V4 Analyse von Genomsequenzen

Transkript

1 V4 nalyse von enomsequenzen - ene identifizieren Intrinsische und Extrinsische Verfahren: Homologie bzw. Hidden Markov Modelle - ranskriptionsfaktorbindestellen identifizieren Position Specific Scoring Matrices (PSSM) - anz kurz: finde Repeat-Sequenzen Suche nach bekannten Repeat-Motiven - lignment zweier enom-sequenzen Suffix Bäume Softwarewerkzeuge 1

2 Frage1: Wie können wir funktionell wichtige Bereiche in enomsequenzen finden? Leitfragen für V4 nsatz: leite aus bekannten enen bzw. ranskriptionsfaktorbindestellen allgemeine Prinzipen ab und verwende diese dann zur Vorhersage. Frage2: Wie können wir funktionell entsprechende Bereiche in anderen enomsequenzen finden? nsatz: finde homologe, nur einmal vorkommende Bereiche in beiden enomen als nkerpunkte für das enom-lignment. Softwarewerkzeuge 2

3 Zur Erinnerung: ufbau der DN Softwarewerkzeuge 3

4 Zur Erinnerung: ufbau der Doppelstrang-DN Softwarewerkzeuge 4

5 Zur Erinnerung: Packung der DN Softwarewerkzeuge 5

6 Zur Erinnerung: ranskription durch RN Polymerase II amkun J. Nat. en. 39, 1421 (2007) Softwarewerkzeuge 6

7 Zur Erinnerung: ranskriptions en-regulationsnetzwerke Die Maschine, die ein en transkribiert, besteht aus etwa 50 Proteinen, einschließlich der RN Polymerase. Dies ist ein Enzym, das DN code in RN code übersetzt. Eine ruppe von ranskriptionsfaktoren bindet an die DN gerade oberhalb der Stelle des Kern-Promoters, während assoziierte ktivatoren an Enhancer-Regionen weiter oberhalb der Stelle binden. a Softwarewerkzeuge 7

8 Identifikation von enen Die einfachste Methode, DN Sequenzen zu finden, die für Proteine kodieren, ist nach offenen Leserahmen (open reading frames oder ORFs) zu suchen. In jeder Sequenz gibt es 6 mögliche offene Leserahmen: 3 ORFs starten an den Positionen 1, 2, und 3 und gehen in die 5 3 Richtung, 3 ORFs starten an den Positionen 1, 2, und 3 und gehen in die 5 3 Richtung des komplementären Strangs. In prokaryotischen enomen werden Protein-kodierende DN-Sequenzen gewöhnlich in mrn transkribiert und die mrn wird ohne wesentliche Änderungen direkt in einen minosäurestrang übersetzt. Daher ist der längste ORF von dem ersten verfügbaren Met codon (U) auf der mrn, das als odon für den ranskriptionsstart fungiert, bis zu dem nächsten Stopcodon in demselben offenen Leserahmen, gewöhnlich eine gute Vorhersage für die Protein-kodierende Region. Softwarewerkzeuge 8

9 Vorgehen zur enidentifikation Erhalte neue genomische DN-Sequenz Übersetze sie in allen 6 Leserahmen und vergleiche sie mit der Datenbank für Protein- sequenzen. Führe Suche in ES- Datenbank oder cdn- Datenbank desselben Organismus nach ähnlichen Sequenzen durch, falls verfügbar. Benutze envorhersageprogramm um ene zu finden nalysiere regulatorische Sequenzen des ens. Softwarewerkzeuge 9

10 Extrinsische und intrinsische Methoden Viele Verfahren kombinieren nun (a) Homologie-Methoden = extrinsische Methoden mit (b) envorhersage-methoden = intrinsische Methoden Etwa die Hälfte aller ene kann durch Homologie zu anderen bekannten enen oder Proteinen gefunden werden. Dieser nteil wächst stetig, da die nzahl an sequenzierten enomen und bekannten cdn/es Sequenzen kontinuierlich wächst. Um die übrige Hälfte an enen zu finden, muss man Vorhersage-Methoden einsetzen. Softwarewerkzeuge 10 Mathé et al. Nucl. cids. Res. 30, 4103 (2002)

