2. Versuch Fortgeleitete AP einzelner Nervenfasern. Protokoll

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1 Protokoll 1. Einleitung: Als Versuchsobjekte dienen bei diesem Versuch (a) der Nervus ischiadicus des Krallenfroschs und (b) die Riesenfasern im Bauchmark des Regenwurms. Ziel der Versuche ist es, die Erregungseigenschaften von Nerven herauszuarbeiten. So untersuchen wir anhand des N. ischiadicus des Krallenfrosches die Leitungsgeschwindigkeit, die Abhängigkeit des Summenpotentials (SP) von der Reizamplitude, sowie die Refraktärzeit. An den Riesenfasern im Bachmarks vom Regenwurm wird die Schwelle und Latenzzeit des Aktionspotential (AP), die Leitungsgeschwindigkeit und Refraktärzeit untersucht. Der Unterschied der beiden zu untersuchenden Objekte liegt darin, dass es sich bei dem Nervus ischiadicus des Krallenfroschs um ein Nervenbündel aus einer Vielzahl von Nerven handelt und somit ein Summenpotential gemessen wird. Bei der Reisenfaser im Bauchmark handelt es sich dagegen nur um, wie der Name schon sagt, eine Faser. Wir messen hier also ein einziges AP. 2. Versuchteil I: Bei den im Versuchteil I durchgeführten Versuchen handelt es sich immer um den Nervus ischiadicus des Krallenfrosches Material und Methode: Nach der Entfernung des Nervus ischiadicus aus dem Bein eines frisch getöteten Krallenfroschs, wird der Nerv in die Ableitkammer gelegt und an zwei Reizelektroden angeschlossen. Weitere Elektroden können jetzt als sog. Ableitelektroden genutzt werden und sind für verschiedene Versuchteile dienlich. In der Ableitkammer handelt es sich um extrazelluläre Ableitungen. Legt man nun an der Reizelektrode eine Spannung an, so wird der Abschnitt des Nervs depolarisiert, der Reiz weitergeleitet und kann dann über eine der Ableitelektroden auf dem Oszilloskop sichtbar gemacht werden. 1

2 Es gilt folgender Versuchsaufbau: (Abb. 1): Schaltskizze aus Skript Der Boden der Ableitkammer ist mit Ringerlösung bedeckt. Channel 1 ist die reiznahe Ableitelektrode, Channel 2 die reizferne. Der Versuchsaufbau ändert sich bis einschließlich Versuch 3 nicht mehr und es wird somit bei den Versuchen auf das oben beschriebene Kapitel zurückgegriffen Versuch 1: Beobachtung / Ergebnisse: Bei Versuch 1 geht es um die Leitungsgeschwindigkeit des N. ischiadicus. Nach Anlegen eines Reizes erscheint folgender Amplitudenverlauf auf dem Oszilloskop: (Abb. 2) (Abb. 3) Zu erkennen ist hier also einmal die Reizamplitude sowie das erste SP, das an Channel 2 verspätet ankommt, sowie ein weiteres SP an Channel 2 das noch später auf dem 2

