VaccZyme Human Anti-Haemophilus influenzae type b Enzyme Immunoassay Kit. For in-vitro diagnostic use Product code: MK016 CONTENTS. Page No.

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1 CONTENTS 1 Intended Use 2 Background 3 Principle of the Assay 4 Precautions 5 Sample Collection and Storage 6 Materials 7 Assay Method Page No. VaccZyme Human Anti-Haemophilus influenzae type b Enzyme Immunoassay Kit For in-vitro diagnostic use Product code: MK016 Product manufactured by: The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, U.K. Telephone: +44 (0) Fax: +44 (0) info@bindingsite.co.uk VaccZyme is a trademark of The Binding Site Group Ltd. FDA (USA) Information Analyte Name Anti-Haemophilus type b Complexity Cat. High 8 Results and Quality Control 9 Protective Levels 10 Performance Characteristics 11 References 1 INTENDED USE This assay is designed for the in-vitro measurement of specific IgG antibodies against Haemophilus influenzae type b (Hib) capsular polysaccharide, present in human serum. Sufficient materials are supplied to allow a maximum of 41 samples to be tested in duplicate, with a calibration curve and two controls. 2 BACKGROUND Hib is an encapsulated Gram negative bacterium which can cause a range of conditions including; meningitis, septicaemia, cellulitis, epiglottitis, pneumonia and septic arthritis 1. Hib infections are common in children under five years of age where it is the major cause of bacterial meningitis 1-3. Serum anti-hib antibodies protect against the organism in vivo, and protective levels have been established for unvaccinated and vaccinated individuals by radio antigen binding assays (RABA) 4-6. Measurement of anti-hib antibodies by EIA have been shown to correlate to RABA 7,8, and allow selective quantitation of the IgG isotype. This is important since protective antibodies belong to the IgG class, although occasionally immune sera with high antibody levels by RABA have been shown to contain predominantly IgM and IgA antibodies by ELISA 9. Patients with repeated bacterial infections should be investigated for immunodeficiency and the inability to respond to specific polysaccharide antigens (review 10 ). A patient s specific antibody response may be evaluated by the serological determination of their IgG anti-hib antibody levels pre- and postvaccination using this quantitative enzyme immunoassay. 3 PRINCIPLE OF THE ASSAY Microwells are pre-coated with the Hib capsular polysaccharide antigen conjugated to human serum albumin. The calibrators, controls and diluted patient samples are added to the wells and antibodies recognising the Hib antigen bind during the first incubation. After washing the wells to remove all unbound proteins, purified peroxidase labelled rabbit anti-human IgG ( chain specific) conjugate is added. The conjugate binds to the captured human antibody and the excess unbound conjugate is removed by a further wash step. The bound conjugate is visualised with 3,3,5,5 tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product, the intensity of which is proportional to the concentration of antibody in the sample. Phosphoric acid is added to each well to stop the reaction. This produces a yellow end point colour, which is read at 450nm. 4 PRECAUTIONS 4.1 WARNING Insert Code E016, Version: 28 th October 2010, Page 1 of 12 All donors of human serum supplied in this kit have been serum tested and found negative for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibodies to human immunodeficiency virus (HIV1 and HIV2) and hepatitis C virus. The assays used were either approved by the FDA (USA) or cleared for in vitro diagnostic use in the EU (Directive 98/79/EC, Annex II); however these tests cannot guarantee the absence of infective agents. Proper handling and disposal methods should be established as for all potentially infective material, including (but not limited to) users wearing suitable protective equipment and clothing at all times. Only personnel fully trained in such methods should be permitted to perform these procedures. This product contains sodium azide and ProClin 300 and must be handled with caution; suitable gloves and other protective clothing should be worn at all times when handling this product. Do not ingest or allow contact with the skin (particularly broken skin or open wounds) or mucous membranes. If contact does occur wash with a large volume of water and seek urgent medical advice. Explosive metal azides may be formed on prolonged contact of sodium azide with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of water to prevent azide build up. The buffers and serum supplied in this kit contain various enzyme inhibitors as listed below. These are hazardous and should be handled with care. INHIBITOR CONCENTRATION Kathon 0.02% Sodium Azide 0.099% Proclin % Bromonitrodioxane 0.002% Methylisothiazone 0.002% Proclin is a trademark of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA Kathon is an irritant and may cause sensitisation by skin contact. The stop solution contains 3M phosphoric acid which is an irritant. Avoid contact with skin and eyes. Reagent spills should be cleaned up appropriately, observing local and environmental regulations.

2 4.2 CAUTION This product should only be used by appropriately trained personnel. Strict adherence to the protocol is recommended. Any deviation may affect assay performance, and the results obtained. Pay attention to specific Notes and warnings throughout these Instructions for Use. Reagents from different batch numbers of kits are NOT interchangeable. If large numbers of tests are performed care should be taken to ensure that all reagents are from the SAME batch. All strips must be taken from the same foil pouch. Substitution of any component may lead to incorrect results. To avoid reagent contamination, only use new or clean plastic / glassware. Never return unused reagents to the bottles. Do not leave reagent bottles uncapped; any resulting evaporation or contamination will lead to inconsistent results. TMB substrate must not be exposed to light or water. Microbially contaminated, haemolysed or lipaemic serum and specimens containing particulate matter should not be used. Inaccurate sample dilution cannot be checked, as kit controls are ready to use. The use of calibrated pipettes and appropriate internal QC samples is recommended. When using automated assay systems, sample dilutors and other automated equipment, follow the manufacturer s instructions carefully. Particular attention should be given to the setup of the equipment and installation and connection to external services. All settings for automatic washers and readers must be followed carefully and equipment must be maintained and serviced according to the manufacturer s instructions. 4.3 STORAGE AND STABILITY The kit should be stored at 2-8 C and should not be frozen. Inappropriate storage temperatures will affect the results. Wash buffer diluted into a clean container can be stored at 2-8 C for a maximum of 4 weeks. The expiry date of the kit is shown on the outer label. 5 SAMPLE COLLECTION AND STORAGE Blood samples should be collected by venepuncture allowed to clot naturally and the serum separated. The serum may be stored at 2-8 C for up to 48 hours prior to assay, or for prolonged storage kept undiluted at -20 C or below. Repeated thawing and freezing should be avoided. Serum samples should not be heat-inactivated, as this may give false positive results. 6 MATERIALS 6.1 MATERIALS SUPPLIED Instruction Leaflet: Giving full assay details QC Certificate: Indicating the expected performance of the batch Haemophilus B Coated Wells: 12 break-apart 8 well strips coated with Hib antigen. Each plate is packaged in a re-sealable foil bag containing two desiccant pouches Type III Sample Diluent: 2 bottles containing 50mL of buffer for sample dilution. Coloured yellow, ready to use Type III Wash Buffer: 1 bottle containing 50mL of a 20-fold concentrated buffer for washing the wells Haemophilus B Calibrator: 5 bottles each containing 1.2mL of diluted human serum, with the following concentrations of anti-hib antibody: 9, 3, 1, 0.33, 0.11mg/L. Ready to use Haemophilus B High Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use Haemophilus B Low Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use Haemophilus B Conjugate: 1 bottle containing 12mL of purified peroxidase labelled antibody to human IgG. Coloured red, ready to use TMB Substrate: 1 bottle containing 14mL of TMB substrate. Ready to use Stop Solution: 1 bottle containing 14mL of 3M phosphoric acid. Ready to use. 6.2 ADDITIONAL MATERIALS AND EQUIPMENT - not supplied Automatic microplate plate washer: This is recommended, however, plate washing can be performed manually Plate reader: Capable of measuring optical densities at 450nm referenced on air Distilled or deionised water: This should be of the highest quality available Calibrated micropipettes: for dispensing 1000, 100 & 10μL Multichannel pipette: Recommended for dispensing 100μL volumes of conjugate, substrate and stop solution Glass/plastic tubes: For sample dilution 7 ASSAY METHOD 7.1 PRE-ASSAY STEPS 1. Bring the kit to room temperature The kit is designed for room temperature operation (20-24 C). Remove the kit from storage and stand at room temperature for approximately 60 minutes. Wells must not be removed from the foil bag until they have reached room temperature. Note: The kits may be maintained at room temperature for up to 1 week. 2. Kit components Gently mix each kit component before use. 3. Wash buffer dilution Add 50mL of the wash buffer concentrate to 950mL of distilled water (1 in 20 dilution) into a clean container and mix. Smaller volumes can be diluted as appropriate. Note: Diluted wash buffer can be stored at 2-8 C for up to 4 weeks, therefore only dilute the appropriate amount. If the buffer shows any sign of microbial contamination or turns cloudy, discard and prepare a fresh solution. 4. Sample dilution Dilute 10μL of each sample with 1000μL of sample diluent (1:100) and mix well. Smaller volumes can be diluted as appropriate. Note: Diluted sample must be used within 8 hours. 5. Strip and frame handling Place the required number of wells in the strip holder. Position from well A1, filling columns from left to right across the plate. When handling the plate, squeeze the long edges of the frame to prevent the wells falling out. Note: Return unused wells to the foil bag immediately with the two desiccant pouches and re-seal tightly to minimise exposure to moisture. Take care not to puncture or tear the foil bag, see below. WARNING: Exposure of wells to moisture or contamination by dust or other particulate matter will result in antigen degradation, leading to poor assay precision and potentially false results. 7.2 ASSAY METHOD Maintain the same dispensing sequence throughout the assay. 1. Sample addition Dispense 100μL of each calibrator, control and diluted (1:100) sample into the appropriate wells of the plate provided. Note: Samples should be added as quickly as possible to the plate to minimise assay drift, and the timer started after the addition of the last sample. Incubate at room temperature for 30 minutes. 