Auf der Suche nach der euploiden Eizelle: Aneuploidiescreening durch robuste Polkörperdiagnostik mit Molecular Copy number Counting (MCC)

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1 Auf der Suche nach der euploiden Eizelle: Aneuploidiescreening durch robuste Polkörperdiagnostik mit Molecular Copy number Counting (MCC) Martin Schorsch 1,2, Thomas Hahn 1,2, Heiko Turley 1, Elisabeth Müller 2, Melanie Schranz 2, Dagmar Seifert 2, Cornelia Vogt 2, Paul H. Dear 3, Angelika Daser 2 Zusammenfassung Chromosomale Fehlverteilungen in den Eizellen sind ein wesentlicher Grund für die niedrige Erfolgsrate von IVF und ICSI in der Reproduktionsmedizin. Verschiedene Techniken zur Analyse des Ploidiestatus von Eizelle oder Embryo werden hier vorgestellt und diskutiert. Die von uns entwickelte Methode des Molecular Copy Countings durch digitale PCR (MCC) erweist sich als besonders geeignet für die Polkörperdiagnostik und ist im Kinderwunschzentrum Wiesbaden erfolgreicher Bestandteil der ICSI-Behandlung. Vor allem ältere Kinderwunschpaare profitieren immens von der PKD: (i) die wenige euploiden Eizellen können identifiziert werden; (ii) es besteht kein Risiko Eizellen mit Trisomie 13, 18 oder 21 zu transferieren und (iii) ein sinnloser Transfer wegen ausschließlich aneuploider Eizellen kann vermieden werden. Die geringere Belastung durch vergebliche ICSI-Zyklen führt zu einem deutlichen Anstieg von Wiederholungszyklen und gesteigerten Schwangerschaftsraten. Einleitung Im Jahr 2014 wurden in Deutschland extrakorporale Befruchtungen (IVF, ICSI) durchgeführt. Es traten Schwangerschaften ein, das entspricht einer Schwangerschaftsrate von 28% (1). Die Wahrscheinlichkeit, im ersten Zyklus ohne medizinische Unterstützung eine Schwangerschaft zu erlangen, liegt bei einer 25-jährigen Frau bei 23% und bei einer 35-jährigen Frau bei 16% (2). Das Deutsche IVF-Register (DIR) (1) weist aktuell Schwangerschaftsraten von über 40% pro Embryotransfer bei 25-jährigen, aber weniger als 25% bei 40-jährigen aus. Internationale Zahlen aus den USA von ICSI-Zyklen zeigen ein noch drastischeres Bild: Schwangerschaftsraten von unter 10% bei Frauen über 39 Jahren und unter 5% bei Frauen über 42 Jahren (3). Das Alter der Patientin spielt also sowohl bei spontaner als auch bei der extrakorporalen Befruchtung eine entscheidende Rolle. Untersuchungen an Abortmaterial zeigten, dass mit zunehmendem Alter der Frau chromosomale Fehlverteilungen (Aneuploidien) als Ursache von Fehlgeburten deutlich zunehmen (4-6). Zurückzuführen sind diese chromosomalen Fehlverteilungen auf Alterungsprozesse der Eizelle (7-10). Sie führen zu einer gestörten 1

2 Embryonalentwicklung und somit zu fehlender Implantation, Frühabort oder der Geburt eines Kindes mit einer Behinderung. Gerade die Gruppe mit den geringsten Erfolgsaussichten stellt mittlerweile den größten Anteil an reproduktionsmedizinischen Behandlungen: war 1996 nur jede dritte behandelte Frau älter als 35 Jahre, so waren es 2014 mehr als die Hälfte der behandelten Frauen (1). Entsprechend muss die Reproduktionsmedizin immer wieder nach neuen Lösungsansätzen suchen, um die Erfolgsraten der aufwendigen und belastenden Behandlungen zu verbessern. Ein Hauptverantwortlicher für die Erfolgsrate ist die Eizelle die Aneuploidierate steigt ab dem 35. Lebensjahr der Frau exponentiell an (7-9, 11). Entsprechend werden seit vielen Jahren Methoden entwickelt und angewandt, die die Identifikation euploider Eizellen oder intakter Embryonen ermöglichen (12). Während in den meisten Ländern die Untersuchung des Embryos durch Blastomerenbiopsie am Tag 3 oder Trophektodermbiopsie (TE) am Tag 5 gestattet ist, ist nach dem deutschen Embryonenschutzgesetz (ESchG) die Untersuchung des Embryos nur für wenige genetische Erkrankungen durch Präimplantationsdiagnostik (PID) nach Genehmigung durch eine Ethikkommission möglich. Die Untersuchung der Eizelle hingegen ist regulatorisch nicht eingeschränkt und wird deshalb in Deutschland seit vielen Jahren in Form der Polkörperdiagnostik (PKD) favorisiert. Auf der Suche nach der euploiden Eizelle - PKD Bei der Polkörperdiagnostik wird der Chromosomengehalt der befruchteten Eizelle überprüft und zwar indirekt durch Analyse der beiden Polkörper, die als Abfallprodukte bei der Eizellreifung und befruchtung entstehen. Während der Reifung durchläuft die Eizelle zwei Reduktionteilungen (Meiosen). Ursprünglich ist jedes Chromosom durch 4 Kopien (Chromatiden) repräsentiert; bei 23 Chromosomen summiert sich das zu 92 Chromatiden. Am Ende des Befruchtungsvorgangs soll nur noch 1 Kopie für jedes Chromosom aus der Eizelle stammen, d.h. die Eizelle muss die Anzahl der Chromatiden von 92 auf 23 reduzieren. Um dies zu erreichen, werden in den beiden Meiosen die überschüssigen Chromatiden in Polkörper 1 und 2 ausgeschleust (Abbildung 1). Durch Analyse der Polkörper kann man auf die Anzahl der verbliebenen Chromatiden in der Eizelle schließen die Polkörper spiegeln den Chromosomengehalt der Eizelle wider, die Eizelle kann also nicht-invasiv auf einen korrekten (Euploidie) bzw. fehlerhaften Chromosomensatz (Aneuploidie) untersucht werden. Altersbedingt kommt es während der beiden Reduktionsteilungen sehr häufig (altersabhängig zwischen 40% und 90%) zu Störungen bei der Verteilung der Chromatiden (Trisomie, Monosomie). Diese Fehlverteilungen werden an alle Zellen des sich entwickelnden Embryos weitergegeben und führen zu Implantationsversagen, Fehlgeburt oder Missbildung. 2

3 Abbildung 1: Befruchtete Eizelle mit erstem (PK1) und zweitem Polkörper (PK2). Während der ersten Reduktionsteilung (Meiose I) werden 46 Chromatiden über den ersten Polkörper in den perivitellinen Raum ausgeschleust. Nach Fertilisation durch das Spermium werden weitere 23 Chromatiden über den zweiten Polkörper aus der Eizelle ausgeschleust. Auf der Suche nach dem euploiden Embryo - PGS Alternativ zur PKD wird das Präimplantationsscreening (PGS) am sehr frühen Embryo durchgeführt. Da Untersuchungen an Embryonen in sehr vielen Ländern gesetzlich nicht eingeschränkt sind, ist PGS an Tag 3-Blastomeren oder Trophektoderm von Tag 5- Blastozysten die bei weitem häufigste Analytik des Aneuploidiescreenings. Argumente für die PGS sind die Erfassung des väterlichen Anteils an Chromosomenfehlverteilungen (ca. 10%) (13) und die gezielte Auswahl sich gut entwickelnder Embryonen (14). Aktuelle Verfahren für PGS Die heute weltweit am häufigsten eingesetzten Technologien für PGS sind: Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Array Comparative Genomic Hybridrisation (acgh) Next Generation Sequencing (NGS) In den USA werden diese Verfahren mit folgender Häufigkeit angewandt: FISH immer noch in hunderten von Laboren, acgh in 180 Laboren, NGS in 4 Laboren (15). Im Folgenden werden die Methoden vorgestellt und die technischen Herausforderungen bzw. Probleme geschildert. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH): Noch immer wird die FISH-Methode am häufigsten eingesetzt, nicht zuletzt weil sie mit relativ geringem technischen Aufwand etabliert und durchgeführt werden kann. Vorteilhaft ist, dass es eine direkte Nachweismethode ist, d.h. die einzelnen Chromatiden und 3

