid-antikörper Titers mit Hilfe dieses quantitativen ELISA Kits beurteilt werden. 3 TESTPRINZIP Die Wells (Vertiefungen) der Mikrotiterplatten sind mit dem Tetanus-Toxoid-Antigen beschichtet. Die Kalibratoren, Kontrollen und zu testende Proben werden in den Wells inkubiert, so dass die anti-tetanus-toxoid-antikörper während der ersten Inkubation an das immobilisierte Antigen binden können. Nach dem Waschen der Wells (zum Entfernen des ungebundenen Protein) gibt man das affinitätsgereinigte, mit Peroxidase markierte Kaninichen anti-human-igg-konjugat hinzu. Nach einer weiteren Inkubation und einem weiteren Waschvorgang - um das ungebundene Konjugat zu entfernen - wird das gebundene Konjugat mit Hilfe von 3,3',5,5' - Tetramethylbenzidin (TMB) sichtbar gemacht. TMB ergibt ein blaues Reaktionsprodukt, dessen Intensität proportional zur Antikörperkonzentration der Probe ist. Phosphorsäure wird in jedes Well pipettiert um die Reaktion zu stoppen. Das gelbe Reaktionsprodukt wird bei 450nm gemessen. 4 WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN 4.1 WARNUNGEN Jede Einzelspende von humanem Serum wurde untersucht und bezüglich Antikörper gegen das Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), das Hepatitis-C- Virus und gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) als negativ befunden. Die hierfür verwendeten Tests sind entweder von der FDA (USA) zugelassen oder für den Gebrauch in der in vitro Diagnostik in der EU freigegeben (Directive 98/79/EC, Annex II). Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Auschluss dieser und anderer Infektionsträger. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen (inklusive dem Tragen entsprechender Schutzkleidung). Der Test sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Dieses Produkt enthält Natriumazid und ProClin 300 und muss mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. Das Tragen von Handschuhen und anderer Schutzkleidung wird während des Umgangs mit diesem Produkt empfohlen. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut (v.a. bei Verletzungen) oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann mit Bleioder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser, nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden. Alle Puffer und Seren im Kit enthalten die unten aufgelisteten Enzym-Inhibitoren als Konservierungsmittel. Diese Substanzen sind als Gefahrstoffe anzusehen und müssen mit Vorsicht gehandhabt werden. INHIBITOR Kathon Natriumazid ProClin 300 Bromonitrodioxan Methylisothiazon KONZENTRATION 0,02% 0,099% 0,045% 0,002% 0,002% ProClin ist ein Warenzeichen der Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA Kathon wirkt reizend und kann bei Hautkontakt zu einer Sensibilisierung führen. Die Stopp-Lösung enthält 3M Phosphorsäure, die Reizungen auslösen kann. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. Verschüttete Reagenzien entsprechend beseitigen, dabei sind ökologische und gesetzliche Bestimmungen zu beachten. Insert Code: E th October 2010, Page 3 of 10

4 4.2 VORSICHTSMAßNAHMEN Dieser Test sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt werden. Testdurchführung strikt nach Arbeitsanleitung. Jegliche Abweichung kann die Testqualität und Ergebnisse beeinflussen. Beachten Sie die spezifischen Hinweise und Warnungen in dieser Arbeitsanleitung. Reagenzien unterschiedlicher Chargen dürfen NICHT untereinander gemischt oder gemeinsam verwendet werden. Bei großem Testdurchsatz muss darauf geachtet werden, dass alle Reagenzien der GLEICHEN Charge entstammen. Alle Mikrotiterstreifen müssen aus demselben Folienbeutel entnommen werden Der Austausch einer Testkomponente kann inkorrekte Ergebnisse zur Folge haben. Zur Vermeidung von Kontaminationen der Reagenzien immer saubere Plastik- oder Glasgefäße verwenden. Niemals unbenutztes Reagenz in die Flaschen zurückgeben. Reagenzienflaschen nicht für längere Zeit offen stehenlassen. Die daraus resultierende Verdunstung oder Verunreinigung führt zu widersprüchlichen Ergebnissen. TMB darf weder mit Licht noch mit Wasser in Berührung kommen. Die Verwendung von mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigter, hämolytischer oder lipämischer Seren vermeiden. Falsche Probenverdünnungen können nicht erkannt werden, da die Kit-Kontrollen gebrauchsfertig sind. Es wird empfohlen kalibrierte Pipetten und geeignete interne Kontrollen zu verwenden. Bei der Verwendung von automatisierten Testsystemen, Probenverdünnern und anderem automatisierten Zubehör, sind die Anweisungen des Herstellers sorgfältig zu befolgen. Besondere Sorgfalt gilt der Aufstellung und Installation der Geräte und der Verbindung zu externen Systemen. Alle Einstellungen, die die automatisierten Wasch- und Lesegeräte betreffen, müssen sorgsam befolgt werden. Die Geräte müssen den Herstellerangaben entsprechend instand gehalten und gewartet werden. 4.3 LAGERUNG UND STABILITÄT Den Kit bei 2-8 C lagern, nicht einfrieren. Lagerung bei falscher Temperatur beeinflusst die Ergebnisse. Der verdünnte Waschpuffer ist in einem sauberen Gefäß bei Raumtemperatur bis maximal 4 Wochen haltbar. Die Haltbarkeit des Kits wird auf dem Außenetikett angegeben. 5 PROBENENTNAHME UND VORBEREITUNG 2. Kit-Komponenten Jede Kit-Komponente vor Gebrauch kurz schütteln. 3. Waschpuffer verdünnen Dazu 50mL Waschpuffer-Konzentrat und 950mL destilliertes Wasser (1/20 Verdünnung) in ein sauberes Gefäß geben und mischen. Es können auch entsprechend kleinere Volumina verdünnt werden. Hinweis: Der verdünnte Puffer ist bei Raumtemperatur bis zu 4 Wochen haltbar; deshalb nur die benötigte Menge verdünnen. 4. Verdünnung der Proben Durch Änderung der Probenverdünnung ist es möglich den Test mit zwei unterschiedlichen Messbereichen durchzuführen. Den geeigneten Messbereich auswählen und die entsprechende Verdünnung (siehe Tabelle unten) herstellen. Gewünschter Volumen Verdünnung Messbereich Probe Diluens 0,25-60 IU/mL 1:200 5μL 1,0mL Step 1 5μL Probe 200μL 1, IU/mL 1:1000 Step 2 10μL verdünnte Probe 250μL Bei Verwendung des Messbereichs 1, IU/mL wird die Probenverdünnung in zwei Schritten durchgeführt. Im 1. Schritt wird eine 1:40-, im 2. Schritt eine 1:25- Verdünnung hergestellt. Daraus resultiert eine Endverdünnung von 1: Umgang mit Streifen und Rahmen Die benötigte Anzahl Wells aus dem Folienbeutel entnehmen und in den Rahmen setzen. Dabei von Position A1 ausgehend die Spalten von links nach rechts auffüllen. Achten Sie darauf, die langen Seiten des Rahmens zusammenzudrücken, damit die Wells nicht herausfallen können. Hinweis: Um die Kontaktzeit mit der Luftfeuchtigkeit zu minimieren die nicht verwendeten Wells sofort in den wiederverschließbaren Folienbeutel mit dem Trockenmittel geben und gut verschließen. Darauf achten, dass der Folienbeutel nicht beschädigt wird. ACHTUNG: Kontakt mit Feuchtigkeit oder Verunreinigung durch Staub oder anderen Partikeln kann einen Antigen-Abbau verursachen. Daraus resultiert eine schlechte Präzision und potentiell falsche Ergebnisse. 