3 Oszilloskop erkennbar ist. Weiterhin erkennbar, ist die unterschiedliche Form der Amplituden. Die Amplituden am Channel 2 sind weitläufiger und weisen somit eine rundere Form auf. Nimmt man jetzt die zeitliche Differenz der Summenpotentialmaxima und den Abstand der Ableitungselektroden, so kann man nach der Formel: v = s/t, die Geschwindigkeit der Reizweiterleitung berechnen. Bei der oben gezeigten Abb. 2, ist t 1 = 0,828 ms, bei Abb. 3 ist t 2 = 2,532 ms. Der Unterschied zwischen Abb. 2 und 3 ist nur der unterschiedlich gelegte Cursor um t präzise ermitteln zu können. Der Abstand der Elektroden beträgt 30 mm ( s). Weiterhin erkennt man, dass nach dem SP bei Channel 2 noch weitere SP zu einem späteren Zeitpunkt auftreten (Abb. 2 und Abb. 3 mit dem entsprechendem t). Das Maximum ist aber um ein Vielfaches kleiner, als das vom ersten SP. t ist hier jedoch viel größer. Somit weisen die verschiedenen Maxima unterschiedliche Geschwindigkeiten auf: t 1 = 0,828 ms = 0, s s = 35 mm = 0,035 m v = s / t 1 = 0,035 m / 0, s = 42,27 m/s t 2 = 2,532 ms = 0, s s = 35 mm = 0,035 m v = s / t 2 = 0,035 m / 0, s = 13,82 m/s 42,27 m/s ist also die Geschwindigkeit für das erste SP. Die später ankommenden weisen eine langsamere Geschwindigkeit von 13,82 m/s auf, da die Zeit im Nenner größer wird Diskussion Die Frage, die sich bei den oben gemachten Beobachtungen stellt, ist die Frage nach dem unterschiedlichen Verlauf der beiden Oszilloskopgraphen am Channel 1 und 2. Die bei beiden Channeln zu beobachtende Reizamplitude kommt von dem sog. Reizartefakt. Es ist hier negativ. Hätte man die Reizelektroden umgepolt, so wäre die Amplitude ins Positive gerichtet gewesen. Der Verlauf an Channel 1 ist im Prinzip relativ einfach zu erklären. nach dem Reiz wird ein bestimmter Membranbereich über den Schwellenwert depolarisiert. Es kommt zu einem AP und durch viele Fasern zu einem SP. Da extrazellulär gemessen wird, ist die Außenseite wegen des Natriumeinstroms negativ geladen, die Amplitude erstreckt sich somit auch ins Negative. Danach erfolgt eine Hyperpolarisierung, was 3

4 durch die kleine positive Amplitude zu erkennen ist. Sie kommt durch den zu lang anhaltenden Kalium Ionen Ausstrom zustande. An Channel 2 dagegen ist der Verlauf wie oben beschrieben nicht dem Verlauf der Kurve des Channel 1 gleich. Auch hier ist eine große Amplitude zuerkennen, die auch durch das erste SP zustande kommt, jedoch zeitlich etwas verschoben und etwas kleiner ist. Dies lässt sich durch den weiteren Abstand der Elektrode von der Reizelektrode erklären. Das sie weiter auseinander gezogen ist liegt daran, dass die einzelnen Nervenfasern dieser Gruppe doch noch etwas unterschiedliche Leitungsgeschwindigkeiten aufweisen. Durch Summation und Subtraktion durch die Verzögerungen kommt dieser etwas rundlich aussehende Amplitudenverlauf zustande. Auch die zweite Amplitude lässt sich durch den Faktor Zeit erklären. Die Geschwindigkeit dieser Nervenfasergruppe ist langsamer, als die der Gruppe mit der großen Amplitude (siehe Berechnung in 2.2. und Abb. 3). Auch hier ist das Auftreten einer eher rundlichen Amplitude zu beobachten, die wiederum durch die Summation entsteht. Das die erste Amplitude am Channel 2 kleiner ist als die des Channel 1, ist durch die Anzahl und Summation der AP zu erklären. Sind weniger AP in der ersten Gruppe vertreten, ist auch die Spannung geringer. Zusammenfassend kann man sagen, dass umso größer der Abstand zwischen Reizund Ableitelektrode ist, immer mehr Gipfel auftreten, da sich immer mehr differenzierte Nervenfasergruppen mit einer bestimmten Leitungsgeschwindigkeit herauskristallisieren werden. Die errechneten Geschwindigkeiten kann man nun der im Skript vorhandenen Tabelle gegenüberstellen und somit den Fasertyp ermitteln. Die schnelleren Fasern entsprechen nach dem Vergleich der Geschwindigkeiten dem Typ Aα, der einen Faserdurchmesser von 18,5 µm. Die langsameren Fasern entsprechen nicht unbedingt einem bestimmten in der Tabelle angegebenen Typ. Dies kann an falschen Versuchsbedingungen oder individuellen Fehlern liegen. Am ehesten handelt es sich, wenn man unbedingt eine Einteilung vornehmen möchte, um den Typ Aγ mit einem Durchmesser von 11 µm. Daran lässt sich die Theorie, dass dickere Fasern einen geringeren Widerstand aufweisen und somit schneller leiten, auch im Praktischen beobachten. 4

