Inhalt. Was ist Bioinformatik? Was ist Genomik? Was ist Metagenomik? Metagenomische Analyse. Was ist Bioinformatik? Warum Bioinformatik?
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- Silke Dresdner
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1 Metagenomik Daniel H. Huson Inhalt Was ist Bioinformatik? Was ist enomik? Was ist Metagenomik? Metagenomische nalyse Inhalt Was ist Bioinformatik? Was ist enomik? Was ist Metagenomik? Metagenomische nalyse orlesung rundlagen der Bioinformatik, SoSe Was ist Bioinformatik? Warum Bioinformatik? Was ist Bioinformatik? Warum Bioinformatik? Was ist Bioinformatik? 4 SOLID pplied Biosystems 5 Forschung Modelle, lgorithmen und Software zur Verarbeitung von biologischen Daten Lehre Interdisziplinäre usbildung in Bioinformatik, Informatik, Mathematik, Biologie und Chemie 6
2 Pacific Symposium on Biocomputing (PSB) 2009 Bioinformatik erman Conference on Bioinformatics 2009 Halle (Saale), September 28-30, 2009 WBI 2009 Workshop on lgorithms in Bioinformatics CSB 2009 workshop on Comparative enome nalyses of Bacterial enomes and pplications Inhalt Was ist Bioinformatik? Was ist enomik? Was ist Metagenomik? Metagenomische nalyse Charles Darwin und die Evolution by eorge Richmond Online Journal of Bioinformatics u.v.m. 7 8 Darwin: "species have changed, and are still slowly changing by the preservation and accumulation of successive slight favorable variations." 9 DNS Biomolekulare rundlage der Evolution DNS und Proteine 1869 Miescher entdeckt DNS in der Küche des Schlosses Hohentübingen Friedrich Miescher ( ) C C... Wiki.org 1953 Francis Crick, Rosalind Franklin, James Watson, und Maurice Wilkins - Struktur der DNS ist eine Doppelhelix - Reihenfolge der Basen bildet einen Kode, der durch die Zelle in ein Protein übersetzt wird 11 12
3 Protein Sequenzierung 1955 Biochemiker Frederick Sanger bestimmt die erste vollständige minosäurensequenz eines Proteins, Insulin. DNS Sequenzierung 1975 Frederick Sanger entwickelt die Kettenabbruchmethode zur Sequenzierung von DNS enomik Die enomik ist das Studium der enomsequenz einzelner Organismen enomgrößen: Bakterien: 1-10 Millionen Basen (Mb) Fruchtfliege: 140 Mb Mensch: 3 Milliarden Basen (b) Sequenzierung Sanger Sequenzierung Sanger Sequenzierung C CCCC C C C C C base pairs of DN (x150000) elesene DNS Sequenz Probe DNS Molekül Datenbank heißt Read DNS Polymerase XXXCCCCCCCXXX CCCCC C C C C C C C DNS Polymerase XXXCCCCCCCXX CCC C C C C C C C C C 16 Deoxynukleotide 17 Deoxynukleotide efärbte di-deoxynukleotide 18
4 Kapillar-echnologie Sequenzfabriken Kapillare Sanger Sequenzierung Eigenschaften: Readlänge ~800 bp C ~99.9% enauigkeit 96 Sequenzen parallel verarbeitet Sequenzierung & ssemblierung ssemblierung enomik 2001 Die Sequenzierung des menschlichen enoms Mondlandung Schrotschuss Klonierung und Zerteilung der DNS Sequenzierung ssemblierung und nnotation