7 TESTDURCHFÜHRUNG 5.1 PLASMAPROBEN Natriumcitrat als Antikoagulanz bei der Blutentnahme verwenden. Das Plasma kann bis zu 14 Tage bei 2-8 C vor der Messung gelagert werden. Für eine längere Lagerung wird empfohlen, die Proben unverdünnt bei mindestens -20 C zu lagern. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden. 5.2 SERUMPROBEN Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen lassen. Serum vom Gerinnsel trennen. Die Seren können bei 2-8 C bis zu 48 Stunden vor dem Test gelagert werden. Für eine längere Lagerung empfiehlt es sich, die Seren unverdünnt bei mindestens -20 C einzufrieren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden. Serumproben nicht hitzeinaktivieren; dies kann zu falsch-positiven Ergebnissen führen. 6 MATERIALIEN 6.1 GELIEFERTE MATERIALIEN Arbeitsanleitung: mit genauen Angaben zur Testdurchführung QC-Zertifikat: mit chargen-spezifischen Angaben zu Kontroll-Sollwerten, ideale Kalibrationskurve T. Tox Coated Wells (T. Tox beschichtete Mikrotiterstreifen): 10 Mikrotiterplatten mit vereinzelbaren Wells, die mit Tetanus Toxoid, das vom Toxin von Clostridium tetani abgeleitet ist, beschichtet sind. Die Streifen sind in einem wiederverschließbaren Folienbeutel, der 2 Beutel mit Trockenmittel enthält, verpackt Sample Diluent (Probendiluens): 19 Flaschen mit je 50mL Probendiluens. Farbcodierung: gelb. Gebrauchsfertig Wash Buffer (Waschpuffer): 9 Flaschen mit je 50mL eines 20-fach konzentrierten Puffers zum Waschen der Wells T. Tox IgG Calibrators (T. Tox IgG-Kalibratoren): 5 x 6 Flaschen mit je 1,2mL gebrauchsfertig verdünntem Humanserum, das folgende Konzentration an anti-tetanus-toxoid-antikörper enthält: 0,00123; 0,0037; 0,0111; 0,0333; 0,1 und 0,3 IU/mL. Gebrauchsfertig T. Tox IgG Control (T. Tox IgG-Kontrolle): 5 Flaschen mit 1,2mL verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben. Gebrauchsfertig T. Tox IgG Conjugate (T. Tox IgG-Konjugat): 10 Flaschen mit 12mL gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Human-IgG. Farbcodierung: rot. Gebrauchsfertig TMB Substrate (TMB-Substrat): 10 Flaschen mit 14mL TMB-Lösung. Gebrauchsfertig Stop Solution (Stopp-Lösung): 10 Flaschen mit 14mL 3M Phosphorsäure. Gebrauchsfertig. 6.2 BENÖTIGTE, NICHT IM KIT ENTHALTENE MATERIALIEN Automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät: ist empfehlenswert, aber die Platten können auch manuell gewaschen werden Mikrotiterplatten-Reader: Messung der optischen Dichte in den Wells bei 450nm Destilliertes Wasser: Es sollte von höchster Qualität sein Kalibrierte Mikropipetten: Zum Pipettieren von 1000, 100 & 10μL Mehrkanal-Pipette: Zum Pipettieren von Volumina von 100μL Glas- oder Plastikgefäße: Zur Probenverdünnung. 6.3 TESTVORBEREITUNG 1. Kit auf Raumtemperatur erwärmen Die optimale Temperatur für die Testdurchführung liegt bei C. Eine ausreichende Reagenzmenge aus dem Kühlschrank nehmen und ca. 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Die Wells bis zum tatsächlichen Gebrauch in der Folie belassen. Hinweis: Der Kit kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert werden. Insert Code: E th October 2010, Page 4 of 10 Alle Reagenzien in der gleichen Reihenfolge pipettieren. 1. Pipettieren der Kalibratoren, Kontrolle und Proben und Inkubation 100μL von jedem Kalibrator, Kontrolle und jeder verdünnten (1:200 oder 1:1000) Probe in das dafür laut Plattenschema vorgesehene Well pipettieren. Bei Tests, bei denen mehr als eine Platte (der gleichen Charge) verwendet wird, muss die Kontrolle auf jeder Platte mitgeführt werden. Hinweis: Die Proben müssen so schnell wie möglich pipettiert werden um eine Drift des Assays zu minimieren; die Inkubationszeit läuft ab Zugabe der letzten Probe. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 2. Waschen der Platte Sorgfältiges Waschen der Wells ist wichtig für eine hohe Präzision und genaue Testergebnisse. Bei nicht korrekt gewaschenen Wells können ungenaue Ergebnisse mit schlechter Präzision und hohem Hintergrund auftreten. Nach der Inkubation die Wells dreimal mit μL Waschpuffer waschen. Das Waschen kann mit einem automatischen Platten-Waschgerät oder manuell erfolgen. Nach dem letzten Waschschritt die Wells durch leichtes Klopfen auf eine absorbierende Unterlage (z.b. Papiertücher) trocknen. Manuelles Waschen: a. Den Inhalt der Wells in den Ausguss schütten, dabei die langen Seiten des Rahmens zusammendrücken. b. Die Wells auf einer absorbierenden Unterlage (z. B. Papiertücher) leicht ausklopfen. c µL Waschpuffer in der Arbeitskonzentration in die Wells pipettieren. d. Die Mikrotiterplatte auf einer flachen Unterlage stehend leicht schütteln. e. Zweimaliges Wiederholen der Schritte a bis d. f. Die Wells wie unter a und b entleeren. 3. Pipettieren des Konjugats und Inkubation 100μL Konjugat in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges Konjugat in die Konjugat-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 4. Waschen der Platte Siehe Abschnitt Pipettieren von Substrat (TMB) und Inkubation Nach dem Waschen 100μL TMB in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges Substrat in die TMB-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. 6. Reaktionsende 100 μl Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Die Farbe schlägt von blau nach gelb um. 7. Farbmessung Die optische Dichte (OD) bei 450nm in jedem Well mit einem Mikrotiterplatten- Reader innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopp-Lösung bestimmen. 8 ERGEBNISSE UND QUALITÄTSKONTROLLE 1. Qualitätskontrolle Nur, wenn alle nachfolgend aufgeführten Kriterien erfüllt sind, ist der Test gültig. Kalibratoren und Kontrolle müssen bei jedem Testansatz mitgeführt werden. Das Ergebnis der Kontrolle muss in dem angegebenen Wertebereich (siehe QC-Zertifikat) liegen. Die berechnete Kalibrationskurve sollte der auf dem QC-Zertifikat abgebildeten Kalibrationskurve ähnlich sein. Ist dies nicht der Fall, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden.