11 Beispiel: Vergleich von limmer und enemarkss Besemer et al. Nucl. cids. Res. 29, 2607 (2003) Softwarewerkzeuge 11

12 Ein Hidden Markov Modell ist ein raph, der verschiedene Zustände verbindet. Im Modell rechts gibt es 3 verborgene Zustände: X1, X2, X3. Zwischen den Zuständen X1 und X2 und zurück und von X2 nach X3 sind hier Übergänge erlaubt. Die Übergangswahrscheinlichkeiten hierfür sind a12, a21 und 23. y1 bis y4 sind die möglichen Output-Zustände, die aus den verborgenen Zuständen mit den Wahrscheinlichkeiten b11 bis b34 erzeugt werden. Die opologie des raphen gibt an, zwischen welchen Zuständen Übergänge erlaubt sind. Diese gibt man bei der Spezifikation des HMM vor. Jeder Übergang hängt nur von den beiden Zuständen i und j ab, nicht von früheren Zuständen. Die Übergangswahrscheinlichkeiten aij und bij müssen in der rainingsphase des HMM hergeleitet werden. Hidden Markov Modell (HMM) Softwarewerkzeuge 12

13 Wettervorhersage mit Hidden Markov Modell Ein efangener im Kerkerverlies möchte das aktuelle Wetter herausfinden. Er weiß, dass auf einen sonnigen ag zu 70 % ein Regentag folgt und dass auf einen Regentag zu 50 % ein Sonnentag folgt. Verborgener Zustand Beobachtung Weiß er zusätzlich, dass die Schuhe der Wärter bei Regen zu 90 % dreckig, bei sonnigem Wetter aber nur zu 60 % dreckig sind, so kann er durch Beobachtung der Wärterschuhe Rückschlüsse über das Wetter ziehen. Softwarewerkzeuge 13

14 Hidden Markov Modell für p-inseln Direkt aufeinander folgende -Nukleotide (p) sind im enom unterrepräsentiert. Sie kommen nicht mit der erwarteten Frequenz von 1/16 vor, sondern viel seltener, da sich methlyiertes ytosin in hymin umwandeln kann. Bereiche mit einer scheinbaren nreicherung von s nennt man p-inseln. Sie lassen sich in einer DN-Sequenz z.b. mit einem HMM aufspüren und liegen oft an ranskriptionsstartstellen, da dort ein erhöhter Selektionsdruck herrscht. Dabei stellt die DN-Sequenz die Beobachtung dar, deren Zeichen {,,,} bilden das usgabealphabet. Im einfachsten Fall besitzt das HMM zwei verborgene Zustände, nämlich p-insel und nicht-p-insel. Diese beiden Zustände unterscheiden sich in ihrer usgabeverteilung, so dass zum Zustand p-insel mit größerer Wahrscheinlichkeit Zeichen und ausgegeben werden. Softwarewerkzeuge 14

15 enerkennung mit Hidden Markov Modellen Bei der enerkennung möchte man bestimmen, wo in einem enom Exons (E) und Introns (I) sind. Der Output ist die bekannte enomsequenz. us dieser soll jedem Basenpaar der günstigste verborgene Zustand (E/I) zugeordnet werden. Softwarewerkzeuge 15

16 IR: limmerm, Exonomy und Unveil opologien von Unveil 283-Zustands-HMM Exonomy 23-Zustands-HMM Für Markov-Modelle gilt: Zustand des i-ten Buchstaben hängt nur von seinem direkten Vorgänger, dem (i-1)- ten Buchstaben ab. Man kann jedoch auch ein sliding window einer bestimmten Breite benutzen, um der zentralen Residue des Fensters z.b. die mittlere Hydrophobizität in diesem Fenster zuzuordnen. Majoros et al. Nucl. cids. Res. 31, 3601 (2003) Softwarewerkzeuge 16

