Allgemeine Hinweise für die Klausur I

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1 Allgemeine Hinweise für die Klausur I - Ziel Vorlesung: grundlegende Kenntnisse / Überblick über wichtigste Methoden der Wasseranalytik - Wichtige Begriffe (z. B. Umkehrphase, Bandenverbreiterung, van Deemter-Kurve, Surpressor, Standardaddition ) - Besonderheiten Wasseranalytik - Vorschläge von Analysenstrategien (Probennahme, -konservierung, -vorbereitung, Messverfahren), Begründung, stoffliche Beispiele - Filtration, Anreicherung, Clean-up; Zusammenhang Eigenschaften Zielanalyten Auswahl Probenvorbereitung - Grundprinzip wichtiger Probenvorbereitungmethoden(SPE, LLE, SPME, Headspace, Soxhlet) - Maßanalyse: Säure-und Basekapazität, Härtebestimmung - Prinzip / Geräteaufbau / Arbeitsweise instrumentelle Analysentechniken (UV/VIS- Spektroskopie, AAS, AES, elektrochemische Methoden) - Wichtigste Detektoren für LC und GC benennen & Prinzip und Einsatzbereiche kennen - Zusammenhänge, Vor-und Nachteile bestimmter Verfahren - Vergleich diverser Analysenmethoden (z. B. Anionen: Photometrie Maßanalyse Ionenchromatographie; AAS - AES)

2 Allgemeine Hinweise für die Klausur II - Einflussgrößen, Rolle von Randbedingungen (ph bei RP-Chromatographie, Matrix, Extraktion: Salzzusatz, AOX -DOC ) - Photometrie wichtigste Reagenzien (Nitrit, Phosphat, Eisen) aber keine umfassenden Gleichungen - AAS: Atomisierungsarten, spektrale Interferenzen und Möglichkeiten zur Vermeidung - Summenbestimmungsmethoden Bedeutung, Vorteile, Grenzen - Prinzip, Randbedingungen und Begriffe CSB, BSB, DOC/TOC, AOX, AOS, TN, SAK - Aussagen bei Kombination bestimmter Summenparameter (SAK/DOC, BSB/CSB, CSB/DOC) - Chromatographie: Einordnung, Chromatogramm, qualitative/quantitative Aussagen - Arten der Kalibrierung - keine detaillierten Fakten (wie z. B. spezifische Temperaturen, Katalysatoren, AAS- Flammenarten ) - keine DIN-Details (auch bei mündlichen Testat) einfache Rechenaufgaben: Anreicherungsfaktor, Wiederfindungsrate, Chromatographie - grundsätzlich: kein Ausformulieren -Stichpunkte ausreichend!! leserlich!

3 Einleitung/Allgemeines Besonderheiten der Wasseranalytik Vielzahl von Wasserinhaltsstoffen belasteter Fluss: bis 10 6 Stoffe in relevanten Konzentrationen keine vollständige Wasseranalyse möglich!! Wichtigkeit von Vorinformationen, problemorientierten Analysen Auftreten dieser Stoffe in stark unterschiedlichen Konzentrationsbereichen Störungen, oft keine direkte Bestimmung möglich! Qualitative und quantitative Veränderlichkeit der Wasserinhaltsstoffe Fehler bei Analytik durch Mehr- oder Minderbefund

4 Einleitung/Allgemeines d[wis] dt = f( neinflussgrößen) n: hoch, unbekannt Einflussgrößen: z. B. Temperatur, Lichtverhältnisse, Redoxpotential, Anzahl und Art vorherrschender Mikroorganismen, Schwebstoffgehalt, andere Wasserinhaltsstoffe, Art Phasengrenzflächen Schlussfolgerung: - Zeit zwischen Probenahme und Analyse möglichst kurz halten; - Einflussgrößen so wählen, dass Stoffe bei Transport/Aufbewahrung nicht verändert werden

5 Probenahme Probenahme Allgemein: Fehler der Probenahme durch exakte Analyse nicht kompensierbar Art der Probenahme richtet sich nach Problemstellung Probenehmer: qualifiziertes bzw. eingewiesenes Personal Entnahmetiefe: abhängig von Homogenität des Gewässers Art: Einzel-/Stichprobe oder Misch-Sammel-/Durchschnittsprobe Wichtig - Probenahmeort: Fließgewässer (Fahnenbildung), Seen (Schichtung, Zuflüsse) Abstand zwischen einzelnen Probenahmestellen spezielle Probenahmegeräte Gefäßmaterialien zur Probenahme und Transport/Aufbewahrung Randbedingungen aufzeichnen (Temperatur, Durchfluss, Tages- und Jahreszeit, Wasserstand) exaktes Probenahmeprotokoll, Beschriftung der Gefäße Besonderheiten bei Probenahme aus Zapfhähnen/Brunnen(Behälter, Grundwasserpumpen, Leitungen, Anlagen); Grundwasser reduzierende Bedingungen! Emission Leitungsrohre: Stagnation? 8 24 h stehen lassen, erste Anteil als Probe nehmen Schwebstoffprobenahme: große Volumina (bis 100 L), Nutzung z. B. von Durchflusszentrifugen Sediment, Boden: Problem repräsentativer Entnahme

6 Probenahme v Durchfluss v zeitproportionale Probenahme Zeit Zeit v durchflussproportionale Probenahme! v volumenproportionale Probenahme Zeit Zeit

7 Probenahme und Probenvorbereitung Kunststoffflaschen Glasflaschen -ph-wert - Leitfähigkeit -Geruch -Aussehen - CSB - Schwermetalle - LHKW -AOX Stabilisierung mit HNO 3 bzw. H 2 SO 4 vor Ort dunkle Glasflasche, ausgeheizt, blasenfrei füllen Bestimmung sofort aus der Originalprobe LHKW AOX

8 Konservierung Konservierung - notwendig, um Veränderungen der Analyten zwischen Probenahme und Analyse zu vermeiden bzw. zu vermindern (entfällt bei Feldmessungen) - Ursache für Veränderungen: chemische Reaktionen/Einwirkung von Mikroorganismen/Adsorption/physikalischer Austrag - Probenkonservierung muss in Anpassung an die vorgesehene Bestimmung erfolgen - sollen bei der Wasserprobe verschiedenen Parameter bestimmt werden, müssen diverse Konservierungsmaßnahmen in getrennten Behältern durchgeführt werden - Hinweise zur Konservierung von 75 chemischen und mikrobiologischen Parametern gibt DIN A21 - Konservierungsmaßnahmen sind exakt zu dokumentieren

9 Konservierung Art der Konservierung/Konservierungsmittel zu konservierender Parameter Zugabe von Chloroform, Silber-, Quecksilberionen, Natriumazid und anderen Bioziden Zugabe von Mn 2+ und NaOH Abgedunkelte Aufbewahrung bei 4 C Einfrieren (-18 C) Verhinderung Abbau, allgemein bei Untersuchungen von abbaubaren organischen Wasserinhaltsstoffen (besonders im Spurenbereich) bzw. DOC-Messungen, nicht bei BSB- und Toxizitätsmessungen Fixieren von gelöstem Sauerstoff als höherwertige Manganoxidhydrate Freies Chlor, organische Wasserinhaltsstoffe (kurzzeitiger Transport/Lagerung) Organische Wasserinhaltsstoffe Zugabe von Säuren (z. B. HCl, HNO 3 ) ph <= 2 Schwermetallionen, NH 4+, Gesamtstickstoff HNO 3 NaOH Membranfiltration (Porendurchmesser 0,45 oder 0,2 µm) AOX, POX Phenole Verminderung Abbauprozesse!