5 2.3. Versuch 2 Im Versuch 2 untersuchen wir die Abhängigkeit des auftretenden Summenpotentials von der Reizamplitude. Dabei wird nur das Potential der reizfernen Elektrode ( CH 2 ) beobachtet. Die Reizstärke wird bei diesem Versuch kontinuierlich verändert um die Zusammenhänge zwischen der Stärke des einwirkenden Reizes und der auftretenden Antwort zu erkennen Beobachtungen / Ergebnisse: Mit zunehmender Reizstärke ist auf dem Bildschirm des Oszilloskops das Auftreten mehrerer Gipfel zu beobachten. Nimmt man die Reizstärke wieder zurück, dann verschwinden die Amplituden, die als letztes aufgetreten sind zuerst. Ist die Reizstärke Null, so erkennt man keinen Ausschlag Diskussion: Ist kein Reiz vorhanden, wird das Nervenfaserbündel des N. Ischiadicus auch nicht depolarisiert und es entsteht kein Aktionspotential und somit auch kein Summenpotential. Durch das Erhöhen der Reizstärke werden als erstes die schnellen Fasern depolarisiert, da der Innenwiderstand dieser Fasern geringer ist. Die schnellen Fasern haben einen größeren Durchmesser und damit auch eine größere Längskonstante λ. Es gilt: Ω = 1/D und λ = R M /R I. Die Längskonstante ist definiert, als die Strecke, über die sich das Signal um 63% abschwächt ( Eckert Tierphysiologie Auflage 2, Seite 153 ). Die nachfolgenden Gipfel stammen von den langsameren Fasern. Sie haben einen kleineren Durchmesser und daher auch einen größeren Innenwiderstand. Somit ist auch λ klein. Diese Fasern haben also auch eine höhere Reizschwelle und benötigen zur Depolarisation einen stärkeren Reiz. Durch die abweichenden Leitungsgeschwindigkeiten der verschiedenen Fasertypen entstehen an der reizfernen Elektrode unterschiedliche Gipfel. Der gefundene Zusammenhang steht nicht im Widerspruch zum Alles-oder-Nichts- Gesetz, da es sich hier um ein Summenpotential handelt. Jede einzelne Fasergruppe antwortet für sich nach dem Alles-oder-Nichts-Gesetz. 5

6 Die maximale Amplitude des Summenpotentials wird erreicht, wenn alle Fasern ein Aktionspotential auslösen. Dies geschieht erst, wenn eine Reizstärke erreicht ist, die auch die dünnste Faser mit dem größten Innenwiderstand erregt. Wenn alle Fasern erregt sind, ist die Amplitude nicht mehr steigerbar Versuch 3 Bei Versuch 3 geht es um die Untersuchung der Refraktärphase der Nervenfasern. Der Nerv wird mit Doppelreizen gereizt und beide Elektroden beobacht Beobachtung: (Abb. 4) (Abb. 5) (Abb. 6) relative Refraktärzeit absolute Refraktärzeit absolute Refraktärzeit reizfern reizfern reiznah An den oben abgebildeten Graphiken erkennt man die relative und absolute Refraktärzeit von der reizfernen und reiznahen Ableitelektrode. An Abb. 4 sind 2 Gipfel zu erkennen, wobei sich die zweite Amplitude in weitere kleine Gipfel aufspaltet. Die relative Refraktärzeit ist hier: t = 1,394 ms. In Abb. 5 sind wiederum 2 Amplituden zu erkennen. Die zweite spaltet sich im Gegensatz zu Abb. 4 nicht weiter auf. Die absolute Refraktärzeit beträgt hier: t = 1,096 ms. In Abb. 6 wurde reiznah abgeleitet. Hier ist nur eine Amplitude zu erkennen und die absolute Refraktärphase beträgt hier: t = 1,015 ms. 6

