Prävalenz antineuronaler Antikörper bei Patienten mit. Multipler Sklerose

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1 Aus der Neurologischen Universitätsklinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Prävalenz antineuronaler Antikörper bei Patienten mit Multipler Sklerose I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. vorgelegt 2008 von Constanze Murek geboren in Müllheim

2 Dekan: Professor Dr. med. Christoph Peters 1. Gutachter: Professor Dr. med. Sebastian Rauer 2. Gutachter: Professor Dr. med. Almut Zeeck Jahr der Promotion: 2009

3 Meinen lieben Eltern in Dankbarkeit gewidmet

4 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Multiple Sklerose: Inzidenz und Krankheitsbild Pathogenese Diagnostik Paraneoplastische neurologische Syndrome: Krankheitsbild Pathogenese Diagnostik Spezifischer Antikörperindex Fragestellung 13 2 Patienten, Material, Methoden Patientenkollektiv Kriterien zur Unterteilung des Patientenkollektivs: Kontrollkollektive Versuchsmaterialien Antigene Chemikalien Geräte Methoden Funktionsprinzip des ELISA Durchführung des ELISA Immunoblot mit rekombinanten Antigenen (Ravoblot) Immunfluoreszenz Spezifischer Antikörperindex Bestimmung des Antikörperindexes 23 3 Ergebnisse Demographische Daten Patienten mit Krebserkrankungen Sensitivität und Spezifität des ELISA Prävalenz antineuronaler Antikörpern bei Patienten mit Multipler Sklerose Positivkontrollen Antikörperspezifitätsindex 32 4 Diskussion 33 5 Zusammenfassung 44 6 Literaturverzeichnis 45

5 7 Anhang Materialien für ELISA Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 52 8 Abkürzungsverzeichnis 53 9 Lebenslauf Danksagung 55

6 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Multiple Sklerose: Inzidenz und Krankheitsbild Die Multiple Sklerose (MS) zählt zu den häufigsten atraumatischen neurologischen Erkrankungen junger Erwachsener [46]. In Deutschland erkranken jährlich 3,5 bis 5 pro Einwohner neu an MS (Inzidenz), wobei Frauen etwa doppelt bis dreifach so häufig betroffen sind wie Männer [11], [13]. Weltweit ist etwa eine Million Menschen an MS erkrankt [11], in Deutschland wird die Zahl der Erkrankten auf geschätzt [32]. In den nördlichen und südlichen Breitengraden scheint die MS häufiger aufzutreten als in den äquatornahen Zonen, was auf verschiedene Faktoren wie genetische Disposition, Klima, Ernährung und unterschiedlichen Hygienestandards zurückzuführen sein kann [13]. Bei den meisten Patienten liegt das durchschnittliche Alter bei Erkrankungsbeginn zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr, in einigen Fällen kann sich die MS aber auch schon vor dem zehnten Lebensjahr und selten nach dem 60. Lebensjahr manifestieren [13]. Die Multiple Sklerose ist eine chronische Erkrankung unklarer Ätiologie, deren Charakteristika die Entzündung und Demyelinisierung der Nervenbahnen in Gehirn und Rückenmark sind. Diese Schädigungen können an den unterschiedlichsten Stellen des zentralen Nervensystems (ZNS), vor allem jedoch in der weißen Substanz auftreten, so dass es zu einer Vielzahl unterschiedlicher Symptome kommen kann [53]: Häufige Frühsymptome sind Sehstörungen, Störungen der Augenbewegungen mit Doppelbildern, Gefühlsstörungen, Gangunsicherheit und erste Lähmungserscheinungen an Armen und Beinen. Im weiteren Verlauf können neben Schmerzsyndromen, Gleichgewichtsstörungen und Miktionsstörungen auch Sprech- und Schluckstörungen hinzukommen [19], [34]. Neben dem Krankheitsbild ist auch der Verlauf der MS sehr variabel. Grundsätzlich kann man drei verschiedene Verlaufsformen unterscheiden: 1. den primär chronisch progredienten Verlauf (primary progressive MS, PPMS) 2. den schubförmig remittierenden Verlauf (relapsing-remitting MS, RRMS) 1

7 Einleitung 3. den sekundär chronisch progredienten Verlauf (secondary progressive MS, SPMS) Die primär chronisch progrediente MS ist durch eine schleichende Zunahme der neurologischen Symptome über einen Zeitraum von mindestens zwölf Monaten definiert [48]. Während des Krankheitsverlaufes kommt es zu keinen schubartigen Episoden oder einer Rückbildung der Symptome. Die Diagnose der PPMS wird eher bei älteren Personen gestellt [34]. Von dieser Verlaufsform sind etwa 10-15% der MS-Erkrankten betroffen [14]. Für die PPMS liegen keine etablierten Behandlungsoptionen vor, bei überlagernden Schüben kann ein Behandlungsversuch mit Interferon beta 1b unternommen werden und bei maßgeblicher Bedrohung der Gehfähigkeit wird probatorisch eine immunsuppressive Behandlung (z.b. mit Mitoxantron oder Cyclophosphamid) empfohlen [11]. Bei über 80% der Patienten ist die Erkrankung durch einen schubförmigen Verlauf charakterisiert. Als Schub wird ein akuter neurologischer Ausfall bzw. die Verschlechterung einer vorbestehenden Symptomatik definiert, die mindestens 24 Stunden lang anhält und mit einem Zeitintervall von mindestens 30 Tagen zum Beginn vorausgegangener Schübe auftritt. Gleichzeitig sollen keine Infekte oder Fieber nachweisbar und die Symptome nicht durch eine Änderung der Körpertemperatur (Uthoff-Phänom) erklärbar sein. Häufig können initial eine einseitige Optikusneuritis, eine belastungsabhängige Schwäche der Beine oder Sensibilitätsstörungen beobachtet werden. Im Verlauf können sich die Symptome vollständig oder zumindest teilweise zurückbilden [11]. Diese Verlaufsform ist die häufigste und betrifft initial vor allem jüngere Menschen zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr. Therapie der Wahl eines Schubes ist eine Steroid-Hochdosistherapie über drei bis fünf Tage. Für die Schubprophylaxe stehen Immunmodulatoren wie Interferon beta und Glatirameracetat sowie seit kurzem auch der monoklonale Antikörper Natalizumab zur Verfügung [11]. Bei etwa 30-40% der Erkrankten kommt es nach zehn bis 15 Jahren zu einer schleichenden Progredienz der Symptome auch ohne zusätzliche Schübe. Man spricht dann von einem sekundär chronisch progredienten Verlauf [11], [14]. 2