4 Chromosomen werden mikroskopisch beurteilt. Dazu werden sie durch chromosomenspezifische Fluoreszenssonden markiert und die Anzahl der Fluoreszenssignale ausgezählt (12, 16, 17). In der Regel werden nur fünf, in Einzelfällen bis zu zehn Chromosomen markiert. Zu der eingeschränkten Zahl der beurteilbaren Chromosomen kommt als weiterer gravierender Nachteil Materialverlust und Überlagerung mit entsprechend hoher Fehlerquote (bis zu 25%) hinzu. Dieser Sachverhalt spiegelt sich in den Schwangerschaftsraten wider diese können mit FISH-Diagnostik niedriger sein als ohne (18-20). Array Comparative Genomic Hybridrisation (acgh) und Next Generation Sequencing (NGS): Entsprechend suchte man nach neuen Verfahren, bei denen alle Chromosomen möglichst fehlerfrei beurteilt werden können (21, 22). Durchgesetzt hat sich Array Comparative Genomic Hybridrisation (acgh) (11, 13, 14, 23, 24) und auf den Markt drängt neuerdings das Nachfolgeverfahren Next Generation Sequencing (NGS) (25-28). Bei beiden Techniken muss die Ausgangsmenge des Probenmaterials vermillionenfacht werden. Dies geschieht durch die sogenannte whole genome amplification (WGA), bei der die gesamte chromosomale DNA ungezielt willkürlich massiv vermehrt wird. Je nach DNA-Beschaffenheit können dabei unterschiedlich große Regionen der Chromosomen unter- oder überdurchschnittlich vermehrt werden. Im Ergebnis kann dies wie eine biologische Unter- oder Überrepräsentation, also eine Aneuploidie aussehen (13, 29). Dieses Problem betrifft sowohl die acgh als auch NGS und ist umso größer, je geringer die Ausgangsmenge ist. Bei Blastomeren und Polkörpern ist dies besonders kritisch, da nur eine einzige Zelle für die DNA-Vermehrung zur Verfügung steht (30). Ausserdem sind beide Verfahren indirekt: Bei acgh wird die Menge an vermillionenfachter DNA pro Chromosom im Vergleich zu einer Referenz abgeschätzt. Das erfordert komplexe Algorithmen und Normalisierungsschritte; direkte Informationen über das Ausgangsmaterial sind nicht mehr zu erhalten. Bei NGS werden statt eines Mengenvergleichs zu einer Referenz-DNA willkürlich viele chromosomale Abschnitte des ebenfalls durch WGA vervielfältigten Ausgangsmaterials sequenziert und die relative Anzahl der Sequenzen pro Chromosom im Verhältnis zu allen Chromosomen bestimmt. Auch hier ist nur durch mehrere komplexe Algorithmen eine Ergebnisinterpretation möglich, direkte Aussagen über die Qualität des Ausgangsmaterials sind nicht möglich. Entsprechend werden Materialprobleme wie degradierte DNA oder Kontaminationen mit anderen Zellen nicht notwendig erkannt. Hinzu kommt, dass die erhebliche Sensitivitätssteigerung bei NGS gegenüber acgh (27, 28, 30) zu einer deutlichen Zunahme der Diagnose Mosaikembryo geführt hat; ob dies in allen Fällen der Biologie entspricht oder zu einem signifikanten Teil der angewandten Methode geschuldet ist, kann bislang nicht durch publizierte Daten beurteilt werden die erheblichen biologischen Konsequenzen werden weiter unten diskutiert. 4