17 Methoden funktionieren nicht überall Ein Beispiel, in dem Exonomy die ene richtig erkennt. Ein Beispiel, in dem limmerm die ene richtig erkennt. Ein Beispiel, in dem Unveil die ene richtig erkennt (auch enscan). Majoros et al. Nucl. cids. Res. 31, 3601 (2003) Softwarewerkzeuge 17

18 Zusammenfassung - envorhersage Die Resultate der intrinsischen envorhersage werden zuverlässiger; dennoch sollte man sie stets mit Vorsicht behandeln. Sie sind sehr nützlich um die Entdeckung von enen zu beschleunigen. Dennoch sind biologische echniken notwendig um die Existenz von virtuellen Proteinen zu bestätigen und um dessen biologischen Funktion zu finden bzw. zu beweisen. Deshalb werden vergleichende enom-nsätze immer wichtiger, in denen Programme enkandidaten auf Homologie mit exprimierten Sequenzen vergleichen (ES oder cdn Sequenzdaten). Neue rbeiten wenden sich nun ebenfalls RN-kodierenden enen zu. Mathé et al. Nucl. cids. Res. 30, 4103 (2002) Softwarewerkzeuge 18

19 Promotervorhersage in E.coli Um E.coli Promoter zu analysieren kann man eine Menge von Promotersequenzen bzgl. der Position alignieren, die den bekannten ranskriptionsstart markiert und in den Sequenzen nach konservierten Regionen suchen. E.coli Promotoren enthalten 3 konservierte Sequenzmerkmale - eine etwa 6bp lange Region mit dem Konsensusmotif bei Position eine etwa 6bp lange Region mit dem Konsensusmotif bei Position die Distanz zwischen den beiden Regionen von etwa 17bp ist relativ konstant a Softwarewerkzeuge 19

20 Machbarkeit der Motivsuche mit dem omputer? ranskriptionsfaktorbindestellen mit einem omputerprogramm zu identifizieren ist schwierig, da diese aus kurzen, entarteten Sequenzen bestehen, die häufig ebenfalls durch Zufall auftreten. Das Problem lässt daher sich schwer eingrenzen Zum einen ist die Länge des gesuchten Motivs vorher nicht bekannt das Motiv braucht zwischen verschiedenen Promotern nicht stark konserviert sein. die Sequenzen, mit denen man nach dem Motiv sucht, brauchen nicht notwendigerweise dem gesamten Promoter entsprechen die zu untersuchenden Promotoren verschiedener ene wurden oft durch einen lusteralgorithmus in eine ruppe eingeteilt, der ebenfalls Beschränkungen unterliegt. Softwarewerkzeuge 20

21 Strategie 1 Wird seit der Verfügbarkeit von Microarray en-expressionsdaten eingesetzt. Durch lustern erhält man ruppen von enen mit ähnlichen Expressionsprofilen (z.b. solche, die zur selben Zeit im Zellzyklus aktiviert sind) Hypothese, dass dieses Profil, zumindest teilweise, durch eine ähnliche Struktur der für die transkriptionelle Regulation verantwortlichen cisregulatorischen Regionen verursacht wird. Suche daher nach gemeinsamen Motiven in < 1000 Basen upstream Region. Bis heute wurde vor allem nach einzelnen Motiven gesucht (als F-Bindestellen), die in den Promotoren von möglicherweise koregulierten enen gemeinsamen auftreten. Besser: suche nach dem gleichzeitigen uftreten von 2 oder mehr Stellen in einem vorgegebenen bstand! Dadurch wird die Suche empfindlicher. Softwarewerkzeuge 21

