DNA Reparatur. Häufige Ursachen von DNA Schäden und ihre. Reparaturmechanismen. Syndrome mit defekter DNA-Reparatur

Transkript

1 DNA Reparatur Häufige Ursachen von DNA Schäden und ihre Reparaturmechanismen Syndrome mit defekter DNA-Reparatur Karzinogene und ihre Wirkungsweise

2 Direkte Reparatur I: die meisten Fehler werden bei der Replikation gemacht und Mutationen trotzdem verhindert! Polymerase -Fehlerrate ~10(e -5) Korrekturlesen ~10(e -2) Fehlpaarungsreparatur ~10(e -3) Gesamt ~10(e -10)

3 UV-Licht kann benachbarte Pyrimidinreste im gleichen Strang crosslinken

4 Direkte Reparatur II: Bakterien und Hefen können Pyrimidindimere photochemisch spalten und zu zwei Monomeren rekonvertieren Die Photolyase besitzt ein Coenzym (N 5, N 10 -Methenyltetrahydrofolat), welches ein Photon absorbieren und dadurch angeregt werden kann.

5 Direkte Reparatur III: die Methylguaninmethyltransferase kann Methylierung von G (zu 6-O-MeG) rückgängig machen Wichtiger Mechanismus z.b. während einer Krebstherapie mit alkylierenden Chemotherapeutika; MGMT-Spiegel müssen dazu gesenkt werden (durch 6-O-Benzylguanin).

6 Desaminierung von C oder 5-Methyl-C ist die häufigste Ursache für Punktmutationen

7 Spontan desaminierte Basen werden durch die Basenexzisionsreparatur repariert NH 2 O O N HN HN CH 3 O N O N O N Cytosin (C) Uracil (U) Thymin (T) Andere DNA-Glykosylasen sind spezifisch für andere modifizierte Basen, z.b. 8-Oxy-Guanin. Depurinierung wird durch einen ähnlichen Mechanismus repariert.

8 Warum enthält RNA Uracil (bzw. warum enthält DNA Thymin)? Die Methylierung von Desoxyuridylat zu Desoxythymidylat ist energetisch aufwendig; was ist der Grund für diese Energieverschwendung? NH 2 O O N HN HN CH 3 O N O N O N Cytosin (C) Uracil (U) Thymin (T) Cytosin in der DNA desaminiert zu einem messbaren Prozentsatz spontan zu Uracil. Da Uracil mit Adenin paart, ist die Desaminierung potenziell mutagen (einer der Tochterstränge würde ein AU-Basenpaar statt einem CG Basenpaar enthalten). In DNA eingebautes Uracil wird durch ein spezielles Reparaturenzym entfernt. Die Methylmarkierung des Thymidins bewirkt, das Thymin von der Uracil-DNA-Glykosidase nicht erkannt wird. Wäre die Methylgruppe nicht vorhanden, könnte korrekt eingebautes Uracil nicht von durch Desaminierung gebildetem Uracil unterschieden werden.

9 UV-Licht kann benachbarte Pyrimidinreste im gleichen Strang crosslinken

10 Pyrimidindimere können durch die Nukleotidexzisionsreparatur repariert werden In E.coli: Nuklease=UvrABC-Excinuklease

11 Xeroderma pigmentosum Patienten haben Defekte in der Nukleotidexzisionsreparatur klinisch und genetisch heterogene Erbkrankheit Häufigkeit 1:10 5-1:10 6 Symptome Extreme Sensitivität gegenüber UV Strahlung 2000-fach erhöhtes Hautkrebsrisiko Schwere Haut- und Augenanomalien Neurologische Defekte (20% der Patienten) Lebenserwartung um 30 Jahre verkürzt

12 Die in XP-Patienten mutierten Gene führten zur Aufklärung der Wirkungsweise der Nukleotidexzisionsreparatur im Menschen 1. UV-Licht 4. Bildung des Reparaturkomplexes TFIIH XPB XPA XPD XPG 2. Schadenerkennung durch XPC RPA 23B XPC 5. Excision durch XPF und XPG Endonukleasen 3. Rekrutierung der Helikasen XPB, XPD ERCC1 XPA TFIIH 23B XPC XPF RPA XPG 6. Reparatursynthese (Pol ε)