8 Einleitung Therapeutisch werden bei relevanter Verschlechterung der Gehfähigkeit überwiegend Immunsuppressiva eingesetzt. Das erstmalige Auftreten eines klinischen Ereignisses mit MS-typischen Symptomen wird als klinisch isoliertes Syndrom (clinically isolated syndrome, CIS) bezeichnet [11]. Die Diagnose einer MS nach den McDonald-Kriterien kann jedoch erst nach einer zeitlichen Dissemination im Sinne eines zweiten Schubes oder einer subklinischen Progression der Erkrankung (neue T2-Läsion) in einem zweiten, nach 30 Tagen durchgeführten MRT festgestellt werden [48] Pathogenese Kennzeichnend für die Pathogenese der MS sind die Entstehung multipler Entzündungsherde und die Demyelinisierung und axonale Schädigung der Nervenbahnen im ZNS [46]. Zu Beginn der Erkrankung steht vor allem der Nachweis entmarkter Plaques im Vordergrund [5]. Dabei können histopathologisch vier unterschiedliche Subtypen der Demyelinisierung unterschieden werden, wobei die Entmarkungsmuster bei verschiedenen MS-Patienten unterschiedlich sein können, während verschiedene Läsionen beim gleichen Patienten dasselbe Muster aufweisen: Die beiden ersten Muster sind durch Makrophagen-vermittelte (Typ I) und Komplement- und Antikörpervermittelte (Typ II) Entzündungsreaktionen gekennzeichnet. Bei den beiden anderen Mustern (Typ III und IV) ist die Schädigung der myelinbildenden Zellen (Oligodentrozyten) ein wesentliches Merkmal [5], [11]. Neben der Demyelinisierung treten zu diesem Zeitpunkt auch bereits axonale Schädigungen und Remyelinisierungsprozesse auf, der Endzustand eines MS- Herdes ist durch die makroskopisch sichtbare Vernarbung (Sklerose) charakterisiert [5], [11]. Die Läsionen treten multifokal auf, vor allem sind aber die periventrikuläre weiße Substanz, der Nervus opticus, der Hirnstamm, das Cerebellum und das Rückenmark betroffen [46]. Man nimmt an, dass die Schädigung des ZNS initial auf eine T-Zell-vermittelte Autoimmunreaktion gegen die Myelinschicht der Neurone zurückzuführen ist [5], [18], [39]: Aktivierte T-Lymphozyten durchdringen die Blut-Hirn-Schranke und erkennen 3

9 Einleitung Myelinantigene, welche ihnen von Mikrogliazellen (MHC Cd8+) präsentiert werden. Daraufhin induzieren die T-Lymphozyten eine Entzündungsreaktion und setzen Zytokine (INF-γ, TNF-α, IL-2) und Proteasen frei, die zu einer Öffnung der Blut- Hirnschranke und damit zum Einstrom von weiteren Immunzellen und Antikörpern führen. Die Zytokine aktivieren außerdem weitere Mikrogliazellen und Astrozyten, so dass auch diese Antigene präsentieren können [39]. Während T-Zellen wahrscheinlich für die Initiation der Inflammation durch Überwindung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlich sind, erfolgt die Demyelinisierung durch weitere Immunmechanismen der zellulären und humoralen Immunantwort [39]: Dabei spielen Autoantikörper, die sich gegen eine Vielzahl von Myelinproteinen wie beispielsweise dem Myelin-Oligodentrozyten-Antigen (MOG) oder dem basischen Myelinprotein (MBP) richten, eine mögliche Rolle [4]. Des Weiteren tragen Mechanismen wie aktivierte Makrophagen oder myelinolytische Zytokine zum Abbau des Myelins bei [39]. Immunologischer Ausdruck des entzündlichen Prozesses im ZNS ist bei der Mehrheit der MS-Patienten eine intrathekale Immunglobulinproduktion. Der Nachweis von sog. oligoklonalen Immunglobulin-G-Banden (OKB) überwiegend oder ausschließlich im Liquor spielt in der MS-Diagnostik eine maßgebliche Rolle [34]. In letzter Zeit wurde auch die axonale Schädigung als Faktor bei der Entstehung der MS diskutiert [15], [46], [35], [52], [56]: Dabei soll es durch die Freisetzung von Stickstoffmonoxid und Glutamat, aber auch durch B-Zell-Antikörper, die zu einer Unterversorgung der Axone mit ATP führen, zur Schädigung und zum Untergang der Axone kommen. Nach Meinung der Experten korrelieren die entzündlichen und demyelinisierenden Prozesse und die axonale Schädigung mit den progredienten und den schubförmigen Phasen der MS, während sie die Remission nach einem Schub als einen Rückgang der Entzündungsreaktion, als eine Remyelinisierung und eine vermehrte Ausbildung von Natriumkanälen entlang der geschädigten Nervenfaser bewerten [46]. 4

10 Einleitung Diagnostik Die Diagnosestellung der MS erfolgt nach den McDonald-Kriterien, die im Jahr 2001 veröffentlicht und im Jahr 2005 überarbeitet und revidiert wurden [38], [48]. Es soll hervorgehoben werden, dass die Diagnose MS eine Ausschlussdiagnose ist, da eine Vielzahl weiterer Autoimmunerkrankungen (z.b. Kollagenosen) sowie Infektionen das Bild der MS phänomenologisch imitieren können. In Tabelle 1 ist ein Schema zur Diagnosefindung nach den McDonald-Kriterien dargestellt. Darin steht vor allem der MRT-Nachweis einer räumlichen und zeitlichen Dissemination im Vordergrund. Für den Nachweis einer räumlichen Dissemination sollen drei der vier folgenden Kriterien erfüllt sein [48]: 1. Mindestens eine Gadolinium anreichernde Läsion oder neun hyperintense Läsionen in der T2-Gewichtung. 2. Mindestens eine infratentorielle Läsion. 3. Mindestens eine juxtakortikale Läsion. 4. Mindestens drei periventrikuläre Läsionen. Zusätzlich gilt nach der Revision 2005 [48]: - Eine Läsion im Rückenmark kann eine infratentorielle Läsion ersetzen. - Eine Kontrastmittel aufnehmende Läsion im Rückenmark kann eine Kontrastmittel aufnehmende Läsion im Gehirn ersetzen. - Um die neun erforderlichen T2-Läsionen zu erreichen, kann eine Läsion im Rückenmark dazu addiert werden. Eine zeitlichen Dissemination gilt als nachgewiesen, wenn: 1. Eine Gadolinium anreichernde Läsion mindestens drei Monate nach erstmaligem Auftreten der Erkrankung auftritt und diese Läsion eine andere Lokalisation hat als die des vorausgegangen Schubes oder 5

11 Einleitung 2. zu einem beliebigen Zeitpunkt eine neue T2-Läsion im Vergleich zu einer Voruntersuchung auftritt, die mindestens 30 Tage nach erstmaligem Auftreten der Erkrankung durchgeführt wurde. Tabelle 1 - McDonald Kriterien zur Diagnosefindung einer MS [48] Klinik Zwei oder mehr Schübe Zwei oder mehr Schübe Nachweisbare Läsionen Zwei oder mehr Eine Zusätzliche Anforderungen zur Diagnosestellung keine weitere Anforderung nötig MRT-Befund hinsichtlich einer räumlichen Dissemination oder Nachweis von zwei oder mehr MS-typischen Läsionen im MRT plus positiver Liquorbefund oder ein weiterer Schub, der eine andere Stelle des ZNS betrifft Ein Schub Zwei oder mehr MRT-Befund hinsichtlich einer zeitlichen Dissemination oder klinischer Nachweis eines zweiten Schubes Ein Schub Eine MRT-Befund hinsichtlich einer räumlichen Dissemination oder Nachweis von zwei oder mehr MS-typischen Läsionen im MRT plus positiver Liquorbefund und MRT-Befund hinsichtlich einer zeitlichen Dissemination oder klinischer Nachweis eines zweiten Schubes PPMS Kontinuierliches Fortschreiten der Erkrankung über 12 Monate und zwei der folgenden Kriterien: A: mindestens 9 Läsionen im T2 gewichteten MRT oder mindestens vier T2 Läsionen mit pathologischen visuell evozierten Potentialen (VEP) B: zwei Läsionen des Rückenmarks in der T2 Gewichtung des MRT C: positiver Liquorbefund Tabelle 1 - McDonald Kriterien zur Diagnosefindung einer MS [48] Die revidierten McDonald-Kriterien von 2005 schlagen auch für die Diagnosestellung einer PPMS Neuerungen vor: Diese Verlaufsform gilt nun nach Ausschluss anderer Differentialdiagnosen als gesichert, wenn die Erkrankung über mindestens zwölf Monate kontinuierlich fortschreitet und zwei weitere Kriterien zutreffen (s. Tabelle 1). Hierbei ist der Nachweis eines positiven Liquorbefundes nicht mehr zwingend 6