5 Anzahl d. Proben 2. Berechnung der mittleren optischen Dichte (nur bei Doppelbestimmung) Für jeden Kalibrator und jede Kontrolle und Probe die mittlere optischen Dichte (OD) der Doppelbestimmungen berechnen. Der Variationskoeffizient (%VK) der Doppelbestimmungen sollte jeweils unter 15% liegen. 3. Erstellen der Kalibrationskurve Die Kalibrationskurve kann entweder automatisch oder manuell erstellt werden. Dazu wird die Anti-Tetanus-toxoid-IgG-Antikörperkonzentration auf der logarithmischen Skala gegen die OD-Werte auf der linearen Skala für jeden Kalibrator aufgetragen. Hinweis: Die Kalibrationskurve darf nicht außerhalb des angegebenen Messbereichs extrapoliert werden. Automatisch: Geeignete, validierte Software verwenden. Kalkulationsmodus verwenden, der am besten zu den Daten passt. Manuell: Halblogarithmisches Millimeterpapier verwenden, eine Ausgleichskurve durch die Punkte legen (keine Gerade oder Punkt-zu-Punkt-Verbindung). 4. Umgang mit abweichenden Kalibrationspunkten Liegt ein Messpunkt nicht auf der Kalibrationskurve, so kann er weggelassen werden. Der Test sollte wiederholt werden, wenn die daraus resultierende Kalibrationskurve deutlich von der im QC-Zertifikat angegebenen Kurvenform abweicht oder, wenn mehrere Kalibrationspunkte zu starke Abweichungen aufweisen. 5. Berechnung der Antikörperkonzentrationen in den Kontrollen Die Konzentration der Anti-Tetanus-Toxoid-Antikörper der Kontrolle wird direkt aus der Kalibrationskurve abgelesen und ist daher für beide Messbereiche geeignet. Der gemessene Kontrollwert muss in den im QC-Zertifkat angegebenen Bereich fallen. 6. Berechnung der Antikörperkonzentrationen in den Proben Die Anti-Tetanus-Toxoid-Antikörperkonzentration der verdünnten Proben von der Kalibrationskurve ablesen. Den abgelesenen Wert mit dem Verdünnungsfaktor (200 oder 1000) multiplizieren, um die Konzentration der unverdünnten Probe zu erhalten. 7. Kalibration des Tests Der Test-Kit ist gegen die NIBSC-Tetantus-antitoxin-Referenzpräparation TE3 kalibriert worden, von der National Institute for Biological Standards and Control hergestellt (NIBSC: 8. Grenzen des Tests Dieser Kit ist als Screening-Test innerhalb eines validierten Qualitätskontroll- Verfahrens zu verwenden. 9 TYPISCHE WERTE Die anti-tetanus-toxoid-igg-antikörperkonzentration wurde im Serum von 200 normalen Blutspendern (mit unbekanntem Impf- und Immunstatus) ermittelt. Die Ergebnisse sind in der untenstehenden Grafik zusammengefasst. Diese Werte dienen nur zur Orientierung und sollten nicht zur Berechnung eines Normalbereichs verwendet werden LEISTUNGSDATEN 10.1 PRÄZISION < Anti-T. Tox IgG IU/mL Die Intra- und Inter-Assay-Präzision wurde mit drei Proben, deren Antikörper- Konzentrationen innerhalb der Kalibrationskurve liegen, bestimmt. Die mittlere Konzentration, die Standardabweichung und der Variationskoeffizient (%VK) sind nachfolgend angegeben: INTRA-ASSAY-PRÄZISION (1:1000-Probenverdünnung) n=20 Mittlere Konzentration IU/mL SD % VK Probe 1 6,2 0,1 2,1 Probe 2 18,9 0,6 3,1 Probe 3 65,8 4,2 6,3 INTRA-ASSAY-PRÄZISION (1:200-Probenverdünnung) n=20 Mittlere Konzentration IU/mL SD % VK Probe 1 6,5 0,4 5,5 Probe 2 12,9 0,9 6,8 Probe 3 19,7 1,3 6,6 INTER-ASSAY-PRÄZISION (1:200-Probenverdünnung) n=6 Mittlere Konzentration IU/mL SD % VK Probe 1 6,7 0,6 9,4 Probe 2 12,2 1,0 7,9 Probe 3 19,7 1,0 5, ANALYTISCHE SENSITIVITÄT DES TESTS Die Sensitivität des Tests wurde anhand der Mehrfachbestimmung von 2 Proben, deren Konzentration das 1,4- bzw 2,0-fache des niedrigsten Kalibrators betrug, bestätigt. Die statistische Analyse mit dem t-test nach Student zeigt, dass sich diese Proben signifikant voneinander unterscheiden (p<0,0001). ANALYTISCHE SENSITIVITÄT Probenverdünnung Probe 1 Probe 2 Niedrigster Konz. Konz. Kalibrator Konz. % VK % VK IU/mL IU/mL 1:200 0,25 IU/mL 0,3 3,0 0,5 4,0 1:1000 1,23 IU/mL 1,7 2,6 2,2 2, PROZONENEFFEKT Drei Seren, mit Anti-T.Tox.-Antikörperkonzentrationen von 2165, 5856 und 9511 IU/mL wurden in einer seriellen Verdünnungsreihe unter Verwendung der 1:1000 Probenverdünnung und des höheren Messbereichs und getestet. Es wurde kein Prozoneneffekt festgestellt LINEARITÄT Die Linearität des Tests wurde anhand 3 Serumproben über den gesamten Messbereich überprüft. Für die Probenverdünnung von 1:1000 wurden R 2 -Werte von 0,9961, 0,9995 und 0,9993, für die Probenverdünnung von 1:200 R 2 -Werte von 0,9965, 0,9949 und 0,9883 gefunden. Hinweis: Die Kalibrationskurve darf nicht außerhalb des angegebenen Messbereichs extrapoliert werden MESSBEREICH Der Messbereich dieses Tests ist in untenstehender Tabelle aufgeführt: MESSBEREICH Probenverdünnung Messbereich 1:200 0,25 60 IU/mL 1:1000 1, IU/mL 10.6 INTERFERIERENDE SUBSTANZEN Der Kit wurde mit verschiedenen Serumtypen (Interference Check A plus Kit von Kokusai, Japan) auf mögliche Effekte von interferierenden Substanzen getestet. Substanz Bilirubin F (Frei) Bilirubin C (Konjugiert) Hämolysiertes Hämoglobin Chylus Rheumafaktor Konzentration 19,1mg/dL 19,6mg/dL 484mg/dL 2130 Units 50 IU/mL Freies und konjugiertes Bilirubin, Hämoglobin, Lipide oder Rheumafaktoren zeigten keinerlei Beeinflussung des Tests. 11 REFERENZEN 1. Berger M. Immunoglobulin G subclass determination in diagnosis and management of antibody deficiency syndromes. The Journal of Paediatrics, 1987:2: Gergen P. J et al. A population-based serologic survey of immunity to tetanus in the United States. The New England Journal of Medicine, 1995; 332: Bjorkholm B. et al. Immune status and booster effects of low doses of tetanus toxoid in Swedish medical personnel, Scandinavian Journal of Infectious Diseases, 1994; 26: Ramsay M. E. B et al. Persistence of antibody after accelerated immunisation with diphtheria / tetanus / pertussis vaccine. British Medical Journal, 1991; 30 2: Schauer U. et al. Levels of antibody specific to Tetanus toxoid, Haemophilus influenzae type b, and Pneumococcal Capsular Polysaccharide in healthy children and adults. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Mar 2003: INTER-ASSAY-PRÄZISION (1:1000-Probenverdünnung) n=6 Mittlere Konzentration IU/mL SD % VK Probe 1 6,1 0,3 4,4 Probe 2 18,3 0,9 5,2 Probe 3 74,8 2,6 3,5 Insert Code: E th October 2010, Page 5 of 10