13 XPV ist nicht beteiligt an Reparatur; es ist eine Polymerase, die Pyrimidindimere tolerieren und übergehen kann (by-pass-polymerase). Eukaryonten DNA-Pol α DNA-Pol β DNA-Pol γ DNA-Pol δ DNA-Pol ε DNA-Pol κ DNA-Pol λ DNA-Pol ι DNA-Pol θ DNA-Pol ϕ DNA-Pol η Primase, kurze DNA-Fragmente Reparatur Replikation des Mitochondriengenoms (16.6 kbp zirkulär*) Replikation Folgestrang Replikation Leitstrang DNA-Synthese auf beschädigter DNA " " " "

14 Verschiedene Arten von Mutationen treten bei der Replikation auf 1. Substitution eines Basenpaares durch ein anderes (am häufigsten) 2. Deletion eines oder mehrerer Basenpaare 3. Insertion eines oder mehrerer Basenpaare Transition: Ersatz eines Purins durch ein anderes oder eines Pyrimidins durch ein anderes Transversion: Ersatz eines Purins durch ein Pyrimidin oder umgekehrt

15 Die Fehlpaarungsreparatur erkennt fehlgepaarte Basen oder kleine Insertionen In E. coli: MutL rekrutiert die Endonuklease MutH, die den nicht-methylierten Strang (blau) spaltet.

16 5' 3' 3' Die Fehlpaarungsreparatur erkennt fehlgepaarte Basen oder kleine Insertionen G T 5' 5' 3' 3' G T hmlh1 hpms2 Exo1 5' hmsh6 G T hmsh2 5' 3' 3' ADP ATP 5' MutSα, MutLα Exo1, PCNA RPA 5' 3' 3' DNA polymerase δ / PCNA DNA ligase 5' 3' G 3' C 5' 5' 5' 3' 3' hmlh1 hpms2 5' ATP ADP hmlh1 hpms2 5' 3' 3' G T 5' Im Menschen: Der Mismatch-Erkennungskomplex aus MSH2/6 und MLH1/PMS2 wandert an der DNA entlang, bis er auf eine Strangdiskontinuität trifft. Dort wird durch PMS2 ein Einzelstrangbruch eingeführt und Exo1 rekrutiert, die den Tochterstrang abbaut.

17 Ionisierende Strahlung (X-, γ ) kann Doppelstrangbrüche hervorrufen

18 Diese werden durch nicht-homologes End-joining repariert

19 Doppelstrangbrüche können auch durch homologe Rekombination repariert werden

20 Doppelstrangbrüche können auch durch homologe Rekombination repariert werden

21 Die Fusion nicht-zusammenpassender Enden kann zu chromosomalen Translokationen und Krebs führen Die t(8;14) Translokation beim Burkitt-Lymphom bewirkt Űberexpression des Myc-Onkoproteins (Transkription von Cyclingenenverstärkte Zellteilung)

22 IgH und Bcl-2 fusionieren bei Follicularem Lymphom, was zu Bcl-2 Űberexpression fuehrt

23 Fehlerhaftes End-joining kann zu chromosomalen Translokationen und Krebs führen Bei der t(9;22) Translokation in CML- Patienten fusioniert der BCR- mit dem Abl- Lokus; Das Fusionsprodukt hat konstitutive Tyrosinkinaseaktivität.

24 Konstitutiv aktives BRC-ABL phosphoryliert zahlreiche neue Substrate und macht die Zellteilung unabhängig von Wachsumsfaktoren Imatinib (Gleevec) blockiert spezifisch BRC-ABL.

25 Der Nachweis von chromosomalen Translokationen erfolgt über FISH

26 Die Enden von Chromosomen replizieren mit Hilfe des Enzyms Telomerase

27 Stammzellen haben lange Telomere und viel Telomerase; in somatischen Zellen nimmt die Telomerlänge mit zunehmenden Alter ab und Telomerase fehlt

28 Der Verlust von Telomeren bewirkt Abbruch-Fusion-Brücken Zyklen (breakage-fusion-bridge cycles)

29 Karzinogene sind häufig Mutagene Epidemiologischer Zusammenhang zwischen Rauchen und Lungenkrebs

30 Benzo(a)pyren wird von Cytochrom P450 Enzymen aktiviert und modifiziert Guanin, so dass es mit A statt C paart (G->T Transversion) Kausaler Zusammenhang zwischen Rauchen und Lungenkrebs

