Vorlesung Neurobiologie Alexander Gottschalk SS Vorlesung # 8 G-Protein gekoppelte Rezeptoren metabotrope Neurotransmitter Rezeptoren 15.6.

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1 Vorlesung Neurobiologie Alexander Gottschalk SS 2010 Vorlesung # 8 G-Protein gekoppelte Rezeptoren metabotrope Neurotransmitter Rezeptoren

2 Metabotrope (G-Protein-gekoppelte) Neurotransmitter Rezeptoren (GPCRs) G-Protein gekoppelte Rezeptor/Ionenkanal Systeme: 1. Rezeptor triggert G-Protein Kaskade 2. G-Protein kann entweder direkt Ionenkanal öffnen oder es setzt eine 2 nd messenger Kaskade in Gang; der 2 nd messenger öffnet dann den Ionenkanal 3. in seltenen Fällen kann der GPCR direkt einen Ionenkanal öffnen langsamer als ligandengesteuerte Ionenkanäle, aber auch vielseitiger: - Verzögerung der Signalweiterleitung möglich - Signalweiterleitung kann abhängig von Persistenz des 2 nd messenger wesentlich länger dauern, als ursprünglicher Stimulus anhielt -2 nd messenger kann Funktion eines Ionenkanals auch nur modulieren - Amplifikation des Signals möglich durch Aktivierung vieler Kanäle - mehrere Arten von Kanälen durch gleichen 2 nd messenger steuerbar - gleichzeitig andere zelluläre Prozesse durch 2 nd messenger steuerbar

3 2 nd messenger Systeme und Neurotransmission Adenylatzyklase / camp System: camp kann direkt Ionenkanäle öffnen, oder über Proteinkinase A Zielproteine (z.b. Ionenkanäle) phosphorylieren Guanylatzyklase / cgmp System: aktiviert cgmp-abhängige Proteinkinase, die wiederum Zielproteine (z.b. Ionenkanäle) phosphoryliert Phospholipase System: Erzeugt 2 nd messenger aus Membranlipiden: Inositoltriphosphat (IP 3 ), Diacylglyzerin (DAG), Arachidonsäure; diese können direkt Ionenkanäle öffnen (IP 3 -Rezeptor, Ca 2+ -Kanal in ER Membran), oder über Proteinkinase C (aktiviert von DAG und Ca 2+ ) Zielproteine phosphorylieren Ca 2+ als 2 nd messenger: Eintritt ins Zytosol durch spannungsgesteuerte Ca 2+ - Kanäle, IP 3 -Rezeptor, Ryanodin-Rezeptor. Viele Zielproteine, z.t. beeinflußt durch Calmodulin (z.b. CaMKII, Calcineurin). Direkter Einfluß auf Ca 2+ -abhängige Ionenkanäle, PKC-Phosphorylierung, etc. β-arrestin-vermittelte Signaltransduktion

4 GPCRs sind Mitglieder einer sehr grossen Genfamilie größte Genfamilie, mindestens 600 verschiedene beim Menschen, ca. 900 verschiedene bei Caenorhabditis elegans, zumeist Chemorezeptoren basierend auf heutigen Informationen kann man die GPCRs in drei Unterfamilien einteilen: - Rhodopsin / adrenerge Rezeptor Familie, Familie A Rezeptoren für ACh, Purine, Dopamin, Catecholamine, Serotonin - Secretin-vasoactive intestinal peptide Rezeptor Familie Neuropeptide (?) - metabotroper Glutamatrezeptor Familie mglurs, GABA B Rezeptoren

5 Die Struktur der GPCRs folgt einem generellen Modell schematische Struktur des β-adrenergen Rezeptors mit Darstellung der Noradrenalin-Bindungsstelle; Vergleich mit der ACh-Bindungsstelle im machr aber: manche GPCRs (mglur, GABA B, Neuropeptid-Rezeptoren haben grosse extrazelluläre Domänen, die die Transmitter-Bindestellen enthalten)