12 Einleitung erforderlich, vielmehr erhält ein positiver Befund im MRT einen höheren Stellenwert [48]. 1.2 Paraneoplastische neurologische Syndrome: Krankheitsbild Als paraneoplastische neurologische Syndrome (PNS) bezeichnet man neurologische Erkrankungen, die mit einem Tumor assoziiert sind. Die Ursache der PNS kann dabei jedoch nicht direkt auf den Tumor selbst, seine Metastasen oder die Therapie des Tumorleidens zurückgeführt werden. PNS sind sehr seltene Erkrankungen, die Inzidenz beträgt nur etwa 0,5-3% der Tumorpatienten [29]. Am häufigsten liegen PNS ein kleinzelliges Bronchial-, Mamma- oder Ovarialkarzinom zu Grunde, auch Hodentumoren, Prostatakarzinome, Thymome und Hodgkin- Lymphome sind häufig mit PNS assoziiert [21], [29], [61]. Anhand von klinisch-anatomischen Gesichtspunkten lässt sich eine Einteilung der PNS in Syndrome des ZNS, des peripheren Nervensystems sowie Syndrome der neuromuskulären Übertragung und des Muskels vornehmen [21]. Die sog. klassischen PNS sind in Tabelle 2 aufgezählt: Tabelle 2: Klinisch-anatomische Klassifikation paraneoplastischer neurologischer Syndrome Syndrome des ZNS: - Enzephalomyelitis - Limbische Enzephalitis - Subakute Kleinhirndegeneration - Opsoklonus-Myoklonus-Syndrom Syndrome des peripheren Nervensystems: - Subakute sensorische Neuronopathie - Chronische gastrointestinale Pseudoobstruktion Syndrome der neuromuskulären Übertragung und des Muskels: - Dermatomyositis, Polymyositis - Lambert-Eaton-Myastheniesyndrom Tabelle 2 - Klinisch-anatomische Klassifikation paraneoplastischer neurologischer Syndrome 7

13 Einleitung Pathogenese Der Pathogenese der PNS liegt wahrscheinlich ein Autoimmunprozess zu Grunde. Man nimmt an, dass es im Tumor zu einer ektopen Expression von Proteinen kommt, die physiologischerweise nur im Nervengewebe exprimiert werden [39]. Diese Proteine induzieren als onkoneurale Antigene eine Immunantwort, bei der sich kreuzreaktive Autoantikörper sowohl gegen die Tumorzellen als auch gegen Nervenzellen richten und so zu einer Nervenzellschädigung führen. Dieser pathophysiologische Mechanismus wurde bisher allerdings nur für drei PNS (das Lambert-Eaton-Syndrom, die Neuromyotonie und die tumorassozierte Retinopathie) nachgewiesen, indem die Erkrankung durch passive Immunisierung bei Labortieren auf diese übertragen werden konnte. Bei den anderen PNS konnte die pathophysiologische Bedeutung der Autoantikörper bislang nicht gezeigt werden [29], bei ihnen vermutet man einen T-Zell-Effektor-Mechanismus als pathogenetische Grundlage [1], [50], [62]. Es finden sich auch Hinweise darauf, dass eine Expression von onkoneuralen Antigenen seitens des Tumors alleine nicht ausreicht, um eine Autoimmunantwort zu induzieren. Laut Dalmau und Kollegen sind auch immunmodulierende Faktoren wie der Major Histocompatibility Complex (MHC) bei der Präsentation der Tumorantigene (Hu-Protein) und der damit resultierenden anti-tumorantwort beteiligt [7]. Des Weiteren wird Apoptose-induzierenden Proteinen der TNF-Rezeptor-Superfamilie (Fas-Proteinen) eine immunregulative Rolle zugeschrieben: Eine Störung der immunsuppressiven Funktion dieser Proteine wie der Induktion der Apoptose und der Unterdrückung der T-Zell-Proliferation führt zu einer mangelnden T-Zellsuppression und damit möglicherweise zu einer gesteigerten Autoimmunantwort [23]. Da die gegen den Tumor gerichtete Immunantwort dazu beizutragen scheint, dass der Tumor sich für einige Zeit nicht ausdehnt und die Erkrankung auf diese Weise einen gutartigeren Verlauf nimmt [29], könnte der Sinn der paraneoplastischen Autoimmunreaktion in der Abwehr des Tumors durch das Immunsystem vermutet werden. In einigen Studien konnte eine Assoziation zwischen einem positiven Antikörperbefund und einem längerem Überleben der untersuchten Patienten gefunden werden [20], [64]. Für die Behandlung der PNS wird eine frühzeitige Entfernung des Tumors und damit der ektopen Antigene empfohlen [61]. 8

14 Einleitung Aufgrund ihrer hohen Spezifität für einen zu Grunde liegenden Tumor gelten antineuronale Antikörper als wichtiger Indikator für einen noch nicht entdeckten Tumor [29], [61]. In vielen Fällen zeigt sich das PNS bevor sich der Tumor klinisch manifestiert [9], [29]. Aus diesem Grund misst man in der Tumorfrühdiagnostik dem Nachweis antineuronaler Antikörper eine wichtige Bedeutung bei Diagnostik Die Diagnosestellung eines PNS erfolgt hauptsächlich anhand der klinischen Symptomatik des Patienten in Assoziation mit einem (latenten) Tumor und dem Nachweis spezifischer Autoantikörper mittels Immunoblot oder in einem Enzymlinked immunosorbant-assay (ELISA). Voraussetzung ist, dass andere z.b. infektbedingte Ursachen eines neurologischen Syndroms ausgeschlossen werden können [61]. Zur Sicherung des Befundes erfolgt ein Bestätigungstest mit einem zweiten Verfahren, z.b. der indirekten Immunfluoreszenz. Von einer europäischen Konsensusgruppe wurden Diagnosekriterien und eine Einteilung in eine definitive und mögliche PNS vorgeschlagen [21]. Diese Kriterien basieren auf dem Vorhandensein eines neurologischen Syndroms, dem Nachweis sog. gut charakterisierter antineuronaler Antikörper sowie der Diagnosestellung eines für das PNS typischen Tumors. Hierbei wird zwischen gut charakterisierten antineuronalen Antikörpern und nicht gut charakterisierten Antikörpern unterschieden: Die Bezeichnung gut charakterisiert beinhaltet, dass die Antikörper von mindesten zwei Arbeitsgruppen bestätigt und an einer ausreichenden Anzahl von Patienten und Kontrollgruppen getestet wurden [61]. Zu diesen Antikörpern zählen anti-hud, anti-yo, anti-ma2, anti-ri, anti-cv2 und anti-amphiphysin. Kriterien, die zur Diagnose eines definitiven PNS führen: 1. Ein neurologische Syndrom (klassisch oder nicht klassisch) und Nachweis gut charakterisierter antineuronaler Antikörper. 2. Ein klassisches PNS und eine Tumordiagnose innerhalb von fünf Jahren. 9