2. Washing The washing procedure is critical and requires special attention. An improperly washed plate will give inaccurate results, with poor precision and high backgrounds. After incubation remove the plate and wash wells 3 times with μL wash buffer per well. Wash the plate either by using an automatic plate washer or manually as indicated below. After the final automated wash, invert the plate and tap the wells dry on absorbent paper. Plates can be washed manually as follows: a. Flick out the contents of the plate into a sink. b. Tap the wells dry on absorbent paper. c. Fill each well with μL of wash buffer using a multichannel pipette. d. Gently shake the plate on a flat surface. e. Repeat a-d twice. f. Repeat a. and b. 3. Conjugate addition Dispense 100μL of conjugate into each well, blot the top of the wells with a tissue to remove any splashes. Note: To avoid contamination, never return excess conjugate to the reagent bottle. Incubate at room temperature for 30 minutes. 4. Washing Repeat step Substrate (TMB) addition Dispense 100μL of TMB substrate into each well, blot the top of the wells with a tissue to remove any splashes. Note: To avoid contamination never return excess TMB to the reagent bottle. Incubate at room temperature in the dark for 30 minutes. 6. Stopping Dispense 100 μl of stop solution into each well. This causes a change in colour from blue to yellow. 7. Optical density measurement Read the optical density (OD) of each well at 450nm on a microplate reader, within 30 minutes of stopping the reaction. 8 RESULTS AND QUALITY CONTROL 1. Quality control In order for an assay to be valid, all the following criteria must be met: Calibrators and controls must be included in each run. The values obtained for the controls should be in the ranges specified on the QC Certificate. The curve shape should be similar to the calibration curve, shown on the QC Certificate. If the above criteria are not met, the assay is invalid and the test should be repeated. 2. Calculate mean optical densities For each calibrator, control and sample calculate the mean OD of the duplicate readings. The percentage coefficient of variation (%CV) for each duplicate OD should be less than 15%. 3. Plot calibration curve The calibration curve can be plotted either automatically or manually as follows by plotting the anti-hib IgG antibody concentration on the log scale against the OD on the linear scale for each calibrator:- Automatic - use appropriately validated software, and the curve fit that best fits the data. Manual - using log/linear graph paper, draw a smooth curve through the points (not a straight line or point to point). 4. Treatment of anomalous points If any one point does not lie on the curve, it can be removed. If the absence of this point means that the curve has a shape dissimilar to that of the sample calibration curve, or more than one point appears to be anomalous, then the assay should be repeated. 5. Calculation of the control values Read the level of the anti-hib IgG antibody in the controls directly from the calibration curve. The values should fall within the ranges given on the QC Certificate. 6. Calculation of antibody levels in diluted samples Read the level of the anti-hib IgG antibody in the diluted samples directly from the calibration curve. Note: The calibrator values have been adjusted by a factor of 100 to account for a 1:100 sample dilution. No further correction is required. Insert Code E016, Version: 28 th October 2010, Page 2 of 12

3 Number of Samples 7. Assay calibration The assay is calibrated against the standard from the Centre for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration: Lot Limitations This kit is used to aid diagnosis only. A positive result must be confirmed by clinical findings and other serological tests. The results obtained from this assay are not diagnostic proof of disease. Each laboratory must establish its own paediatric / adult protective normal ranges. 9 PROTECTIVE LEVELS As a guide, an anti-hib antibody concentration of 0.15mg/L is generally accepted as the minimum level required for protection, at a given time, however it does not confer long term protection. On this basis, a study from Finland suggested that the optimum protective level is 1.0mg/L post immunisation 4. Note: As the immune response to the Hib vaccine is age related 1,6, paediatric protective levels should be established by each laboratory. 10 PERFORMANCE CHARACTERISTICS 10.1 PRECISION The intra-assay precision was measured using 20 replicates of six samples within the range of the calibration curve. The mean and % C.V. for each sample are given below: INTRA-ASSAY PRECISION n=20 Concentration (mg/l) % C.V. Sample Sample Sample Sample Sample Sample The inter-assay precision was measured using six samples tested in duplicate six times over three days. The mean and % CV for each sample are given below: INTER-ASSAY PRECISION n=6 Concentration (mg/l) % C.V. Sample Sample Sample Sample Sample Sample ANALYTICAL SENSITIVITY Assay sensitivity of 0.11mg/L was confirmed by assaying two samples in multiple replicates with values 1.2 and 2.0 times the lowest calibrator point (0.11mg/L). Statistical analysis by the Student s t test, confirmed that these samples were significantly different from each other (p<0.0001) MEASURING RANGE The measuring range of the assay is mg/L. Note: The accuracy of the curve is limited by the sensitivity/precision below 0.33mg/L TYPICAL VALUES Anti-Hib IgG antibody levels were measured in serum from 100 normal adult blood donors (of unknown vaccination and immune status). The results displayed below, are provided for illustration only, and should not be used to calculate a normal range. 11 REFERENCES 1. Cochi S C and Broome C V. et al. Vaccine prevention of Haemophilus influenzae type b disease: past, present and future. Pediatric Infectious Disease. 1986; 5 (1): Murphy T V. et al. Prospective Surveillance of Haemophilus influenzae Type b Disease in Dallas County, Texas, and in Minnesota. Pediatrics. 1978; 79(2): Granoff D M. and Squires J E. Hemophilus Meningitis: New Developments in Epidemiology, Treatment and Prophylaxis. Seminars in Neurology. 1982; 2(2): Peltola H. et al. Prevention of Haemophilus Influenzae type B bacteremic infections with the capsular polysaccharide vaccine. New England Journal of Medicine. 1984; 310: Robbins J B. et al. Quantitative measurement of Natural and Immunizationinduced Haemophilus influenzae type b Capsular Polysaccharide Antibodies. Pediatric Research. 1973; 7: Hazelwood M. et al. The acquisition of anti-pneumococcal capsular polysaccharide Haemophilus influenzae type b and tetanus toxoid antibodies, with age, in the UK. Clin Exp Immunol. 1993; 93: Phipps D C. et al. An ELISA employing a Haemophilus influenzae type b oligosaccharide-human serum albumin conjugate correlates with the radioantigen binding assay. J Immunol Methods. 1990; 135: Madore DV et al. Interlaboratory Study Evaluating Quantitation of Antibodies to Haemophilus influenzae Type b Polysaccharide by Enzyme-Linked Immunosorbant Assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1996; 3(1): Barra A. et al. Measurement of anti-haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide antibodies by ELISA. J Immunol Methods. 1988; 115: Berger M. Immunoglobulin G subclass determination in diagnosis and management of antibody deficiency syndromes. The Journal of Pediatrics, 1987:2: Schauer U. et al. Levels of antibody specific to Tetanus toxoid, Haemophilus influenzae type b and Pneumococcal Capsular Polysaccharide in healthy children and adults. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Mar 2003: < >9 Anti-HIB mg/l Normal ranges have been established using the Binding Site Hib kit (MK016). See reference ASSAY LINEARITY Linearity was tested across the calibration range using 3 test samples, the regression co-efficient R 2 was greater than when comparing the actual to the expected values in mg/l, with the mean recovery of 80.8% PROZONE STUDIES No prozone was observed when serial dilutions of three samples containing 28.6, 50.4 and 74.7 mg/l of anti-hib IgG antibody were assayed INTERFERING SUBSTANCES Various serum types were assayed to test the possible effect of interfering substances using an Interference Check A plus kit (Kokusai, Japan). Substance Bilirubin F (Free) Bilirubin C (Conjugate) Haemolysed Haemoglobin Chyle Rheumatoid Factor Concentration 19.1mg/dL 19.6mg/dL 484mg/dL 2130 Units IU/mL No interference was observed with free or conjugated bilirubin, haemoglobin, lipid or rheumatoid factor. Insert Code E016, Version: 28 th October 2010, Page 3 of 12

4 INHALT 1 Verwendungszweck 2 Einführung 3 Testprinzip 4 Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 5 Probenentnahme und vorbereitung 6 Materialien 7 Testdurchführung Seite VaccZyme Anti-Haemophilus influenzae Typ b (Human) Enzym-Immunoassay-Kit Zur in-vitro Diagnostik Bestell-Nr.: MK016 Hergestellt von: The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK. Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A D Schwetzingen, Deutschland Telefon: +49 (0) Fax: +49 (0) office@bindingsite.de VaccZyme ist ein Warenzeichen von The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK 8 Ergebnisse und Qualitätskontrolle 9 Schutzgrenze 10 Leistungsdaten 11 Referenzen 1 VERWENDUNGSZWECK Dieser Kit dient zum in-vitro-nachweis von spezifischen IgG Antikörpern gegen Haemophilus influenzae Typ b (Hib) Kapsel-Polysaccharid in humanem Serum. Der Kit enthält ausreichend Material, um maximal 41 Proben in Doppelbestimmung sowie eine Kalibrationskurve und 2 Kontrollen zu messen. 2 EINFÜHRUNG Haemophilus influenzae Typ b (Hib) ist ein kapselbildendes gram-negatives Bakterium, welches Meningitis, Septikämie, Cellulitis, Epiglottitis, Pneumonie und septische Arthritis auslösen kann. 1 Hib-Infektionen kommen am häufigsten bei Kindern unter fünf Jahren vor, wobei sie die häufigste Ursache für bakterielle Meningitis sind. 1-3 Serum-Antikörper gegen das Hib-Kapsel-Polysaccharid schützen gegen diesen Organismus in vivo; die schützende Antikörperkonzentration wurde durch einen "radio antigen binding assay" (RABA) in nicht-geimpften und geimpften Individuen ermittelt. 4-6 Die Messung von Antikörpern gegen Hib-Kapsel-Polysaccharid durch "Enzyme Immunoassay" (ELISA) korreliert mit RABA 7-8 und ermöglicht die selektive Quantifizierung des IgG-Isotyps. Dies ist wichtig, da der schützende Antikörper überwiegend zur Immunglobulin G (IgG) Klasse gehört. Allerdings findet man bei einigen Seren, die im RABA einen hohen Titer aufweisen, im ELISA überwiegend IgM- und IgA-Antikörper. 9 Patienten mit rezidivierenden bakteriellen Infektionen sollten auf das Vorliegen eines Immundefekts, und auf die Fähigkeit, auf spezifische Polysaccharid-Antigene zu reagieren, untersucht werden (Übersicht 10 ). Die spezifische Antikörper-Reaktion eines Patienten kann durch die serologische Bestimmung der IgG-Anti-Hib- Antikörper vor und nach der Impfung mit diesem quantitativen Enzym-Immunoassay ermittelt werden. 3 TESTPRINZIP Die Wells (Vertiefungen) der Mikrotiterplatten sind mit dem Hib-Kapsel- Polysaccharid-Antigen, das an Albumin gekoppelt wurde, beschichtet. Die Kalibratoren, Kontrollen und zu testende Proben werden in den Wells inkubiert, so dass die Anti-Hib-Antikörper während der ersten Inkubation an das immobilisierte Antigen binden können. Nach dem Waschen der Wells - zum Entfernen des ungebundenen Proteins - gibt man das mit Peroxidase markierte Kaninchen Anti- Human-IgG-Konjugat (spezifisch für die -Kette) hinzu. Nach einer weiteren Inkubation und einem weiteren Waschvorgang - um das ungebundene Konjugat zu entfernen - wird das gebundene Konjugat mit Hilfe von 3,3',5,5' - Tetramethylbenzidin (TMB) sichtbar gemacht. TMB ergibt ein blaues Reaktionsprodukt, dessen Intensität proportional zur Antikörper-Konzentration der Probe ist. Phosphorsäure wird in jedes Well pipettiert, um die Reaktion zu stoppen. Das daraus resultierende gelbe Reaktionsprodukt wird bei 450 nm gemessen. 4 WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN 4.1 WARNUNGEN Jede Einzelspende von humanem Serum wurde untersucht und bezüglich Antikörper gegen das Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), das Hepatitis-C- Virus und gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) als negativ befunden. Die hierfür verwendeten Tests sind entweder von der FDA (USA) zugelassen oder für den Gebrauch in der in vitro Diagnostik in der EU freigegeben (Directive 98/79/EC, Annex II). Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Auschluss dieser und anderer Infektionsträger. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen (inklusive dem Tragen entsprechender Schutzkleidung). Der Test sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Dieses Produkt enthält Natriumazid und ProClin 300 und muss mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. Das Tragen von Handschuhen und anderer Schutzkleidung wird während des Umgangs mit diesem Produkt empfohlen. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut (v.a. bei Verletzungen) oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann mit Bleioder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser, nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden. Alle Puffer und Seren im Kit enthalten die unten aufgelisteten Enzym-Inhibitoren als Konservierungsmittel. Diese Substanzen sind als Gefahrstoffe anzusehen und müssen mit Vorsicht gehandhabt werden. Insert Code E016, Version: 28 th October 2010, Page 4 of 12