6 Konservierte Aminosäuren im machr rosa: finden sich in allen GPCRs gelb: Aminosäuren, die für die ACh Bindung im machr wichtig sind, befinden sich auf der gleichen Höhe relativ zur Membran

7 Die Struktur von Rhodopsin (cryo-em bzw. Kristall)

8 GPCR Domänen sind austauschbar, Hinweis auf Oligomerbildung Oligomerisierung durch Hefe Zwei-Hybrid Interaktionen, Co-Präzipitation und FRET-Studien belegt; wichtig für Interaktion ist der C-Terminus

9 Struktur des β2-adrenergen Rezeptors (2007) Komplex mit Fab gegen den IL 3

10 Struktur des β2-adrenergen Rezeptors (2007) II Bindungstasche inverser Agonist inaktiviert eine konstitutiv aktive Konformation Rezeptor konnte über immobilisierten Agonisten (Affinitätssäule) zu 100 % aktiv isoliert werden, Carazolol stabilisiert Rezeptor während Kristallisation

11 Struktur des β2-adrenergen Rezeptors (2007) III Movie Austausch von IL 3 mit T4 Lysozym

12 Struktur des β2-ar Dimerisierung?

13 β2-ar Vergleich mit Rhodopsin & Ligandenbindung B2-AR Rhodopsin

14 Kristallstruktur des β-adrenergen Rezeptors β-adrenerger Rezeptor konnte kristallisiert werden weil: a) Flexibler intrazellulärer loop III wurde stabilisiert durch Fab, bzw. genetisch ersetzt durch T4 Lysozym b) Affinitätssäule mit Alprenolol erlaubt Aufreinigung von 100 % aktivem Rezeptor c) Weitere Stabilisierung durch hochaffinen Liganden Carazolol d) Neue Kristallisationstechniken ( Bicellen, lipid cubic phases), unter Einbeziehung von natürlicher Lipidumgebung, mikrofokussierte x-rays Ähnlichkeit zu Rhodopsin in einigen Bereichen der Struktur (läßt Schluß auf ähnlichen Transduktionsmechanismus zu), aber in anderen Bereichen sehr Unterschiedlich (z.b. extrazelluläre Helix, die Ligandenbindestelle offen hält In Rhodopsin dagegen auf die Oberfläche kollabiert um hydrophobe Bindungstasche von cis-retinal abzuschliessen

15 β2-ar Ligandenbindung und Aktivierung - Modell Norepinephrin Movie ionic lock

16 β2-ar Ligandenbindung und Aktivierung - Modell Norepinephrin Movie ionic lock

17 FRET Studien zu ligandenabghängigen GPCR Konformationsänderung und GPCR-G Protein oder GPCR-Arrestin Bindung HEK293 Zellen, die PTHR (Parathyroid Hormone receptor) Förster Radius: 4.9 nm Lohse et al. (2008) Villardaga et al.

18 FRET Studien zu GPCR Liganden G Protein Interaktion PTH 1-34 und PTH 1-36 : Unterschiedliche Varianten des PTH Hormons, dauerhaft oder transient aktivierend

19 Weitere Eigenschaften von GPCRs - ein GPCR kann mit mehreren Sorten von G-Proteinen interagieren (Bsp.: α2ar hat mindestens zwei Konformationen, eine interagiert mit G-Protein, das Phospholipase C aktiviert, eine andere mit G-Protein, das Phospholipase A2 aktiviert) mehrere verschiedene Effektorenzyme und Signalkaskaden stimulierbar - Interaktion mit G-Protein erhöht Affinität für Transmitter verlängert die Dauer der Interaktion mit G-Protein erhöht Menge an erzeugtem Signal - ein aktivierter GPCR kann nacheinander viele G-Proteine stimulieren ( "collision coupling") Menge an exprimiertem GPCR bestimmt die Empfindlichkeit für den NT - Desensitisierung der GPCRs erlaubt der Zelle, die Empfindlichkeit für NT zu reduzieren

20 Modifikationen von GPCRs - Posttranslationale Modifikationen wie Glycosylierung der extrazellulären Domäne haben positiven Einfluss auf Membraninsertion und Trafficking - Disulfidbrücke in extrazellulären Loops e2 und e3 stabilisiert Struktur, für Bildung der Bindungstasche notwendig - Cystein in C-terminaler Domäne wird mit Fettsäuren (Palmitat) modifiziert, zur Stabilisierung der Wechselwirkung von C-Terminus und Membran - Phosphorylierung führt zu Desensitisierung (s.u.)