10 Hinweisuntersuchung 1. Geruch/(Geschmack) 2. Färbung (DIN C1) Definition: Als Färbung eines Wassers bezeichnet man dessen optische Eigenschaft, die spektrale Zusammensetzung des sichtbaren Lichtes durch Absorption zu verändern (bewirkt durch Wasserinhaltsstoffe). Unterteilung in wahre/visuelle Färbung, Einfluss Schwebstoffe auf Farbe Oberflächenwässer häufig gelbbraun Ursache Huminstoffe, Eisen Einheit: m Trübung/Sichttiefe (EN ISO 7027) Definition: Als Trübung eines Wassers bezeichnet man dessen Eigenschaft, eingestrahltes Licht zu streuen bzw. die Verringerung der Durchsichtigkeit von Wasser, verursacht durch die Gegenwart von feindispersiven, suspendierten Teilchen. Erfassung von Sand-, Lehm-und Tonpartikeln sowie von Bakterien und anderen Mikroorganismen (ca bis m -1 Teilchendurchmesser) Formen: Messung der Schwächung der durchgehenden Strahlung; Streulichtmessung, (Streuwinkel 90 ); Messung der vorwärts gestreuten Strahlung (Streuwinkel 0 ), jeweils 860 nm

11 Probenvorbereitung Probenvorbereitung in der Wasseranalytik umfasst alle Schritte nach der Probenahme bis zum eigentlichen Bestimmungsverfahren innerhalb des analytischen Gesamtverfahrens am höchsten fehlerbehaftet die direkte Anwendung hochentwickelter Analysentechniken kaum möglich, da: die Konzentration der Analyten unter den Nachweis-und Bestimmungsgrenzen des Analysenverfahrens liegt (Anreicherung) Störverbindungen in der Probe eine Bestimmung der Analyten verhindern bzw. eine Schädigung des analytischen Systems verursachen (Matrixabtrennung) der chemische oder physikalische Zustand der Probe nicht für die direkte Bestimmung geeignet ist (Derivatisierung) die zu bestimmenden Stoffe nicht homogen in der Probe verteilt sind (Verkleinern, Mahlen, Ultraschallbehandlung)

12 Probenvorbereitung Spurenanalytik Aufkonzentrieren/Abtrennen von Störkomponenten Headspace- Technik Flüssig-Flüssig- (Fest)-Extraktion Festphasen- Extraktion SPME - statische HS - dynamische HS (CLSA) - Ausschütteln - Perforieren - Soxhletextraktion -polare E. - unpolare E. - Ionenaustausch-E. - Ionenpaar-E. - Größenausschluss-E. -in der Gasphase -in der Lösung -leichtflüchtige Stoffe (LHKW, Lösungsmittel) - mittel- bis unpolare Stoffe (Nitroaromaten, PAK) - polare bis unpolare Stoffe, Ionen (z. B. PSMBP, Phenole, Amine) -flüchtige Stoffe (Geruchsstoffe, BTEX-Aromaten)! GC / HPLC / DC / CE

13 Probenvorbereitung/Filtration Filtration Frage nach Notwendigkeit (Verluste, Kontamination) nach Möglichkeit Vor-Ort (Adsorption an Schwebstoffe zeitabhängig) organische Spurenanalytik: Glasfaserfilter vorteilhaft (Rückhaltevermögen: 0,5 µm) Membranfilter (z. B. Zellulose-Acetat) stärkeres Rückhaltevermögen (Porendurchmesser: < 0,2 µm), aber Adsorption möglich, z. T. sehr zeitaufwendig Alternative: Zentrifugation Analysenprotokoll: unbedingt Porendurchmesser und Material angeben zur Feststellung von Verlusten: Wiederfindungsversuche mit Standards nach Filtration Filtrat und Filterrückstand untersuchen

14 Probenvorbereitung/Anreicherung Anreicherung (Vorkonzentrierung) Erhöhung der Stoffmengenkonzentration in einer meist flüssigen Phase Erhöhung des Massenverhältnisses Spurenkomponente (Analyt) / Matrix - Anreicherungsfaktor: F = c i c i (Konzentrat) (Ausgangsprobe) - Wiederfindung(recovery): R S = Q Q S S,0 100% [= Maß für Verlust/Fehler bei der Probenvorbereitung]

15 Probenvorbereitung/Anreicherung Beispiel für die Anreicherung anorganischer Spurenkomponenten Schwermetalle: Reaktion mit Chelatbildnern gebildete Metall-Chelat-Komplexe wie organische Spuren anreichern z. B. Flüssig-Flüssig-Extraktion nach Anreicherung Extraktionsmittel durch Verflüchtigung entfernbar Vorteile der Chelate: sehr selektiv Schwermetalle: Mitfällung an organischem/anorganischem Spurenfänger z. B. Einsatz von Eisen- und Aluminiumhydroxid, Metallchelate nach Abtrennen/Lösen mit geringem Flüssigkeitsvolumen weitere quantitative Analyse Ionen: Anwendung von Ionenaustauschverfahren Ionen:Elektroosmose, Teil der Flüssigkeit wandert unter Einfluss des elektrischen Feldes durch eine Membran (=Entwässerung)

16 Probenvorbereitung/Anreicherung Verdampfen/Verflüchtigen Nachteile: Verlust flüchtiger/thermoinstabiler Substanzen Mengenverhältnis Analyt/andere Wasserinhaltsstoffe bleibt gleich - häufig im Anschluss an Extraktionsverfahren: weitere Reduzierung der Volumina von Lösungsmittelextrakten - Einengung A: Vakuumrotationsverdampfer - niedrige Temperatur - dünner Lösungsmittelfilm an Wandungen B: Einengen im Stickstoffstrom - Inertgas - Arbeiten im Abzug - zur Trockne? Je nach Analyt Gefriertrocknung: Entwässerung durch ständiges Absaugen des Wasserdampfes bei tiefen Temperaturen im Hochvakuum

17 Probenvorbereitung/Head-Space-Technik Head-Space-Technik Head-Space = Dampf-(Kopf-)raum-Technik grundsätzlich nur für flüchtige Komponenten geeignet Möglichkeit zur Abtrennung flüchtiger Analyten von der nicht-oder schwerflüchtigen Matrix fast ausschließlich in Kombination mit der Gaschromatographie geeignet für unterschiedlichste Matrices (z. B. Wasser, Blut, Urin, Lebensmittel, Kosmetika, Lacke, Textilien, Boden) einfaches und besonders wirksames Prinzip zur Matrixentfernung Statische Head-Space(SHS) einmalige Gasextraktion Dynamische Head-Space(DHS) Strippgas über die Probe hinweg Strippgas durch die Probe hindurch kontinuierliche Gasextraktion

18 Probenvorbereitung/Head-Space-Technik Schematischer Arbeitsablauf der Head-Space-Techniken GC Strippgas Trap GC Feststoff oder Flüssigkeit HS-Probenfläschchen Flüssigkeit Strippgas Statische Head-Space(SHS) Trap GC Dynamische Head-Space(DHS) in Form des Gasstrippings (Purge and Trap) meist Feststoff Dynamische Head-Space(DHS) über die Probe hinweg

19 Probenvorbereitung/Head-Space-Technik Head-Space-Technik SHS: DHS: Dampfdruck proportional dem Molenbruch; dem Aktivitätskoeffizienten und dem Dampfdruck der reinen Substanz bei der Erwärmung einer Probe in einer geschlossenen Probeflasche auf vorgegebene Temperatur stellt sich ein kontrollierbares Gleichgewicht zwischen flüssiger und gasförmiger Phase ein Dampfraum ist Abbild für die in der Probe enthaltenen flüchtigen Stoffe durch Septumwird mit Dosierkapillare definiertes Volumen für GC entnommen die Probe wird mit inertemstrippgas über-bzw. durchströmt bis Konzentration der extrahierten flüchtigen Komponente gegen 0 geht Dampfraumprobe wird in einem Zwischenspeicher (Trap) festgehalten (Ausfrieren oder Adsorption) Überführung in GC durch rasches Ausheizen oder Herauslösen (Lösungsmittel)