5 INHIBITOR Kathon Natriumazid ProClin 300 Bromonitrodioxan Methylisothiazon KONZENTRATION 0,02% 0,099% 0,045% 0,002% 0,002% ProClin ist ein Warenzeichen der Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA Kathon wirkt reizend und kann bei Hautkontakt zu einer Sensibilisierung führen. Die Stopp-Lösung enthält 3M Phosphorsäure, die Reizungen auslösen kann. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. Verschüttete Reagenzien entsprechend beseitigen, dabei sind ökologische und gesetzliche Bestimmungen zu beachten. 4.2 VORSICHTSMASSNAHMEN Dieser Test sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt werden. Testdurchführung strikt nach Arbeitsanleitung. Jegliche Abweichung kann die Testqualität und Ergebnisse beeinflussen. Beachten Sie die spezifischen Hinweise' und Warnungen in dieser Arbeitsanleitung. Reagenzien unterschiedlicher Chargen dürfen NICHT untereinander gemischt oder gemeinsam verwendet werden. Bei großem Testdurchsatz muss darauf geachtet werden, dass alle Reagenzien der GLEICHEN Charge entstammen. Alle Mikrotiterstreifen müssen aus demselben Folienbeutel entnommen werden. Der Austausch einer Testkomponente kann inkorrekte Ergebnisse zur Folge haben. Zur Vermeidung von Kontaminationen der Reagenzien immer saubere Plastik- oder Glasgefäße verwenden. Niemals unbenutztes Reagenz in die Flaschen zurückgeben. Reagenzienflaschen nicht für längere Zeit offen stehenlassen. Die daraus resultierende Verdunstung oder Verunreinigung führt zu widersprüchlichen Ergebnissen. TMB darf weder mit Licht noch mit Wasser in Berührung kommen. Die Verwendung mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigter, hämolytischer oder lipämischer Seren vermeiden. Falsche Probenverdünnungen können nicht erkannt werden, da die Kit-Kontrollen gebrauchsfertig sind. Es wird empfohlen, kalibrierte Pipetten und geeignete interne Kontrollen zu verwenden. Bei der Verwendung von automatisierten Testsystemen, Probenverdünnern und anderem automatisierten Zubehör, sind die Anweisungen des Herstellers sorgfältig zu befolgen. Besondere Sorgfalt gilt der Aufstellung und Installation der Geräte und der Verbindung zu externen Systemen. Alle Einstellungen, die die automatisierten Wasch- und Lesegeräte betreffen, müssen sorgsam befolgt werden. Die Geräte müssen den Herstellerangaben entsprechend instand gehalten und gewartet werden. 4.3 LAGERUNG UND STABILITÄT Den Kit bei 2-8 C lagern, nicht einfrieren. Lagerung bei falscher Temperatur beeinflusst die Ergebnisse. Der verdünnte Waschpuffer ist in einem sauberen Gefäß bei 2-8 C bis maximal 4 Wochen haltbar. Die Haltbarkeit des Kits wird auf dem Außenetikett angegeben. 5 PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen lassen. Serum vom Gerinnsel trennen. Die Seren können bei 2-8 C bis zu 48 Stunden vor dem Test gelagert werden. Für eine längere Lagerung wird empfohlen, die Seren unverdünnt bei mindestens -20 C einzufrieren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden. Serumproben nicht hitzeinaktivieren, dies kann zu falsch-positiven Ergebnissen führen. 6 MATERIALIEN 6.1 GELIEFERTE MATERIALIEN Arbeitsanleitung: mit genauen Angaben zur Testdurchführung QC-Zertifikat: mit Angaben zu Kontroll-Sollwerten, ideale Kalibrationskurve Haemophilus B Coated Wells (Haemophilus B Antigen beschichtete Mikrotiterstreifen): 12 Mikrotiterstreifen mit 8 vereinzelbaren Wells, die mit Hib-Antigen beschichtet sind. Sie sind in einem wiederverschließbaren Folienbeutel, der ein Trockenmittel enthält, verpackt Type III Sample Diluent (Probendiluens TypIII): 2 Flaschen mit je 50mL gebrauchsfertigem Puffer zur Probenverdünnung. Farbcodierung: gelb Type III Wash Buffer (Waschpuffer Typ III): 1 Flasche mit 50mL eines 20- fach konzentrierten Puffers zum Waschen der Wells Haemophilus B Calibrator (Haemophilus B Kalibratoren): 5 Flaschen mit je 1,2mL gebrauchsfertig verdünntem Humanserum der folgenden Konzentrationen an Anti-Haemophilus B-Antikörper enthält: 9; 3; 1; 0,33; 0,11mg/L Haemophilus B High Control (Haemophilus B Hohe Kontrolle): 1 Flasche mit 1,2mL verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC- Zertifikat angegeben. Gebrauchsfertig Haemophilus B Low Control (Haemophilus B Niedrige Kontrolle): 1 Flasche mit 1,2mL verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben. Gebrauchsfertig Haemophilus B Conjugate (Haemophilus B-Konjugat): 1 Flasche mit 12mL gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Human-IgG. Farbcodierung:rot. Gebrauchsfertig TMB Substrate (TMB-Substrat): 1 Flasche mit 14mL TMB-Lösung. Gebrauchsfertig Stop Solution (Stopp-Lösung): 1 Flasche mit 14mL 3M Phosphorsäure. Gebrauchsfertig. 6.2 Benötigte, nicht im Kit enthaltene Materialien 7 TESTDURCHFÜHRUNG 7.1 TESTVORBEREITUNG 1. Kit auf Raumtemperatur erwärmen Die optimale Temperatur für die Testdurchführung liegt bei C. Den Kit nach Entnahme aus dem Kühlschrank ca. 60 Minuten bei Raumtemperatur erwärmen lassen. Die Wells bis zum tatsächlichen Gebrauch in der Folie belassen! Hinweis: Der Kit kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert werden. 2. Kit-Komponenten Jede Kit-Komponente vor Gebrauch kurz schütteln. 3. Waschpuffer verdünnen Dazu 50mL Waschpuffer-Konzentrat und 950mL destilliertes Wasser (1/20- Verdünnung) in ein sauberes Gefäß geben und mischen. Bei Bedarf können auch kleinere Mengen verdünnt werden. Hinweis: Der verdünnte Puffer ist bei 2-8 C bis zu 4 Wochen haltbar; deshalb nur die benötigte Menge verdünnen. Den Waschpuffer verwerfen, falls er Anzeichen für eine mikrobielle Kontamination zeigt oder trübe wird. In diesem Fall eine frische Verdünnung herstellen. 4. Verdünnung der Proben 10μL jeder Probe mit 1000μL Probendiluens verdünnen (1:100) und gut mischen. Hinweis: Die verdünnten Proben müssen innerhalb von 8 h gemessen werden. 5. Umgang mit Streifen und Rahmen Die benötigte Anzahl Wells aus dem Folienbeutel entnehmen und in den Rahmen setzen. Dabei von Position A1 ausgehend die Spalten von links nach rechts auffüllen. Achten Sie darauf, die langen Seiten des Rahmens zusammenzudrücken, damit die Wells nicht herausfallen können. Hinweis: Um die Kontaktzeit mit der Luftfeuchtigkeit zu minimieren, die nicht verwendeten Wells sofort in den wiederverschließbaren Folienbeutel mit dem Trockenmittel geben und gut verschließen. Darauf achten, dass der Folienbeutel nicht beschädigt wird. ACHTUNG: Kontakt mit Feuchtigkeit oder Verunreinigung durch Staub oder andere Partikel kann einen Antigen-Abbau verursachen. Daraus resultiert eine schlechte Präzision und potentiell falsche Ergebnisse. 7.2 TESTDURCHFÜHRUNG Alle Reagenzien in der gleichen Reihenfolge pipettieren. 1. Pipettieren der Kontrollen, Kalibratoren und Proben und Inkubation 100μL von jedem Kalibrator, jeder Kontrolle und jeder verdünnten (1:100) Probe in das dafür laut Plattenschema vorgesehene Well pipettieren. Hinweis: Die Proben müssen so schnell wie möglich pipettiert werden, um eine Drift des Assays zu minimieren. Die Inkubationszeit läuft ab Zugabe der letzten Probe. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 2. Waschen der Platte Sorgfältiges Waschen der Wells ist wichtig für eine hohe Präzision und genaue Testergebnisse. Bei nicht korrekt gewaschenen Wells können ungenaue Ergebnisse mit schlechter Präzision und hohem Hintergrund auftreten. Nach der Inkubation die Wells dreimal mit μL Waschpuffer waschen. Das Waschen kann mit einem automatischen Platten-Waschgerät oder manuell erfolgen. Nach dem letzten Waschschritt die Wells durch leichtes Klopfen auf eine absorbierende Unterlage (z.b. Papiertücher) trocknen. Manuelles Waschen: a. Den Inhalt der Wells in den Ausguss schütten, dabei die langen Seiten des Rahmens zusammendrücken. b. Die Wells auf einer absorbierenden Unterlage (z.b. Papiertücher) leicht ausklopfen. c µL Waschpuffer in der Arbeitskonzentration in die Wells pipettieren. d. Die Mikrotiterplatte auf einer flachen Unterlage stehend leicht schütteln. e. Zweimaliges Wiederholen der Schritte a bis d. f. Die Wells wie unter a und b entleeren. 3. Pipettieren des Konjugats und Inkubation 100μL Konjugat in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen,um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges Konjugat in die Konjugat-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 4. Waschen der Platte Siehe Abschnitt Pipettieren von Substrat (TMB) Nach dem Waschen 100μL TMB in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges TMB in die TMB-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. 6. Reaktionsende 100μL Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Die Farbe schlägt von blau nach gelb um. 7. Farbmessung Die optische Dichte (OD) bei 450nm in jedem Well mit einem Mikrotiterplatten- Reader innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopp-Lösung bestimmen Automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät: ist empfehlenswert, aber die Platten können auch manuell gewaschen werden Mikrotiterplatten-Reader: Messung der optischen Dichte in den Wells bei 450nm Destilliertes Wasser: Es sollte von höchster Qualität und frei von Metallionen sein Kalibrierte Mikropipetten: Zum Pipettieren von 1000, 100 & 10μL Mehrkanal-Pipette: Zum Pipettieren von Volumina von 100mL von Konjugat, TMB-Substrat und Stopp-Lösung Glas- oder Plastikgefäße: Zur Probenverdünnung. Insert Code E016, Version: 28 th October 2010, Page 5 of 12 8 ERGEBNISSE UND QUALITÄTSKONTROLLE 1. Qualitätskontrolle Nur, wenn alle nachfolgend aufgeführten Kriterien erfüllt sind, ist der Test gültig. Ist dies nicht der Fall, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden. Kalibratoren und Kontrollen müssen bei jedem Testansatz mitgeführt werden. Das Ergebnis der Kontrollen muss in dem angegebenen Wertebereich (siehe QC-Zertifikat) liegen. Die berechnete Kalibrationskurve sollte der auf dem QC-Zertifikat abgebildeten Kalibrationskurve ähnlich sein.