21 Desensitisierung von GPCRs Reduzierung der Sensitivität der Zelle für Neurotransmitter durch - kovalente Modifikation, z.b. Phosphorylierung; Sekunden bis Minuten - Entfernung der GPCR von Zelloberfläche, entweder reversibel (Rezeptoren werden in intrazellulärem Kompartiment (early endosomes) zwischengelagert : Sequestration, oder irreversibel (Rezeptoren werden abgebaut); Minuten bis Stunden

22 Desensitisierung durch Phosphorylierung mind. 3 Kinasen involviert: PKA, PKC und G-Protein Rezeptor Kinasen (GRKs) PKA und PKC phosphorylieren Stellen in der i3 Loop Region und dem cytoplasmatischen C-Terminus; dies verhindert die Interaktion mit G-Proteinen; unabhängig von Agonist GRKs phosphorylieren nur den agonist-gebundenen Rezeptor, auch in der C- terminalen Domäne (andere Stellen als PKA, PKC); phosphorylierter Rezeptor bindet Arrestin, das Wechselwirkung mit G-Proteinen verhindert; dissoziierte Gβγ UE binden GRKs und rekrutieren sie zu Bereichen mit aktiven GPCRs

23 Desensitisierung durch Internalisierung und Abbau schneller, reversibler Prozess: Sequestration durch Endozytose; keine Phosphorylierung notwendig, aber PKA und GRK Phosphorylierung und Arrestin-Bindung begünstigen den Prozeß; intrazellulär wird GPCR dephosphoryliert, kann im basalen Zustand auf Zelloberfläche zurückkehren langsamer, irreversibler Prozess: Endozytose und anschließend Abbau in Lysosomen; Rolle von Phosphorylierung durch PKA nicht klar; innerhalb ca. 4h; längerfristig (>14h) kommt es zu einer Herabregulierung der GPCR Transkription

24 Ferrandon et al. GPCR Internalisierung, ligandeninduziert

25 Neue Erkenntnisse: GPCRs koppeln über β- Arrestine zu weiteren Signaltranduktionswegen "klassisch" neuere Erkenntnisse β-arrestine dienen als multifunktionale Adapterproteine

26 zahlreiche Interaktionspartner von β- Arrestinen wurden identifiziert

27 Aktivierung von Genexpression durch β-arrestin-vermittelte GPCR-Endocytose und Interaktion von β-arrestin mit Komponenten der MAPK Kaskade

28 Interaktionsdomänen von β-arrestin mit Clathrin und AP2 (Endozytose), sowie MAP- und anderen Kinasen

29 Bindung von phosphoryliertem GPCR verändert die Konformation von β-arrestin C-Terminus enthält Bindestellen für Clathrin und AP2

30 Direkte Wechselwirkung von GPCRs mit ionotropen Rezeptoren D5 Dopamin Rezeptor (GPCR) kann direkt an GABA A Rezeptor (ionotrop) binden, über Wechselwirkung der C-terminalen Domäne mit dem 2. intrazellulären loop des γ2-untereinheit des GABA A Rezeptors Wechselwirkung inhibiert wechselseitig die Funktion der Rezeptoren, Interaktion ist abhängig von Bindung der Liganden (Dopamin und GABA) Liu et al. (2000) Nature