5 Die neue Methode - MCC Als Alternative haben wir für Einzelzellen, also Polkörper (und theoretisch auch Blastomeren) ein robustes, direktes Analyseverfahren etabliert: Molecular Copy number Counting mit digitaler PCR (MCC). Untersucht werden klar definierte Produkte, die aus den beiden meiotischen Teilungen einer Ursprungszelle, der Eizelle, hervorgegangen sind. MCC basiert auf dem einfachen Prinzip der Endpunktverdünnung (31), wodurch ohne whole genome amplification und ohne Algorithmen die Anzahl der Chromatiden pro Chromosom einfach abgezählt werden kann. Ausgangsmaterial sind erster und zweiter Polkörper mit 2 Kopien bzw. 1 Kopie von jedem Chromosom. Durch die Endpunktverdünnung werden die Kopien der Chromosomen in kleinen Reaktionsgefäßen vereinzelt und dann die Anzahl der Reaktionsgefäße abgezählt, die eine Kopie der Chromosomen enthalten, die Daten werden also direkt und digital als Rohdaten erhoben - die Vorgehensweise ist in Abbildung 2 schematisch dargestellt. Polkörper#lysieren# # # # Chroma+den#verteilen# DNA#Vervielfäl+gung:# PCR 1 PCR 2 PCR 3 PCR 4 PCR 5 PCR 6 PCR 7 PCR 8 Σ + PCR Chrom. ROT 2 PCR 1 PCR 2 PCR 3 PCR 4 PCR 5 PCR 6 PCR 7 PCR 8 Σ + PCR Chrom. GRAU 2 PCR 1 PCR 2 PCR 3 PCR 4 PCR 5 PCR 6 PCR 7 PCR 8 Σ + PCR Chrom. BLAU 2 1.#Runde# Mul+plex.PCR# # # # 2.#Runde# Einzel.PCR#! Digitale#Ergebniserfassung:######PCR#Produkte#zählen# Zahl#der#PCR#Produkte###=##Produkte#der#Chroma+den##### Abbildung 2: Schematische Darstellung von MCC durch Endpunktverdünnung und chromosomenspezifische DNA-Vervielfältigung mittels PCR. Das hier dargestellte Beispiel bezieht sich auf einen ersten Polkörper. Die DNA von PK1 (oder PK2) wird durch Zelllyse präpariert/zugänglich gemacht und auf acht Reaktionsgefäße verteilt. Damit enthalten zwei Gefäße je eine Kopie eines Chromosoms hier dargestellt als Chromosom Rot, Grau und Blau ; sechs Gefäße bleiben für das jeweilige Chromosom leer, enthalten keine Kopie. Auch bei MCC muss die DNA vervielfältigt werden, das geschieht chromosomenspezifisch durch einfache PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion). In der ersten Runde wird die DNA mit chromosomenspezifischen Sonden vorangereichert (multiplex PCR). In der zweiten Runde werden die Sonden einzeln analysiert. Man erhält nur in denjenigen Reaktionsgefäßen ein PCR-Produkt, in die bei der Endpunktverdünnung eine Kopie des Chromosoms gelangt ist. Durch simples Abzählen der PCR Produkte ermittelt man die Anzahl der Kopien = Chromatiden der Chromosomen. 5

6 Mit MCC gibt es auf dem Markt jetzt vier Methoden für die PKD bzw. PGS. Die Eignung für die unterschiedlichen Ausgangsmaterialien ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: Untersuchungsmaterial und Methoden für das Auffinden von Aneuploidien vor der Implantation PKD und PGS Methoden Material Herkunft FISH acgh NGS MCC Polkörper 2 Einzelzellen Eizelle + + n.d.** +++ Blastomeren 1 Einzelzelle Tag 3 Embryo + + n.d.** +++ TE Zellverband* Tag 5 Embryo ? *** - * ca Zellen aus dem Trophektoderm, nicht der inneren Zellmasse, die den Embryo bildet ** nicht durchgeführt *** bislang nicht hinreichend evaluiert Tabelle 1: Untersuchungsmaterial und Methoden für das Auffinden von Aneuploidien vor der Implantation PKD und PGS. Einzelzellanalyse wird an Polkörpern und Blastomeren von Tag 3-Embryonen durchgeführt. FISH und MCC sind ausschließlich dafür ausgelegt, FISH kann allerdings nur eine Auswahl von Chromosomen untersuchen und hat eine Fehlerrate von bis zu 25%. MCC analysiert alle Chromosomen und die bislang ermittelte Fehlerrate liegt unter 5%. Array CGH ist wegen des extrem geringen Ausgangsmaterials für die Einzelzellanalyse nicht gut geeignet und für NGS gibt es keine publizierten Daten. Für die Trophektodermanalyse sind beide Verfahren geeignet, allerdings kommt es besonders bei NGS wegen der hohen Sensitivität