6 Coffret ELISA VaccZyme Anti-toxine tétanique de type IgG Pour un usage en diagnostic in-vitro Référence : MK010.4 Produits fabriqués en Angleterre par la société : The Binding Site Group Ltd., PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK Distribués en France par la société : The Binding Site France, 14 rue des Glairaux, BP226, St Egrève Cedex Téléphone : Fax : info@bindingsite.fr VaccZyme est une marque par The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK. 1 INDICATIONS Ce coffret est utilisé pour mesurer in-vitro les anticorps IgG spécifiques dirigés contre la toxine tétanique (Tox.T.) présents dans le sérum et le plasma. Ce coffret permet de tester 89 échantillons en simple avec une courbe de calibration et un contrôle sur chacune des 10 plaques. 2 PRESENTATION GENERALE Les anticorps anti-toxine tétanique sont produits en réponse à la vaccination avec la protéine de la toxine tétanique. Une réponse de patient à l immunisation peut être évaluée par conséquent par la détermination sérologique des taux d anticorps antitoxine tétanique en utilisant une technique ELISA. 3 PRINCIPE DU TEST Les micropuits sont recouverts d antigène de toxine tétanique. Les calibrateurs, les contrôles et les échantillons de patients dilués sont ajoutés aux puits. Les anticorps reconnaissant l antigène de toxine tétanique se lient durant la première incubation. Après le lavage des puits pour enlever toutes les protéines non liées, un conjugué de lapin purifié anti-igg humaines (spécifique de la chaîne ) et marqué à la péroxydase est ajouté. Le conjugué se lie aux anticorps humains capturés et le conjugué non lié est éliminé par une étape de lavage. Le conjugué lié est visualisé avec du substrat 3,3,5,5 tetramethylbenzidine (TMB) qui donne un produit de réaction bleu. L intensité de celui-ci est proportionnelle à la concentration en anticorps de l échantillon. L acide phosphorique est ajouté dans chaque puits pour arrêter la réaction. Ceci produit une coloration jaune qui est lue à 450nm. 4 PRECAUTIONS 4.1 ATTENTION Tous les sérums humains fournis dans ce coffret ont été testés et trouvés négatifs pour l antigène de surface de l hépatite B (Ag HBs), pour le virus de l hépatite C et pour les anticorps anti-virus de l immunodéficience humaine (HIV1 and HIV2). Les tests utilisés ont soit été approuvés par la FDA (USA) ou accepté pour un usage en diagnostic in-vitro par l union européenne (Directive 98/79/EC, Annexe II); néanmoins ces tests ne peuvent garantir l absence d agents infectieux Tous les échantillons doivent donc être manipulés comme des produits potentiellement infectieux. Seul un personnel qualifié dans la manipulation d échantillons potentiellement infectieux est Insert Code: E th October 2010, Page 6 of 10

7 Nb d'échantillons 4. Dilution échantillon En changeant la dilution échantillon, il est possible d effectuer l analyse à deux gammes de mesure différentes. Sélectionner la gamme de mesure appropriée et utiliser la dilution associée comme indiquée dans le tableau ci-dessous : Volume Gamme de mesure Dilution Échantillon Diluant 0,25-60 UI/mL 1:200 5μL 1,0mL Etape 1 5μL Échantillon 200μL 1, UI/mL 1:1000 Etape 2 10μL Échantillon non dilué 250μL Pour utiliser la gamme de mesure 1, UI/mL, les échantillons sont dilués en deux étapes : tout d abord, une dilution au 1:40 et ensuite une autre au 1:25 pour une dilution finale au 1: Manipulation de la plaque Placer le nombre requis de puits sur la trame. Remplir les colonnes de gauche à droite à partir du puits A1. Lors de la manipulation de la plaque, maintenir les longs bords de la trame afin d éviter que les puits ne tombent. Note : Remettre immédiatement les puits non utilisés dans leur emballage afin de minimiser l exposition des puits à l humidité. Faire attention à ne pas percer ou déchirer l emballage. ATTENTION: L exposition des puits à l humidité ou leur contamination par la poussière ou par d autres particules de matière induit une dégradation de l antigène conduisant à une mauvaise précision ou à des résultats faux. 7 PROCEDURE Maintenir la même séquence de dépôt tout le long du test. 1. Dépôt de l échantillon Déposer 100μL de chaque calibrateur, contrôle et échantillon dilué (1:200 ou 1:1000) dans les puits appropriés de la plaque. Les tests lançés sur plus d une plaque (du même groupe) doivent comporter des contrôles sur chaque plaque. Note : Les échantillons doivent être déposés sur la plaque aussi rapidement que possible afin de minimiser les écarts, et le décompte du temps commence après l addition du dernier échantillon. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 2. Lavage La procédure de lavage est importante et requiert une attention spéciale. Un lavage imparfait peut induire des résultats faussés avec une mauvaise précision et du bruit de fond. Après incubation, laver 3 fois les puits avec 250 à 350μL de tampon de lavage par puits. Laver la plaque avec un laveur automatique de plaque ou manuellement comme indiqué ci-dessous. Après le lavage final automatique, retourner la plaque et taper les puits sur du papier absorbant. Les plaques peuvent être lavées manuellement comme suit : a. Renverser le contenu de la plaque dans un récipient. b. Taper les puits sur du papier absorbant. c. Remplir chaque puits avec 250 à 350μL de tampon de lavage en utilisant une pipette multi-canaux. d. Secouer doucement la plaque sur une surface plane. e. Répéter les étapes a à d 2 fois. f. Répéter a et b. 3. Addition du conjugué Déposer 100μL de conjugué par puits, nettoyer le haut des puits avec un tissu pour enlever les éclaboussures. Note : Afin d éviter les contaminations, ne jamais remettre l excès de conjugué dans le flacon d origine. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 4. Lavage Répéter l étape Addition du substrat (TMB) Déposer 100μL de substrat TMB dans chaque puits, nettoyer le haut des puits avec un tissu pour enlever les éclaboussures. Note : Afin d éviter les contaminations, ne jamais remettre l excès de TMB dans le flacon d origine. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes à l obscurité. 6. Arrêt Déposer 100μL de solution d arrêt dans chaque puits. Ceci induit un changement de couleur du bleu au jaune. 7. Mesure de la densité optique Lire la densité optique (DO) de chaque puits à 450nm à l aide d un lecteur de microplaques dans les 30 minutes suivant l arrêt de la réaction. 8 RESULTATS ET CONTROLE DE QUALITE 1. Contrôle de qualité Pour valider le test, tous les critères suivants doivent être respectés : Les calibrateurs et le contrôle doivent être inclus dans chaque série de tests. La valeur obtenue pour le contrôle doit être dans la gamme spécifiée dans le certificat de contrôle de qualité. La forme de la courbe doit être similaire à la courbe de calibration fournie dans le certificat de contrôle qualité. Si les critères ci-dessus ne sont pas respectés, le test est invalide et doit être répété. 