31 Aflatoxin (ein Schimmelpilzgift) modifiziert nach Aktivierung ebenfalls G und bewirkt G-> T Transversionen (seltene Mutationen in p53)

32 Das Erhitzen von Fleisch bei hohen Temperaturen erzeugt heterozyklische Amine, die Guaninaddukte bilden und mit Prostatakrebs in Verbindung stehen (p53 Mutationen)

33 Erbkrankheiten mit DNA-Reparatur-Defekten

34 Expression der genetischen Information- RNA-Synthese (Transkription)

35 Bei der Transkription wird DNA in RNA umgeschrieben (transkribiert)

36 Einige Konventionen bei der Beschreibung der Transkription

37 Die Transkription besteht aus 3 Schritten: Initiation, Elongation und Termination

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40 Űbersicht Transkription

41 Bakterien besitzen eine einzige RNA-Polymerase, die aus mehreren Untereinheiten besteht Untereinheit Gen Anz. Masse Funktion (kd)! rpo A 2 37 Bindet regulatorische Sequenzen " rpo B Bildet Phosphodiesterbindungen " rpo C Bindet die DNA-Matrize # 70 rpo D 1 70 Erkennt den Promotor und initiiert die Synthese

42 Bakt. RNA-Polymerase mit Matrize während der Elongation Transkriptionsrichtung

43 Bakterielle und eukaryotische RNA-Polymerasen sind ähnlich aufgebaut

44 Eukaryoten besitzen mehrere RNA-Polymerasen mit unterschiedlicher Funktion

45 Die Zusammensetzung der Untereinheiten ist bei allen RNA-Pol ähnlich

46 Nur die RNA-Pol II (mrna Synthese) hat eine C-terminale Domäne, die während aktiver Transkription phosphoryliert wird chromosomal puffs : Orte aktiver Transkription grün: nicht-phosphorylierte CTD rot: phosphorylierte CTD

47 Genorganisation in Pro- und Eukaryoten

48 Transkription und Translation sind in Eukaryoten zeitlich und räumlich getrennt

49 Regulation der Genexpression-- Prokaryoten

50 Die Sigma-Untereinheit der bakt. RNA-Pol erkennt Promotorsequenzen upstream des Transkriptionsstarts -35 Region -10 Region TTGACAT bp TATAAT

51 E. coli kann die Gene des Laktosemetabolismus in Abhängigkeit von Substratverfügbarkeit kontrollieren Die Kontrollregion rund um den Transkriptionsstart des lacz-operons besteht aus ca. 100bp, die Repressoren und Aktivatoren binden

52 RNA-Pol assoziiert mit unterschiedlichen Sigmafaktoren, je nach Wachstumsphase und Substratverfügbarkeit housekeeping heat shock nitrogen metabolism

53 Transkriptionsfaktoren können auch sehr weit entfernt vom Transkriptionsstart an regulatorische Sequenzen binden- sog. Enhancer Schleifenbildung

54 Zwei-Komponentensysteme erlauben es Bakterien, schnell auf Umwelteinflüsse zu reagieren

55 Regulation der Genexpression-- Eukaryoten

56 Eukaryotische RNA-Pol erkennen ebenfalls Promotorsequenzen upstream des Transkriptionsstarts

57 Konsensussequenz der TATA-Box >900 eukaryotische Gene analysiert

58 Die generellen Transkriptionsfaktoren TFIIA,B, und D ermöglichen die Initiation der Transkription durch sukzessive Bindung an die TATA-Box

59 Alternativ zur TATA-Box können Initiator-Elemente oder CpG- Inseln als Promotoren (z.b. von housekeeping-genen) dienen Initiator 5 - Y-Y-A +1 -N-T/A-Y-Y-Y -3 CpG Insel

60 Typischer Aufbau eines Säuger- bzw. Hefegenlokus-- Enhancer können viele kb upstream vom durch sie regulierten Gen liegen

61 Die Kontrollregion eines Gens kann Bindungsstellen (Enhancerelemente) für mehrere Transkriptionsfaktoren haben

62 Enhancer werden von Transkriptionsfaktoren gebunden, die eine DNA-Bindungs- und eine Aktivierungsdomäne besitzen

63 Die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors interagiert mit DNA (grosse Furche) z.b. mittels einer α-helix