bei noch unklarer Spezifität sehr häufig zu Diagnosen, die schwer zu interpretieren sind und zum Verwerfen möglicherweise guter Embryonen führt. Polkörperdiagnostik mit MCC Ergebnisse Wir haben inzwischen 375 ICSI-Zyklen von 275 Patientinnen mit MCC untersucht. Die größte Nachfrage besteht in der Altersgruppe mit den meisten zu erwartenden Aneuploidien bzw. niedrigsten Schwangerschaftsraten, nämlich 38 Jahre und älter mit 62% aller Zyklen. Die Ergebnisse sind in drei Altersgruppen unterteilt, die sich reproduktionsbiologisch unterschiedlich verhalten: die jüngste Gruppe (34 Jahre und jünger) mit zu erwartender guter Schwangerschaftsrate, die mittlere Gruppe (35 bis 37 Jahre) mit bereits deutlich abfallender Fruchtbarkeit und die älteste Gruppe (38 Jahre und älter) mit dem geringsten Behandlungserfolg. Korrespondierend ist die Anzahl euploider Eizellen (Abbildung 3A+B): Während junge Patientinnen in jedem Zyklus im Schnitt 3,6 euploide Eizellen haben, sind es bei über 37-jährigen nur noch 1,1 Euploide/Zyklus (Abbildung 3A) und bei über 41-jährigen liegt die durchschnittliche Zahl der euploiden Eizellen immer unter 1 (Abbildung 3B). 6

7 Anzahl Eizellen # analysierte Eizellen # aneuploid # euploid % 37% 18% 0 34 Jahre und jünger Jahre 38 Jahre und älter 3,6 2,9 1,1 euploid/zyklus Abbildung 3A: Anzahl euploider Eizellen in drei Altersgruppen. In der jüngsten Gruppe (34 Jahre und jünger) sind durchschnittlich 45% der untersuchten Eizellen euploid und es stehen für den Transfer 3,6 geeignete Embryonen zur Verfügung; die mittlere Gruppe hat noch 37% euploide Eizellen und entsprechend gute Aussichten für einen Embryotransfer; bei der ältesten Gruppe steht mit 18% euploiden Eizellen im Schnitt nur noch ein Embryo für den Transfer zur Verfügung. Abbildung 3B: Altersbedingte Abnahme euploider Eizellen. Während bis zu einem Alter von etwa 41 Jahren im Schnitt mindestens eine euploide Eizelle pro Zyklus diagnostiziert werden kann, ist ab 42 Jahren nicht mehr in jedem Zyklus eine euploide Eizelle vorhanden. Die Anzahl der MCC Zyklen pro Geburtsjahr ist in Klammern hinter der Jahreszahl angegeben. 7

8 Entsprechend häufig führt die PKD in den älteren Gruppen auch zu Zyklen ohne Embryotransfer (Abbildung 4) Anzahl Zyklen # Zyklen kein Transfer Jahre und jünger Jahre 38 Jahre und älter Abbildung 4: Anzahl von ICSI-Zyklen und Transfers in den drei Altersgruppen 34 Jahre und jünger, 35 bis 37 Jahre, 38 Jahre und älter. Entsprechend der Nachfrage sind in der jüngsten Gruppe nur 63 der 375 Zyklen; in allen Zyklen gab es euploide Eizellen und entsprechend wurde in allen Zyklen ein Transfer durchgeführt. Die mittlere Gruppe hatte 78 Zyklen, hier waren 5 Zyklen ohne euploide Eizellen und ohne Transfer. Den Löwenanteil stellt die älteste Gruppe: 234 Zyklen, 81 davon (35%) ohne Transfer wegen ausschließlich aneuploider Eizellen. Interessanterweise führt das Ergebnis der PKD gerade bei diesen Patientinnen zu wiederholten ICSI-Zyklen: fast die Hälfte der 375 Zyklen waren Mehrfachzyklen, nämlich 177 Zyklen bei 77 Patientinnen (44%), mit guter Erfolgsquote in Zyklus 2 und 3 (Tabelle 2 und Abbildung 5). Tabelle 2: Altersverteilung bei wiederholten ICSI-Zyklen Altersgruppe 34 Jahre Jahre Jahre # Frauen # Zyklen % 15% 68% 100% Σ 8