7 Diskussion: Die Refraktärphase stellt die Zeit dar, in der die Nervenfasern eine andere Erregbarkeit als normal aufweisen. Man unterscheidet hier die absolute Refraktärphase, bei der die Nervenfasern auch bei einem starken Reiz überhaupt nicht erregbar sind, von der relativen Refraktärphase, bei der ab einer bestimmten Reizstärke wieder Aktionspotentiale ausgelöst werden können. Diese Reizstärke variiert bei jeder Nervenfaser. Die Amplituden sind dabei jedoch geringer, als bei einem normalen Aktionspotential, da der Spannungsunterschied bei der erneuten Reizung nicht so groß ist. Die Repolarisation ist zu diesem Zeitpunkt noch nicht abgeschlossen und das Ruhepotential noch nicht erreicht. Somit befinden sich immer noch relativ viele Natrium Ionen im Inneren, weshalb der Einstrom der Ionen geringer ist. Der Verlauf der Kurve in Abb. 4, lässt sich folgendermaßen erklären. Auf den ersten Reiz entsteht ein Summenpotential, das sich durch die reizferne Ableitung in zwei Amplituden aufspaltet. Dies liegt an den unterschiedlichen Leitungsgeschwindigkeiten der Fasergruppen. Durch den zweiten Reiz wird nur bei einigen Fasern ein Aktionspotential ausgelöst, die durch die Reizstärke schon wieder depolarisiert werden können. Dieses Potential wird auf das Potential der langsameren Fasern des ersten Reizes aufaddiert. Dadurch kommen die kleineren Gipfel bei der zweiten Amplitude zustande. In Abbildung 5 ist die absolute Refraktärphase dargestellt. Hier ist der Verlauf ähnlich dem in Abbildung 4, es entsteht jedoch kein Aktionspotential als Antwort auf den zweiten Reiz. Die zweite Amplitude entsteht hier ausschließlich durch die auf den ersten Reiz antwortenden langsamen Fasern, daher ist sie hier auch niedriger als in Abbildung 4. In Abbildung 6 ist die absolute Refraktärphase dargestellt, diesmal jedoch an der reiznahen Ableitung. Man erkennt hier keine Aufspaltung der Amplitude, da auf dieser geringen Strecke die Unterschiede in den Leitungsgeschwindigkeiten der langsamen und schnellen Fasern nicht so stark ins Gewicht fallen. Auf den zweiten Reiz erfolgt keine Antwort. Die absolute Refraktärphase schließt die Dauer des Aktionspotentials und eine kurze Zeit unmittelbar danach ein. Danach schließt sich die relative Refraktärphase an. 7

8 Durch das Vorhandensein der Refraktärphase wird die maximale Frequenz, mit der eine Faser Aktionspotentiale ausbilden kann, begrenzt. 3. Versuchsteil II: Bei den im Versuchteil II durchgeführten Versuchen handelt es sich immer um die Riesenfasern im Bauchmark (BM) des Regenwurms Material / Methode: Die Ableitung der Potentiale erfolgt von extrazellulär am lebenden, aber betäubten Tier. Das Bauchmark des Regenwurms besteht aus einer medianen und zwei lateralen Fasern. Die lateralen Fasern sind mit synaptischen Querverbindungen ausgestattet und agieren so als eine funktionelle Einheit. Die Reizelektroden sind bei diesem Versuch in 5 mm Abstand angelegt. Die Reizdauer beträt 0,1 ms. Der Versuchsaufbau ist dem in Versuchteil I ähnlich und sieht folgendermaßen aus: (Abb. 7) 3.2. Versuch 1: In diesem Versuch ermitteln wir die Schwelle und die Latenzzeit des Aktionspotentials, indem man Einzelreize mit zunehmender Reizstärke gibt Beobachtung: (Abb. 8) Durch die Gabe eines Reizes erkennt man vorerst nur kleine Spannungsunterschiede. Danach wird eine negative Amplitude sichtbar. Der Verlauf kehrt sich nach einem Maximum um und steigt kurz ins Positive, bis die Spannung wieder auf den 8