20 Probenvorbereitung/Probenaufbereitung Probenaufbereitung fester Proben (Boden, Sediment, Klärschlamm): Soxhlet-Extraktion Einsatz bei der Analytik schwerflüchtiger organischer Verbindungen z. B. Pflanzenschutzmittel polychlorierte Biphenyle polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe Dioxine, Furane Festprobe soll wasserfrei (z. B. gefriergetrocknet) und fein zermahlen sein definierte Menge wird in Extraktionshülse aus Zellulose oder Teflon gegeben Extraktionsmittel z. B. Pentan Hexan Toluol Extraktionszeiten häufig sehr lang, bis 30 h, dabei mehrere hundert Extraktionszyklen, dabei quantitative Überführung der Analyten in die Lösungsmittelphase

21 Probenvorbereitung/Extraktion Flüssig-Flüssig-Extraktion allgemeine Definition: Herauslösen der/des Analyten aus einer flüssigen Mischphase durch ein selektiv wirkendes Lösungsmittel NERNSTscher Verteilungssatz: k = c c A i B i A, B nicht miteinander mischbare Flüssigkeiten c, k A B i ci Gleichgewichtskonzentration des Stoffes i in A bzw. B Verteilungskoeffizient praktisch Extraktion nur möglich, wenn k>> 1 (bzw. k<<1) Trennung zweier Stoffe im gleichen Zweiphasensystem, wenn k1 k2 Trennfaktor: β = k k 1 2 k 1 Verteilungskoeffizient des Stoffes 1 k 2 Verteilungskoeffizient des Stoffes 2

22 Probenvorbereitung/Extraktion Festphasenextraktion (Fest-Flüssig-Extraktion, Solid Phase Extraction SPE) Durchführung: Konditionierungsmittel Probenwasser Waschmittel Elutionsmittel Störverbindung Analyt Trennsäule Adsorbens Konditionierung Probenaufgabe Waschschritt Elution

23 Probenvorbereitung/Extraktion Festphasenextraktion entscheidende Wechselwirkungen A. Anreicherung Lösungsmittel (Wasser) Analyt Sorbent B. Elution Sorbent Analyt Elutionsmittel Arten der möglichen Wechselwirkungen ionische Wechselwirkungen Wasserstoffbrückenbindungen Dipol-Dipol-Wechselwirkungen Dipol-induzierte Dipol-Wechselwirkung π-komplex-bindung Dispersionskräfte

24 Probenvorbereitung/ Festphasenextraktion Arten der Festphasenextraktion/Sorbentien: Vielfalt von Festphasenmaterialien selektive Gestaltung der Probenvorbereitung Einteilung nach Art der primären Wechselwirkungen zwischen Sorbens und Analyt: Polare Extraktion Unpolare Extration Ionenaustauschextraktion Größenausschlussextraktion wichtig: Wirkung von funktionellen Gruppen der Sorbensoberfläche große Bedeutung: Silicagel + modifizierte Silicagelmaterialien

25 Probenvorbereitung/Extraktion Analyt Sorbens Probelösungsmittel polar (z. B. organische Halogenide, Alkohole, Aldehyde) polar (Silicagel, Florisil, Aluminiumoxid) relativ unpolar (Hexan, Methylenchlorid, Chloroform) primäre Wechselwirkungen Dipol Dipol, Dipol induzierter Dipol, Wasserstoffbrückenbindung Elutionsmittel Bemerkungen polar (Wasser, Puffer, Acetonitril, organische Säuren z. T. sehr selektive Trennung kein direkter Einsatz von Wasserproben möglich Si Si OH O H Beispiel für polare Extraktion: Benzylamin an Silicagel H N CH 2 H

26 Probenvorbereitung/Extraktion Synthese von gebundenen Phasen (Modifizierung der Silicageloberfläche) Si OH Si OH CH 3 CH 3 Si OH + Cl Si R Si O Si R -HCl Si OH CH 3 Si OH CH 3 R=! polar - Diolgruppe - Aminopropyl - Nitrogruppe unpolar - C-18-Gruppe - C-8-Gruppe - Phenylgruppe - Cyclohexylgruppe - Cyanopropylgruppe

27 Probenvorbereitung/Extraktion Unpolare Extraktion (Umkehrphasenchromatographie) Analyt Sorbens Probelösungsmittel unpolar bis mittelpolar (Aromaten, Alicyclen, Verbindungen mit Alkylgruppen) modifizierte Silicagelmaterialien(C-18, C-8, Phenyl, Cyanopropyl), Aktivkohle, Polymere, XAD-Harze polare Medien, vorrangig Wasser, Wasser-Lösungsmittelgemische primäre Wechselwirkungen Disperionskräfte, sekundär auch polare Wechselwirkungen Elutionsmittel Bemerkungen unpolar bis mittelpolar (Hexan, Methylenchlorid, Acetonitril) -C-18-Phasen häufigste Verwendung, aber unselektiv!

28 Probenvorbereitung/Extraktion C 18 -Ketten a b Silicagelträger Zustand der Octadecyloberfläche vor (a) und nach (b) der Konditionierung

29 Probenvorbereitung/Extraktion Allgemeine, wichtige Einflussgrößen bei der Festphasenextraktion Grad der Konditionierung Probenmatrix (Konkurrenzadsorption) ph-wert Wasserprobe Neutralsalzgehalt (besonders Ionenaustauscher, auch Aussalzeffekt) Art, Korngröße und Menge Festphasenmaterial Probendurchlaufgeschwindigkeit Waschvorgang (Art Waschmittel) Trocknen der Phase (Trocknungsgrad) Aufbewahrung der beladenen Festphase Elutionsmittel! Durchführung der Elution

30 Probenvorbereitung/Extraktion desorbierte Analytmenge in [%] Elutionsschritt Beispiel für die Abhängigkeit der quantitativen Analyterfassungvon der Anzahl der Elutionsschritte

31 Probenvorbereitung/Extraktion Fehlerquellen jeder Schritt kann zum Gesamtfehler beitragen ungenügende Konditionierung Gefahr des Durchbruchs von Analyt unvollständige Elution, teilweise irreversible Adsorption mögliche chemische Veränderung der adsorbierten Analyten Verlust, Kontamination bei der Trocknung irreversible Adsorption von Analytz. B. am Kartuschenmaterial (besonders Kunststoff)

32 Probenvorbereitung/Extraktion Vergleich Festphasenextraktion Flüssig-Flüssig-Extraktion Festphasenextraktion Flüssig-Flüssig-Extraktion Art der Verteilung dynamische Verteilung einmalige Gleichgewichtseinstellung Anreicherungsfaktor hoch (begrenzt durch Verstopfung, Durchbruch) mittel (begrenzt durch Lösungsmittelmenge) Lösungsmittelverbrauch relativ gering (i. a. < 10 ml) relativ hoch (häufig weit über 10 ml) Lösungsmittelauswahl praktisch unbegrenzt begrenzt (Wassermischbarkeit) Wassergehalt der Extrakte je nach Trocknung (effizient: Gefriertrocknung ) relativ hoch (Trocknung z. B. mit Na 2 SO 4 notwendig) Extraktqualität hoch z. T. Emulsion Zeitaufwand mittel, viele Proben parallel analysierbar hoch, bei vielen Proben Anreichung Vor-Ort gut möglich schwierig Automatisierbarkeit leicht möglich schwierig Fraktionierte Trennung leicht möglich möglich Geräteaufwand gering z. T. hoch Reproduzierbarkeit bezüglich Chargen Verluste (irreversible Sorption) schlecht z.b. Basen an Silanolgruppen - Kontamination Zubehör z. T. hoch gering gut

33 Probenvorbereitung/Extraktion Solid-Phase-Microextraction SPME Mikrofestphasenextraktion direkte Anreicherung organischer Spurenstoffe aus: 1. flüssigen Proben (z. B. Wasserproben) 2. gasförmigen Proben (z. B. in Verbindung mit Headspace, SHS) keine vollständige Extraktion, sonder immer Verteilungsgleichgewicht der Analyten zwischen Probematrix und stationärer Phase (Faser) Gleichgewicht bei Anreicherung (Adsorption) und bei thermischer Desorption im GC-Injektor