64 Viele Transkriptionsfaktoren haben Zink-Finger-Domänen, die ebenfalls eine α-helix in die grosse Furche inserieren GL1: C 2 H 2, monomeric Glucocorticoid-R: C 4, homodimeric; recognizes inverted repeats

65 Andere Transkriptionsfaktoren gehören zur Familie der Leucine-Zipper- oder Helix-Loop-Helix-Proteine Leucine Zipper Basic Helix loop Helix Im C-Terminus bewirken hydrophobe AS die Dimerisierung (amphipathische α- Helices) Im N-Terminus bewirken positiv geladene (basische) AS die Bindung an DNA (Phosphatreste)

66 Manche Transkriptionsfaktoren brauchen die Hilfe von Co-Aktivatoren Der Östrogenrezeptor gehört zur Transkriptionsfaktor- Familie der nuclear receptors.

67 Manche Transkriptionsfaktoren kooperieren : nur wenn beide vorhanden sind, können AP1 und NFAT hochaffin an promotor-proximale Kontrollelemente binden IL-2 Genlokus

68 An Enhancerelementen bilden sich häufig Multiproteinkomplexe (Enhancesomen), die kooperativ die Genexpression regulieren β-interferon Enhancerelement

69 Wie werden Transkriptionsfaktoren reguliert? -Entwicklungsspezifische Regulation -Zelltyp-/Gewebe-/Organspezifische Regulation -Regulation durch Signale von aussen: Proteinsignale Hormonsignale

70 Steroidhormone wirken, indem sie spezifische Transkriptionsfaktoren ( nuclear receptors ) aktivieren

71 Nuclear receptors haben konservierte DNA-Bindungsdomänen und variable N- und C-Termini

72 Manche Nuclear receptors binden als Homodimere, andere als Heterodimere an ihre Kontrollregionen (Response elements) Der Glukocorticoid- und der Östrogenrezeptor binden als Homodimere an inverted repeats. Die Vitamin D3-, Thyroxin- und Retinolsäurerezeptoren bilden Heterodimere mit RXR, und binden an direkte repeats, die sich nur in der Anzahl zwischengeschalteter Nukleotide unterscheiden (N) 3,4,5.

73 Hormonbindung aktiviert die homodimeren Nuclear receptors, indem sie ihre Translokation vom Zytoplasma in den Kern induziert - Hormon + Hormon

74 Wie arbeiten Transkriptionsfaktoren? -beeinflussen die Dichte des Chromatins und damit die Zugänglichkeit der DNA für Proteine -regulieren die Initiation der Transkription, indem sie die Zusammenlagerung des Präinitiationskomplexes bewirken

75 Transkriptionsfaktoren wie z.b. die Nuclear Rezeptors wirken, indem sie die Packung der DNA beeinflussen

76 Aktiv transkribierte Gene befinden sich in lose gepacktem (Eu)chromatin

77 Die Kondensation des Chromatins wird durch Acetylierung von Histonen beeinflusst Reprimierende bzw. aktivierende Transkriptionsfaktoren beeinflussen den Acetylierungsstatus benachbarter Nukleosomen und damit die Zugänglichkeit der in ihnen verpackten Promotorsequenzen

78 Methylcytosin in CG-Dinukleotiden kann ebenfalls durch Rekrutierung von Histon-Deacetylasen Chromatinkondensation bewirken 5-Methylcytosin NH 2 CH 3 O N N 5 T T A A C G A T A C 3 3 A A T T G C T A T G 5

79 Sukzessive Bindung der generellen Transkriptionsfaktoren an Promotorelemente initiiert die Transkription

80 Pol II im Komplex mit DNA und generellen Transkriptionsfaktoren

81 Der Mediatorkomplex rekrutiert Pol II an Promotoren, indem er sowohl an Pol II als auch an Aktivierungsdomänen von Transkriptionsfaktoren bindet

82 Die Elongation verläuft hochprozessiv mit 50 Nukleotiden/ Sekunde Die Entwindung der DNA in der Transkriptionsblase wird von TFIIH Vorangetrieben.