6 Anzahl 2. Berechnung der mittleren optischen Dichte Für jeden Kalibrator und jede Kontrolle und Probe die mittlere optischen Dichte (OD) der Doppelbestimmungen berechnen. Der Variationskoeffizient (%VK) der Doppelbestimmungen sollte jeweils unter 15% liegen. 3. Erstellen der Kalibrationskurve Die Kalibrationskurve kann entweder automatisch oder manuell erstellt werden. Dazu wird die Anti-Hib-Antikörper-Konzentration auf der logarithmischen Skala gegen die OD-Werte auf der linearen Skala für jeden Kalibrator aufgetragen. Automatisch: Geeignete, validierte Software verwenden. Kalkulationsmodus verwenden, der am besten zu den Daten passt. Manuell: Halblogarithmisches Millimeterpapier verwenden, eine Ausgleichskurve durch die Punkte legen (keine Gerade oder Punkt-zu-Punkt-Verbindung). 4. Umgang mit abweichenden Kalibrationspunkten Liegt ein Messpunkt nicht auf der Kalibrationskurve, so kann er weggelassen werden. Der Test sollte wiederholt werden, wenn die daraus resultierende Kalibrationskurve deutlich von der im QC-Zertifikat angegebenen Kurvenform abweicht oder, wenn mehrere Kalibrationspunkte zu starke Abweichungen aufweisen. 5. Berechnung der Antikörper-Konzentrationen in den Kontrollen Die Anti-Hib-Antikörper-Konzentrationen der Kontrollen können direkt aus der Kalibrationskurve abgelesen werden. Die Kontrollwerte müssen in den im QC- Zertifikat angegebenen Bereich fallen. 6. Berechnung der Antikörperkonzentrationen in den Proben Die Anti-Hib-Antikörper-Konzentrationen der Proben können direkt aus der Kalibrationskurve abgelesen werden. Hinweis: Die Standardprobenverdünnung von 1:100 ist in der Kalibrationskurve bereits berücksichtigt. Es sind keine weiteren Korrekturen nötig. 7. Kalibration des Tests Der Test ist gegen eine Referenzpräparation des Centre for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, Lot 1983, kalibriert. 8. Grenzen des Tests Dieser Testkit dient nur zur Unterstützung der Diagnose. Ein positives Ergebnis muss durch den klinischen Befund und andere serologische Untersuchungen bestätigt werden. Die Testergebnisse können nicht als diagnostischer Beweis für das Vorliegen bzw. Nichtvorliegen einer Krankheit verwendet werden. Jedes Labor sollte eine eigene Schutzgrenze für Normalwerte bei Kindern bzw. Erwachsenen ermitteln. 9 SCHUTZGRENZE Es ist allgemein akzeptiert, dass eine Anti-Hib-Antikörperkonzentration von mindestens 0,15mg/L benötigt wird, um einen Impfschutz zu haben, der aber nicht als Langzeitschutz ausreicht. Auf dieser Basis schlägt eine finnische Studie vor, dass der optimale Immunschutz bei einer Anti-Hib-Antikörperkonzentration von größer als 1,0mg/L liegt 4. Anmerkung: Da die Immunantwort auf den Hib-Impfstoff altersabhängig 1,6 ist, sollten die pädiatrischen Normalwerte in jedem Labor selbst bestimmt werden. 10 LEISTUNGSDATEN 10.1 PRÄZISION Die Intra-Assay-Präzision wurde mit 6 Proben, deren Konzentrationen innerhalb der Kalibrationskurve liegen, durch jeweils 20-fache Messung bestimmt. Die Variationskoeffizienten (%VK) jeder Probe sind nachfolgend angegeben: INTRA-ASSAY-PRÄZISION n = 20 Mittlere Konzentration (mg/l) % VK Probe 1 0,22 7,1 Probe 2 1,03 3,0 Probe 3 1,18 3,2 Probe 4 1,99 5,8 Probe 5 4,08 6,0 Probe 6 5,46 3,3 Die Inter-Assay-Präzision wurde mit 6 Proben, deren Konzentrationen innerhalb der Kalibrationskurve liegen, durch jeweils 6-fache Doppelbestimmung an drei verschiedenen Tagen bestimmt. Die Variationskoeffizienten (%VK) jeder Probe sind nachfolgend angegeben: INTER-ASSAY-PRÄZISION n = 6 Mittlere Konzentration (mg/l) % VK Probe 1 0,25 12,7 Probe 2 1,04 8,3 Probe 3 1,28 9,2 Probe 4 2,17 9,9 Probe 5 4,26 9,1 Probe 6 5,83 7, < >9 Anti-HIB mg/l Eine Normalverteilung wurde unter Verwendung des Binding Site Kits (MK016) generiert, siehe auch Referenz LINEARITÄT Die Linearität des Tests wurde mithilfe von 3 Serumproben über den gesamten Messbereich überprüft. Beim Vergleich der gemmessenen mit den berechneten Konzentration wurde ein Korrelationskoeffizient R 2 größer als 0,9969 und eine mittlere Wiederfindung von 80,8% gefunden PROZONENEFFEKT Drei Seren, mit Anti-Hib-Antikörperkonzentrationen von 28,6, 50,4 und 74,7mg/L, wurden in einer seriellen Verdünnungsreihe getestet. Es wurde kein Prozoneneffekt festgestellt INTERFERIERENDE SUBSTANZEN Der Kit wurde mit verschiedenen Serumtypen (Interference Check A plus Kit von Kokusai, Japan) auf mögliche Effekte von interferierenden Substanzen getestet. Bilirubin F (Frei) Substanz Bilirubin C (Konjugiert) Hämolysiertes Hämoglobin Chylus Rheumafaktor Konzentration 19,1mg/dL 19,6mg/dL 484mg/dL 2130 Einheiten 113,8 IU/mL Freies und konjugiertes Bilirubin, Hämoglobin, Lipide oder Rheumafaktoren zeigen keinerlei Beeinflussung des Tests. 11 REFERENZEN 1. Cochi S C and Broome C V. et al. Vaccine prevention of Haemophilus influenzae type B disease: past, present and future. Pediatric Infectious Disease. 1986; 5 (1): Murphy T V. et al. Prospective Surveillance of Haemophilus influenzae Type b Disease in Dallas County, Texas, and in Minnesota. Pediatrics. 1978; 79(2): Granoff D M. and Squires J E. Hemophilus Meningitis: New Developments in Epidemiology, Treatment and Prophylaxis. Seminars in Neurology. 1982; 2(2): Peltola H. et al. Prevention of Haemophilus Influenzae type B bacteremic infections with the capsular polysaccharide vaccine. New England Journal of Medicine. 1984; 310: Robbins J B. et al. Quantitative measurement of Natural and Immunizationinduced Haemophilus influenzae type b Capsular Polysaccharide Antibodies. Pediatric Research. 1973; 7: Hazelwood M. et al. The acquisition of anti-pneumococcal capsular polysaccharide Haemophilus influenzae type b and tetanus toxoid antibodies, with age, in the UK. Clin Exp Immunol. 1993; 93: Phipps D C. et al. An ELISA employing a Haemophilus influenzae type b oligosaccharide-human serum albumin conjugate correlates with the radioantigen binding assay. J Immunol Methods. 1990; 135: Madore DV et al. Interlaboratory Study Evaluating Quantitation of Antibodies to Haemophilus influenzae Type b Polysaccharide by Enzyme-Linked Immunosorbant Assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1996; 3(1): Barra A. et al. Measurement of anti-haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide antibodies by ELISA. J Immunol Methods. 1988; 115: Berger M. Immunoglobulin G subclass determination in diagnosis and management of antibody deficiency syndromes. The Journal of Pediatrics, 1987:2: Schauer U. et al. Levels of antibody specific to Tetanus toxoid, Haemophilus influenzae type b and Pneumococcal Capsular Polysaccharide in healthy children and adults. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Mar 2003: ANALYTISCHE SENSITIVITÄT DES TESTS Die Sensitivität des Tests wurde anhand der Mehrfachbestimmung von 2 Proben, deren Konzentration das 1,2- bzw. 2,0-fache des niedrigsten Kalibrators (0,11mg/L) betrug, bestätigt. Die statistische Analyse mit dem Student s t Test zeigt, dass sich diese Proben signifikant voneinander unterscheiden (p<0,0001) MESSBEREICH Der Messbereich dieses Tests liegt zwischen 0,11-9,0mg/L. Anmerkung: Die Genauigkeit der Kalibrationskurve ist durch die Sensitivität/- Präzision unterhalb von 0,33mg/L limitiert TYPISCHE WERTE Von 100 erwachsenen, gesunden Blutspendern wurde die Anti-Hib-IgG- Antikörperkonzentration im Serum gemessen. Die unten aufgeführten Ergebnisse dienen nur zur Orientierung und sollten nicht zur Normalbereichbestimmung verwendet werden. Insert Code E016, Version: 28 th October 2010, Page 6 of 12

7 CONTENU 1 Indications 2 Présentation générale 3 Principe 4 Précautions 5 Echantillons 6 Matériel Page No. Coffret ELISA VaccZyme TM Anti-Haemophilus influenzae de type b Pour un usage en diagnostic in vitro Référence : MK016 Produit fabrique en Angleterre par la société: The Binding Site Group Ltd., PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK Distribués en France par la société : The Binding Site France, 14 rue des Glairaux, BP226, St Egrève Cedex Téléphone : Fax : info@bindingsite.fr VaccZyme est une marque de The Binding Site Group Ltd. UK. 7 Procédure 8 Résultats et contrôle de qualité 9 Taux de protection 10 Performances 11 Bibliographie 1 INDICATIONS Ce test est utilisé pour mesurer in-vitro les anticorps IgG spécifiques dirigés contre le polysaccharide capsulaire Haemophilus influenzae de type b (HIB) présents dans le sérum humain. Ce coffret permet de tester 41 échantillons en double ou 89 échantillons en simple avec une courbe de calibration en 5 points et 2 contrôles. 2 PRESENTATION GENERALE HIB est une bactérie encapsulée à Gram négatif qui peut être en cause dans les pathologies suivantes : méningites, septicémies, abcès, épiglottites, pneumonies et arthrites septiques (référence 1). Les infections à HIB sont communes chez des enfants de moins de 5 ans et sont la cause majeure des méningites bactériennes (références 1 à 3). Les anticorps sériques anti-hib protègent l organisme in vivo et des taux protecteurs ont été établis pour les individus vaccinés et non vaccinés par des tests radioimmunologiques (RABA) (références 4 à 6). Les mesures des anticorps anti-hib en ELISA corrèlent avec les mesures RABA (références 7 et 8), et permettent la quantification sélective de l isotype IgG. Ceci est important car les anticorps protecteurs appartiennent à la classe IgG bien qu occasionnellement, des sérums immuns avec des taux élevés par les mesures RABA contiennent de façon prédominante des anticorps IgM et IgA en ELISA (référence 9). Chez des patients ayant des infections bactériennes répétées, une immunodéficience et par conséquent une incapacité à répondre aux antigènes polysaccharides spécifiques devraient être recherchées (référence 10). Une réponse en anticorps d un patient peut être évaluée par la détermination sérologique du taux d anticorps IgG anti-hib avant et après immunisation en utilisant cette technique ELISA. 