34 Probenvorbereitung/Extraktion

35 Probenvorbereitung/Extraktion Einflussgrößen auf Lage und Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung sowie Präzision: Beschaffenheit der Faser (Art, Vernetzung, Volumen) Rührgeschwindigkeit Probenzusätze (Salz, Lösungsmittel) ph-wert Derivatisierung Faserposition im Injektor Injektortemperatur Zeitspanne zwischen Adsorption und Desorption

36 Analysenmethoden Messmethoden in der Wasseranalytik Auswahlkriterien: - Fragestellung - Zielanalyt(en) - Matrix - Möglichkeiten Schwebstoffe/ Kolloide/MO gelöste anorganische Wasserinhaltsstoffe CSB AOX DOC SAK 254 gelöste organische Wasserinhaltsstoffe Aniline Phenole Tenside (meist photometrisch) Summenparameter Gruppenparameter Einzelstoffe GC HPLC DC SFC CE Anionen Kationen Summenparameter Schwermetalle Gase Leitfähigkeit Maßanalyse Maßanalyse Maßanalyse Maßanalyse Redoxpotential Glührückstand Photometrie IC/CE Photometrie AAS Photometrie AAS amperometrisch! Potentiometrie IC/CE ICP-AES Polarographie

37 Eigenschaften Zielanalyten mittelflüchtig wenigflüchtig, hydrophil wenigflüchtig, amphiphil Polarität leichtflüchtig wenigflüchtig, lipophil Flüchtigkeit nach C. ZWIENER, Karlsruhe

38 Auswahl der Analysenmethode(grobe Orientierung) Flüssigchromatographie Polarität Gaschromatographie Flüchtigkeit nach C. ZWIENER, Karlsruhe

39 Chromatographie Chromatographie Definition: - ist ein Trennprozess, bei dem ein Probegemisch zwischen zwei nichtmischbaren Phasen verteilt wird. - Verteilung erfolgt zwischen einer ruhenden (stationären) und einer sich bewegenden (mobilen) Hilfsphase Allgemeine Kennzeichen: - schonende Arbeitsweise - stets Kopplung Trennung Detektion - qualitative/quantitative Aussagen Systematisierung nach: - Aggregatzustand mobile Phase - Trennungsmechanismen - Ausführungstechniken

40 Chromatographie Chromatographie Aspekte: - wichtig: Verteilungskoeffizienten der zu trennenden Stoffe - im Laufe des Trennbettes: Einstellung immer neuer Gleichgewichte - Strecke in der sich Gleichgewicht einstellt: theoretische Trennstufe - Ziel: System mit hoher Trennstufenzahl - somit lange Säule günstig, aber Bandenverbreiterung - Abbildung des Trennergebnisses: Chromatogramm Ursachen Bandenverbreiterung: - Streudiffusion (EDDY-Diffusion) - Strömungsverteilung (laminar) - Längsdiffusion - Stoffaustauschphänomene! - Abhängigkeit Trennstufenhöhe von Fließgeschwindigkeit, graphische Darstellung: VAN DEEMTER-Kurve

41 Chromatographie! Trennstufenhöhe H Van-Deemter-Kurve 1 EDDY-Diffusion+ Strömungsverteilung 2 Längsdiffusion 3 Stoffaustauschphänomene 4 Resultierende Kurve V optim Lineare Fließgeschwindigkeit v

42 Van-Deemter-Kurve: Einfluss Partikeldurchmesser (gepackte Säulen)

43 Chromatographie Signal Das Chromatogramm und seine Kenngrößen Komponente 1 Komponente 2 t R1 t R2 w Basisbreite eines Peaks t 0 Totzeitder Trennsäule: die Zeit, die die mobile Phase benötigt, um durch die Trennsäule zu wandern t 0 w 1 w 2 Zeit t R1 Probenaufgabe t R2

44 Chromatographie Das Chromatogramm und dessen Aussagen - Erfassung der getrennten Substanzen mittels Detektor - Einzelsignal: Peak, Gesamtheit: Chromatogramm - Idealform eines Peaks: Gaußkurve - jeder Peak ist charakterisiert durch Retentionszeit, Peakhöhe bzw. fläche Qualitative Messung - Retentionszeit für jede Substanz bei konstanten chromatographischen Bedingungen charakteristisch - Faktoren, welche die Retentionszeit beeinflussen: Trennsäule Laufmittel Fließgeschwindigkeit Probengröße Temperatur - Identifizierung: Vergleich Retentionszeit Probenpeak Peak Reinsubstanz (Standard)!

45 Chromatographie Das Chromatogramm und dessen Aussagen - bei Übereinstimmung kann Probenpeak gesuchte Substanz sein - höhere Sicherheit durch: Aufstockungsverfahren Überprüfung mit anderen Trennsäule präparativeisolierung und Untersuchung mit zusätzlichen anderen Verfahren (MS, IR) spezielle Detektoren (charakteristische Signalverhältnisse) parallele Anwendung einer anderen Methode

46 Chromatographie Quantitative Messung - Proportionalität Stoffkonzentration Peakfläche(bzw. Peakhöhe) - vorher mit verschiedenen Lösungen bekannter Konzentration (Standards) Kalibrierung erstellen - Fläche mittels Integratoren/Rechnern ermittelt - früher: Wägemethode Millimeterpapier auszählen Bestimmung mittels Planimetrie Näherung: Halbwertsbreite mal Höhe Näherung: Höhe mal Gesamtretentionszeit

47 Chromatographie Kalibrierung Arten der Kalibrierung! I. Externe Kalibrierung (Methode des äußeren Standards) - im Vorfeld der Probenanalytik wird mit Hilfe von verschiedenen Lösungen exakt definierter Konzentration eine Kalibrierfunktion (i. a. linear) erstellt (Stoffgemisch) - bei neuen Methoden Kalibriervorschrift beachten (Arbeitsbereich an Problem anpassen, 10-Punkte, äquidistant, statistische Kontrolle: Linearität und Varianzhomogenität, Wiederholbarkeit, über Gesamtverfahren) - Routineanalytik: weniger Punkte, zwischen den Proben Standards ermitteln, Rekalibration II. Interne Kalibrierung (Methode des inneren Standards) - extern: Nachteil Schwankungen (z. B. Ursache Detektor), besonders GC - Zugabe eines zusätzlichen Standards, der alle Prozesse (auch Störungen) mit durchläuft, Standard wird jeder Probe zu Beginn der Analyse zugegeben - im Vorfeld: Ermittlung einer Kalibrierkurve - Messsignale werden immer auf diesen Standard bezogen

48 Chromatographie Kalibrierung Arten der Kalibrierung Anforderungen interner Standard: - nicht in Probe enthalten - ähnliche Eigenschaften wie Analyten - ähnliche Retentionszeit wie Analyten - Konzentration im Bereich Analyten! III. Standardaddition (Aufstockungsverfahren) - Problem: Matrixeinfluss auf Retentionszeit und Messsignal (Peakfläche) - Ausweg: Zugabe der Kalibrierlösung zur Probe - mehrere Kalibrierpunkte + Originalprobe rechnerische oder graphische Ermittlung der Probenkonzentration - Vorteile: Berücksichtigung von Matrixeinfluss Zuordnung/Identifizierung von Peaks Erkennen von Störungen - Nachteile: zeit-und arbeitsaufwendig, da für jede Probe mindestens 6 Bestimmungen erforderlich sind

49 Chromatographie Wichtige Formeln in der Chromatographie Verteilungskoeffizient K = X c c stat mob Kapazitätsfaktor k ' = X n n stat mob k' X = t' t R 0 = t R t t 0 0 k ' =K V V stat mob Trennfaktor (relative Retention) (= MaßfürFähigkeitdes chrom. Systems, zweistoffezutrennen; BeeinflussungdurchWahl stat./mob. Phase) α = k' k' 2 1 = (mit k 2 > k 1 ) t t R2 R1 t t 0 0 = K K 2 1!