15 Einleitung 3. Ein nicht klassisches Syndrom, Nachweis antineuronaler Antikörper (gut charakterisiert oder nicht gut charakterisiert) und eine Tumordiagnose innerhalb von fünf Jahren. 4. Ein nicht klassisches Syndrom bei bekanntem Tumorleiden und Besserung des neurologischen Syndroms nach Tumortherapie. Kriterien eines möglichen PNS: 1. Ein klassisches PNS, keine antineuronalen Antikörper, aber ein hohes Tumorrisiko (Risikofaktoren sind z.b. Rauchen, Alter über 40 Jahre oder keine Besserung der neurologischen Symptomatik nach Immuntherapie). 2. Ein neurologisches Syndrom (klassisch oder nicht klassisch) und Nachweis (noch) nicht gut charakterisierter Antikörper. 3. Ein nicht klassisches Syndrom, keine antineuronalen Antikörper, aber Tumordiagnose innerhalb von zwei Jahren. Die Kriterien zur Diagnosefindung der PNS zeigen, welchen hohen Stellenwert der Nachweis antineuronaler Antikörper in den letzten Jahren erlangt hat. Daher ist es nachvollziehbar, dass neben der Einteilung der PNS nach klinisch-anatomischen Gesichtspunkten (s. Tabelle 2) eine Klassifikation anhand des Antikörperbefundes zunehmend an Bedeutung gewonnen hat. In Tabelle 3 ist eine Übersicht der sechs gut charakterisierten antineuronalen Antikörper, die dieser Arbeit zu Grunde liegen, und den damit assoziierten Tumoren und häufig einhergehenden PNS zusammengefasst [29], [61]. 10

16 Einleitung Tabelle 3 - Gut charakterisierte antineuronale Antikörper Antikörper Anti-Hu Anti-Ri Anti-Yo Anti-Ma2 Anti-CV2 Anti-Amphiphysin Häufig assoziierte Tumore - Kleinzelliges Bronchial- Ca (- Neuroblastom) (- Prostata-Ca) - Mamma-Ca - Kleinzelliges Bronchial- Ca - Ovarial-Ca - Mamma-Ca - Seminom - Bronchial-Ca - Kleinzelliges Bronchial- Ca - Thymom - Mamma-Ca - Kleinzelliges Bronchial- Ca Neurologisches Syndrom - Limbische Enzephalitis - Hirnstammenzephalitis - Paraneoplastische Enzephalomyelitis - Subakute sensorische und autonome Neuropathie - Chronisch gastrointestinale Pseudoobstruktion - Kleinhirndegeneration - Opsoklonus-Myoklonus- Syndrom - Myelitis - Kleinhirndegeneration - Limbische Enzephalitis - Hirnstammenzephalitis - Kleinhirndegeneration - Limbische Enzephalitis - Kleinhirndegeneration - Sensible Polyneuropathie - Chronisch gastrointestinale Pseudoobstruktion - Lambert-Eaton-Syndrom - Stiff-Person-Syndrom - Neuropathie Tabelle 3 - Gut charakterisierte antineuronale Antikörper Spezifischer Antikörperindex Der Nachweis antineuronaler Antikörper kann sowohl im Serum als auch im Liquor erfolgen [16]. Aus dem Quotienten der spezifischen Antikörper beider Kompartimente im Verhältnis zum Quotienten des Gesamt-IgG in Liquor und Serum lässt sich der spezifische Antikörper-Index (AI) berechnen. Dieser dient als Maßstab zur Quantifizierung der intrathekalen Synthese spezifischer antineuronaler Antikörper. In einigen Fällen konnte beobachtet werden, dass die Antikörperkonzentration im Liquor höher war als im Serum [16]. Vega et al. beschreiben in einer Studie, dass bei Patienten mit einem anti-hu assoziierten PNS und einer klinischen Manifestation des Krankheitsbildes im ZNS eine intrathekale anti-hu Synthese aufgezeigt werden 11

17 Einleitung konnte, wohingegen bei Patienten mit einer isolierten paraneoplastischen sensorischen Neuropathie keine intrathekale Antikörpersynthese nachweisbar war [60]. Dies lässt vermuten, dass eine klinisch-immunologische Korrelation zwischen einer zentralen Manifestation bei positivem Antikörperindex einerseits und einer peripheren Manifestation bei fehlendem Nachweis einer spezifischen intrathekalen Synthese andererseits existiert. 12

18 Einleitung 1.3 Fragestellung Den Krankheitsbildern MS und PNS liegen höchstwahrscheinlich Autoimmunprozesse zu Grunde, deren Ursachen für beide Erkrankungen nicht vollständig geklärt sind. Bei der Erstmanifestation beider Erkrankungen können die Symptome der MS und PNS einander ähneln, so dass sich die Unterscheidung für den Kliniker als schwierig erweisen kann. So konnte bislang die Frage, ob das Krankheitsbild der MS in manchen Fällen durch eine antineuronale Immunreaktion eines PNS imitiert werden kann, nicht sicher beantwortet werden [39]. PNS sollten daher als mögliche Differentialdiagnose der MS in Erwägung gezogen werden. Sowohl bei der MS als auch den PNS ist es möglich, im Liquor und Serum der Patienten eine Vielzahl von Autoantikörpern nachzuweisen. Während solche Antikörper bei der MS allerdings nicht spezifisch sind, sondern auch bei anderen demyelinisierenden Erkrankungen vorkommen können [4], [19], liefert der Nachweis antineuronaler Antikörper einen direkten Hinweis auf eine paraneoplastische Genese [21], [61]. Bislang wurde noch kein größeres Kollektiv an MS-Patienten systematisch auf die Prävalenz der gut charakterisierten paraneoplastischen antineuronalen Antikörper untersucht. Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit ist deshalb die retrospektive Analyse der Seren eines großen Kollektives an MS-Patienten der Universitätsklinik Freiburg auf die Prävalenz der sechs gut etablierten Antikörper anti-hu, anti-yo, anti- Ma2, anti-ri, anti-cv2 und anti-amphiphysin. Ferner soll bei Seren, die einen positiven Antikörperbefund aufweisen, der spezifische Antikörperindex bestimmt werden und so eine Quantifizierung der intrathekalen Antikörpersynthese ermöglicht werden. Dabei liegen der vorliegenden Arbeit folgende Hypothesen zu Grunde: Sollte sich bei einem der MS-Patienten retrospektiv eine hohe antineuronale Aktivität nachweisen lassen, muss bei diesem Patienten die Diagnose MS reevaluiert werden und differentialdiagnostisch an ein PNS gedacht werden. Ferner stellt sich die Frage, ob bei der MS der Neuronenuntergang durch die entzündlich-degenerativen Prozesse zu einer sekundär-unspezifischen Erhöhung der gut etablierten antineuronalen Antikörper im Sinne eines Epiphenomens führen kann. 13

19 Patienten, Material, Methoden 2 Patienten, Material, Methoden In der vorliegenden Arbeit wurden retrospektiv die Seren von 247 Probanden auf die Prävalenz der antineuronalen Antikörpern anti-hud, anti-yo, anti-ma2, anti-ri, anti- CV2 und anti-amphiphysin untersucht. Der Antikörpernachweis erfolgte mittels ELISA, bei zweimalig positivem Testergebnis im ELISA wurden die Seren mit einem Bestätigungstest (Immunoblot und Immunfluoreszenz) untersucht. 2.1 Patientenkollektiv Im Zeitraum vom bis zum wurden in der neurologischen Abteilung der Universitätsklinik Freiburg 684 Patienten mit der Diagnose Multiple Sklerose (ICD G35.-, 341.-) erfasst. Aus dieser Patientengruppe wurde ein Kollektiv von 247 Probanden zusammengestellt, bei denen im Rahmen von Routineuntersuchungen in der Universitätsklinik Freiburg Serum und gegebenenfalls Liquor entnommen und bei -80 C tief gefroren worden war. Es erfolgte eine telefonische und schriftliche Kontaktaufnahme mit diesen Patienten, um über die Ziele und Inhalte der Studie aufzuklären. Des Weiteren wurde um eine mündliche und schriftliche Zustimmung zur retrospektiven Untersuchung der asservierten Proben gebeten. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Universitätsklinik Freiburg genehmigt (Antragsnummer Ethikkommission Freiburg: 214/09; Votum vom 09. Oktober 2006) Kriterien zur Unterteilung des Patientenkollektivs: Ausgehend von den Arztbriefen und Krankenakten der Patienten wurde das Kollektiv im Weiteren in folgende vier Gruppen unterteilt: Gruppe 1: Patienten mit primär chronisch progredient verlaufender MS (PPMS) Gruppe 2: Patienten mit schubförmig remittierender MS (RRMS) Gruppe 3: Patienten mir sekundär chronisch progredient verlaufender MS (SPMS) Gruppe 4: Patienten mit wahrscheinlicher MS (CIS) 14