9 60% 50% Schwangerscha,srate 40% 30% 20% Zyklus 1 mit MCC Zyklus 2+3 mit MCC 10% 0% Jahre Jahre Jahre 40 Jahre und älter # Zyklen Abbildung 5: Schwangerschaftsraten nach einem oder mehreren ICSI-Zyklen mit PKD durch MCC. Zyklus 2 und Zyklus 3 wurden zusammengefaßt, da die Zahlen zum jetzigen Zeitpunkt noch sehr niedrig sind. Betrachtet man die Schwangerschaftsraten in allen Altersgruppen für Zyklen, in denen ein Embryotransfer stattgefunden hat, so nähern sich diese zwischen den Altersgruppen an und liegen für alle über 30% (Abbildung 6), d.h. das Auffinden der seltenen, euploiden Eizellen kann auch in einem Alter deutlich über 40 Jahre noch zu einer Schwangerschaft führen (Abbildung 6). 80% Embryotransfer- und Schwangerscha5srate 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% Embryotransfer-Rate Schwangerscha5srate 0% 34 Jahre und jünger Jahre 38 Jahre und älter Abbildung 6: Embryotransfer- und Schwangerschaftsrate nach ICSI-Zyklen mit PKD und MCC. in den beiden jüngeren Gruppen wurde in 70% der Zyklen ein oder mehrere Embryonen transferiert (die restlichen ca. 30% waren Einfrierzyklen); in der ältesten Gruppe lag die Transferrate nur knapp über 50% wegen der hohen Aneuploidierate (s. auch Abb. 4). 9

10 Diskussion In vielen Ländern wird die Suche nach chromosomalen Fehlverteilungen am Embryo vorgenommen, entweder an einzelnen Blastomeren (sehr frühen embryonalen Einzelzellen) oder an Trophektoderm (einem Zellverband, der später die Plazenta bildet und nicht Bestandteil des Embryo ist). In Deutschland ist die Polkörperanalyse und damit die Analyse der Eizelle das Verfahren der Wahl. Der Vorteil der PKD gegenüber der Diagnose am Embryo ist das Ausgangsmaterial zwei Polkörper, die nacheinander von ein und derselben Eizelle abgetrennt werden und nicht aus einem Zellgemisch stammen, das genetisch uneinheitlich sein kann. Ein Problem war immer, dass es keine akkurate Methode für Einzelzellanalyse gab. Durch die Etablierung von MCC steht jetzt ein robustes und einfaches Verfahren zur Verfügung, das mit hoher Präzision im Hochdurchsatz die Kopien aller Chromosomen in beiden Polkörpern digital bestimmt und damit den Ploidiestatus der Eizelle eindeutig definiert. Die PKD erweist sich gerade bei älteren Patientinnen (40 Jahre und älter) als besonders sinnvoll. In dieser Altersgruppe ist die Schwangerschaftsrate ohne PKD 10% und kleiner. Wenn PKD mit MCC durchgeführt wird, können wir selbst bei deutlich über 40-jährigen Schwangerschaftsraten von über 25% erzielen. Ein weiterer, nicht zu unterschätzender Effekt ist die Transparenz, die eine robuste Polkörperdiagnostik schafft: die biologische Qualität eines Zyklus kann genau beurteilt und dem Kinderwunschpaar kommuniziert werden Vorhandensein oder Nichtvorhandensein euploider Eizellen mit der Konsequenz Transfer oder kein Transfer. Wenn wegen ausschließlich aneuploider Eizellen kein Transfer möglich ist, dann besteht immer die Option in einem Nachfolgezyklus euploide Eizellen zu identifizieren und nach erfolgreichem Transfer zu einer Schwangerschaft zu kommen. Entsprechend sind fast 50% unserer ICSI-Zyklen mit MCC Wiederholungszyklen mit Schwangerschaftsraten von über 30% auch in der höchsten Altersgruppe. Und da keine frustranen Transfers durchgeführt werden, ist das Intervall bis zum nächsten Zyklus in der Regel kurz, es wird also keine kostbare Zeit verschenkt. Nachteile der PKD sind zum einen, dass pro sich entwickelndem Embryo immer zwei Analysen anfallen PK1 und PK2. Durch die Entwicklung von MCC als schnellem Hochdurchsatzverfahren haben wir aber auch diesem Sachverhalt Rechnung getragen. Der andere Nachteil, dass der paternale Anteil nicht diagnostiziert wird, schlägt nur mit etwa 10% zu Buche, da 90% aller