22 Motif-Identifizierung Ohler, Niemann rends en 17, 2 (2001) Softwarewerkzeuge 22

23 Strategie 2: Erschöpfende Motivsuche in upstream-regionen Benutze Beobachtung, dass sich relevante Motive in der upstream-region oft viele Mal wiederholen, unter Umständen mit kleinen Variationen, damit die regulatorische Wirkung effektiv ist. Suche in der upstream-region nach überrepräsentierten Motiven (1) Ordne ene nach den überrepräsentierten Motiven. (2) nalysiere ruppen von enen, die Motive für Ko-Regulation in Microarray- Experimenten gemeinsam haben. (3) Betrachte überrepräsentierte Motive, die ruppen von koregulierten enen als mögliche Bindungsstellen markieren. ora et al. BM Bioinformatics 5, 57 (2004) Softwarewerkzeuge 23

24 Exploit Erschöpfende Motivsuche in upstream-regionen ora et al. BM Bioinformatics 5, 57 (2004) Softwarewerkzeuge 24

25 Positions-spezifische ewichtsmatrix Populäres Verfahren wenn es eine Liste von enen gibt, die ein F-Bindungsmotiv gemeinsam haben. Bedingung: gute MSs müssen vorhanden sein. lignment-matrix: wie häufig treten die verschiedenen Buchstaben an jeder Position im lignment auf? Hertz, Stormo (1999) Bioinformatics 15, 563 Softwarewerkzeuge 25

26 Positions-spezifische ewichtsmatrix Beispiele für Matrizen, die von YRS verwendet werden: Softwarewerkzeuge 26

27 Datenbank für eukaryotische ranskriptionsfaktoren: RNSF BIOBase / U Braunschweig / BF Relationelle Datenbank 6 Dateien: FOR Wechselwirkung von Fs SIE ENE ELL ihre DN-Bindungsstelle durch welche sie diese Zielgene regulieren wo kommt Faktor in Zelle vor? MRIX F Nukleotid-ewichtungsmatrix LSS Klassifizierungsschema der Fs Wingender et al. (1998) J Mol Biol 284,241 Softwarewerkzeuge 27

28 Datenbank für eukaryotische ranskriptionsfaktoren: RNSF BIOBase / U Braunschweig / BF Matys et al. (2003) Nucl cid Res 31,374 Softwarewerkzeuge 28

29 Identifizierung von Repeats: RepeatMasker RepeatMasker: durchsucht DN Sequenzen auf - eingefügte bschnitte, die bekannten Repeat-Motiven entsprechen (dazu wird eine lange abelle mit bekannten Motiven verwendet) und - auf Regionen geringer Komplexität (z.b. lange bschnitt ). Output: - detaillierte Liste, wo die Repeats in der Sequenz auftauchen und - eine modifizierte Version der Input-Sequenz, in der die Repeats maskiert sind, z.b. durch N s ersetzt sind. Für die Sequenzvergleiche wird eine effiziente Implementation des Smith- Waterman-otoh lgorithmus verwendet. Softwarewerkzeuge 29

30 Zusammenfassung Es gibt große Datenbanken (z.b. RNSF) mit Informationen über Promoterstellen. Diese Informationen sind experimentell überprüft. Microarray-Daten erlauben es, nach gemeinsamen Motiven von ko-regulierten enen zu suchen. uch möglich: gemeinsame nnotation in der ene Ontology etc. F-Bindungsmotive sind oft überrepräsentiert in der 1000 bp-region upstream. Die klare Funktion dieser Bindungsmotive ist oft unbekannt. llgemein gilt: - relativ wenige Fs regulieren eine große nzahl an enen - es gibt globale und lokale Fs - ene werden üblicherweise durch mehr als einen F reguliert Softwarewerkzeuge 30

31 Whole enome lignment (W) Wenn die genomische DN-Sequenz eng verwandter Organismen verfügbar wird, ist die erste Frage, wie das lignment zweier enome aussieht. lobale enom-lignments machen nur für eng verwandte Organismen Sinn. Im anderen Fall muss man zuerst die genomischen Rearrangements betrachten. Dann kann man die systenischen Regionen (Regionen, in denen en- Reihenfolge des nächsten gemeinsamen Vorfahrens in beiden Spezies konserviert blieb) betrachten und lokale enom-lignments dieser Regionen produzieren. Softwarewerkzeuge 31