3 PRINCIPE DU TEST Les micropuits sont recouverts de l antigène polysaccharide capsulaire HIB conjugué à de l albumine sérique humaine. Les calibrateurs, les contrôles et les échantillons de patients dilués sont ajoutés aux puits. Les anticorps reconnaissant l antigène HIB se lient durant la première incubation. Après le lavage des puits pour enlever toutes les protéines non liées, un conjugué de lapin purifié anti-igg humaines (spécifique de la chaîne ) et marqué à la péroxydase est ajouté. Le conjugué se lie aux anticorps humains capturés et le conjugué non lié est éliminé par une étape de lavage. Le conjugué lié est visualisé avec du substrat 3,3,5,5 tétraméthylbenzidine (TMB) qui donne un produit de réaction bleu. L intensité de celui-ci est proportionnelle à la concentration en anticorps de l échantillon. L acide phosphorique est ajouté dans chaque puits pour arrêter la réaction. Ceci produit une coloration jaune qui est lue à 450 nm. 4 PRECAUTIONS 4.1 ATTENTION Tous les sérums humains fournis dans ce coffret ont été testés et trouvés négatifs pour l antigène de surface de l hépatite B (Ag HBs), pour le virus de l hépatite C et pour les anticorps anti-virus de l immunodéficience humaine (HIV1 and HIV2). Les tests utilisés ont soit été approuvés par la FDA (USA) soit acceptés pour un usage en diagnostic in-vitro par l union européenne (Directive 98/79/EC, Annexe II); néanmoins ces tests ne peuvent garantir l absence d agents infectieux Tous les échantillons doivent donc être manipulés comme des produits potentiellement infectieux. Seul un personnel qualifié dans la manipulation d échantillons potentiellement infectieux est autorisé à utiliser ce coffret. Ce produit contient de l azide de sodium et ProClin 300 et doit être manipulé avec précaution; des gants appropriés et d autres vêtements de protection doivent être portés lors de toutes manipulation. Ne pas ingérer ou avoir de contact avec la peau (spécialement sur les zones abîmées) ou des muqueuses. S il y a contact, laver abondamment avec de l eau et demander un avis médical. Des azides de métaux explosifs peuvent se former par contact prolongé entre de l azide de sodium et les tuyauteries en plomb et cuivre; pour éliminer les réactifs, rincer avec un large volume d eau pour prévenir tout dégât. Les tampons et sérums fournis dans ce coffret contiennent plusieurs inhibiteurs d enzymes listés ci-dessous. Ils sont dangereux et doivent manipulés avec précaution. INHIBITEURS Kathon Azide de sodium ProClin 300 Bromonitrodioxane Methylisothiazone CONCENTRATION 0,02% 0,099% 0,045% 0,002% 0,002% ProClin est une marque déposée par Rohm et Haas Corp. Philadelphie, PA Insert Code E016, Version: 28 th October 2010, Page 7 of 12

8 Le kathon est un irritant et peut induire une sensibilisation en cas de contact avec la peau. La solution stop contient de l acide phosphorique 3M qui est irritant. Eviter tout contact avec la peau et les yeux. Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées de façon appropriée en observant les réglementations locales et environnementales. 4.2 PRECAUTIONS Ces réactifs doivent être utilisés par un personnel entraîné de façon appropriée. Il est recommandé de suivre scrupuleusement le protocole. Toute déviation peut affecter les performances et les résultats obtenus. Faire attention aux Notes spécifiques dans les instructions d utilisation. Les réactifs des coffrets ayant des numéros de lots différents ne sont pas interchangeables. Toutes les barrettes utilisées doivent être issues du même sachet aluminium. Si de grandes séries de tests doivent être réalisées, vérifier que tous les réactifs aient le MÊME numéro de lot. Afin d éviter la contamination des réactifs, utiliser uniquement des récipients en plastique ou en verre neufs ou propres. Ne jamais remettre les réactifs non utilisés dans les flacons d origine. Ne jamais laisser les flacons non bouchés. Une évaporation ou une contamination peut induire des résultats incorrects. Le substrat TMB ne doit pas exposé à la lumière ou à l eau. Les sérums hémolysés, lipidiques ou contaminés par des bactéries ou des particules de matière ne doivent pas être utilisés. Une mauvaise dilution des échantillons ne peut pas être vérifiée car les contrôles sont fournis prêts à l emploi. L utilisation de pipettes calibrées et d échantillons appropriés de contrôles de qualité internes est recommandée. Lorsque vous utilisez des systèmes d analyses automatisés, diluteurs d échantillons et autres équipements automatisés, suivez les instructions du fabricant avec soin. Une attention particulière devra être accordée à l'installation de l'équipement et à la connexion à des services externes. Tous les paramètres pour les laveurs et lecteurs automatisés doivent être suivis attentivement et les équipements doivent être maintenus et entretenus selon les instructions du fabricant. 4.3 STOCKAGE ET STABILITE Le coffret doit être stocké à 2-8 C et ne doit pas être congelé. Des conditions de stockage non appropriées affecteraient les résultats. Le tampon de lavage dilué dans un récipient propre peut être stocké à 2-8 C pendant 4 semaines. La date de péremption du coffret est indiquée sur l étiquette extérieure. 5 ECHANTILLONS Les échantillons de sang doivent être collectés par ponction veineuse. Laisser coaguler naturellement et séparer le sérum. Le sérum peut être stocké 48 heures à 2-8 C avant le test ou pour un stockage prolongé conservé non dilué à -20 C ou à une température inférieure. Les congélations et décongélations répétées doivent être évitées. Les sérums ne doivent pas être inactivés par la chaleur ce qui peut induire des résultats faux-positifs. 6 MATERIEL 6.1 MATERIEL FOURNI Une fiche technique : donnant tous les détails de la technique Un certificat de contrôle de qualité: indiquant les performances attendues du lot Haemophilus B Coated Wells (Puits recouverts d Haemophilus B) : 12 barrettes de 8 puits sécables avec de l antigène HIB. La plaque est emballée dans un sachet réutilisable contenant 2 dessicateurs Type III Sample Diluent (Diluant échantillon de type III) : 2 flacons de 50mL de tampon de dilution des échantillons. Il est coloré en jaune et prêt à l emploi Type III Wash Buffer (Tampon de lavage de type III) : 1 flacon de 50mL de tampon concentré 20 fois pour le lavage des puits Haemophilus B Calibrator (Calibrateurs Haemophilus) : 5 flacons de 1,2mL de sérum humain dilué avec les concentrations suivantes en anticorps anti-hib: 9; 3; 1; 0,33 et 0,11 mg/l. Ils sont prêts à l emploi Haemophilus B High Control (Contrôle haut Haemophilus B) : 1 flacon de 1,2mL de sérum humain dilué. La valeur attendue est donnée sur le certificat de contrôle de qualité. Il est prêt à l emploi Haemophilus B Low Control (Contrôle bas Haemophilus B) : 1 flacon de 1,2mL de sérum humain dilué. La valeur attendue est donnée sur le certificat de contrôle de qualité. Il est prêt à l emploi Haemophilus B Conjugate (Conjugué Haemophilus B) : 1 flacon de 12mL d anticorps purifiés anti-igg humaines et conjugués à la péroxydase. Il est coloré en rouge et est prêt à l emploi TMB Substrate (Substrat TMB) : 1 flacon de 14mL de substrat TMB. Il est prêt à l emploi Stop Solution (Solution d arrêt) : 1 flacon de 14mL d acide phosphorique 3M. Elle est prête à l emploi. 6.2 MATERIEL NECESSAIRE ET NON FOURNI Laveur automatique de microplaques : il est recommandé mais le lavage peut se faire manuellement Lecteur de plaques : capable de mesurer des densités optiques de 450nm en référence à l air Eau distillée ou désionisée : elle doit être de bonne qualité Micropipettes calibrées : pour des dépots de 1000, 100 et 10µL Pipette multicanaux : recommandée pour des dépôts de 100µL de conjugué, de substrat et de solution d arrêt Tubes en plastique ou en verre : pour la dilution des échantillons. 7 PROCEDURE 7.1 ETAPES PREALABLES 1. Ramener le coffret à température ambiante. Le coffret fonctionne à température ambiante (20-24 C).Sortir le coffret du réfrigérateur et le laisser à température ambiante approximativement 60 minutes. Les puits ne doivent pas être sortis de leur emballage avant qu ils ne soient à température ambiante. Note : Les coffrets peuvent être maintenus à température ambiante 1 semaine. 2. Composants du coffret Mélanger doucement chaque composant du coffret avant utilisation. Insert Code E016, Version: 28 th October 2010, Page 8 of Dilution du tampon de lavage Ajouter 50mL de tampon de lavage concentré à 950mL d eau distillée (dilution:1/20) et mélanger. De plus petits volumes peuvent être dilués. Note : le tampon dilué peut être stocké à 2-8 C pendant 4 semaines. Il est recommandé de ne diluer que la quantité nécessaire pour la manipulation. Si le tampon montre des signes de contamination microbienne ou devient trouble, jetezle et repréparez une solution. 4. Dilution des échantillons Diluer 10μL de chaque échantillon avec 1000μL de diluant échantillon (1:100) et mélanger bien. Note : Les échantillons dilués doivent être utilisés dans les 8 heures. 5. Manipulation de la plaque Placer le nombre requis de puits dans le cadre. Remplir les colonnes de gauche à droite à partir du puits A1. Lors de la manipulation de la plaque, maintenir les bords du cadre afin d éviter que les puits ne tombent. Note : Remettre immédiatement les puits non utilisés dans leur emballage afin de minimiser l exposition des puits à l humidité. Faire attention de ne pas percer ou déchirer l emballage. ATTENTION: L exposition des puits à l humidité ou leur contamination par la poussière ou par d autres particules de matière induit une dégradation de l antigène conduisant à une mauvaise précision ou à des résultats faux. 7.2 PROCEDURE Maintenir la même séquence de dépôt tout le long du test. 1. Dépôt de l échantillon Déposer 100μL de chaque calibrateur, contrôle et échantillon dilué (1:100) dans les puits appropriés de la plaque. Note : Les échantillons doivent être déposés sur la plaque aussi rapidement que possible afin de minimiser les écarts, et le chronomètre doit être déclenché après l addition du dernier échantillon. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 2. Lavage La procédure de lavage est importante et requiert une attention spéciale. Un lavage imparfait peut induire de mauvais résultats avec une mauvaise précision et du bruit de fond. Après incubation, laver 3 fois les puits avec 250 à 350μL de tampon de lavage par puits. Laver la plaque avec un laveur automatique de plaque ou manuellement comme indiqué ci-dessous. Après le lavage final automatique, retourner la plaque et taper les puits sur du papier absorbant. Les plaques peuvent être lavées manuellement comme suit : a. Renverser le contenu de la plaque dans un récipient. b. Taper les puits sur du papier absorbant. c. Remplir chaque puits avec 250 à 350μL de tampon de lavage en utilisant une pipette multi-canaux. d. Agiter doucement la plaque sur une surface plate. e. Répéter les étapes a à d 2 fois. f. Répéter a et b. 3. Addition du conjugué Déposer 100μL de conjugué par puits, nettoyer le haut des puits avec un tissu pour enlever les éclaboussures. Note: Afin d éviter les contaminations, ne jamais remettre le conjugué en excès dans le flacon d origine. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 4. Lavage Répéter l étape Addition du substrat (TMB) Déposer 100μL de substrat TMB dans chaque puits, nettoyer le haut des puits avec un tissu pour enlever les éclaboussures. Note: Afin d éviter les contaminations, ne jamais remettre l excés de TMB dans le flacon d origine. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes à l obscurité. 6. Arrêt Déposer 100μL de solution d arrêt dans chaque puits. Ceci induit un changement de couleur du bleu au jaune. 7. Mesure de la densité optique Lire la densité optique (DO) de chaque puits à 450nm à l aide d un lecteur de microplaques dans les 30 minutes suivant l arrêt de la réaction. 8 RESULTATS ET CONTROLE DE QUALITE 1. Contrôle de qualité Pour valider le test, tous les critères suivants doivent être respectés : Les calibrateurs et les contrôles doivent être inclus dans chaque série de tests. Les valeurs obtenues pour les contrôles doivent être dans les gammes spécifiées dans le certificat de contrôle de qualité. La forme de la courbe doit être similaire à la courbe de calibration fournie dans le certificat de contrôle qualité. Si les critères ci-dessus ne sont pas respectés, le test est invalide et doit être répété. 2. Calculer les densités optiques moyennes (pour des tests réalisés en double) Pour chaque calibrateur, contrôle et échantillon, calculer la moyenne des DO du duplicat. Le coefficient de variation (CV en %) pour chaque duplicat doit être inférieur à 15%. 3. Courbe de calibration La courbe de calibration peut être tracée de façon automatique ou manuellement en appliquant la concentration d anticorps IgG anti-hib sur une échelle logarithmique versus les densités optiques sur une échelle linéaire pour chaque calibrateur. Automatique Utiliser un logiciel validé approprié et une courbe qui suit les données. Manuelle Utiliser du papier graphique log/lineaire, tracer une courbe qui passe par les points (pas une droite ni une courbe point à point).

9 Nombre d'echantillons 4. Traitement des points anormaux Si un point ne passe pas par la courbe, il peut être enlevé. Si en l absence de ce point, la forme de la courbe est différente de celle du certificat de contrôle de qualité ou si plus d un point apparaît anormal, alors le test doit être répété. 5. Calcul de la valeur du contrôle Lire la concentration d anticorps anti-hib IgG dans les contrôles directement à partir de la courbe de calibration. Les valeurs doivent être dans les gammes données sur le certificat de contrôle de qualité. 6. Calcul du taux d anticorps dans les échantillons dilués Lire le taux d anticorps anti-hib IgG dans les échantillons dilués directement à partir de la courbe de calibration. Note : Les valeurs des calibrateurs ont été ajustées d un facteur de 100 pour tenir compte de la dilution au 1:100 des échantillons. Aucune autre correction n est nécessaire. 7. Calibration du test Le test est calibré par rapport à un standard provenant du Centre d'evaluation et de Recherche Biologiques, Etats-Unis, FDA : Lot Limites Ce coffret peut être utilisé pour aider au diagnostic. Un résultat positif doit être confirmé par la clinique et d autres tests sérologiques. Les résultats obtenus à partir de ce test ne sont pas une preuve diagnostique d une maladie. Chaque laboratoire doit établir ses propres gammes pédiatriques et adultes de protection. 9 TAUX DE PROTECTION A titre indicatif, une concentration en anticorps anti-hib de 0,15mg/L est généralement acceptée comme le taux minimum requis pour une protection, à un temps donné, cependant ce taux ne confert pas une protection à long terme. Sur cette base, une étude finlandaise suggère que le taux optimal de protection est 1,0mg/L après immunisation (réf. 4). Note : Comme la réponse immunitaire au vaccin HIB est dépendante de l âge (réf. 1 et 6), les taux de protection pédiatriques doivent être établis pour chaque laboratoire. 10 PERFORMANCES 10.1 PRECISION La précision intra-essai a été mesurée en utilisant 20 réplicats de 6 échantillons dans la gamme de la courbe de calibration. La moyenne et le coefficient de variation (CV en %) pour chaque échantillon sont donnés ci-dessous : PRECISION INTRA-ESSAI n=20 Concentration (mg/l) C.V. en % Echantillon 1 0,22 7,1 Echantillon 2 1,03 3,0 Echantillon 3 1,18 3,2 Echantillon 4 1,99 5,8 Echantillon 5 4,08 6,0 Echantillon 6 5,46 3,3 La précision inter-essai a été mesurée en utilisant 6 échantillons testés 6 fois en duplicats pendant trois jours. La moyenne et le coefficient de variation (CV en %) pour chaque échantillon sont donnés ci-dessous : PRECISION INTER-ESSAI n=6 Concentration (mg/l) C.V. en % Echantillon 1 0,25 12,7 Echantillon 2 1, Echantillon 3 1, Echantillon 4 2,17 9,9 Echantillon 5 4,26 9,1 Echantillon 6 5,83 7, SENSIBILITE ANALYTIQUE La sensibilité de 0,11mg/L a été confirmée en testant 2 échantillons par de multiples réplicats avec des valeurs de 1,2 et 2,0 fois la valeur du plus petit point de calibration (0,11mg/mL). L analyse statistique par le test de t de Student a confimé que ces échantillons étaient significativement différents l un de l autre (p<0,0001) GAMME DE MESURE La gamme de mesure du test est 0,11 à 9mg/L. Note : La fiabilité de la courbe est limitée par la sensibilité/précision en-dessous de 0,33mg/L VALEURS TYPIQUES Les taux d anticorps IgG anti-hib ont été mesurés dans le sérum de 100 donneurs de sang adultes sains (de vaccination et de statut immunitaire inconnus). Les résultats illustrés ci-dessous ne doivent pas être utilisés pour calculer une gamme normale LINEARITE DE L ANALYSE La linérarité a été testée contre la gamme de calibration en utilisant 3 échantillons tests. Le coefficient de régression R 2 était supérieur à 0,9969 en comparant le réel aux valeurs prévues en mg/l, avec un recoupement moyen de 80,8% ETUDE DE PROZONE Aucun phénomène de prozone n a été observé avec des séries de dilutions de trois échantillons contenant 28,6, 50,4 et 74,7mg/mL d anticorps anti-hib IgG SUBSTANCES INTERFERENTES Différents types de sérums ont été analysés pour tester le possible effet de substances interférentes en utilisant un coffret «Interference check A plus» (Kokusai, Japon). Substance Bilirubine F (libre) Bilirubine C (conjuguée) Hémoglobine hémolysée Chyle Facteur rhumatoïde Concentration 19,1mg/dL 19,6mg/dL 484mg/dL 2130 unités 113,8 UI/mL Aucune interférence n a été observée avec la bilirubine libre ou conjuguée, l hémoglobine, les lipides et le facteur rhumatoïde. 11 REFERENCES 1. Cochi S C and Broome C V. et al. Vaccine prevention of Haemophilus influenzae type b disease: past, present and future. Pediatric Infectious Disease. 1986; 5 (1): Murphy T V. et al. Prospective Surveillance of Haemophilus influenzae Type b Disease in Dallas County, Texas, and in Minnesota. Pediatrics. 1978; 79(2): Granoff D M. and Squires J E. Hemophilus Meningitis: New Developments in Epidemiology, Treatment and Prophylaxis. Seminars in Neurology. 1982; 2(2): Peltola H. et al. Prevention of Haemophilus Influenzae type B bacteremic infections with the capsular polysaccharide vaccine. New England Journal of Medicine. 1984; 310: Robbins J B. et al. Quantitative measurement of Natural and Immunizationinduced Haemophilus influenzae type b Capsular Polysaccharide Antibodies. Pediatric Research. 1973; 7: Hazelwood M. et al. The acquisition of anti-pneumococcal capsular polysaccharide Haemophilus influenzae type b and tetanus toxoid antibodies, with age, in the UK. Clin Exp Immunol. 1993; 93: Phipps D C. et al. An ELISA employing a Haemophilus influenzae type b oligosaccharide-human serum albumin conjugate correlates with the radioantigen binding assay. J Immunol Methods. 1990; 135: Madore DV et al. Interlaboratory Study Evaluating Quantitation of Antibodies to Haemophilus influenzae Type b Polysaccharide by Enzyme-Linked Immunosorbant Assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1996; 3(1): Barra A. et al. Measurement of anti-haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide antibodies by ELISA. J Immunol Methods. 1988; 115: Berger M. Immunoglobulin G subclass determination in diagnosis and management of antibody deficiency syndromes. The Journal of Pediatrics, 1987:2: Schauer U. et al. Levels of antibody specific to Tetanus toxoid, Haemophilus influenzae type b and Pneumococcal Capsular Polysaccharide in healthy children and adults. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Mar 2003: < >9 Anti-HIB mg/l Les valeurs normales ont été établies en utilisant le coffret Binding Site (ref. MK016). Cf. Référence 11. Insert Code E016, Version: 28 th October 2010, Page 9 of 12