50 Chromatographie lineare Geschwindigkeit des Lösungsmittels u = L t 0 Auflösung zweier Peaks - Trennvermögen einer Säule bezüglich zweier Stoffe - R = 2 Differenz der Retentionszeiten Summe der Basisbreiten t 2 = 2 R t R R Auflösung zweier benachbarter Peaks ω 1+ω2 1!

51 Chromatographie Wichtige Formeln in der Chromatographie Trennstufenzahl N 2 16 t 5,4 h t R tr p R 2 = = = π ω ω1 A 2 2 2! Trennstufenhöhe H = L N Beeinflussung der Auflösung R 1 = α 4 ( 1) N k' 1+ k' mit k' = k' 1+ k 2 ' 2 Abhängig von Trennstufenzahl eines chromatographischen Systems Verbesserung durch: - k : Änderung der Stärke der mobilen Phase - N: Verwendung längerer / besserer Säulen; Fließgeschwindigkeit optimieren - α: Änderung - Art Trennmechanismus, chromatographisches System

52 Chromatographie Peaksymmetrie ideale Peakform: Gaußkurve Praxis: fast immer geringe Abweichungen starke Asymmetrie (Fronting, Tailing) verursacht durch Fehler Asymmetrischer Peak: Tailing(Fronting) b 0,1 T = < 2,5 a 0,1 a 0,1 b 0,1 0,1 h h Ursachen: - schlechte Säulenpackung - Totvolumen System - Überladung - Unverträglichkeit!

53 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Pumpe(n) Probeneingabe/ Reodyne (+ Autosampler) Auswerteeinheit Säulenthermostat Trennsäule Detektor Druckgasflasche (Trägergas)

54 Chromatographie HPLC HPLC (High Performance Liquid Chromatographie) Physikalisch-chemische Prozesse: - Adsorption - Verteilung - Siebeffekte - Ionenaustauschvorgänge - selektive Bindungen Mechanismen: - Adsorptionschromatographie - Verteilungschromatographie - Umkehrphasenchromatographie - Ionenaustauschchromatographie - Ionenpaarchromatographie - Größenausschlusschromatographie - Affinitätschromatographie

55 Chromatographie HPLC Laufmittel in der HPLC: - Anforderungen: niedrige Viskosität gute UV-Durchlässigkeit Brechungsindexunterschied zur Probe Mischbarkeit mit anderen Laufmitteln Siedepunkt beachten hohe Reinheit (problemangepasst) inertbezüglich Probesubstanzen, Leitungssytemen möglichst geringe Toxizität, niedriger Preis ohne Luftanteil schwebstofffrei

56 Chromatographie HPLC Arbeitsweise HPLC isokratisch die Eigenschaften der mobilen Phase bleiben während der Analyse konstant Gradient Laufmitteleigenschaften werden während des chromatographischen Vorgangs kontinuierlich verändert Vorteile: - Reduzierung Analysenzeit und Laufmittelmenge - nach Optimierung Gradient Multikomponentenanalyse möglich - Reduzierung Bandenverbreiterung - Verbesserung Peakform Probleme: - Basisliniendrift - zusätzliches Zurückfahren und Equilibrieren - hohe Reinheitsanforderungen an Laufmittel

57 Chromatographie HPLC Vergleich von isokratischerund Gradientenelution

58 Chromatographie HPLC HPLC-Detektoren Aufgabe: - Nachweis der getrennten Analyten durch kontinuierliche Messung physikalischer Größen - erfassen Änderungen der Zusammensetzung der mobilen Phasen und Umwandlung in elektrische Signale Anforderungen: - hohe Empfindlichkeit - geringe Drift/Rauschen - unempfindlich bei Temperaturänderungen - unempfindlich bei Änderung Lösungsmittelzusammensetzung - kleines Zellvolumen - schnelle Ansprechzeit - hohe lineare Proportionalität Signal Stoffmenge - leicht bedienbar, robust, preiswert

59 Chromatographie HPLC Detektion in der Chromatographie Durchflusszelle eines UV/VIS-Detektors Detektor Licht h Detektorrauschen und Drift Rauschpegel Signal Signal h t =Drift Zeit t

60 Chromatographie - HPLC UV-Detektor: HPLC-Detektoren I - Absorptionsmessung des in Probe eingebrachten Lichtes (LAMBERT- BEER) - relativ hohe Empfindlichkeit - für die meisten Wasserschadstoffe einsetzbar - kleines Zellvolumen möglich - Gradiententechnik i.allg. anwendbar - großer linearer Bereich - Nachteil: Analyten müssen ähnliche Lage Absorptionsmaxima aufweisen (Ausweg: programmierbarer UV-Detektor, DAD) Diodenarraydetektor: - Spezialform des UVD - Messung Lichtabsorption durch größere Anzahl kleiner Photodioden - Absorption bei verschiedenen Wellenlängen innerhalb kurzer Zeit! - Aufnahme von Spektren zu jeder Retentionszeit (3-D-Chromatogramm) - Peakidentifikation/Erkennen von Störungen - hohe Rechenanforderungen - geringere Empfindlichkeit

61 Chromatographie HPLC/Detektoren HPLC-Detektoren II Fluoreszenzdetektor: - begrenzter Einsatz, Derivatisierung - sehr empfindlich (bis in den ppb-bereich) - Optimierung Extinktions-und Emissionswellenlänge (Empfindlichkeit) - wichtige Anwendungsbeispiele: PAK, Sulfonsäuren Leitfähigkeitsdetektor: - Ionenchromatographie

62 Chromatographie Kopplungstechniken: u.a. : LC GC LC DC LC NMR LC MS (MS² ) Kopplung LC MS Anfänge: Thermospray Übertragung von Ladungen/geladenen Spezies auf Analytdurch chemische Ionisation Entstehung von Molekülionen(detektierbar); Quasi -Molekülionen Positiv-/Negativmodus (Zufügen/Verlust von Protonen bzw. Bildung von Clustern, Addukten, ) +/-H 3 O +, NH 4+, Kationen, Molekülbruchstücke CI-Spektren keine/wenige Fragmentierung diverse Kopplungstechniken (Inerface)

63 Chromatographie Lösungsmittel in der LC-MS geeignet: - Mischungen aus Wasser und Methanol bzw. Acetonitril - Zusatz flüchtiger Puffer (Ammoniumacetat,-formiat) ungeeignet: - Zusatz von Salzen, nichtflüchtige Puffer - anorganische Säuren - Zusatz anderer üblicher Zusätze (Trifluoressigsäure, Triethylamine)

64 Chromatographie Kopplung LC MS APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation): - Eluent wird verdampft/zerstäubt (Heizrohr, heated nebulizer gas ) - Korona-Entladungsnadel: Entstehung von Primärionenaus LM - Reaktion mit Analytmolekülen in der Gasphase! - hohe Flussrate möglich ESI (ElectroSpray Ionisation): - Notwendigkeit polarer Eluenten/Vorhandensein von Ionen - Hochspannung Zuleitung + nebulizer gas Spraybildung - Lösungsmittelverdunstung/Selbstabstoßung: Überwindung Oberflächenspannung, Tröpfchenexplosion, Emission von Molekülionen

65 Chromatographie LC-APCI-MS (heated nebulizer, PESciex) Elektronen -fängergas 1. Primärionenentstehungvorwiegend aus Lösungsmittel. 2. Die entstandenen Ionen reagieren mit Analytmolekülen, Bildung von Clustern 3. Das Elektronenfängergas unterstützt dentransfer der Ionen zum Massendetektor und bewirkt eine Ionenentclusterung 2. M XH + X X X 3. XH + X X MH + X X MH + XH + Zerstäubergas LC-Ablauf Probe (M) X X 1. M X XH + M X Elektronen -fängergas X: Lösungsmittelmoleküle, z. B. H 2 O, NH 3, etc. Zusatzgas (~ 120 C) Korona-Entladungsnadel