32 Konservierung von Syntenie zwischen Mensch und Maus Ein typisches 510-kb Segment des Maus-hromosoms 12, das mit einem 600-kb Stück des menschlichen hromosom 14 verwandt ist. Blaue Linien: reziprok eindeutige reffer in beiden enomen. Rote Markierungen kennzeichnen die Länge der passenden Regionen. Die bstände zwischen diesen Landmarks sind im Maus-enom kleiner als im Mensch, was mit der 14% kürzeren esamtlänge des enoms übereinstimmt. he mouse genome. Nature 420, Softwarewerkzeuge 32

33 Entsprechung syntenischer Regionen 342 Segmente und 217 Blöcke >300 kb mit konservierter Syntenie im Mensch sind im Maus-enom markiert. Jede Farbe entspricht einem bestimmten menschlichen hromosom. he mouse genome. Nature 420, Softwarewerkzeuge 33

34 Sensitivität Im globalen Mensch:Maus lignment sind mehr als eine Millionen Regionen stärker als 70% konserviert (auf 100-bp Level) diese Regionen decken > 200 Million bp ab. Nur 62% von ihnen werden von (lokalen) BL-reffern abgedeckt. Dies bedeutet, daß man 38% der konservierten bschnitte nur durch das globale lignment finden kann! Idee: lokales lignment soll als nker-verfahren für anschliessendes globales lignment dienen. Dadurch hofft man, viele zusätzliche konservierte Regionen ausserhalb der nker-regionen zu finden. ouronne,..., Dubchak, enome Res. 13, 73 (2003) Softwarewerkzeuge 34

35 hohe Sensitivität von globalen lignments Beispiel: das globale lignment der mouse finished sequence N_ gegen die Region, die mit BL-nkern gefunden wurde, zeigt konservierte kodierende und nicht-kodierende Elemente, die mit BL nicht gefunden wurden. ouronne,..., Dubchak, enome Res. 13, 73 (2003) Softwarewerkzeuge 35

36 nkerbasierte Methoden für W Diese Methoden versuchen, sich entsprechende eile der Buchstabenfolgen der betrachteten Sequenzen zu finden, die wahrscheinlich zu einem globalen lignment gehören werden. (Diese teilweisen reffer können durch lokale lignments gefunden werden). Sie bilden nker in den beiden zu alignierenden Sequenzen. In diesen Methoden werden zuerst die nkerpunkte aligniert und dann die Lücken dazwischen geschlossen. MUMmer ist eine sehr erfolgreiche Implementation dieser Strategie für das lignment zweier genomischer Sequenzen. Softwarewerkzeuge 36

37 Was ist MUMmer?.L. Delcher et al. 1999, 2002 Nucleic cids Res. Nimm an, dass zwei Sequenzen eng verwandt sind (sehr ähnlich) MUMmer kann zwei bakterielle enome in weniger als 1 Minute alignieren nutzt Suffix-Bäume um Maximal Unique Matches zu finden Definition eines Maximal Unique Matches (MUM): Eine Subsequenz, die in beiden Sequenzen genau einmal ohne bweichungen vorkommt und in keine Richtung verlängert werden kann. rundidee: ein MUM ausreichender Länge wird sicher eil eines globalen lignments sein. maximal unique matching subsequence (MUM) of 39 nt (shown in uppercase) shared by enome and enome B. ny extension of the MUM will result in a mismatch. By definition, an MUM does not occur anywhere else in either genome. Delcher et al. Nucleic cids Res 27, 2369 (1999) Softwarewerkzeuge 37

38 MUMmer: wichtige Schritte Erkenne MUMs (Länge wird vom Benutzer festgelegt) Softwarewerkzeuge 38

39 Definition von MUMmers Für zwei Strings S1 und S2 und einen Parameter l Der Substring u ist eine MUM Sequenz wenn gilt: u > l u kommt genau einmal in S1 und genau einmal in S2 (Eindeutigkeit) vor Für jeden Buchstaben a kommt weder ua noch au sowohl in S1 als auch in S2 vor (Maximalität) Softwarewerkzeuge 39