2. Calculer les densités optiques moyennes (pour des tests réalisés en double) Pour chaque calibrateur, contrôle et échantillon, calculer la moyenne des DO du duplicat. Le coefficient de variation (CV en %) pour chaque duplicat doit être inférieur à 15%. 3. Courbe de calibration La courbe de calibration peut être tracée de façon automatique ou manuellement en appliquant la concentration d anticorps anti-toxine tétanique sur une échelle logarithmique contre les densités optiques sur une échelle linéaire pour chaque calibrateur. Note : La courbe de calibration ne doit pas être extrapolée à l extérieur de la gamme de mesure du test. Automatique utiliser un logiciel validé approprié et une courbe qui suit les données. Manuelle utiliser du papier graphique log/linéaire et tracer une courbe la plus arrondie possible qui passe par les points (pas une ligne droite ni du point à point). 4. Traitement des points anormaux Si un point ne passe pas par la courbe, il peut être enlevé. Si en l absence de ce point, la forme de la courbe est différente de celle du certificat de contrôle de qualité ou si plus d un point apparaît anormal, alors le test doit être répété. 5. Calcul de la valeur des contrôles Le niveau d anticorps anti-toxine tétanique dans le contrôle est lu directement à partir de la courbe de calibration et pour cette raison est approprié pour les deux gammes de mesure. La valeur doit être comprise dans la gamme de mesure inscrite sur le certificat de contrôle de qualité. 6. Calcul du taux d anticorps dans les échantillons dilués Lire le niveau d anticorps anti-toxine tétanique présent dans les échantillons dilués à partir de la courbe de calibration. Multiplier cette valeur par le facteur de dilution (200 ou 1000) pour obtenir le niveau d anticorps anti-toxine tétanique présent dans l échantillon pur. 7. Calibration du test Le test est calibré par rapport à la préparation de référence anti-toxine tétanique NIBSC TE3, fourni par le National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC: 8. Limites Ce test est conçu pour une utilisation en dépistage, dans un protocole de contrôle de qualité validé. 9 VALEURS ATTENDUES Les taux d anticorps anti-toxine tétanique ont été mesurés dans le sérum de 200 donneurs de sang adultes sains (de vaccination et de status immunitaire inconnus). Les résultats illustrés ci-dessous ne doivent pas être utilisés pour calculer une gamme normale PERFORMANCES 10.1 PRECISION 0 < Anti-T. Tox IgG UI/mL Les précisions intra- et inter-essai ont été mesurées en utilisant 3 échantillons dans la gamme de la courbe de calibration. La concentration, la déviation standard et le C.V. en % pour chaque échantillon sont donnés ci-dessous : PRECISION INTRA-ESSAI (dilution d échantillon 1:1000) n=20 Concentration (UI/mL) DS C.V. en % Echantillon 1 6,2 0,1 2,1 Echantillon 2 18,9 0,6 3,1 Echantillon 3 65,8 4,2 6,3 PRECISION INTRA-ESSAI (dilution d échantillon 1:200) n=20 Concentration (UI/mL) DS C.V. en % Echantillon 1 6,5 0,4 5,5 Echantillon 2 12,9 0,9 6,8 Echantillon 3 19,7 1,3 6,6 PRECISION INTER-ESSAI (dilution d échantillon 1:1000) n=6 Concentration (UI/mL) DS C.V. en % Echantillon 1 6,1 0,3 4,4 Echantillon 2 18,3 0,9 5,2 Echantillon 3 74,8 2,6 3,5 PRECISION INTER-ESSAI (dilution d échantillon 1:200) n=6 Concentration (UI/mL) DS C.V. en % Echantillon 1 6,7 0,6 9,4 Echantillon 2 12,2 1,0 7,9 Echantillon 3 19,7 1,0 5,2 Insert Code: E th October 2010, Page 7 of 10

8 10.2 SENSIBILITE ANALYTIQUE La sensibilité du test a été confirmée en testant 2 échantillons avec plusieurs replications et avec des valeurs 1,4 et 2,0 fois la valeur du point de calibration le plus bas. L analyse statistique par le t test de Student a confirmé que ces deux échantillons étaient sensiblement différents l un de l autre (p<0,0001). SENSIBILITE ANALYTIQUE Valeur du Echantillon 1 Echantillon 2 Dilution calibrateur le plus Conc. % Conc. échantillon % C.V. bas UI/mL C.V. UI/mL 1:200 0,25 UI/mL 0,3 3,0 0,5 4,0 1:1000 1,23 UI/mL 1,7 2,6 2,2 2, PHENOMENE DE ZONE Aucun phénomène de zone n a été observé quand les dilutions en série de 3 échantillons contenant respectivement 2165, 5856 et 9511 UI/mL d anticorps anti- T.Tox. ont été testées à la dilution 1:1000 avec la gamme de mesure la plus haute LINEARITE La linéarité a été testée sur toute la gamme de mesure de calibration en utilisant 3 échantillons tests. Les valeurs R 2 étaient 0,9961, 0,9995 et 0,9993 avec une dilution échantillon au 1:1000 et 0,9965, 0,9949, 0,9883 avec une dilution échantillon au 1:200. Note : La courbe de calibration ne doit pas être extrapolée en dehors de la gamme de mesure du test GAMME DE MESURE La gamme de mesure du test est lue dans la table ci-dessous : GAMME DE MESURE Dilution échantillon Gamme de mesure 1:200 0,25 60 UI/mL 1:1000 1, UI/mL 10.6 SUBSTANCES INTERFERENTES Différents types de sérum ont été testés pour évaluer l effet possible de substances interférentes en utilisant le coffret Interference Check A plus (Kokusai, Japon). Substances Bilirubine (libre) Bilirubine (conjuguée) Hémoglobine hémolysée Chyle Facteur rhumatoïde Concentration 19,1mg/dL 19,6mg/dL 484mg/dL 2130 unités 50 UI/mL Aucune interférence a été observée avec la bilirubine libre ou conjuguée, l hémoglobine, les lipides ou le facteur rhumatoïde. 11 REFERENCES 1. Berger M. Immunoglobulin G subclass determination in diagnosis and management of antibody deficiency syndromes. The Journal of Paediatrics, 1987:2: Gergen P. J et al. A population-based serologic survey of immunity to tetanus in the United States. The New England Journal of Medicine, 1995; 332: Bjorkholm B. et al. Immune status and booster effects of low doses of tetanus toxoid in Swedish medical personnel, Scandinavian Journal of Infectious Diseases, 1994; 26: Ramsay M. E. B et al. Persistence of antibody after accelerated immunisation with diphtheria / tetanus / pertussis vaccine. British Medical Journal, 1991; 30 2: Schauer U. et al. Levels of antibody specific to Tetanus toxoid, Haemophilus influenzae type b, and Pneumococcal Capsular Polysaccharide in healthy children and adults. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Mar 2003: Anti-toxoide tetánico IgG VaccZyme Kit Inmunoenzimático Para uso diagnóstico in-vitro Código producto : MK010.4 Fabricado por: The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. The Binding Site Spain S.L.U., C/ Balmes 243 4º 3ª, Barcelona Teléfono Fax: info@bindingsite.es web: VaccZyme es marca de The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK. 1 UTILIZACIÓN Este kit está preparado para la cuantificación in vitro de anticuerpos específicos IgG (T.Tox.) contra el toxoide tetánico presente en el suero y plasma. Se suministra material suficiente para analizar un máximo de 89 muestras en un único ensayo, con una curva de calibración y control en cada una de las 10 placas. 