83 In Prokaryoten besteht das Terminationssignal aus einer Haarnadelschleife gefolgt von einer poly-u Sequenz

84 In Eukaryoten wird das Primärtranskript prozessiert

85 Übersicht über Primärtranskript-Prozessierung in Eukaryoten

86 Die Prä-mRNA erhält ko-transkriptionell ein schützendes Cap Das capping Enzym bindet an die phosphorylierte CTD der PolII und wird dadurch aktiviert

87 Die Prä-mRNA erhält post-transkriptionell einen poly(a)-schwanz

88 EM-Fotos von mrna-dna-hybriden bewiesen die Existenz von Introns

89 Übersicht über RNA-Prozessierung inkl. Spleissen

90 Konsensus-Sequenz der Spleiss-Region

91 Atomarer Mechanismus des Spleissens

92 Am Spleissprozess sind ca. 100 Proteine und 5 snrnas beteiligt Im ersten Schritt hybridisieren die U1 und U2 snrnas mit der 5 Spleissstelle und der Sequenz um die Verzweigungsstelle

93 Das nicht gepaarte A der Verzweigungsstelle zeigt aus dem Hybrid der U2 snrna mit der komplementären Sequenz der Prä-mRNA heraus

94 Durch anschliessende Anlagerung der U4-6 Ribonukleoproteinkomplexe entsteht das Spleissosom

95 Die U2 und U6 Ribonukleoproteinkomplexe bilden das katalytische Zentrum Bei der ersten Transesterifizierung bildet sich ein 2-5 verknüpftes Intermediat zwischen dem G am 5 des Introns und dem A der Verzweigungsstelle Die beiden Exons werden bei der zweiten Transesterifizierung über eine normale 5-3 Verknüpfung verbunden Nach extensiver Umlagerung der Basenpaarungen zwischen U1,2,4,5 und 6 dissoziieren U1 und U4 ab.

96 Vorgang des Spleissens

97 Die snrnas im Spleissosom leiten sich wahrscheinlich von sich selbst spleissenden Introns ab

98 Durch die Assoziation von mrna-prozessierenden Proteinen mit phosphorylierter CTD von PolII werden Transkription und Prozessierung gekoppelt

99 Übersicht Transkription, mrna-prozessierung und Translation

100 Ribosomale RNA (rrna) wird als eine einzige Prä-rRNA synthetisiert

101 Pro Transkriptionseinheit werden simultan zahlreiche Prä-rRNA- Moleküle von RNA-Pol I synthetisiert

102 rrna wird in Nukleoli transkribiert, und assoziiert sofort mit ribosomalen Proteinen

103 Ribosomen sind Nukleoprotein-Komplexe und bestehen zu 60% aus RNA und zu 40% aus Protein

104 Bei der Reifung der Prä-rRNA im Nukleolus wird das Primärtranskript exo- und endonukleolytisch gespalten und methyliert

105 Jede trna ist spezifisch für eine Aminosäure, die am 3 -Ende gebunden wird trnas bestehen aus ca. 75 Nukleotiden, die teilweise Basenpaarungen eingehen.

106 Auch trnas werden im Kern post-transkriptionell prozessiert Das 5 Ende wird exonukleolytisch durch RNase P gespalten. Die Uridin-Reste am 3 Ende werden durch CCA ersetzt. Etwa 10% der Nukleotide in trnas werden modifiziert. Manche trnas besitzen Introns, die herausgespleisst werden müssen.

107 Bei der Modifizierung der Basen entstehen einige seltene Nukleotide N N O N NH NH 2 Guanin (G) (G) NH 2 N N N N Adenin (A) (A) NH 2 O O N HN CH HN 3 O N O N O N Cytosin (C) Uracil (U) Thymin (T) O O NH 2 O - CH 3 HN N HN NH N CH 3 N N + N N O O N NH 2 N N Ribose Ribose Ribose Ribose Inosin (I) Pseudouridin (Ψ) 5 Methylcytosin (m5c) 7-Methylguanosin (m7g)

108 Die dreidimensionale Struktur einer trna sieht aus wie ein L

109 Translation/Proteinsynthese -Der genetische Code -Initiation, Elongation, Termination

110 Die drei Arten von RNA arbeiten bei der Proteinsynthese zusammen

111 Der genetische Code besteht aus 4 3 =64 Codons

112 Die meisten Aminosäuren werden durch mehr als 1 Codon spezifiziert

113 Die Abfolge von Codons zwischen einem Start- und einem Stopcodon heisst Leseraster (reading frame) Eine mrna kann für 2, in seltenen Fällen sogar 3 Polypeptide kodieren (Leserasterverschiebung).