66 Chromatographie 1. Das Ionenspray-Inleterzeugt kleine geladene Tröpfchen; LM verdunstet -das elektrische Feld wird verstärkt und die Ionen bewegen sich Richtung Oberfläche. 2. Ab einem bestimmten kritischen Feldwert emittieren Ionen aus den Tröpfchen. 3. Das Elektronenfängergas unterstützt die Abtrennung der Ionen. Ion Spray-Ionenquelle (PESciex) Elektronen -fängergas Hochspannung Zerstäubergas LC-Ablauf Elektronen -fängergas

67 LC-MS/MS Iontrap-Systeme -Fragmentierungvon Molekülionen(Tochterionen) in Interface (schlechtdefiniert) und Q2 (Kollisionszelle) - bessere Möglichkeiten zur Identifizierung, aber Art derfragmentbildungstark von Randbedingungen abhängig!! (keine universelle MS-Bibliothek!) - diskontinuierliche Arbeitsweise - höhere Empfindlichkeit im Scan-Modus -Problem: oft Wechselwirkungen

68 Chromatographie HPLC - Möglichkeiten Variation: Optimierung von Intensität, Auflösung und Analysenzeit - Fahrweise, Gradient - Säule: Art, Länge, Teilchengröße, Endcapping u. a. - Laufmittel: Art, Zusammensetzung, ph-wert, Zusätze - Fließgeschwindigkeit - Säulentemperatur! - Detektorparameter

69 Chromatographie HPLC Fehler in der HPLC allgemein: - Ursachenfindung: Ausschlussverfahren - Führung exakter Aufzeichnungen - frühzeitiges Erkennen wichtig mobile Phase: - Verunreinigungen - Gasblasengehalt - Algenbildung Pumpe: - Leckbildung, Ablagerungen/Verschleißan Dichtungen und Pumpenköpfen Injektor: Säule: - Verstopfungen, Lecks - Injektionslösungsmittel ungeeignet - Verunreinigungen (Vorsäule!, Spülen) - Pufferausfällung - Hohlräume (plötzliche Veränderung Fluss, Eluent) Detektor: - mechanische und optische Probleme selber lösen - elektronische Probleme: Firma

70 Chromatographie Allgemeine Vorgehensweise bei der chromatographischen Trennung 1. Literaturrecherche, problemorientiert, Vorauswahl Trennmechanismus und Detektion 2. Isokratische Trennung Analytgemisch(Standards), Überprüfen Peakanzahl, Peakbreite(Fließgeschwindigkeit ändern) 3. einfacher Gradient, (lange Analysenzeit wählen) 4. Variation Gradient(Steilheit, Kombination mit isokratischen Abschnitten), Analysenzeit optimieren, bei Nichtlösen Trennproblem: Änderung Säule, Trennprinzip, Säulenlänge, Laufmittel (auch ph-wert, Zusätze) 5. Einzelstoffe injizieren (Peakzuordnung) 6. Kalibrierung mit definierten Standardmischungen 7. Überprüfung Gesamtverfahrenmit Reinstwasser (alle Probenvorbereitungsschritte), Ermittlung Wiederfindungsrate, Kalibrierung 8. Einbeziehung Realwasser (Matrixeinfluss), Störungen?, ev. Parameter verändern (Clean-up, Gradient), Kalibrierung, Statistik, Wiederholbarkeit 9. Aufnahme von Messwerten, Rekalibrieren, Überprüfung (Parallelverfahren, Standardzusatz, Ringtest) Verringerung des praktischen Aufwandes durch Rechnersimulation möglich ( DryLab ), aber einzelne Punkte nicht ersetzbar

71 Chromatographie HPLC HPLC anwendungsorientierte Aspekte I Trennung dissoziierbarer organischer Verbindungen mittels RP: Grundsätze: -dissoziiertekomponentestets polarer kürzerer t! - Verbindung sollte nicht in zwei Ladungsformen vorliegen(peakform!) - geladene Komponenten: unerwünschte Sekundär-WW beikenntnispk s -WertLadungszustandableitbar; Probleme: 1) z.t. unzureichende Literaturangaben, 2) amphotere Stoffe/ multifunktionelle Moleküle Beeinflussung Ladungszustand? - durch Zusatz von geeigneten Puffern im Laufmittel - Anforderungen: möglichst geringe Beeinflussung Detektion, nicht korrosiv, beständig, keine Mischungsprobleme, MSD: flüchtig! Beispiele: stark sauer ph 1,3 3,3 Phosphatpuffer(H2 PO - 4 ), HCOOH schwach sauer ph 3,8 5,8 Acetatpuffer neutral bisschwachbasischph 6,2 8,2 Phosphatpuffer(HPO 2-4 ) basisch ph 7,0 9,5 Boratpuffer, NH 4 HCO 3 Achtung, StabilitätRP-Phasenbeachten! (ph<2: Hydrolyse C18, ph>8: Auflösung)!

72 Chromatographie HPLC HPLC anwendungsorientierte Aspekte II Bei der Umkehrphasenchromatographie zur Trennung dissoziierbarer Verbindungen müssen Puffer eingesetzt werden. Welchen Einfluss hat deren Konzentration? generell gilt: 1) Eluent wird polarer: - kürzere Retention polarerer Stoffe - lipophilere Verbindungen eluieren später - Löslichkeit des polaren Kieselgels erhöht sich, Verschleiß! 2) Unterdrückung der Dissoziation der freien Silanolgruppen: geringere Auswirkungen bei Chargenunterschieden; System wird robuster - Puffer soll eine ph-änderung sicher vermeiden - beischwachpolarenanalyten: 5 bis10 mmoft ausreichend - sonst 20 bis 30 mm(insbesondere bei älteren Materialien) - Ionenpaarchromatographie: mm

73 Chromatographie IC EN ISO (früher DIN ): Bestimmung der gelösten Anionen Fluorid, Chlorid, Nitrit, Orthophosphat, Bromid, Nitrat und Sulfat mittels Ionenchromatographie Matrix: - wenig belastete Wässer (Trink-, Grund-, Oberflächenwasser) Konzentrationsbereiche: - Fluorid 0,01 10 mg/l - Chlorid 0,1 50 mg/l - Nitrit 0,05 20 mg/l - Orthophosphat 0,1 20 mg/l - Bromid 0,05 20 mg/l - Nitrat 0,1 50 mg/l - Sulfat 0,1 100 mg/l Störungen: - organische Säuren (z. B. Malonsäure, Maleinsäure) - Querempfindlichkeiten bei großen Konzentrationsunterschieden - Schwebstoffe und organische Wasserinhaltsstoffe (Huminstoffe)

74 Chromatographie IC Bestimmung der gelösten Anionen Fluorid, Chlorid, Nitrit, Orthophosphat, Bromid, Nitrat und Sulfat mittels Ionenchromatographie Trennsäule: - Anionenaustauscher niedriger Kapazität Grundmaterial (Polystyrol/ Divinylbenzol-Copolymer, Polymethacrylate) mit Austauschergruppen(quarternäre Ammoniumgruppen)Teilchengröße: 5 25 µm Eluent: - wässrige Lösungen von Salzen schwacher ein- oder zweibasiger Säuren a) mit Suppressortechnik(z. B. Na2CO3/NaHCO3) b) ohne Suppressortechnik(z. B. Kaliumhydrogenphthalat) Detektoren: I. Leitfähigkeitsdetektor, möglichst mit Suppressor II. UV-Detektor oder Diodenarraydetektor III. Elektrochemischer Detektor (Ionen müssen oxidierbar oder reduzierbar sein), z. B. amperometrische Detektion

75 Chromatographie IC Bestimmung der gelösten Anionen Fluorid, Chlorid, Nitrit, Orthophosphat, Bromid, Nitrat und Sulfat mittels Ionenchromatographie Suppressor: - Herabsetzung Leitfähigkeit des Eluenten nach der Säule Probenvorbereitung: - Filtration/Einmal-Kartuschen zur Entfernung von gelöster Organika (HS), hohen Chlorid- oder Sulfatmengen, Verdünnung

76 Chromatographie IC ASRS im Auto-Suppressionsmode Anode (+) Abfall/Abzug Analyt in Na + OH - Eluent Abfall/Abzug Kathod e (-) H 2 O & O 2 H + Na + Na + OH - & H 2 OH - 4H + + O 2 H + + OH - H 2 O H OH - 2 H 2 O Analyt in H 2 O 2 H 2 O H 2 O H 2 O zum Detektor Kationenaustauschmembran Kationenaustauschmembran

77 Chromatographie IC Retentionsbestimmende Parameter in der Ionenaustausch-Chromatographie Größe Regel: Je größer der Ionenradiusdes zu analysierenden Ions, desto größer die Retentionszeit. Beispiel: t ms : F - < Cl - < Br - << I - Ausnahme: Bei Erdalkalimetallen ist eine Retentionsumkehr zwischen Magnesium und Calcium durch Komplexbildung in der mobilen Phase möglich.