9 Normalwert sinkt. Die Zeit bis zur Βildung eines AP beträgt 1,35 ms. Auf dieser Grafik erkennt man zwei Reizimpulse, von denen jedoch nur einer mit einem Aktionspotential beantwortet wird (Abb.9) Diskussion: Anhand der Abbildung 8 läßt sich die Latenzzeit bestimmen. Die Latenzzeit ist die Zeit, die benötigt wird, um auf einen Reiz eine Antwort bzw. Aktionspotential zu generieren. Die Latenzzeit ist somit die Reizreaktionszeit. Während der Latenzzeit öffnen sich die ligandengesteuerten Natriumkanäle und darauf folgend die spannungsgesteuerten. Die Latenzzeit endet mit dem Zustandekommen des Allesoder-Nichts-Prinzips, sprich der Ausbildung eines Aktionspotentials. Um die Latenzzeit zu bestimmen, wird die Zeit zwischen dem Reiz und dem negativen Gipfel des durch den Reiz ausgelösten Aktionspotentials gemessen. Mittels Leitungsgeschwindigkeit und dem Abstand zwischen Reiz und Ableitstelle berechnet man die Leitungszeit und subtrahiert diese von dem ersten Wert. Dadurch hat man die Zeit von der Reizelektrode zur Ableitelektrode eliminiert und die reine Latenzzeit bestimmt. Es gilt: 1,35 ms (Leitungszeit) = Latenzzeit. Die Latenz ändert sich auch bei Erhöhung der Reizstärke über die Schwelle nicht, da die Ausbildung eines Aktionspotentials immer dem Alles-oder-Nichts Prinzip folgt und somit immer gleich aussieht. 9

10 In Abbildung ist der erste Impuls dementsprechend nicht stark genug, um den Nerv über den Schwellenwert zu depolarisieren und ein Aktionspotential nach dem Allesoder-nichts Prinzip auszulösen Versuch 2: Im Versuch 2 bestimmen wir die Leitungsgeschwindigkeit der Bauchmarkfasern Beobachtung: (Abb. 10) Auf der Abbildung ist nach einem Reizimpuls ein Aktionspotential zu erkennen. t der beiden Maxima entspricht 1,536 ms Diskussion: Der Nerv wurde einmal gereizt. Darauf erfolgt als Antwort ein Aktionspotential. Die positive Amplitude entspricht dem gleichen Aktionspotential und ist auf die Ableitungsmethode zurückzuführen (Unterschiedliche Polung der beiden Elektroden). Nach der Formel v = s / t kann man jetzt die Leitungsgeschwindigkeit berechnen: t = 1,536 ms = 0,0015 s s = 35mm = 0,035m ( siehe Versuchsteil I ) v = 0,035 / 0,0015 = 23,33 m/s 10

11 3.4. Versuch 3: In diesem Versuch untersuchen wir die Refraktärzeit des Bauchmarks des Regenwurms. Der Versuch wird analog zu dem beim Krallenfrosch durchgeführt. Auch hier wird mit einem Doppelreiz gereizt und die Veränderungen registriert Beobachtung: (Abb. 11) Auf der Abbildung 9 sind zwei Aktionspotentiale zu erkennen, deren Amplitude gleich groß ist. Die Aktionspotentiale erfolgen als Antwort auf zwei nacheinander gegebene Reize Diskussion: Bei Abb.9 entspricht der Abstand der zwei gegebenen Reize dem Ende der relativen Refraktärzeit, da die Amplituden gleich groß sind. Gibt man den Reiz vor den 9,108 ms so hätte man nur ein schwächeres Aktionspotential erkennen können. Zur Ermittlung der relativen Refraktärzeit jedoch muss die Amplitude gleich groß sein. Weitere Einzelheiten zu den Refraktärphasen wurden bereits in Versuchsteil I beschrieben. 11