2 GENERALIDADES Los anticuerpos anti-toxoide tetánico aumentan en respuesta a la vacunación con la proteína toxoide tetánica. La respuesta del paciente a la inmunización puede ser, por tanto, comprobada mediante la determinación serológica del nivel de anticuerpos anti-toxoide tetánico utilizando este método cuantitativo por la técnica del enzimoinmunoensayo. 3 PRINCIPIOS DEL MÉTODO Los pocillos se encuentran sensibilizados con antígeno toxoide tetánico. Los calibradores, controles y muestras diluidas de pacientes se añaden a los pocillos y los autoanticuerpos que reconocen el antígeno toxoide tetánico se unen durante la primera incubación. Tras el lavado de los pocillos para eliminar las proteínas no unidas, se añade un conjugado de conejo purificado anti-igg (específico de cadena ) humana marcado con peroxidasa. El conjugado se une al anticuerpo humano capturado y el exceso de conjugado no unido se elimina mediante un lavado posterior. El conjugado unido se visualiza con el sustrato 3,3,5,5 tetrametilbenzidina (TMB) que da un producto de color azul cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpo en la muestra. Se añade ácido fosfórico a cada pocillo para parar la reacción, lo que produce un color amarillo final que se lee a 450nm. 4 PRECAUCIONES 4.1 AVISOS Los sueros humanos suministrados en el kit han sido sometidos a screening para donantes, resultando negativos a la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B y a la presencia de los anticuerpos de la ante los virus HIV1, HIV2 y HCV. Las técnicas usadas están aprobadas por la FDA (USA) o para el diagnóstico in vitro por la UE (Directiva 98/79/EC, Anexo II). Sin embargo los sobredichos ensayos no garantizan la ausencia de agentes infecciosos. Por lo tanto, deben tratarse los reactivos como potencialmente infecciosos. Tanto la manipulación como los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa de materiales infecciosos y solo personal adecuadamente instruido deberá efectuar el test. Los componentes del kit contienen azida sódica y ProClin 300 y debe ser manipulados con precaución; use guantes y vestuario protector adecuado en todo momento al manipular este producto. No trague ni permita el contacto con la piel o las mucosas (especilamente si hay heridas). En caso de contacto, lave con abundante agua y consulte a un médico. Con el plomo y el cobre pueden formarse azidas metálicas explosivas. Cuando se elimine el reactivo, lave con mucha agua los recipientes para evitar la acumulación de azida. Insert Code: E th October 2010, Page 8 of 10 Los tampones y sueros suministrados con este kit contienen diferentes inhibidores enzimáticos según sigue. Son productos peligrosos y se deben manipular con precaución. INHIBIDOR Kathon Azida sódica ProClin 300 Bromonitrodioxano Metilisotiazona CONCENTRACIÓN 0,02% 0,099% 0,045% 0,002% 0,002% ProClin es una marca de Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA Kathon es un producto irritante y puede producir sensibilización en contacto con la piel. La solución de parada contiene ácido fosfórico 3M. Es irritante y debe evitarse el contacto con la piel y ojos. Los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa local de materiales infecciosos. 4.2 ADVERTENCIAS Este producto debe ser utilizado únicamente por personas correctamente entrenadas. Se recomienda seguir el protocolo de forma estricta. Cualquier desviación puede afectar a la funcionalidad de este ensayo y a los resultados obtenidos. Ponga especial atención a los avisos y Notas que encontrará en estas instrucciones de uso.

9 NO se pueden intercambiar calibradores, controles, conjugados y microplacas de distintos lotes. La sustitución de cualquier componente por otro con un número de lote distinto al incluido en el kit puede conducir a resultados erróneos. Deben tomarse todas las tiras del mismo envoltorio. Para evitar la contaminación de los reactivos utilice únicamente material plástico o de vidrio limpio. Nunca devuelva reactivos no utilizados a los viales. No deje viales de reactivo abiertos; cualquier posible contaminación o evaporación dará resultados inconsistentes. El sustrato TMB no debe exponerse a la luz o al agua. No deben ser utilizadas muestras hemolizadas, lipémicas, con material particulado o contaminación microbiana. No se puede comprobar una posible dilución de muestra incorrecta ya que los controles están listos para su uso. Se recomienda la utilización de pipetas calibradas y muestras CC internas apropiadas. Al usar sistemas de ensayo automatizados, diluyentes de muestra y otros equipos automáticos, siga con atención las instrucciones del fabricante. Se debe tener especial cuidado con la configuración e instalación del equipo y la conexión a servicios externos. Se deben seguir con atención todos los parámetros de los lectores y de los aclaradores automáticos y seguir las instrucciones del fabricante para el mantenimiento del equipo. 4.3 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD El kit debe conservarse a 2-8ºC y no debe congelarse. Temperaturas de conservación no adecuadas afectarán a los resultados. El tampón de lavado diluido puede conservarse en una botella limpia a temperatura ambiente durante un máximo de 4 semanas. La fecha de caducidad de este kit se muestra en la etiqueta exterior. 5 OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS 5.1 OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE PLASMA 4. Dilución de la muestra Existe la posibilidad de ejecutar este ensayo a dos rangos de medición distintos cambiando la dilución de muestra. Seleccione el rango de medición deseado y use la dilución que corresponda según la siguiente tabla: Rango de ensayo Volumen Dilución requerido Muestra Diluyente 0,25-60 IU/mL 1:200 5μL 1,0mL Paso 1 5μL de muestra 200μL 1, IU/mL 1: μL de muestra Paso 2 250μL diluida Para utilizar el rango de medición 1, IU/mL las muestras están diluidas en un proceso de dos pasos. El primer paso es a dilución 1:40 y el segundo a 1:25, haciendo una dilución total de 1: Manipulación de tira y marco Coloque el número de pocillos necesarios en el soporte de las tiras. Posicione a partir del pocillo A1, rellenando las columnas de izquierda a derecha a través de la placa. Cuando manipule la placa, apriete los bordes largos del marco para evitar que los pocillos caigan fuera. Nota: Vuelva a colocar inmediatamente los pocillos no utilizados en su envoltorio junto a las dos bolsitas de desecante, y séllelo fuertemente para minimizar su exposición a la humedad. Tenga cuidado de no perforar o rasgar el envoltorio, ver más abajo. ATENCIÓN: La exposición de los pocillos a la humedad o a contaminación por polvo u otro material particulado provocará la degradación del antígeno, dando como resultado una pobre precisión del método y potencialmente resultados falsos. 