10 Contenido 1 Propósito 2 Introducción 3 Principio del método 4 Precauciones 5 Obtención y conservación de las muestras 6 Materiales 7 Metodología Página VaccZyme Anti Haemophilus influenzae humano tipo b Kit EIA Spanish Para uso diagnóstico in-vitro Código producto: MK016 Fabricado por: The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. The Binding Site Spain S.L.U., C/ Balmes 243 4º 3ª, Barcelona Teléfono Fax: info@bindingsite.es web: VaccZyme es una marca de The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK 8 Resultados y control de calidad 9 Nivel de protección 10 Caracteristicas de rendimiento 11 Referencias 1 PROPÓSITO El propósito de este kit es la determinación in-vitro de anticuerpos IgG específicos a Haemophilus influenzae tipo b (Hib) polisacárido capsular, presente en suero humano. El kit contiene suficiente material para realizar máximo 41 tests en duplicado u 89 tests simples junto con una curva de calibración y 2 controles. 2 INTRODUCCIÓN El Hib es una bacteria gram negativa encapsulada que puede provocar: meningitis, septicemia, celulitis, epiglotitis, neumonía y artritis septica 1. Infecciones de Hib son comunes en niños menores de 5 años siendo la principal causa de meningitis bacteriana 1-3. Anticuerpos-suero contra el polisacárido capsular Hib protegen este organismo in vivo; se han podido establecer niveles de anticuerpos protectores por medio de un "radio antigen binding assay" (RABA) en individuos vacunados y no-vacunados 4-6. La cuantificación de anticuerpos contra Hib polisacárido capsular por medio de un test (ELISA) "Enzyme Immunoassay" muestra una correlación con RABA 7-8 y permite una cuantificación selectiva del isótopo IgG. Esto es importante dado que los anticuerpos protectores pertenecen generalmente a la clase de inmunoglobulina G (IgG). Aunque ocasionalmente con ELISA se encuentren, en algunos sueros con un titulo elevado de RABA, mayormente anticuerpos IgM y IgA 9. Pacientes con infecciones recurrentes deberán ser investigados a un posible defecto inmunológico y consecuentemente la incapacidad de responder a los antígenos polisacárido específicos (informe 10 ). La respuesta de reacción a anticuerpos específicos de un paciente deber ser evaluada serologicamente por medio de la cuantificación por ELISA de los niveles de anticuerpos IgG anti-hib antes y después de la vacunación. 3 PRINCIPIO DEL MÉTODO Los micropocillos están impregnados con antígeno Hib polisacárido capsular conjugado a albúmina de suero humano. Los calibradores, controles y muestras de paciente diluidas son aplicados a los pocillos y los anticuerpos reconociendo el antígeno de Hib se fijan en la primera incubación. Tras el lavado de los pocillos para eliminar todas las proteínas no fijadas, se añade IgG purificada de conejo antihumano marcada con peroxidasa. El conjugado se fija al anticuerpo humano capturado y el exceso de conjugado no fijado se elimina mediante un segundo lavado. El conjugado fijado se visualiza con tetrametilobenzidina 3,3, 5,5 (TMB) dando un color azul. La intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpos en la muestra. Para parar la reacción se añade a cada pocillo ácido fosfórico. Esto produce un color amarillo a punto final, legible a 450nm. 4 PRECAUCIONES 4.1 ADVERTENCIA Los sueros humanos suministrados en el kit han sido sometidos a screening para donantes, resultando negativos a la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B y a la presencia de los anticuerpos de la ante los virus HIV1, HIV2 y HCV. Las técnicas usadas están aprobadas por la FDA (USA) o para el diagnóstico in vitro por la UE (Directiva 98/79/EC, Anexo II). Sin embargo los sobredichos ensayos no garantizan la ausencia de agentes infecciosos. Por lo tanto, deben tratarse los reactivos como potencialmente infecciosos. Tanto la manipulación como los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa de materiales infecciosos y solo personal adecuadamente instruido deberá efectuar el test. Los componentes del kit contienen azida sódica y ProClin 300 y debe ser manipulados con precaución; use guantes y vestuario protector adecuado en todo momento al manipular este producto. No trague ni permita el contacto con la piel o las mucosas (especilamente si hay heridas). En caso de contacto, lave con abundante agua y consulte a un médico. Con el plomo y el cobre pueden formarse azidas metálicas explosivas. Cuando se elimine el reactivo, lave con mucha agua los recipientes para evitar la acumulación de azida. Los tampones y sueros suministrados con este kit contienen diferentes inhibidores enzimáticos según sigue. Son productos peligrosos y se deben manipular con precaución Insert Code E016, Version: 28 th October 2010, Page 10 of 12

11 INHIBIDOR Kathon Azida sódica ProClin 300 Bromodinitrodioxano Metilisotiazona CONCENTRACIÓN 0,02% 0,099% 0,045% 0,002% 0,002% ProClin es una marca de Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA Kathon es un producto irritante y puede producir sensibilización en contacto con la piel. La solución de parada contiene ácido fosfórico 3M. Es irritante y debe evitarse el contacto con la piel y ojos. Los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa local de materiales infecciosos. 4.2 ADVERTENCIAS Este producto debe ser utilizado únicamente por personas correctamente entrenadas. Se recomienda seguir el protocolo de forma estricta. Cualquier desviación puede afectar a la funcionalidad de este sensible ensayo. Si como consecuencia se obtienen lecturas de densidades ópticas inferiores, la sensibilidad del ensayo puede quedar comprometida. Ponga especial atención a los avisos y Notas que encontrará en estas instrucciones de uso. NO se pueden intercambiar reactivos de distintos lotes. Si se ha de realizar un elevado número de ensayos, se debe asegurar que todos los reactivos sean del MISMO lote. Deben tomarse todas las tiras del mismo envoltorio. La sustitución de cualquier componente puede conducir a resultados erróneos. Utilice únicamente material plástico o de vidrio limpio. Nunca devuelva reactivos no utilizados a los viales. No deje viales de reactivo abiertos; cualquier posible contaminación o evaporación dará resultados inconsistentes. El sustrato TMB no debe se expuesto a la luz o al agua. Muestras hemolizadas, lipémicas, con material particulado o contaminación microbiana no deben ser utilizadas. No se puede comprobar una posible dilución de muestra incorrecta ya que los controles están listos para su uso. Se recomienda la utilización de pipetas calibradas y muestras CQ internas apropiadas. Al usar sistemas de ensayo automatizados, diluyentes de muestra y otros equipos automáticos, siga con atención las instrucciones del fabricante. Se debe tener especial cuidado con la configuración e instalación del equipo y la conexión a servicios externos. Se deben seguir con atención todos los parámetros de los lectores y de los aclaradores automáticos y seguir las instrucciones del fabricante para el mantenimiento del equipo. 4.3 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD El kit debe conservarse a 2-8ºC y no debe congelarse. Temperaturas de conservación no adecuadas afectarán a los resultados. El tampón de lavado diluido puede almacenarse en un recipiente limpio a 2-8 C por un tiempo máximo de 4 semanas. La fecha de caducidad de este kit se muestra en la etiqueta exterior. 7 METODOLOGÍA 7.1 PASOS PREVIOS 1. Atemperar a temperatura ambiente El kit está diseñado para trabajar a temperatura ambiente (20-24 C). Sacar el kit de su embalaje y dejar a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos. Los pocillos no deben sacarse de su embalaje antes de alcanzar la temperatura ambiente. Nota: Este kit puede mantenerse a temperatura ambiente hasta 1 semana. 2. Componentes del kit Mezclar con cuidado cada componente del kit antes de usar. 3. Dilución tampón de lavado Añadir 50mL del tampón de lavado concentrado a 950mL de agua destilada (dilución 1 en 20) en un contenedor limpio y mezclar. Se pueden diluir volúmenes más pequeños según sea adecuado. Nota: El tampon de lavado diluido debe conservarse a 2-8 C durante un máximo de 4 semanas; diluya, por lo tanto, solamente la cantidad necesaria. Si el tampón muestra indicios de contaminación microbiana o es turbio, descarte y prepare una nueva solución. 4. Dilución de muestra Diluir 10 L de cada muestra con 1000 L de diluyente (1:100) y mezclar bien. Se pueden diluir volúmenes más pequeños según sea adecuado. Nota: Las muestras diluidas tienen que emplearse dentro de 8 horas. 5. Manipulación de las tiras y el marco Colocar el número necesario de pocillos en el contenedor de tiras. Desde la posición del pocillo A1 rellenar las columnas de izquierda a derecha. Mientras se manipula la placa, apretar los cantos largos del marco para evitar que los pocillos se salgan. Nota: Devolver inmediatamente a la bolsa los pocillos no utilizados con los desecantes y cerrar fuertemente con el fin de minimizar la exposición a la humedad. Tener cuidado de no punzar o rasgar la bolsa. ADVERTENCIA: La exposición de los pocillos a la humedad o contaminación por polvo u otras partículas conlleva a una degradación del antígeno llegando a obtener resultados imprecisos y potencialmente falsos. 7.2 METODOLOGÍA Mantener la misma secuencia de dispensación durante todo el test. 1. Adición de la muestra Aplicar 100 L de cada de calibrador, control y muestra diluida (1:100) a los pocillos correspondientes. Nota: Las muestras deben aplicarse lo más rápido posible para minimizar la deriva del análisis, y poner en marcha el cronómetro después de la adición de la última muestra. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. 5 OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS Las muestras de sangre se han de obtener por punción en vena, dejar que coagule de modo natural y separar el suero. El suero puede conservarse a 2-8ºC hasta 48 horas, o a -20ºC sin diluir para periodos superiores. Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. Las muestras de suero no deben ser inactivadas por calor ya que esto puede ocasionar resultados falsos positivos. 6 MATERIALES 6.1 MATERIALES SUMINISTRADOS Hoja de Instrucciones: Detallada Certificado QC: Indicando los resultados esperados del lote Haemophilus B Coated Wells (Pocillos impregnados con Haemophilus B): 12 tiras de 8 pocillos separables impregnados con antígeno Hib. Cada placa está metida en una bolsa reutilizable conteniendo 2 desecantes Type III Sample Diluent (Diluyente muestra tipo III): 2 botellas con 50mL cada una de tampón para diluir las muestras. De color amarillo. Listo para usar Type III Wash Buffer (Tampón de lavado tipo III): 1 botella con 50mL de tampón con una concentración 20 veces para el lavado de los pocillos Haemophilus B Calibrator (Calibrador Haemophilus B): 5 botellas con 1,2mL cada una de suero humano diluido con las siguientes concentraciones de anticuerpo anti-hib: 9; 3; 1; 0,33; 0,11mg/L. Listo para usar Haemophilus B High Control (Control alto Haemophilus B): 1 botella conteniendo 1,2mL de suero humano diluido. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para usar Haemophilus B Low Control (Control bajo Haemophilus B): 1 botella conteniendo 1,2mL de suero humano diluido. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para usar Haemophilus B Conjugate (Conjugado Haemophilus B): 1 botella conteniendo 12mL de anticuerpo purificado marcado con peroxidasa anti IgG humana. De color rojo. Listo para usar TMB Substrate (Substrato TMB): 1 botella conteniendo 14mL de substrato TMB. Listo para usar Stop Solution (Solución de parada): 1 botella conteniendo 14mL de ácido fosfórico 3M. Listo para usar. 6.2 MATERIAL ADICIONAL Y EQUIPO NO SUMINISTRADO Lavador automático de microplacas: Su uso es recomendable, aunque las placas pueden lavarse manualmente Lector de microplacas: Capaz de medir densidades ópticas a 450nm en referencia al aire Agua destilada o desionizada: Ha de ser de la calidad más alta disponible Micropipetas calibradas: Para dispensar 1000, 100 y 10µL Pipeta multicanal: Recomendada para dispensar volúmenes de 100µL de conjugado, solución sustrato y solución de parada Tubos de vidrio/plástico: Para dilución de la muestra. 2. Lavado El proceso de lavado es crítico y requiere una atención especial. Una placa lavada impropiamente conlleva a obtener unos resultados inexactos con escasa precisión y elevados valores de fondo. Tras la incubación sacar la placa y lavar los pocillos 3 veces con L de tampón de lavado por cada pocillo. Lavar la placa con un lavador de placas automático o manualmente según las siguientes indicaciones. Si se realiza el lavado automático, invertir la placa al final del lavado y sacudir los pocillos sobre papel absorbente. Las placas pueden lavarse manualmente según sigue: a. Verter el contenido de placa al fregadero. b. Sacudir los pocillos sobre papel absorbente hasta que se sequen. c. Echar en cada pocillo L de tampón de lavado utilizando una pipeta multicanal. d. Con cuidado agitar la placa sobre una superficie plana. e. Repetir a-d dos veces. f. Repetir a y b. 3. Adición del conjugado Pipetear 100 L de conjugado a cada pocillo, secar la parte superior del pocillo con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras. Nota: Para evitar contaminación, nunca devolver el exceso de conjugado a la botella. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. 4. Lavado Repetir punto Adición del substrato (TMB) Pipetear 100 L de substrato TMB en cada pocillo, secar la parte de arriba de los pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras. Nota: Para evitar contaminación, nunca devolver el exceso de TMB a la botella. Incubar 30 minutos a oscuras y a temperatura ambiente. 6. Parada Pipetear 100 L de la solución de parada en cada pocillo. Esto dará un cambio de color de azul al amarillo. 7. Medición de la densidad óptica Leer la densidad óptica (DO) de cada pocillo a 450nm en un lector de microplacas en los siguientes 30 minutos a la reacción. 8 RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD 1. Control de calidad Para que el test sea válido este debe cumplir con los siguientes criterios: Cada serie debe incluir los controles positivo y negativo. Los valores obtenidos deben estar dentro los rangos especificados en el Certificado QC. La forma de la curva debe ser similar a la curva de calibración indicada en el Certificado QC. Si no se cumpliesen los criterios anteriormente citados, el test no es válido y se debe repetir. Insert Code E016, Version: 28 th October 2010, Page 11 of 12

12 Cantidad de muestras 2. Cálculo de la medias de las densidades ópticas Calcular la media de la DO para cada calibrador, control y muestra. El porcentaje del coeficiente de variación (% CV) para cada DO en duplicado debe ser inferior de 15%. 3. Trazado de la curva de calibración La curva de calibración puede trazarse automática o manualmente según sigue trazando la concentración de anticuerpo anti-hib IgG sobre la escala logarítmica contra la DO de la escala lineal para cada calibrador: Automáticamente Usar un software validado apropiado y la curva será la más idónea a los datos que correspondan. Manualmente Utilizando papel logarítmico dibujar una línea suave a través de los puntos (no una línea recta o punto a punto). 4. Tratamiento de puntos anómalos En caso de que alguno de los puntos esté fuera de la línea, este se puede eliminar. Si la ausencia de este punto significa que la forma de la curva no es similar a la curva de calibración de la muestra o si más de un punto aparece anómalo, el test debe repetirse. 5. Cálculo de los valores de control Leer el nivel de auto anticuerpo anti-hib IgG de la curva de calibración. Los valores deben estar dentro de los rangos indicados en el Certificado QC. 6. Cálculo de los niveles de autoanticuerpos en muestras diluidas Leer el nivel de auto anticuerpo anti-hib IgG de las muestras diluidas directamente de la curva de calibración. Nota: Los valores del calibrador han sido ajustados con un factor 100 considerando una dilución de muestra del 1:100, por lo tanto no se requiere una posterior conversión. 7. Calibración del test El test esta calibrado contra de referencia de Centre for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration: Lot Limitaciones El kit es para el apoyo en el diagnóstico. Un resultado positivo sugiere determinada enfermedad que debe confirmarse con otros análisis serológicos y clínicos. Los resultados obtenidos con este test no es una prueba confirmatoria de presencia o ausencia de la enfermedad. Cada laboratorio deberá establecer sus propios rangos normales protectores de niños y adultos. 9 NIVELES DE PROTECCIÓN Generalmente, una concentración de anticuerpo anti-hib de 0,15mg/L se acepta como nivel mínimo requerido para la protección inmunitaria, de todos modos no proporciona protección a largo plazo. Sobre esta base, estudios hechos en Finlandia sugieren que el nivel óptimo de protección después de inmunización es 1,0mg/L 4. Nota: Puesto que la inmunorespuesta a la vacuna de Hib está relacionada con la edad 1,6, cada laboratorio debería establecer sus propios valores de niveles de protección en pediatría. 10 CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO 10.1 PRECISIÓN La precisión intra-ensayo se ha evaluado ensayando seis muestras en 20 replicados que se encontraban dentro del rango de la curva de calibración. Las concentraciones y el % C.V. de cada muestra se elencan a continuación: PRECISIÓN INTRA-ENSAYO n=20 Concentración (mg/l) % C.V. Muestra 1 0,22 7,1 Muestra 2 1,03 3,0 Muestra 3 1, Muestra 4 1,99 5,8 Muestra 5 4,08 6,0 Muestra 6 5,46 3,3 La precisión inter-ensayo se evaluado utilizando seis muestras ensayadas en duplicado seis veces en tres días. La concentración media y el % C.V. para cada muestra se indica a continuación: PRECISIÓN INTER-ENSAYO n=6 Concentración (mg/l) % C.V. Muestra 1 0,25 12,7 Muestra 2 1,04 8,3 Muestra 3 1,28 9,2 Muestra 4 2,17 9,9 Muestra 5 4,26 9,1 Muestra 6 5,83 7, Los rangos normales han sido establecidos utilizando el kit Hib de Binding Site (MK016). Ver referencia LINEARIDAD DEL ENSAYO La linearidad ha sido evaluada utilizando 3 muestras en el ámbito del rango de calibración; el coeficiente de regresión R 2, derivado por la comparación de los valores realmente obtenidos con los esperados en mg/l, ha sido mayor de 0,9969, con un valor medio de recuperación igual al 80,8% ESTUDIOS PROZONA Ningún efecto prozona ha sido observado ensayando diluciones seriales de 3 muestras con concentraciones de 28,6 50,4 y 74,7mg/L de anticuerpos anti-hib IgG SUSTANCIAS INTERFENTES Varios tipos de sueros han sido ensayados para verificar los eventuales efectos de sustancias interferentes, utilizando el Interference Check A plus kit (Kokusai, Japón). Sustancia Bilirrubina F (libre) Bilirrubina C (conjugada) Hemoglobina hemolizada Quilo Factor reumatoide Concentración 19,1mg/dL 19,6mg/dL 484mg/dL 2130 Unidades 113,8 IU/mL No se señalan interferencias con la bilirrubina libre o conjugada, la hemoglobina, los lípidos o el factor reumatoide. 11 REFERENCIAS 5 0 < >9 Anti-HIB mg/l 1. Cochi S C and Broome C V. et al. Vaccine prevention of Haemophilus influenzae type b disease: past, present and future. Pediatric Infectious Disease. 1986; 5 (1): Murphy T V. et al. Prospective Surveillance of Haemophilus influenzae Type b Disease in Dallas County, Texas, and in Minnesota. Pediatrics. 1978; 79(2): Granoff D M. and Squires J E. Hemophilus Meningitis: New Developments in Epidemiology, Treatment and Prophylaxis. Seminars in Neurology. 1982; 2(2): Peltola H. et al. Prevention of Haemophilus Influenzae type B bacteremic infections with the capsular polysaccharide vaccine. New England Journal of Medicine. 1984; 310: Robbins J B. et al. Quantitative measurement of Natural and Immunizationinduced Haemophilus influenzae type b Capsular Polysaccharide Antibodies. Pediatric Research. 1973; 7: Hazelwood M. et al. The acquisition of anti-pneumococcal capsular polysaccharide Haemophilus influenzae type b and tetanus toxoid antibodies, with age, in the UK. Clin Exp Immunol. 1993; 93: Phipps D C. et al. An ELISA employing a Haemophilus influenzae type b oligosaccharide-human serum albumin conjugate correlates with the radioantigen binding assay. J Immunol Methods. 1990; 135: Madore DV et al. Interlaboratory Study Evaluating Quantitation of Antibodies to Haemophilus influenzae Type b Polysaccharide by Enzyme-Linked Immunosorbant Assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1996; 3(1): Barra A. et al. Measurement of anti-haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide antibodies by ELISA. J Immunol Methods. 1988; 115: Berger M. Immunoglobulin G subclass determination in diagnosis and management of antibody deficiency syndromes. The Journal of Pediatrics, 1987:2: Schauer U. et al. Levels of antibody specific to Tetanus toxoid, Haemophilus influenzae type b and Pneumococcal Capsular Polysaccharide in healthy children and adults. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Mar 2003: SENSIBILIDAD ANALÍTICA La sensibilidad del ensayo de 0,11mg/L ha sido confirmada ensayando dos muestras en réplicas múltiples con valores de 1,2 y 2,0 veces el calibrador más bajo (0,11mg/L). El análisis estadístico efectuado con el t test de Student, ha confirmado que estas muestras eran considerablemente diferentes la una de la otra (p<0,0001) RANGO DE MEDICIÓN El rango de medición es de 0,11-9mg/L. Nota: La exactitud de la curva está limitada por un cociente sensibilidad/precisión inferior a 0,33mg/L VALORES TÍPICOS Los niveles de anticuerpos anti-hib se obtuvieron de sueros de 100 donantes de sangre normales adultos (estado de vacunación e inmunización desconocido). Los siguientes datos solo sirven a título ilustrativo y no deben utilizarse para calcular el rango normal. Insert Code E016, Version: 28 th October 2010, Page 12 of 12