Chromosomenfehlverteilungen von der Eizelle kommen und durch die PKD erfasst werden (13). Das Präimplantationsscreening - PGS - am sehr frühen Embryo ist aus unserer Sicht neben den bereits geschilderten technischen auch mit großen biologischen Problemen behaftet. Das größte biologische Problem ist bedingt durch das häufige Auftreten von postzygotischen mitotischen Fehlverteilungen: in den frühen embryonalen Zellen passieren häufig Fehler bei der Zellteilung, sodass die frühen Embryonen aus Zellen mit unterschiedlicher genetischer Ausstattung (genomische Mosaike) bestehen (32-34). Im Laufe der Entwicklung können sich 10

11 diese Mosaike zurückbilden (35), allerdings ist es zur Zeit noch völlig unklar, wie und in welchem Umfang die Mosaike korrigiert werden. Das bedeutet natürlich für das Präimplantationsscreening, dass es ein Material untersucht, dessen Relevanz unklar ist (36, 37): bei der Tag 3-Biopsie von einer oder mehreren Blastomeren repräsentiert das PGS- Ergebnis nicht notwendig den Ploidiestatus der anderen, sich weiter entwickelnden Blastomeren des Embryos. Bei der TE-Biopsie am Tag 5 wird nicht der Embryo (innere Zellmasse), sondern das Trophektoderm biopsiert. Damit ist die PGS-Diagnose gleich mit zwei großen Unsicherheiten behaftet: wird der Embryo durch die TE Zellen wirklich repräsentiert; und ist bei Vorliegen eines Mosaikembryos der Chromosomengehalt der biopsierten Zellen repräsentativ für den Chromosomengehalt des Gesamtembryos. Man kann somit nicht sicher sein, ob man ein für den Embryo relevantes Biopsat untersucht hat und damit eine sichere Diagnose gestellt hat. Konsequenzen können sein, dass man einen vermeintlich euploiden Embryo transferiert, der aber eine Aneuploidie in der inneren Zellmasse hat oder einen vermeintlich aneuploiden Embryo verwirft, dessen innere Zellmasse aber euploid ist. Gerade durch die hohe Sensitivität von acgh und NGS kommen sehr viele Diagnosen Mosaikembryo zustande. Nachdem man diese Embryonen lange Zeit verworfen hat, entschließt man sich neuerdings in einigen Zentren zum Transfer (38, 39) und es sind bereits 11 Kinder nach 61 Transfers geboren worden. Wie Mosaikembryonen in diesen Zentren als transferierbar ausgewählt werden, ist bislang nicht bekannt und es konnten noch keine sicheren Kriterien für eine Auswahl definiert werden (39). In Deutschland sind wir mit der PKD in einer komfortablen, weil eindeutigen Situation: die PKD kann immer eine sichere Aussage über den Ploidiestatus des Major Players befruchtete Eizelle machen (13, 36). Major Player deshalb, weil 90% aller Aneuploidien durch Meiosefehler der Eizelle bedingt sind und weil diese Meiosefehler sich in allen Zellen des Embryos wiederfinden und somit für alle Kompartimente des Embryos relevant sind. Das heißt, dass die Diagnose euploide Eizelle einen sicheren Transfer erlaubt und die Diagnose aneuploide Eizelle einen Transfer verbietet. MCC stellt sicher, dass diese Diagnosen schnell und präzise gestellt werden können. Und Schwangerschaftsraten um 30% auch bei über 40jährigen Frauen zeigen, dass PKD mit MCC den Kinderwunsch auch bei älteren Paaren erfüllen kann. Literaturverzeichnis 1 DIR Jahrbuch 2014, J Reproduktionsmed Endokrinol 2015; 12 2 Bundesgesundheitsblatt 2013; 56: Munne S, COGEN Paris 2015, 4 Hassold T, Chen N, Funkhouser J, Jooss T, Manuel B, Matsuura J, Matsuyama A, Wilson C, Yamane JA, Jacobs PA. A cytogenetic study of 1000 spontaneous abortions. Ann Hum Genet Oct;44(Pt 2):

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