20 Patienten, Material, Methoden Die Unterteilung des Patientenkollektivs in die vier Untergruppen orientierte sich an den unterschiedlichen Verlaufsformen der MS. Die Diagnose MS aller Patienten wurde klinisch, liquordiagnostisch und kernspintomographisch in der Routinediagnostik gesichert. Anhand der Arztbriefe wurden die Patienten unter Berücksichtigung des in der Anamnese beschriebenen Verlaufs der Symptome sowie dem dokumentierten Verlauf der Erkrankung gemäß der McDonald Kriterien [38] in die oben genannten Subgruppen eingeteilt. Für die einzelnen Definitionen der vier Untergruppen sei auf das Kapitel 1.1 in der Einleitung dieser Arbeit verwiesen. Abbildung 1 demonstriert die Einteilung des Patientenkollektives anhand eines Flussdiagrammes: Abbildung 1 - Einteilung des Patientenkollektives dargestellt als Flussdiagramm Kontrollkollektive Als Negativkontrolle dienten 45 Seren von gesunden Studenten und Liquor- /Serumproben von Patienten mit Normaldruckhydrozephalus (NPH), deren Studiendaten in einer vorausgegangen Arbeit von Barbara Kleer erhoben worden waren [31]. Als Positivkontrolle wurden die Liquor- und Serumproben von 23 Patienten verwendet, die klinisch und serologisch ein gesichertes PNS gemäß der 15

21 Patienten, Material, Methoden Konsensuskriterien von 2004 [21] mit hohen Titern der antineuronalen Antikörper anti-hud, Yo, Ri, Ma2, CV2 und Amphiphysin aufwiesen. 21 dieser Patienten wurden bereits in der vorausgegangenen Arbeit von Barbara Kleer untersucht [31]. 2.2 Versuchsmaterialien Antigene Die Untersuchung der Patientenproben im ELISA basierte auf der Verwendung der sechs gut charakterisierten onkoneuralen Antigene HuD, Ri, Ma2, Yo, Amphiphysin und CV2. Diese wurden mittels des Baclovirus Expressionssystems rekombinant hergestellt, unter Verwendung der Affinitätschromatographie gereinigt und von Ravo Diagnostika in Freiburg zur Verfügung gestellt Chemikalien Die verwendeten Chemikalien und weitere Laborreagentien sind im Anhang (s. Kapitel 7.1) aufgelistet Geräte Die Serum- und Liquorproben wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, Flachboden und hoher Bindungskapazität der Firma Greiner getestet: Abbildung 2 - ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen mit Flachboden 16

22 Patienten, Material, Methoden Die einzelnen Waschschritte erfolgten mit Hilfe eines Platten-Waschgerätes der Firma Tecan: Abbildung 3 - ELISA-Washer mit Wasser-, Pufferlösung- und Abfallbehälter Zur Inkubation bei 37 C wurden die ELISA-Platten in einem Wärmeschrank der Firma Heraeus Instruments aufbewahrt: Abbildung 4 - Wärmeschrank 17

23 Patienten, Material, Methoden Für die Messung der Farbreaktion wurden die Platten in einem ELISA-Reader der Firma Biolinx, Dynatec MR 4000, gelesen. Die Auswertung erfolgte an einer angeschlossenen Computerstation: Abbildung 5 - Plattenlesegerät und Computerarbeitsplatz 2.3 Methoden Der Nachweis und die Quantifizierung der antineuronalen Antikörper erfolgte mittels eines Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA): Funktionsprinzip des ELISA 1. Verdünntes Serum wird in die Vertiefungen (Wells) einer Mikrotiterplatte pipettiert. In diesen Wells sind spezifische Antigene gebunden (Festphase). 2. Wenn spezifische Antikörper (Primärantikörper) in den Serumproben vorhanden sind, binden diese an die adsorbierten Antigene. 3. In mehreren Spülschritten erfolgt die Entfernung nicht gebundener, überschüssiger Serumbestandteile. 4. Danach wird ein zweiter Antikörper aufgetragen, der gegen den ersten Antikörper gerichtet ist. An diesen Sekundärantikörper ist ein Enzym (Peroxidase) gekoppelt. 5. Im nächsten Schritt wird ein farbloses Substrat hinzugegeben, welches von dem Enzym in einen Farbstoff umgesetzt wird. 18

24 Patienten, Material, Methoden 6. Die Färbung lässt sich mit einem Photometer (ELISA-Reader) als optische Dichte (OD) messen: je mehr Primärantikörper im Serum vorhanden sind, desto intensiver ist der Farbumschlag des Substrates und desto größer ist die OD. Substrat Farbreaktion Optische Dichte ~ Antikörperkonzentration in Serumprobe Peroxidase-markierter Sekundärantikörper Probe mit Primärantikörper, der am Antigen bindet adsorbiertes Antigen Plattenboden Abbildung 6 - Funktionsprinzip des ELISA Durchführung des ELISA Im ersten Schritt erfolgte die Beschichtung der Mikrotiterplatte mit dem Antigen: Dazu wurde die entsprechende Menge Antigen (s. Tabelle 4) in Beschichtungspuffer (ph 9,6) verdünnt und jeweils 100µl in die Vertiefungen pipettiert. Die Mikrotiterplatte wurde dann über Nacht bei 4 C inkubiert, um eine Bi ndung des Antigens an die Platte zu erreichen. Am nächsten Tag wurde nach dreimaligem Waschvorgang mit Waschpuffer je 100µl Verdünnungspuffer in die Wells aufgetragen und die Platten bei Raumtemperatur erneut inkubiert, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Im zweiten Schritt wurden die Serumproben mit Verdünnungspuffer je nach zu bestimmenden Antikörper im Verhältnis 1:2000, 1:1000 und 1:500 verdünnt (s. Tabelle 4) und je 100µl der Proben in die Wells pipettiert. Zur Doppeltbestimmung wurden dabei jeweils zwei Vertiefungen mit derselben Probe gefüllt. Zusätzlich zu 19