40 Wie findet man MUMs? Naiver nsatz Vergleiche alle eilsequenzen von mit allen eilsequenzen von B. Dies dauert O(n n ) verwende Suffix-Bäume als Datenstruktur ein naiver nsatz, einen Suffix-Baum zu konstruieren hat eine quadratische Komplexität in der Rechenzeit und dem Speicherplatz durch klevere Benutzung von Pointern gibt es lineare lgorithmen in Rechenzeit und Speicherplatz wie den lgorithmus von Mcreight Softwarewerkzeuge 40

41 Suffix-Bäume Suffix-Bäume sind seit über 20 Jahren wohl etabliert. Einige ihrer Eigenschaften: ein Suffix beginnt an jeder Position I der Sequenz und reicht bis zu ihrem Ende. Eine Sequenz der Länge N hat N Suffices. Es gibt N Blätter. Jeder interne Knoten hat mindest zwei Kinder. 2 Kanten aus dem selben Knoten können nicht mit dem selben Buchstaben beginnen. m Ende wird angefügt Softwarewerkzeuge 41

42 Konstruktion eines Suffix-Baums Suffixes: 1. 1 Softwarewerkzeuge 42

43 Konstruktion eines Suffix-Baums Suffixes: Softwarewerkzeuge 43

50 Softwarewerkzeuge 50 Suchen in einem Suffix-Baum Search Pattern:

51 Softwarewerkzeuge 51 Suchen in einem Suffix-Baum Search Pattern:

52 Sortieren der MUMs MUMs werden nach ihren Positionen in enom sortiert enome : enome B: enome : enome B: Jeder MUM ist nur mit seiner Nummer gekennzeichnet, ohne Berücksichtigung seiner Länge. Das obere lignment zeigt alle MUMs. Die Verschiebung von MUM 5 in enom B zeigt eine ransposition an. Die Verschiebung von MUM 3 könnte ein Zufallstreffer oder eil einer inexakten Repeat-Sequenz sein. Unteres lignment: suche in beiden enomen die längste gemeinsam ansteigende Folge an Subsequenzen Softwarewerkzeuge 52

53 Beispiel: lignment zweier Mikroorganismen Das enom von M.genitalium ist nur etwa 2/3 so lang wie das von M.pneumoniae. Obere bbildung: FS-lignment von M.genitalium und M.pneumoniae. Mitte: lignment mit 25mers Unten: lignment mit MUMs. 5 ranslokationen. Ein Punkt bedeutet jeweils einen reffer zwischen den enomen. FS-Plot: ähnliche ene 25-mer-Plot: 25-Basen-Sequenz, die in beiden Sequenzen genau einmal vorkommt. MUM-Plot: MUM-reffer. Delcher et al. Nucleic cids Res 27, 2369 (1999) Softwarewerkzeuge 53

54 Beispiel: lignment Mensch:Maus lignment von weiter entfernt liegenden Spezies: Mensch gegen Maus. Hier: lignment einer bp eilsequenz auf dem menschlichen hromosom 12, accession no. U47924, gegen eine bp lange eilsequenz des Mauschromosoms 6. Jeder Punkt des Plots entspricht einem MUM von [ge]15 bp. Delcher et al. Nucleic cids Res 27, 2369 (1999) Softwarewerkzeuge 54

55 Zusammenfassung Die nwendung der Suffix-Bäume war ein Durchbruch für die lignierung ganzer enome MUMmer 2 besitzt zusätzliche Verbesserung für die Rechenzeit und den Speicherplatz die Verwendung von Suffix-rrays anstatt von Suffix-Bäumen gibt eine verbesserte Datenstruktur ( Stefan Kurtz, Hamburg) es wird nun möglich, mehr als zwei enome zu alignieren (implementiert in M) Softwarewerkzeuge 55