7 METODOLOGÍA DEL ENSAYO Se debe usar citrato sódico como anti-coagulante en la obtención de sangre. El plasma puede conservarse a 2-8ºC hasta 14 días antes del ensayo.. Para periodos superiores, ha de conservarse sin diluir a -20ºC. Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. 5.2 OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE SUERO Las muestras de sangre se han de obtener por punción en vena, dejar que coagule de modo natural y separar el suero. El suero puede conservarse a 2-8ºC hasta 48 horas antes del ensayo. Para periodos superiores, ha de conservarse sin diluir a -20ºC o a temperatura inferior. Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. Las muestras de suero no deben ser inactivadas por calor ya que esto puede ocasionar resultados falsos positivos. 6 MATERIALES 6.1 MATERIAL SUMINISTRADO Hoja de instrucciones: Indica todos los detalles del ensayo Certificado CC: Indica la funcionalidad esperada del lote T. Tox. Coated Wells (Pocillos sensibilizados con T. Tox.): 10 placas rompibles sensibilizadas con un toxoide tetánico derivado de la toxina Clostridium tetani. Cada placa se suministra en una bolsa que puede volver a cerrarse y que contiene dos bolsas de desecante Sample Diluent (Diluyente de muestra): 19 viales con 50mL de tampón para dilución de la muestra. Coloreado en amarillo, listo para usar Wash Buffer (Tampón de lavado SAF) (concentrado 20x): 9 viales con 50mL de tampón concentrado 20 veces para el lavado de los pocillos T. Tox. IgG Calibrators (Calibradores de IgG T. Tox.): 5 x 6 viales con 1,2mL de suero humano diluido cada uno, con las siguientes concentraciones de autoanticuerpo anti- toxoide tetánico: 0,00123; 0,0037; 0,0111; 0,0333; 0,1; 0,3 IU/mL. Listo para usar T. Tox. IgG Control (Control IgG T. Tox.): 5 viales con 1,2mL de suero humano diluido. El valor esperado se indica en el certificado CC. Listo para usar T. Tox IgG Conjugate (Conjugado IgG T. Tox): 10 viales con anticuerpo IgG humano purificado marcado con peroxidasa. Color rojo, listo para usar TMB Substrate (SustratoTMB): 10 viales con 14mL de sustrato TMB. Listo para usar Stop Solution (Solución de parada): 10 viales con 14mL de ácido fosfórico 3M. Listo para usar. 6.2 MATERIAL ADICIONAL Y EQUIPO no suministrado Lavador automático de microplacas: Su uso es recomendable, aunque las placas pueden lavarse manualmente Lector de microplacas: Capaz de medir densidades ópticas a 450nm en referencia al aire Agua destilada o desionizada: Ha de ser de la calidad más alta disponible Micropipetas calibradas: Para dispensar 1000, 100 y 10µL Pipeta multicanal: Recomendada para dispensar volúmenes de 100µL de conjugado, solución sustrato y solución de parada Tubos de vidrio/plástico: Para dilución de la muestra. 6.3 PASOS PRE-ENSAYO 1. Lleve el kit a temperatura ambiente Los kits están diseñados para su uso a temperatura ambiente (20-24 C). Retire el kit de la cámara frigorífica y déjelo a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos. Los pocillos no deben sacarse de su envoltorio hasta que hayan alcanzado la temperatura ambiente. Nota: Los kits pueden mantenerse a temperatura ambiente hasta una semana. 2. Componentes del kit Mezcle cuidadosamente cada componente del kit antes de su uso. Mantenga la misma secuencia de dispensación durante todo el proceso. 1. Adición de la muestra Dispense 100µL de cada calibrador, control y muestra diluida (1:200 o 1:1000) en los pocillos adecuados de la placa. Las ejecuciones del ensayo que impliquen más de una placa (del mismo lote) deben incluir el control en cada una de ellas. Nota: Las muestras deben añadirse lo más rápidamente posible a la placa para minimizar la deriva del ensayo, y conectar el timer tras la adición de la última muestra. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. 2. Lavado El procedimiento de lavado es crítico y requiere una atención especial. Un lavado inadecuado de la placa dará resultados inexactos, con una pobre precisión y fondos elevados. Tras la incubación retire la placa y lave 3 veces con µL de tampón de lavado por pocillo. Puede lavar la placa tanto con un lavador de placas automático o manualmente como se indica a continuación. Después del último lavado automático, invierta la placa y golpee los pocillos sobre papel secante. Las placas pueden lavarse de modo manual como sigue: a. Sacuda el contenido de la placa en un fregadero b. Golpee los pocillos sobre papel secante c. Pipetee µL de tampón de lavado en cada pocillo con una pipeta multicanal d. Agite la placa suavemente en una superficie plana e. Repita a-d dos veces. f. Repita a y b. 3. Adición del conjugado Dispense 100µL de conjugado en cada pocillo, seque la parte superior de los pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras. Nota: No devuelva cantidades que sobren de conjugado al vial original del reactivo, con el fin de evitar su contaminación. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. 4. Lavado Repita el paso Adición del sustrato (TMB) Dispense 100µL de sustrato TMB en cada pocillo, seque la parte superior de los pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras. Nota: No devuelva cantidades que sobren de TMB al vial original del reactivo, con el fin de evitar su contaminación. Incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. 6. Parada Dispense 100µL de solución de parada en cada pocillo. De este modo se produce un cambio de color de azul a amarillo. 7. Medición de la densidad óptica Lea la densidad óptica (OD) de cada pocillo a 450nm en un lector de microplacas, dentro de los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción. 8 RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD 1. Control de calidad Para que un ensayo sea válido se han de cumplir los siguientes requisitos: Se han de incluir calibradores y controles en cada ensayo. El valor obtenido para el control positivo y negativo ha de entrar en el rango especificado en el certificado CC. La forma de la curva ha de ser similar a la curva de calibración que se muestra en el certificado CC. Si estos requisitos no se cumplen el ensayo no es válido y debe repetirse. 2. Cálculo de densidades ópticas medias (Sólo para ensayos que se 3. Dilución del tampón de lavado lleven a cabo en duplicado) Añada 50mL del tampón de lavado concentrado a 950mL de agua destilada Calcule la media de DO de las lecturas duplicadas para cada calibrador, control y (dilución 1 a 20) en un recipiente limpio y mezcle. Pueden prepararse volúmenes muestra. El porcentaje del coeficiente de variación (%C.V.) para cada duplicado de más pequeños diluyendo adecuadamente. DO ha de ser menor al 15%. NOTA: El tampón de lavado diluido puede conservarse a temperatura ambiente hasta 4 semanas, por tanto diluya únicamente la cantidad necesaria. Insert Code: E th October 2010, Page 9 of 10