25 Patienten, Material, Methoden den Serumproben wurden auf jeder Platte ein Positiv-, eine Negativkontrolle und ein Leerwert (nur Verdünnungspuffer) mitgeführt. Während der 30 minütigen Inkubation bei 37 C konnten eventuell vorhandene Antikörper au s der Serumprobe an das Antigen binden. Die Platten wurden erneut dreimal gewaschen und mit Verdünnungspuffer für eine Stunde geblockt. Nachdem der mit Peroxidase (HRP; horse radish peroxidase) konjugierte Sekundärantikörper zuvor im Verhältnis von 1:5000 in Verdünnungspuffer verdünnt worden war, wurde dieser nun mit jeweils 100µl in die Vertiefungen aufgetragen, die Platten bei 37 C über dreißig Minuten inkubiert und danach erneut dreimal gewaschen. Für die Farbentwicklung wurden vier Orthophenylendiamin- (OPD) Tabletten eine halbe Stunde vor dem Entwicklungsschritt lichtgeschützt in 12ml Aqua dest. aufgelöst und kurz vor Start der Reaktion 10µl H dazugegeben. Dann wurden jeweils 100µl dieser Substratlösung in die Wells pipettiert und nach der jeweiligen Entwicklungszeit (s. Tabelle 4) 50µl H 2 SO 4 dazu gegeben, um den Farbumschlag zu stoppen. Tabelle 4 - Konzentrationen für Antigenbeschichtung, Serumverdünnungen, Entwicklungszeiten und Cut off-werte der jeweiligen Antigene Antigen Konzentration Beschichtung Serumverdünnung Entwicklungszeit [min] Cut off [mg/l] HuD 0,8 1:500 1:15 0,077 Ri 0,2 1:1000 1:30 0,065 Yo 0,4 1:2000 1:15 0,049 Ma 2 0,8 1:500 1:30 0,177 CV2 0,2 1:1000 1:30 0,156 Amphiphysin 0,2 1:1000 1:30 0,099 Tabelle 4 - Konzentrationen für Antigenbeschichtung, Serumverdünnungen, Entwicklungszeiten und Cut off-werte der jeweiligen Antigene Im letzten Schritt erfolgte die Bestimmung der optischen Dichte mittels Photometer (ELISA-Reader) bei einer Wellenlänge von 410 nm. Zur Auswertung wurden die Mittelwerte der jeweiligen Doppeltbestimmungen berechnet und die Mittelwerte der Leerwertbestimmungen abgezogen. 20

26 Patienten, Material, Methoden In einer vorausgegangenen Arbeit von Barabara Kleer wurden die Cut off-werte unter Verwendung der 45 Seren von NPH-Patienten und Studenten (Negativkontrollen) bestimmt (s. Tabelle 4) [31]. Lagen die Ergebnisse der OD- Messung über diesen Werten, wurde die Serumprobe als positiv gewertet und in einem zweiten Durchlauf sowie in einer seriellen Verdünnung des Serums in direktem Vergleich zu einer seriellen Verdünnung einer Positivkontrolle erneut getestet Immunoblot mit rekombinanten Antigenen (Ravoblot) Bei positivem Befund im ELISA diente ein Immunoblot (ravo PNS blot, Ravo Diagnostika GmbH, Freiburg) als Bestätigungstest. Dieses Testverfahren verwendet rekombinante Antigene (HuD, Yo, Ri, Ma2, CV2, Amphiphysin) zum Nachweis antineuronaler Antikörper: Dabei werden verdünnte Serumproben (1:2000) auf Teststreifen mit Antigenen aufgetragen und 60 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Gebundene Antikörper können nun durch Zugabe eines mit Alkalischer Phosphatase markierten IgG-Konjugats (30 Minuten Inkubation) und eines gebrauchsfertigen Substrates (25 Minuten Inkubation) sichtbar gemacht werden. Die Farbreaktion wird durch Spülen mit Aqua dest. gestoppt und die Teststreifen mit einer Positivkontrolle verglichen Immunfluoreszenz Als dritte Methode zum Nachweis antineuronaler Antikörper wurde die indirekte Immunfluoreszenz herangezogen (Neurologie-Mosaik 1, Euroimmun, Lübeck, Germany). Bei diesem Verfahren werden Gewebeschnitte vom Primaten (Cerebellum, Darm und peripherer Nerv) als Antigen-Substrate verwendet. Während einer ersten Inkubationszeit von 30 Minuten binden sich bei positiven Proben die nachzuweisenden Antikörper aus dem verdünnten Patientenserum an die Antigene im Gewebe. Nach einem zweiten Inkubationsschritt (30 Minuten) mit Fluoreszinmarkierten Antikörpern und anschließendem mehrfachen Waschen können die gebundenen Antikörper im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden. 21

27 Patienten, Material, Methoden In den Abbildungen 7 und 8 sind eine Negativkontrolle und eine Positivkontrolle für das Yo-Antigen dargestellt. Abbildung 7 - Negativkontrolle Yo, Cerebellum Abbildung 8 - Positivkontrolle Yo, Cerebellum Spezifischer Antikörperindex Bei Seren, die einen positiven Antikörperbefund im ELISA aufwiesen, wurde der spezifische Antikörperindex (AI) bestimmt, um damit eine Quantifizierung der intrathekalen Synthese antineuronaler Antikörper zu ermöglichen. Der AI wird aus dem Konzentrationsquotienten der spezifischen Antikörper in Liquor und Serum (Q spez ) einerseits und dem Gesamt-IgG-Quotienten in Liquor und Serum (Q IgG ) andererseits nach folgender Formel berechnet: 1) AI = Q spez /Q IgG Die Gesamt-IgG-Konzentration im Liquor kann durch verschiedene Prozesse beeinflusst werden und damit zu einer Verfälschung des AI führen: Entzündliche Prozesse im ZNS, die zu einer polyspezifischen intrathekalen Immunantwort führen, und Funktionsstörung der Blut-Liquor-Schranke können eine erhöhte Konzentration des Gesamt-IgG im Liquor zur Folge haben. Dadurch würde der AI mit falschniedrigen Werten berechnet werden [54]. Aus diesem Grund wird Q IgG mit dem Albuminquotienten (Q Alb ) verglichen. Dieser ist ein Indikator für die Integrität der Blut-Liquor-Schranke, da Albumin ausschließlich 22

28 Patienten, Material, Methoden peripher, d.h. in der Leber produziert wird. Die nicht-lineare Beziehung zwischen Q IgG und Q Alb wird nach Reiber und Peter als eine hyperbolische Funktion dargestellt [49]: 2) Q Lim (Q IgG ) = 0,93 (Q Alb )² + 6 x ,7 x 10-3 Durch diese Funktion kann im so genannten Reibergramm zwischen einer isoliert intrathekalen und einer peripheren IgG-Synthese mit Übertritt von IgG nach intrathekal unterschieden werden: Q IgG -Werte, die oberhalb von Q Lim liegen, geben Hinweis auf eine polyspezifische intrathekale IgG-Synthese. In diesem Fall wird die Berechnung des AI auf Q Lim bezogen, damit die spezifische intrathekale Synthese nicht unterschätzt wird. Deshalb gilt: - AI = Q spez / Q IgG für Q IgG < Q Lim - AI = Q spez / Q Lim für Q IgG > Q Lim Als Referenzbereich gelten Werte für AI = 0,7-1,3. Werte des AI > 1,4 sind als pathologisch anzusehen und sprechen für eine intrathekale Synthese spezifischer Antikörper Bestimmung des Antikörperindexes Zur Berechnung von Q spez wurden mittels ELISA die ODs der Liquor-Serum-Paare bei verschiedenen Konzentrationen (20 mg/l, 10 mg/l, 5 mg/l, 2,5 mg/l, 1,25 mg/l, 0,63 mg/l) bestimmt: Dafür wurden die Probenpaare in Liquor und Serum beginnend bei 20 mg/l mit Verdünnungspuffer auf die gleiche IgG-Konzentration angeglichen und seriell verdünnt. Die Gesamt-IgG-Konzentrationen des Liquors (IgG Liquor ) und des Serums (IgG Serum ) sowie die Albuminkonzentrationen wurden im Routinelabor im Nephelometer bestimmt. Aus den im ELISA ermittelten ODs des Liquors (OD Liquor ) und des Serums (OD Serum ) und den Gesamt-IgG-Konzentrationen ließ sich nach der oben genannten Formel 1) der AI berechnen: 23