5 enomik enomsequenzen von vielen Modellorganismen mittels Sanger bestimmt: Mensch, Maus, Hund, Ratte, Fruchtfliege, Hefe, cker- Schmalwand, Pappel, verschiedene Bakterien und Viren... Neue Sequenzierungstechnologien b 2005 neue Verfahren Sequenzierungsprojekte Erste neue Sequenziertechnik Emulsion-basierte mplifikation DNS Kugel in die PicoiterPlate M laden ) Jeder Kugel wird ein DNS Fragment zugeordnet Kugel in eine PicoiterPlate M laden Enzyme hinzufügen Zentrifugation Nature, 2005 Source: Stephan C. Schuster, Penn State C) Mikroreaktoren auflösen, mit DNS beladene Kugel selektieren B) Kugel und Reagenzien werden in Wasser-in-Öl Mikroreaktoren eingebracht 44 µm Source: Source:
6 Sequenzierung-mittels-Synthese Parallele Sequenzierung der Fragmente: Fluss Fluss CCCCC CC CC CCCC Sequenzierung-mittels-Synthese Parallele Sequenzierung der Fragmente: Fluss Fluss Fluss usw... CCCCC CC CC CCCC Sequenzierung-mittels-Synthese Basenbestimmung durch nalyse einer Serie von Bildern Source: C DNS Reads zufällig auf einem räger verteilt Solexa Sequenzierung Basenbestimmung durch Bildanalyse egenüberstellung der echnologien Readlänge Basen per Lauf Kosten per Base Sanger < kb > < Mb >10 Solexa <75 10 b 1 Sequenzierungsprojekte nzahl der abgeschlossenen oder zurzeit durchgeführten Projekte: ca Bakterien, ca. 100 rchaebakterien, ca. 100 Eukaryoten Werte ändern sich stetig und deshalb stimmen die ngaben nur größenordnungsmäßig 35 36
7 Sequenzierungsprojekte Inhalt Wie viele rten gibt es? 1000 enomes Projekt: Sequenzierung der enome von 1000 verschiedenen Menschen 1001 enomes Projekt: Sequenzierung von 1001 verschiedenen enomen von Pflanzen (rabidopsis thaliana) EB (enomic Encyclopedia of Bacteria and rchaea) Projekt: Sequenzierung von 100 Prokaryoten Was ist Bioinformatik? Was ist enomik? Was ist Metagenomik? Metagenomische nalyse Eine ungelöste Hauptfrage: nzahl der verschiedenen rten? Nicht mal bis auf einige rößenordnungen genau beantwortet Einige Schätzungen 3-50 Millionen rten von rthropoden Millionen rten von Fadenwürmern Once the diversity of the microbial world is catalogued, it will make astronomy look like a pitiful science Julian Davies, Professor Emeritus, Microbiology and Immunology, UBC 39 Identifizierte Moderne Spezies ~1.7 Million benannte rten Pflanzen, inkl.: Moose Farne 980 nacktsamige zweikeimblättrige einkeimblättrige Pilze Flechten Prokaryoten ~ iere, inkl.: wirbellose: Insekten Weichtiere Krustentiere andere Wirbeltiere: Fische mphibien Reptilien Vögel Säugetiere (Was ist eine Spezies?) Wikipedia listet mehr als 20 verschiedene Definitionen des Begriffes Spezies Metagenomik Das Studium der DNS von unkultivierten Organismen > 99% aller Mikroben nicht kultivierbar report.de Ein enom: esamtheit der genetischen Information eines einzelnen Organismus Ein Metagenom: esamtheit der genetischen Information einer ruppe von Organismen Quelle: Sequenzen für ~
8 ypische Quellen für Metagenome lobal Ocean Sampling Expedition (JCVI) Darm Mikrobiota Bodenproben Meeresproben Bohrkerne aus dem Meeresgrund Luftproben Uralte DNS soils.usda.gov Rusch et al. (2007): 41 Wasserproben röße gefiltert 0,1-0,8 µm Sanger Sequenzierung 7,7 Million Reads Readlänge ~822bp ~ 5,9 b Sequenz Niedriger nteil klonaler Organismen Mikroheterogenität Yooseph et al. (2007): 6 Million Proteine Lineare Entdeckungsrate urnbaugh et al (2006) Mikrobielle DNS aus ob/ob, ob/+, +/+ Mäusen Sanger Sequenzierung: 39.5 Mb Readlänge ~ 750 bp 454 Sequenzierung: 160 Mb Readlänge ~ 93 bp Obesität-assozierte