78 Chromatographie IC Retentionsbestimmende Parameter in der Ionenaustausch-Chromatographie Ladung Regel: Je höher die Valenz des zu analysierenden Ions, desto größer die Retentionszeit. Beispiel: t ms (Nitrat)< t ms (Sulfat) Ausnahme: Die Retention von multivalenten Ionen wie Orthophosphat ist abhängig vom ph-wert des Elutionsmittels.

79 Chromatographie IC Retentionsbestimmende Parameter in der Ionenaustausch-Chromatographie Polarisierbarkeit Regel: Je höher die Polarisierbarkeit des zu analysierenden Ions, desto größer die Retentionszeit. Beispiel: t ms (Sulfat) < t ms (Thiocyanat) Begründung: Der Ionenaustausch-Prozess wird durch Adsorptionsprozesse überlagert.

80 Chromatographie IC Probenstabilisierung Beständige Parameter: Konservierbare Parameter: Nicht-konservierbare Parameter: (Bakterien!) z. B. Chlorid, Bromid, Sulfat, Alkalimetalle z. B. Sulfit, Erdalkalimetalle z. B. Nitrit, Nitrat, Orthophosphat, Ammonium Stabilisierungsmaßnahmen: - Probenahme unter Sauerstoffausschluss - kühl und dunkel stellen, ggf. tieffrieren(-18 C) (Auftauen nach Vorschrift im lauwarmen Wasserbad) Achtung! Minderbefund bei Sulfat! Mikrokristalle, die nicht mehr komplett in Lösung gehen.

81 Chromatographie GC Gaschromatographie Kennzeichen/allgemeine Aspekte mobile Phase: stationäre Phase: Träger inertes Trägergas vor allem immobilisierteflüssigkeiten, auf (poröser Feststoff) oder an Wandungendünner Röhren (Kapillargaschromatographie) Phasensystem (=Kombination stationäre und mobile Phase) wird nur durch stationäre Phase bestimmt (Gase unbegrenzt mischbar) kontinuierlicher Strom der mobilen Phase über stationärer Phase kontinuierliche Verteilung der Probesubstanzen

82 Chromatographie GC Gaschromatographie Flussgeber Auswerteeinheit Reinigungsstufe ev. Split Injektor Kapillarsäule Säulenofen (temperaturprogrammiert) Detektor Abgase

83 Chromatographie GC Gaschromatographie Kennzeichen/allgemeine Aspekte Trägergas kaum Wechselwirkungen zu gasförmigen Gasbestandteilen somit Selektivität nur durch stationäre Phase bestimmt aber Einfluss auf: Trennleistung Zeitbedarf Detektierbarkeit der Probe weitere Anforderungen: chemisch inert, hohe Reinheit Kriterien wie Preis, Toxizität und Brennbarkeit beachten hauptsächlich Stickstoff, Helium, Wasserstoff, (Argon)

84 Chromatographie GC Aufbau GC: Versorgungseinrichtung Trägergas/Hilfsgase/Brenngase Probenaufgabesystem (on column, Kaltnadel-, split/splitless) Trennsäule/Säulenofen Detektor: Wärmeleitfähigkeitsdetektor Trägergas Helium (gute Wärmeleitfähigkeit) Messung Verringerung Wärmeabgabe eines Heizdrahtes; universell Vergleich (ca. Detektionsgrenze) 400 pg absolut! Flammenionisationsdetektor Wasserstoff-Luft-Flamme, Analytwird ionisiert, Ionenerfassungmittels Kollektor (Stromfluss); universell, T > 100 C Elektroneneinfangdetektor Ionisation Trägergas: Stickstoff oder Argon (+ 5 % Methan), Analyten: elektronegative Spezies, Aufnahme thermischer Elektronen, Stromabnahme; selektiv pg 0,05 1 pg

85 Chromatographie GC keine Spannung Spannung angelegt e - e - e - e - M β - Ni 63 β - Ni 63 e - RCl e - RCl Anode (+) Kathode Anode (+) Kathode β - = betateilchen M = Trägergasmolekül e - = sekundäre Elektronen mit niedriger Energie e - RCl = elektrophilesmolekül mit eingefangenem Elektron

86 Chromatographie GC Aufbau GC: Detektor: Stickstoff-Phosphor-Detektor ähnlich FID, nur niedrigere Temperatur, bei Anwesenheit Rb selektive Ionisation von N- und P-Verbindungen; selektiv Vergleich (ca. Detektionsgrenze) 0,4 10 pg N 0,1 1 pg P Flammenphotometrischer Detektor Verbrennung von S-und P-haltigenSubstanzen: Chemolumineszenz; selektiv 0,9 pg P 20 pg S! Massenselektiver Detektor Elektronenstoß-oder chemische Ionisation, teilweise Bindungssprengung, für jedes Molekül charakteristische Fragmente, Auftrennung in Magnet-oder Hochfrequenzwechselfeld: Massenspektren (3-Daten), Identifizierung im Scan-Modus, Quantifizierung im SIM-Betrieb < 0,1 pg (SIM) Atomemissionsdetektor, Elektrolytischer Leitfähigkeitsdetektor u. a. 0,2 pg

87 Chromatographie Diagramm eines Quadrupol Massenspektrometers Detektor Ionenquelle Die Ionen treten in Wechselwirkung mit dem elektrischen Feld, welches durch die vier Quadrupolstäbehervorgerufen wird und werden entsprechend dem Masse/Ladungs- Verhältnis getrennt.

88 Chromatographie!

89 Chromatographie SFC Chromatographie mit überkritischen Phasen überkritisches Fluid: - mobile Phase: kritische Zustandsform - Zustand: weder Gas noch Flüssigkeit! - Zustand wird erreicht durch Erhöhung Druck und Temperatur - die einzelnen Gase/Flüssigkeiten besitzen eine bestimmte kritische Temperatur bzw. kritischen Druck, oberhalb dieser Punkte: überkritisches Fluid(CO 2 : 31,3 C und 7,3 Mpa) Kennzeichen: - gegenüber Flüssigkeiten: geringere Dichte niedrigere Viskosität höherer Diffusionskoeffizient - oberhalb T kritisch : auch bei weiterer Erhöhung des Drucks keine Verflüssigung möglich - überkritische Fluide sind kompressibel; gutes Strömungsverhalten - Zunahme Lösungsvermögen mit steigendem Druck

90 Chromatographie Anwendung: SFC Chromatographie mit überkritischen Phasen - für Analyten, die auf Grund zu geringer Flüchtigkeit/hoher Thermolabilität nicht mit GC und wegen Unbeständigkeit/schlechter Lösungseigenschaften in üblichen Lösungsmitteln nicht mit der HPLC getrennt werden können Gerätetechnik Hauptmodule: - Einrichtung zur Druckerzeugung, -regelung und entspannung - Pumpe, Injektionsventil (ähnlich HPLC) - Trennsäule (HPLC oder GC) - Detektor (HPLC oder GC) Gradienttechnik: - Zusammensetzung mobile Phase (vgl. HPLC) - Temperatur (vgl. GC) - Druck - Dichte - lineare Strömungsgeschwindigkeit