29 Patienten, Material, Methoden a) Q spez = OD Liquor / OD Serum b) Q IgG = IgG Liquor / IgG Serum Und daraus folgend: c) AI = Q(OD Liquor / OD Serum )/ Q(IgG Liquor / IgG Serum ) Mit Hilfe der Albuminkonzentrationen wurde nach Formel 2) Q Lim berechnet und mit Q IgG verglichen: Für Patienten mit Hinweis auf eine polyspezifische IgG- Konzentration (Q IgG > Q Lim ) wurde anstelle von Q IgG zur Berechnung des AI Q Lim herangezogen: d) AI = Q(OD Liquor / OD Serum )/ Q Lim Auf diese Weise erhielt man entsprechend der Konzentrationsschritte je sechs Einzelwerte des AI. 24

30 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Demographische Daten Insgesamt ergab sich innerhalb des Gesamtkollektivs eine Geschlechterverteilung von 82 Männern und 165 Frauen. Das durchschnittliche Alter bei Probenentnahme betrug 39,0 Jahre. Die größte Subgruppe stellte die Gruppe der RRMS mit insgesamt 136 Patienten dar, die Gruppen der PPMS, SPMS und wahrscheinliche MS/CIS umfassten jeweils 53, 32 und 26 Patienten. In Tabelle 5 finden sich die demographischen Daten des Probandenkollektivs und der Untergruppen zusammengefasst. Tabelle 5 - Demographische Daten der Patienten und Kontrollgruppen Gruppe/Subgruppe n Altersdurchschnitt und Standardabweichung Geschlecht (M/F) MS-Verlaufsform: PPMS 53 45,1 (10,7) 25/28 RRMS ,9 (10,3) 35/101 SPMS 32 42,9 (14,4) 10/22 wahrscheinliche 26 38,6 (10,6) 12/14 MS/CIS Total ,0 (11,5) 82/165 PPMS: primär chronisch progrediente MS; RRMS, schubförmig remittierende MS; SPMS, sekundär chronisch progrediente MS; CIS: klinisch isoliertes Syndrom Tabelle 5 - Demographische Daten der Patienten und Kontrollgruppen 3.2 Patienten mit Krebserkrankungen Bei drei der 247 (1,2%) getesteten MS-Patienten wurde in der Vorgeschichte von einem Tumor bzw. dem Verdacht auf eine Krebserkrankung berichtet: Ein PPMS-Patient mit Zustand nach transurethaler Prostataresektion bei inzidentiellem Prostatakarzinom (pt1agi) im Jahr 1996 und einer monoklonalen Gammopathie vom Typ IgG mit Verdacht auf Plasmozytom. Zum Zeitpunkt der Blutentnahme war der Patient 69 Jahre alt, zwischen 25

31 Ergebnisse Tumordiagnose und dem Auftreten neurologischer Symptome lagen zwei Jahre. Eine RRMS-Patientin mit unklarer suprasellärer Raumforderung im MRT 2001, DD Zyste der Rathke-Tasche. Das Alter dieser Patientin betrug bei Probenentnahme 35 Jahre, zwischen dem Verdacht auf eine mögliche Tumorerkrankung und den neurologischen Beschwerden lag ein Jahr. Eine SPMS-Patientin mit Zustand nach Corpus uteri-karzinom, Erstdiagnose 1998, die Therapie beinhaltete eine Totaloperation und eine perkutane und intravaginale Bestrahlung, in den Nachsorgeuntersuchungen fand sich kein Anhalt für ein Rezidiv. Bei Blutentnahme war die Patientin 64 Jahre alt, das Intervall zwischen Tumordiagnose und der neurologischen Symptomatik betrug drei Jahre. Gesicherte Malignome im untersuchten MS-Kollektiv traten damit nur bei zwei von 247 Patienten (0,8%) auf. 3.3 Sensitivität und Spezifität des ELISA Zur Etablierung des ELISA wurden in einer vorausgehenden Arbeit von Barbara Kleer die Sensitivität und Spezifität der Methode bestimmt [31]: Dafür wurden 21 Seren von Patienten, die eindeutig eine Paraneoplasie aufwiesen, für alle sechs Antigene getestet. Alle zeigten ein eindeutig positives Ergebnis mit OD-Werten zwischen 0,4 und 1,6. Damit konnte für den ELISA eine Sensitivität von 100% demonstriert werden. Die Spezifität wurde anhand einer Gruppe von Negativkontrollen untersucht. Diese beinhaltete Patienten mit nicht-entzündlichen neurologischen Erkrankungen (NPH- Patienten) und gesunde Studenten. Jeweils eine Serumprobe zeigt eine geringe Reaktion mit den Antigenen CV2 und Yo. Für diese beiden Antigene konnte somit eine Spezifität von 98,9% ermittelt werden, für die übrigen Antigene wurde eine Spezifität von 100% erreicht. 26

32 Ergebnisse 3.4 Prävalenz antineuronaler Antikörpern bei Patienten mit Multipler Sklerose Bei keinem der 247 Seren der MS-Patienten konnte im ELISA eine hohe Konzentration der antineuronalen Antikörpern anti-hud, anti-ri, anti-yo, anti-cv, anti-ma2 oder anti-amphiphysin nachgewiesen werden. In Tabelle 6 sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der optischen Dichte für die jeweiligen MS-Untergruppen und der 45 Negativ- und 21 Positivkontrollen aufgezeigt. Tabelle 6 - Mittelwerte und Standardabweichungen der Optischen Dichte (OD) MS-Verlaufsform: PPMS 0,019 (0,017) Antigen: HuD Ri Yo CV2 Ma2 Amphiphysin 0,005 (0,008) 0,010 (0,010) 0,008 (0,016) 0,024 (0,023) 0,008 (0,014) RRMS 0,020 (0,016) 0,006 (0,009) 0,008 (0,011) 0,009 (0,019) 0,022 (0,022) 0,007 (0,011) SPMS 0,019 (0,025) 0,007 (0,010) 0,004 (0,004) 0,005 (0,007) 0,022 (0,024) 0,003 (0,005) wahrscheinliche MS/CIS 0,019 (0,017) 0,009 (0,016) 0,005 (0,006) 0,007 (0,010) 0,021 (0,025) 0,011 (0,018) MS gesamt 0,019 (0,018) 0,006 (0,010) 0,007 (0,010) 0,008 (0,017) 0,022 (0,023) 0,007 (0,012) Kontrollen: Negativkontrollen (Studenten und NPH) 0,024 (0,013) Positivkontrollen 0,724 (0,183) 0,020 (0,011) 0,826 (0,372) 0,007 (0,011) 1,062 (0,393) 0,031 (0,031) 0,776 (0,481) 0,046 (0,033) 0,602 (0,102) 0,031 (0,017) 1,342 (0,000) Cut off: 0,077 0,065 0,049 0,156 0,177 0,099 Tabelle 6 - Mittelwerte und Standardabweichungen der Optischen Dichte (OD) 27

33 Ergebnisse Zwei Patienten wiesen eine sehr niedrige Antikörperkonzentration auf, davon zeigte: ein Patient mit einer SPMS einen mäßig positiven Befund für das HuD-Antigen (OD: 0,138, Cut off: 0,077) eine Patientin mit einer RRMS einen schwach positiven Befund für das Yo- Antigen (OD: 0,094, Cut off: 0,049) Diese beide Seren wurden mittels Immunoblot und indirekter Immunfluoreszenz erneut auf antineuronale Antikörper getestet: In keinem der beiden Verfahren konnte ein positives Ergebnis erzielt werden. Auch in einer zusätzlich angefertigten seriellen Verdünnungsreihe (1:500 bis 1:64000) zeigte die HuD-Probe im Gegensatz zur Positivkontrolle (dazu s. Tabelle 7, Kapitel 3.5) bereits im zweiten Verdünnungsschritt OD-Werte unterhalb des Cut offs. Für Yo konnte in der Verdünnungsreihe in keinem Schritt ein positives Ergebnis wiederholt werden. Für die Antigene Ri, CV2, Ma2 und Amphiphysin konnte in keinem der Seren eine positive Antikörperreaktion nachgewiesen werden. Auch die Patienten, bei denen in der Vorgeschichte ein Tumorleiden oder der Verdacht auf eine Krebserkrankung (s. Kapitel 3.2) festgestellt worden war, zeigten keinen Hinweis auf das Vorhandensein antineuronaler Antikörper. Die Ergebnisse des ELISA sind in den nachfolgenden Abbildungen 9 bis 14 dargestellt, wobei jeder Punkt dem Messwert der optischen Dichte eines Patientenserums entspricht. Werte über der Cut-off-Linie gelten als positiv. 28