31 Phylogenetische Beziehung verschiedener GPC Neurotransmitter Rezeptoren der Rhodopsin Familie (GPCR Familie A) GPCR Familie C ist strukturell stark verschieden von Familie A Baum gebildet aufgrund Homologien der TM Domänen DA1, DA5 Rezeptoren ähnlicher zu α 2 ARs, als zu anderen DA Rezeptoren

32 muscarinische Acetylcholinrezeptoren 5 Vertreter, dominieren bei der Vermittlung von Effekten durch ACh im Gehirn beeinflussen die Eigenschaften von Ionenkanälen, können sowohl exzitatorische (M 2 /M 4 ) wie inhibitorische Wirkungen haben; können Adenylatzyklase inhibieren, die z.b. durch βar aktiviert wurde; M 1,3,5 aktivieren PLC, erzeugt IP 3 sowohl prä- als auch postsynaptische Expression gefunden prä-synaptische machrs involviert in feedback-inhibition der ACh Freisetzung K.O. von M1 machr erzeugt Resistenz gegen Pilocarpin-ausgelöste Epilepsie Agonisten: ACh, Muscarin, Carbamylcholin Antagonist: z.b. Atropin, N-Methylscopolamin

33 muscarinische Acetylcholinrezeptoren II orange: Identität in allen 5 Typen Pfeile: wichtig für Interaktion mit G-Proteinen fünf Subtypen bekannt (M1-M5; kda), koppeln zu verschiedenen G- Proteinen, Spezifizität resultiert aus i3 Domäne, hier sind die größten Unterschiede in den Sequenzen der fünf machrs zu finden

34 Dopaminrezeptoren DA überwiegend in Hirnbereichen, die für Motorfunktionen wichtig sind kommen sowohl prä- als auch post-synaptisch vor, wie auch andere Catecholaminrezeptoren (adrenerge Rezeptoren) fünf Typen von DA Rezeptoren, D1-D5; eingeteilt in 2 Klassen: D1-ähnlich (D1, D5; stimulieren Adenylat-Zyklase über G S ), D2-ähnlich (D2, D3, D4; inhibieren Adenylat-Zyklase über G i /G o ) Stimulation von PKA, Effekte auf Genexpression (durch Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren, z.b. CREB, oder immediate early Gen Produkte wie c-fos, c-jun, etc.) chronische Behandlung mit DA Antagonisten führt zu erhöhter Expression von D1 und D2 Rezeptoren; möglicher Grund für bestimmte motorische & psychotische Störungen

35 Purinrezeptoren GPCRs, die ATP, oder das metabolische Abbauprodukt Adenosin binden ATP oft als co-transmitter mit anderen NTs freigesetzt Adenosin kann frei durch Membranen diffundieren, kann metabolischen Status eines Neurons an benachbarte Zellen (z.b. Glia) signalisieren ATP von P2 Klasse Rezeptoren detektiert (P2y, t & u; P2x, P2z sind ionotrop) biphasische Neuronale Effekte: 1. Exzitatorischer Effekt durch ATP; 2. inhibitorischer Effekt durch das entstehende Abbauprodukt Adenosin Adenosin von A Klasse Rezeptoren gebunden (A1, A2a, A2b, A3); A1 inhibiert Adenylatzyklase und aktiviert PLC

36 Serotonin (5-HT) Rezeptoren Serotonin wirkt sowohl als NT (involviert in Regulation von Schlaf-/Wachzuständen, circadianen Rhythmen, Hunger, allgemeine Erregbarkeit), wie auch als Hormon (Einfluss auf Kontraktion glatter Muskulatur, Aggregation von Blutplättchen,Immunsystem); sehr umfangreiche Genfamilie der 5-HT Rezeptoren:? 5-HT 1A Inhibition of adenylyl cyclase, opening of K + channels 5-HT 1Dα Inhibition of adenylyl cyclase 5-HT 1Dβ Inhibition of adenylyl cyclase 5-ht 1E Inhibition of adenylyl cyclase 5-ht 1F Inhibition of adenylyl cyclase 5-HT 2A Stimulation of phosphoinositide-specific phospholipase C, closing of K + channels 5-HT 2B Stimulation of phosphoinositide-specific phospholipase C 5-HT 2C Stimulation of phosphoinositide-specific phospholipase C 5-HT 3 Ligand-gated cation channel 5-HT 4 Stimulation of adenylyl cyclase 5-ht 5A Inhibition of adenylyl cyclase 5-HT 5B 5-ht 6 Stimulation of adenylyl cyclase 5-HT 7 Stimulation of adenylyl cyclase