91 Chromatographie CE Kapillar(zonen)elektrophorese CE (CZE) Begriffe: - Elektrophorese: Trennung durch unterschiedliche Bewegung/Wanderung von geladenen Teilchen im elektrischen Feld - Ionophorese: Elektrophorese kleiner Ionen - Kata-/Anaphorese: Elektrophorese von Kationen bzw. Anionen - Trägerfreie E.: Trennung freier Lösung - Träger-E.: Trennung bei Anwesenheit eines Trägermatrials(Gel, Papier, Celluloseacetatfolie) wichtige Einflussgrößen: - Ionenbeweglichkeit, Funktion von: Temperatur Feldstärke Teilchenradius + Lösungsmittelmoleküle! Ionenladung Ionenstärke der Lösung Dissoziationsgrad ph-wert Reibungseffekte Lösungsmittel, Wandungen

92 Chromatographie CE

93 Chromatographie CE

94 Huminstoffe allgemeine Definition: Huminstoffe sind refraktäre, höhermolekulare, polydisperse und polyfunktionelle Substanzen biogenen Ursprungs Huminstoffe werden bei chemischen und biologischen Ab-und Umbaureaktionen aus natürlichen organischen Substanzen gebildet keine einheitlichen, im Sinne der klassischen Chemie definierten Verbindungen es kann weder eine Summenformel noch eine Struktur angegeben werden aquatische Huminstoffe machen ca % des DOC aus, im Allgemeinen dominieren Fulvinsäuren Angaben zu den molarenmassen schwanken sehr stark und reichen von 500 g/mol bis g/mol, wobei die Fulvinsäurendie niedrigeren Werte aufweisen ( g/mol)

95 Analytische Charakterisierung von Huminstoffen I Operationell definierte Unterscheidung (Bodenuntersuchungen) Bodenmaterial Extraktion Unlösliche Fraktion Lösliche Fraktion (Extrakt) Humine Ansäuern auf ph 2! Niederschlag Huminsäuren Gelöste Fraktion Fulvinsäuren

96 Summenbestimmungsmethoden Kennzeichen - Erfassung gemeinsamer stofflicher Strukturmerkmale oder Eigenschaften Warum? Vorteile? - Vielzahl organischer WIS, auch wenn deren Einzelkonzentrationen nicht bestimmbar - Schnelligkeit der Verfahren - Aufwand relativ gering - Einsatz u. a. Monitoring, Überwachung Grenzen/Probleme? - einzelne Summenparameter oft nur begrenzt Aussagen möglich( Kombination diverser Analysenparameter) - keine Aussagen über Art/Bewertung der einzelnen Verbindungen( zusätzlich ausgewählte Einzelstoffanalysen LC/GC - und wirkungsbezogene Analytik)!

97 Analytik organischer Verbindungen Beispiele für Summen- und Gruppenparameter (operationell definiert) CSB BSB DOC TOC AOX AOS IOS (Chemischer Sauerstoffbedarf) chemisch oxidierbare organische Substanzen (Biologischer Sauerstoffbedarf) biologisch oxidierbare organische Substanzen (Dissolved Organic Carbon) gelöste organische Substanzen (Total OrganicCarbon) Gesamtheit der gelösten und ungelösten organischen Substanzen (adsorbierbare organische Halogen(X)-verbindungen) chlor-, brom-, iodhaltige organische Substanzen (adsorbierbare organische Schwefelverbindungen) organische Schwefelverbindungen (ionenpaarextrahierbareorganische Schwefelverbindungen) organische Schwefelverbindungen (Sulfonsäuren) Aromatische Amine Anilin und Anilinderivate Phenolindex Phenole Methylenblau-/Bismutaktive Substanzen anionische / nichtionische Tenside

98 Analytik organischer Verbindungen Methoden zur Ermittlung der Sauerstoffmenge, die zur Oxidation der organischen Wasserinhaltsstoffe notwendig ist Chemischer Sauerstoffbedarf Biochemischer Sauerstoffbedarf indirekte Verfahren definierte Bedingungen erforderlich (Vergleichbarkeit) Vollständigkeit der Reaktion häufig nicht gegeben

99 Analytik organischer Verbindungen Biochemischer Sauerstoffbedarf Prinzip: - Tätigkeit von Mikroorganismen (aerobe Bedingungen) Abbau organischer Stoffe - Verbrauch an Sauerstoff wird gemessen und angegeben Durchführung: Variante 1: Probe (20 C) auf ph 7 8 einstellen, 2 h Standzeit bei anorganischen sauerstoffzehrenden Stoffen (Fe(II)) ev. diverse Verdünnungsreihen (mit luftgesättigtem Wasser) je nach Probe: Sättigung mit reinem Sauerstoff/Animpfen mit definierter MO-Mengen(Kläranlagenablauf) Messung O 2 (WINKLER oder elektrometrisch), t = 0 wiederholte Messung nach verschiedenen Zeiten (BSB-Kurve) üblich: nach 5 Tagen O 2 -Restmenge bestimmen: Differenz = BSB 5

100 Analytik organischer Verbindungen Biochemischer Sauerstoffbedarf Durchführung: Variante 2: geschlossene Flasche: Teil Gas (Luft oder O 2 )/Teil Probe Messung (in Abhängigkeit von der Zeit): 1. Änderung Partialdruck (Maßfür O 2 -Verbrauch) 2. CO 2 -Entstehung auch Messung Differenz CSB (t = 0) und CSB (t = n Tage) Einflussfaktoren: - Sauerstoffkonzentration (Luft: Sättigung ca. 9 mg/l) - Nährstoffangebot - Temperatur - Lichteinwirkung - Zeit - Art der Wasserinhaltsstoffe

101 Analytik organischer Verbindungen Biochemischer Sauerstoffbedarf Praxis: - vorrangig zur Abwasserbeurteilung - Verfälschung durch toxische Stoffe - Problem Nitrifikation(zeitlich später; Nitrifikationshemmer zusetzen) - Zusammenhang zu Gewässergüteklassen: Gewässergüteklasse I II III IV BSB 5 [mg/l] ,5 5,5 14 über 14 - Grundwasseruntersuchung: Wirksamkeit Mineralisation in der Bodenpassage - Nachteil: langer Zeitbedarf

102 Analytik organischer Verbindungen Chemischer Sauerstoffbedarf Prinzip: - Umsetzung organischer Wasserinhaltsstoffe mit bestimmten Oxidationsmitteln - Verbrauch an Oxidationsreagenz (Differenzmessung vor und nach der Reaktion) = Maß für Menge an organischen Inhaltsstoffen - Umrechnung auf Sauerstoff - Oxidationsmittel: KaliumdichromatK 2 Cr 2 O 7 (KaliumpermanganatKMnO 4 )

103 Analytik organischer Verbindungen Chemischer Sauerstoffbedarf Vollständigkeit der Oxidation abhängig von: - Art der organischen Stoffe - Konzentration der organischen Stoffe - ph-wert - Reaktionstemperatur - Reaktionszeit - Anwesenheit bestimmter anorganischer Stoffe

104 Analytik organischer Verbindungen Chemischer Sauerstoffbedarf (Dichromatverbrauch) Hinweise: - Umrechnung: 1 mg K 2 Cr 2 O 7 = 0,163 mg O 2 - Störungen durch Chlorid (Oxidation zu Chlor): Verhinderung durch Zusatz Quecksilbersulfat (Maskierung) % igeoxidation der Organika, Rest beständige Spaltprodukte (CO, CH 4 ), z. T. N-haltigeHeterocyclen - relativ unempfindlich (> 15 mg/l) - weitere Nachteile: relativ umständlich, zeitaufwendig, Anfall zu entsorgender Mengen Quecksilber-, Chrom- und Silberionen - Abwasserabgabengesetz: mittelfristig Ersatz CSB durch TOC - ca. -Umrechnung: CSB (mg/l O 2 ) = 3 x TOC (mg/l C); CSB/TOC = mittlerer! Ox.-grad!! - sehr wichtig: Verhältnis BSB 5 /CSB(max. = 1), besonders bei Verfolgung biologischer Behandlung (Quotient wird zunehmend kleiner)