34 Ergebnisse Anti-HuD Antikörper 1,200 1,000 0,800 OD 0,600 0,400 0,200 Cut off: 0,077 0,000 gesunde Studenten NPH PPMS RRMS SPMS wahrsch. MS/CIS Positivkontrollen Abbildung 9 - Optische Dichte-Werte (OD) aller getesteten Probanden einschließlich Positivund Negativkontrollen für HuD Anti-Ri Antikörper 1,200 1,000 0,800 OD 0,600 0,400 0,200 Cut off: 0,065 0,000 gesunde Studenten NPH PPMS RRMS SPMS wahrsch. MS/CIS Positivkontrollen Abbildung 10 - Optische Dichte-Werte (OD) aller getesteten Probanden einschließlich Positivund Negativkontrollen für Ri 29

35 Ergebnisse Anti-Yo Antikörper 1,600 1,400 1,200 1,000 OD 0,800 0,600 0,400 0,200 Cut off: 0,049 0,000 gesunde Studenten NPH PPMS RRMS SPMS wahrsch. MS/CIS Positivkontrollen Abbildung 11 - Optische Dichte-Werte (OD) aller getesteten Probanden einschließlich Positivund Negativkontrollen für Yo Anti-Ma2 Antikörper 0,800 0,700 0,600 0,500 OD 0,400 0,300 0,200 Cut off: 0,177 0,100 0,000 gesunde NPH Studenten PPMS RRMS SPMS wahrsch. MS/CIS Positivkontrollen Abbildung 12 - Optische Dichte-Werte (OD) aller getesteten Probanden einschließlich Positivund Negativkontrollen für Ma2 30

36 Ergebnisse Anti-CV2 Antikörper 0,900 0,800 0,700 0,600 0,500 OD 0,400 0,300 Cut off: 0,156 0,200 0,100 0,000 gesunde Studenten NPH PPMS RRMS SPMS wahrsch. MS/CIS Positivkontrollen Abbildung 13 - Optische Dichte-Werte (OD) aller getesteten Probanden einschließlich Positivund Negativkontrollen für CV2 Anti-Amphiphysin Antikörper 1,400 1,200 1,000 OD 0,800 0,600 0,400 0,200 Cut off: 0,099 0,000 gesunde wahrsch. NPH PPMS RRMS SPMS Studenten MS/CIS Positivkontrolle Abbildung 14 - Optische Dichte-Werte (OD) aller getesteten Probanden einschließlich Positivund Negativkontrollen für Amphiphysin 31

37 Ergebnisse 3.5 Positivkontrollen Die in der vorliegenden Arbeit mitgetesteten sechs Positivseren zeigten alle hohe Konzentrationen der antineuronalen Antikörper anti-hud, anti-ri, anti-yo, anti-cv, anti-ma2 oder anti-amphiphysin im Bereich zwischen 0,2 und 1,1. In Tabelle 7 sind die Mittelwerte der ODs der Positivkontrollen und die Ergebnisse der seriellen Verdünnung dieser Kontrollen aufgelistet: Tabelle 7 - Mittelwert und Standardabweichung der Optischen Dichte der Positivkontrollen MW (SD) 0,222 (0,071) Verdünnung HuD Ri Yo CV2 Ma2 Amphiphysin 0,826 (0,424) 0,876 (0,087) 0,420 (0,123) 0,726 (0,205) Optische Dichte in serieller Verdünnung 1:500 0, , ,835 1,047 1,039 (0,426) 1:1000 0,117 0,68 1,113 1,224 0,516 1,019 1:2000 0,096 0,510 0,952 1,000 0,294 0,923 1:4000 0,036 0,37 0,832 0,701 0,158 0,777 1:8000 0,057 0,244 0,658 0,471 0,076 0,648 1: ,004 0,169 0,492 0,286 0,036 0,450 1: ,006 0,117 0,307 0,189 0,013 0,323 1: ,001 0,093 0,164 0,120 0,007 0,189 Tabelle 7 - Mittelwert und Standardabweichung der Optischen Dichte der Positivkontrollen 3.6 Antikörperspezifitätsindex Bei den beiden im ELISA schwach positiv getesteten Seren wurde die Antikörperreaktivität im Liquor bestimmt. Dabei fanden sich in beiden Fällen im Vergleich zur Kontrollgruppe (10 NPH Patienten; [31]) keine signifikant erhöhte ODs als Hinweis auf eine intrahekale antigenspezifische Synthese. Aus diesem Grund konnte die Berechnung des spezifischen Antikörperindexes nicht erfolgen. 32

38 Diskussion 4 Diskussion Sowohl der Multiplen Sklerose (MS) als auch paraneoplastischen neurologischen Syndromen (PNS) liegen wahrscheinlich Autoimmunprozesse zu Grunde, die im Krankheitsverlauf zu einer entzündlich-autoimmunologischen Schädigung des Nervensystems führen. Da PNS auch isoliert das zentrale Nervensystem betreffen können, kann sich in seltenen Fällen die Differenzierung eines PNS von einer MS als schwierig gestalten, weil sich die Klinik bei Erstmanifestation der beiden ätiologisch unterschiedlichen Krankheitsbilder ähneln kann. So finden sich z.b. die klinischen Syndrome einer Optikusneuritis oder einer Encephalomyelitis bei beiden Erkrankungen [6], [10], [12], [22]. Fallbeispiel Im Neurologischen Zentrum der Universitätsklinik Freiburg wurde ein Fall beobachtet, dessen Symptomatik die Kliniker zuerst an eine MS denken ließ, die Bestimmung antineuronaler Antikörper letztendlich aber wegweisend für die Diagnose eines PNS war: Ein 47-jähriger, männlicher Patient stellte sich mit seit über einem Jahr andauernder, an Intensität zunehmender Gangstörungen vor. Zusätzlich berichtete er über eine depressive Verstimmung und das Auftreten transienter Doppelbilder. Die neurologische Untersuchung ergab eine spastische Paraparese und eine Pallhypästhesie der Extremitäten. Aufgrund dieser Befunde und dem Nachweis eines für die MS typisch veränderten Liquorbefundes wurde mit dem Patienten die Verdachtsdiagnose einer chronisch progredienten MS besprochen. Nachdem zwei Jahre nach Diagnosestellung der MS ein kleinzelliges Bronchialkarzinom festgestellt worden war, konnten in einer retrospektiven Serumanalyse die antineuronalen Antikörper anti-hud und anti-cv2 bereits zum Zeitpunkt der vermeintlichen MS- Diagnosestellung nachgewiesen werden. Anhand dieser neuen Befunde wurde die Diagnose eines PNS gestellt. Dieser Fall zeigt, dass PNS eine Differentialdiagnose der MS darstellen können. Mit dem Nachweis der antineuronalen Antikörper ergibt sich ein direkter Hinweis auf ein paraneoplastisches Geschehen und damit auf einen oftmals okkulten Tumor [21]. Vor diesem Hintergrund wurden in der vorliegenden Arbeit die Seren von 247 MS- Patienten auf das Vorhandensein der sechs gut charakterisierten antineuronalen 33