37 metabotrope Glutamat-Rezeptoren (mglurs) sehr divergent im Vergleich zu anderen GPCRs; Besonderheit: Große extrazelluläre N-terminale Domäne und langer C-Terminus, der zu G-Proteinen koppelt Glutamat-Bindestelle sitzt in N-terminaler Domäne, diese ist homolog zu bakteriellen Aminosäure-bindenden Proteinen 8 verschiedene mglurs bekannt, mglur1 und 5 koppeln zu PLC, mglur1 auch zu Adenylat- Zyklase; andere mglurs unterscheidbar durch Präferenz für spezielle Agonisten, können camp-produktion hemmen; mglur4 ist der Geschmacksrezeptor für umami Geschmack wirken prä- und post-synaptisch, beeinflussen Glutamatfreisetzung durch feedback Inhibition post-synaptisch an Langzeit-Plastizität beteiligt (mglur1), sowohl LTP (im Hippocampus) als auch LTD (Kleinhirn)

38 Struktur der liganden-bindenden Domäne des mglurs mit Glutamat oder dem Antagonisten S-MCPG

39 Prä-synaptische Regulierung/Desensitisierung von mglur1 durch Phosphorylierung ändert G-Protein Kopplung prä-synaptische mglurs bewirken je nach Bedingung durch Kopplung an unterschiedliche G-Proteine Anregung (A) oder Inhibition (B) der Glutamatfreisetzung durch Stimulation oder Hemmung von spannungsgesteuerten Ca 2+ -Kanälen (die NT Freisetzung auslösen), bzw. K + -Kanälen (die Membran hyperpolarisieren)

40 GABA B Rezeptoren wirken inhibitorisch, sowohl prä- als auch post-synaptisch koppeln zu Kalium Kanälen (direkt und indirekt), verringern die Ca 2+ -Leitfähigkeit (prä-synaptische Inhibition) post-synaptische Inhibition durch langsame Hyperpolarisation, erwirkt durch Aktivierung eines K + -Stromes inhibieren camp Produktion strukturell ähnlich dem mglur, große extrazelluläre Domäne, die GABA Bindestelle enthält Funktionelle GABA B Rezeptoren sind Dimere aus R1 und R2 Untereinheiten

41 Heterotetramere GABA B Rezeptoren bilden grosse Komplexe mit assoziierten Untereinheiten (KCTD), die funktionelle Eigenschaften der GABA B Rs verändern Co-Expression in Neuronen Co-Expression in Oocyten J Schwenk et al. Nature 000, 1-5(2010) doi: /nature08964

42 Neuropeptidrezeptoren extrem umfangreiche und diversifizierte Familie koppeln alle an G-Proteine, oder stimulieren assoziierte Tyrosin Kinase kein direkter Einfluss auf Ionenkanäle Peptidbindestellen sowohl bestimmt durch extrazellulären N-Terminus, als auch durch Bereiche in den Transmembrandomänen, also Mischform von Familie A und C GPCRs vielleicht Grund für die sehr hohe Affinität für Neuropeptide

43 Opto-XRs photo-aktivierte GPCRs Belohnungsempfinden, optisch ausgelöst, führt zu Verhaltensänderung in der Maus Airan et al.,

44 Chemorezeptoren umfangreichste Genfamilie überhaupt, bis zu 900 Gene z.b. in C. elegans Geschmacks- und Geruchsrezeptoren, möglicherweise spezifisch für genau eine Substanz nächstes Mal mehr