Darm Mikrobiom Veränderung der Häufigkeit von Bacteroidetes und Firmicutes Veränderung der funktionalen Kapazität (in Richtung Energieaufnahme) Nature, Vol /28 December 2006 doi: /nature Mammut Projekt Metatranskriptomik einer Bodenprobe Inhalt DNS aus einem Mammut ( Jahre alt, Permafrost) DNS aus einem ram Knochen extrahiert 454 Sequenzierung Reads ~ Länge ~ 95 bp Urich et al (2008): RNS in cdns zurückgeschrieben 454 Sequenzierung: Reads: ~ Länge: ~ 98 bp RNS ypen: ~ 75% rrns Reads ~ 8% mrns Reads ~ 17% andere rrns nalyse Was ist Bioinformatik? Was ist enomik? Was ist Metagenomik? Metagenomische nalyse 46 mrns nalyse 47 48
9 Zwei Hauptfragen für die Bioinformatik Zwei Hauptfragen für die Bioinformatik Wer ist da? axonomische nalyse Wer ist da draußen? Welche Organismen? In welchen Mengen? Was machen sie? Welche ene vorhanden? ktive Stoffwechselwege? In welchen Mengen? Wer ist da draußen? Welche Organismen? In welchen Mengen? Was machen sie? Welche ene vorhanden? ktive Stoffwechselwege? In welchen Mengen? Hauptprinzip: Ähnlichkeitssuche Für jedes sequenziertes Read: Finde ähnliche Referenzsequenzen in einer Datenbank bekannter Spezies Benutze sie um das Read in die axonomie des Lebens zu plazieren rundlage für biologische Fragen, z.b.: Wie funktioniert eine emeinschaft von Mikroben? rundlage für biologische Fragen, z.b.: Wie funktioniert eine emeinschaft von Mikroben? Wie evolvieren Mikroben? 49 Wie evolvieren Mikroben? Metagenom nalyse Sequenzvergleich mit BLS Die NCBI-NR Datenbank Verarbeitungs pipeline Probe Metagenom DNS Reads Sequenz Vergleich nr nt env-nr env-nt Vergleichsdaten Interaktive nalyse und Visualisierung Das Programm BLS vergleicht Reads gegen eine Datenbank und meldet ähnliche Sequenzen >gi ref ZP_ flagellar motor switch protein [Campylobacter lari RM2100] Score = 33.9 bits (76), Expect = 1.8 Identities = 13/26 (50%), Positives = 19/26 (73%) Query: 79 LMFVFDDLVEENIREIINRDKK 2 LMF FDD++ + N IRE++ DK+ Sbjct: 243 LMFFDDISQLSNIREVLKDKR 268 NCBI-NR ist die größte Proteindatenbank der Welt Mehr als 50 Millionen Einträge Über die Hälfte Homo sapiens Mehr als 1,2 Milliarden minosäuren (NR= nicht redundant) enome Referenz Datenbanken 52 BLS - das meistbenutzte ool der Bioinformatik Original BLS (1990) mal zitiert apped BLS (1997) mal zitiert 53 nr nt enome env-nr env-nt 54
10 Die NCBI-N Datenbank Weitere Datenbanken Metagenom nalyse NCBI-N enthält DNS Sequenzen Mehr als 3 Millionen Einträge Ca 10% Homo sapiens Mehr als 16 Milliarden Nukleotide Environmental-NR Proteinsequenzen aus Metagenomik Proben Environmental-N DNS Sequenzen aus Metagenomik Proben enomdatenbanken Hunderte von rten Probe Metagenom DNS Reads Sequenz Vergleich nr nt env-nr env-nt Vergleichsdaten Interaktive nalyse und Visualisierung nr nt env-nr env-nt nr nt env-nr env-nt enome Referenz Datenbanken enome enome Identifizierung durch Vergleich Einsortierung der Reads in die axonomie nalyse mittels axonomie der rten DNS Read Ein Read hat oft Ähnlichkeit zu mehreren Referenzsequenzen: Einsortierung der Reads in die axonomie: Probe CCCC...C >gi ref ZP_ flagellar motor switch proteinfli [Campylobacter lari RM2100] Score = 33.9 bits (76), Expect = 1.8 Identities = 