10 Cantidad de muestras 3. Trazado de la curva de calibración Se puede trazar la curva de calibración de modo manual o automático, con los valores de concentración de autoanticuerpo anti-toxoide tetánico en la escala log frente a la DO en la escala lineal, para cada calibrador: Nota: La curva de calibración no debe ser extrapolada fuera del rango de medición de ensayo indicado. Automático utilice un software adecuado y validado y el ajuste de curva que mejor se adapte a los datos. Manual utilice papel gráfico log/lineal y dibuje una suave curva a través de los puntos (no una línea recta o punto a punto). 4. Tratamiento de puntos anómalos Si alguno de los puntos no entra en la curva, puede eliminarse siempre y cuando se mantenga la forma esperada de la curva (normalmente esto ocurre de forma automática cuando se usa un software de ajuste de la curva). Si la ausencia de dicho punto implica que la forma de la curva sea distinta a la curva de calibración de muestra, o más de un punto parece ser anómalo, el ensayo debe repetirse. 5. Cálculo del valor de control El nivel de anticuerpo anti-toxoide tetánico del control se lee directamente de la curva de calibración y por lo tanto es adecuado para ambos rangos de medición. El valor debe entrar dentro del rango indicado en el certificado CC. 6. Cálculo del nivel de autoanticuerpo en muestras diluídas Lea el nivel de autoanticuerpo anti-toxoide tetánico de las muestras diluidas desde la curva de calibración. Multiplique el valor por el factor de dilución (200 o 1000) para obtener el nivel de autoanticuerpo anti-toxoide tetánico de la muestra. 7. Calibración del ensayo El ensayo se encuentra calibrado frente a la preparación de referencia NIBSC antitoxina tetánica TE3, que suministra el National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC: 8. Limitaciones Este ensayo tiene como función el análisis por screening dentro de un protocolo válido de control de calidad. 9 VALORES TÍPICOS Se midieron los niveles de autoanticuerpos IgG anti- toxoide tetánico en los sueros de 200 donantes de sangre normales, cuyo estado de vacunación e inmunización era desconocido. Los resultados indicados a continuación son únicamente ilustrativos y no deben utilizarse para establecer un rango de normalidad < Anti-T. Tox IgG IU/mL 10 CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO SENSIBILIDAD ANALÍTICA Punto más Muestra 1 Muestra 2 Dilución de bajo del Conc. Conc. muestra % C.V. % C.V. calibrador IU/mL IU/mL 1:200 0,25 IU/mL 0,3 3,0 0,5 4,0 1:1000 1,23 IU/mL 1,7 2,6 2,2 2, ESTUDIOS PRO-ZONA No se observó pro-zona al analizar las diluciones seriales de tres muestras que contenían 2165, 5856 y 9511 IU/mL de anticuerpo anti-t.tox a la dilución de muestra 1:1000 y con el rango de medición más alto LINEALIDAD DEL ENSAYO La linealidad se analizó a lo largo del rango de calibración usando 3 muestras. La regresión coeficiente R 2 fue 0,9961, 0,9995 and 0,9993 con dilución de muestra 1:1000 y 0,9965, 0,9949, 0,9883 con dilución de muestra 1:200. Nota: La curva de calibración no debe ser extrapolada fuera del rango de medición de ensayo indicado RANGO DE MEDICIÓN El rango de medición se muestra en la tabla a continuación: RANGO DE MEDICIÓN Dilución de muestra Rango de medición 1:200 0,25 60 IU/mL 1:1000 1, IU/mL 10.6 SUSTANCIAS INTERFERENTES Se analizaron varios tipos de suero para comprobar el posible efecto de sustancias interferentes mediante el kit Interference Check A plus (Kokusai, Japón). Sustancia Bilirrubina F (libre) Bilirrubina C (conjugada) Hemoglobina hemolizada Chyle Factor reumatoide Concentración 19,1mg/dL 19,6mg/dL 484mg/dL 2130 Unidades 50 IU/mL No se observaron interferencias con bilirrubina libre o conjugada, hemoglobina, lípidos o factores reumatoides. 11 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Berger M. Immunoglobulin G subclass determination in diagnosis and management of antibody deficiency syndromes. The Journal of Paediatrics, 1987:2: Gergen P. J et al. A population-based serologic survey of immunity to tetanus in the United States. The New England Journal of Medicine, 1995; 332: Bjorkholm B. et al. Immune status and booster effects of low doses of tetanus toxoid in Swedish medical personnel, Scandinavian Journal of Infectious Diseases, 1994; 26: Ramsay M. E. B et al. Persistence of antibody after accelerated immunisation with diphtheria / tetanus / pertussis vaccine. British Medical Journal, 1991; 30 2: Schauer U. et al. Levels of antibody specific to Tetanus toxoid, Haemophilus influenzae type b, and Pneumococcal Capsular Polysaccharide in healthy children and adults. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Mar 2003: PRECISIÓN Las precisiones intra- e inter-ensayo se midieron utilizando tres muestras en el rango de la curva de calibración. La concentración, desviación estándard (SD) y el % C.V. para cada muestra se indican a continuación: PRECISIÓN INTRA-ENSAYO (dilución de muestra 1:1000) n=20 Concentración (IU/mL) SD %C.V. Muestra 1 6,2 0,1 2,1 Muestra 2 18,9 0,6 3,1 Muestra 3 65,8 4,2 6,3 PRECISIÓN INTRA-ENSAYO (dilución de muestra 1:200) n=20 Concentración (IU/mL) SD %C.V. Muestra 1 6,5 0,4 5,5 Muestra 2 12,9 0,9 6,8 Muestra 3 19,7 1,3 6,6 PRECISIÓN INTER-ENSAYO (dilución de muestra 1:1000) n=6 Concentración (IU/mL) SD %C.V. Muestra 1 6,1 0,3 4,4 Muestra 2 18,3 0,9 5,2 Muestra 3 74,8 2,6 3,5 PRECISIÓN INTER-ENSAYO (dilución de muestra 1:200) n=6 Concentración (IU/mL) SD %C.V. Muestra 1 6,7 0,6 9,4 Muestra 2 12,2 1,0 7,9 Muestra 3 19,7 1,0 5, SENSIBILIDAD ANALÍTICA La sensibilidad del ensayo se confirmó mediante el análisis de dos muestras en múltiples réplicas con valores 1,4 y 2,0 veces superiores al punto más bajo del calibrador. Análisis estadísticos del Student s t test confirmaron que estas muestras eran notablemente diferentes unas de otras (p<0.0001). Insert Code: E th October 2010, Page 10 of 10