13/26 (50%), Positives = 19/26 (73%) BLS reffer Query: 79 LMFVFDDLVEENIREIINRDKK 2 LMF FDD++ + N IRE++ DK+ Sbjct: 243 LMFFDDISQLSNIREVLKDKR 268 >gi ref ZP_ flagellar motor switch protein [Campylobacter lari RM2100] Score = 33.9 bits (76), Expect = 1.8 Identities = 13/26 (50%), Positives = 19/26 (73%) Ordnung >gi gb P flagellar motor switch protein Fli [Helicobacter hepaticus CC 51449] Score = 33.5 bits (75), Expect = 2.4 Identities = 13/26 (50%), Positives = 20/26 (76%) Query: 79 LMFVFDDLVEENIREIINRDKK 2 +MF F+D++ ++ N IREI+ DKK Sbjct: 244 MMFFEDISKLDNNIREILKIDKK 269 Query: 79 LMFVFDDLVEENIREIINRDKK 2 LMF FDD++ + N IRE++ DK+ Sbjct: 243 LMFFDDISQLSNIREVLKDKR 268 >gi emb CE FLELLR MOOR SWICH PROEIN FLI [Wolinella succinogenes] Score = 32.7 bits (73), Expect = 4.1 Identities = 13/26 (50%), Positives = 19/26 (73%) Zuordnung des Reads Campylobacter lari RM Query: 79 LMFVFDDLVEENIREIINRDKK 2 +MF F+D+ ++ N IREI+ DKK Sbjct: 242 MMFFEDIEKLDNNIREILKVDKK 267 Neue, unbekannte rt Regelfall: Metagenom enthält viele unbekannte rten 59 60
11 axonomie des Lebens Beispiel: Darmflora einer Maus Vergleichende nalyse Klassifizierung der bekannten rten ~285,000 axa Hauptebenen: 25,000 Prokaryoten Königreich 84,000 iere Stamm 65,000 Pflanzen Klasse 17,000 Viren Ordnung Familie attung rt Lactobacillus: eil der Darmflora, verarbeitet Lactose 62 Veschiebung der nteile dieser beiden Phyla 63 Zwei Hauptfragen für die Bioinformatik ene Ontology Beispiel O Prozesse Wer ist da draußen? Welche Organismen? In welchen Mengen? Was machen sie? Welche ene vorhanden? ktive Stoffwechselwege? In welchen Mengen? rundlage für biologische Fragen, z.b.: Wie funktioniert eine emeinschaft von Mikroben? Wie evolvieren Mikroben? 64 Die ene Ontology stellt ein Vokabular bereit, um ene zu beschreiben Drei Ontologien: Function Funktion des enes Process n welchen Prozessen beteiligt? Component In welchem eil der Zelle? Ca Begriffe 65 66
12 Beispiel O Funktion Beispiel O Zellteil Was machen sie? Funktionale nalyse Hauptprinzip: Ähnlichkeitssuche Für jedes sequenziertes Read: Finde ähnliche Referenzsequenzen in einer Datenbank bekannter Spezies Benutze sie um das Read in die O Ontologie zu plazieren Metagenom nalyse Funktionale nalyse BLS O Ontologien reffer Funktion Prozess eil Prozess Einordung eines Reads in O Process Probe Metagenom DNS Reads Sequenz Vergleich nr nt env-nr env-nt Vergleichsdaten Interaktive nalyse und Visualisierung Read M 1 M 2 M 3 M 4 protein binding response to stress signal transduction cell communication nucleus cellular process enome Referenz Datenbanken M 5 cell part cytosol cell communication 70 Einordunung??? 71? response to stress signal transduction 72
13 Beispiel: Darmflora einer Maus Vergleichende nalyse Vergleichende nalyse 73 Obese Maus: Signifikant mehr ene zur Energieextrahierung 74 Obese Maus: Signifikant mehr ene zur Energieextrahierung Nature, Vol /28 December 2006 doi: /nature usblick Ende der technologischen Fortschritte in der Biologie nicht in Sicht Umwelt enthält sehr viele bisher unbekannte Organismen Bioinformatik hilft, die zwei rundfragen zu beantworten: Who is out there? What are they doing? 76
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