114 Die Übersetzung der Nukleotidsequenz der mrna in die Aminosäuresequenz eines Proteins erfolgt in zwei Hauptschritten: 1. Die Aminosäure wird durch ihre spezifische Aminoacyl-tRNA-Synthetase an die korrespondierenden trnas gekoppelt.

115 Die Übersetzung der Nukleotidsequenz der mrna in die Aminosäuresequenz eines Proteins erfolgt in zwei Hauptschritten: 2. Das Anticodon der trna paart mit dem Codon in der mrna, das für die auf die trna geladene Aminosäure kodiert. Dadurch kann diese ins Protein eingebaut werden.

116 Die dritte Position eines Codons kann häufig mit mehr als einer Base im trna Anticodon paaren ( wobble position ) Beispiel: 4 der 6 für Leucin kodierenden Codons- CUA, CUC, CUU, UUAerkennen die gleiche trna (GAI), da das Inosin in der wobble position mit A, C und U paaren kann und das U in der Position 1 ein unkonventionelles Basenpaar mit G bilden kann.

117 Die Proteinsynthese erfolgt an der Schnittstelle zwischen kleiner und grosser Untereinheit der Ribosomen

118 Bakterielle (polycistronische) mrnas kodieren für mehrere Proteine, eukaryotische (monocistronische) mrnas nur für ein Protein

119 Die Proteinsynthese auf eukaryotischen mrnas beginnt in der Regel in <100 Nukleotiden Entfernung vom 5 Cap, am ersten AUG Kozak-Sequenz: ACCAUGG

120 Inaktive Ribosomenuntereinheiten sind separiert und an spezifische Initiationsfaktoren (IF) gebunden

121 Bei der Translationsinitiation in Eukaryoten muss sich zunächst ein Prä-Initiationskomplex aus kleiner Ribosomenuntereinheit, IFs und Methionyl-Initiator-tRNA bilden Regulation der Proteinsynthese über Phosphorylierung von eif2 (GDP-GTP-Austausch)

122 Der Prä-Initiationskomplex assoziiert dann mit mrna, an deren Cap eif4 gebunden hat, zum Initiationskomplex

123 Der Initiationskomplex wandert an der mrna entlang und sucht das Startkodon (scanning) Beim Scanning müssen RNA-Sekundärstrukturen durch die eif4a Helikase entwunden werden. Nachdem das Startkodon identifiziert worden und die trna über ihr Anticodon damit fest verbunden ist, hydrolysiert eif2-gtp zu GDP und alle IFs dissoziieren ab.

124 Unter Mithilfe von eif5 und 6 assoziiert am Startkodon die grosse Ribosomenuntereinheit mit der kleinen Untereinheit zum 80S Ribosom Dabei wird die Initiator-tRNA in der P-Stelle positioniert.

125 Die Proteinsynthese auf prokaryotischen mrnas beginnt an internen Startkodons, denen eine Shine-Dalgarno-Sequenz vorausgeht Die Shine-Dalgarno-Sequenz (6 bp, purinreich) ist komplementär zum 3 Ende der rrna in der kleinen Ribosomenuntereinheit.

126 Prokaryotischen mrnas haben kein Cap; der Initiationskomplex entsteht am Startkodon/ der Shine-Dalgarno-Sequenz

127 Die Elongation der Peptidkette wird durch Bindung einer neuen, komplementaren trna in Position A eingeleitet Die trnas sind an den Elongationsfaktor EF1α gebunden, der sie ans Ribosom transportiert

128 Die GTPase-Aktivität der Elongationsfaktoren stellt die Irreversibilität der einzelnen Schritte sicher Bei korrekter Basenpaarung hydrolysiert EF1α GTP zu GDP, was im Ribosom zu einer Konformationsänderung, und zu fester Bindung der trna führt Die 23S rrna (grosse Ribosomen-UE) katalysiert die Bildung einer Peptidbindung zwischen den Aminosäuren in Positionen A und P Nach erfolgter Peptidbindung treibt die Hydrolyse von GTP durch EF2 die Translokation des Ribosoms um ein Codon in 3 Richtung an

129 Elongation der Polypeptidkette-Mechanismus

130 Wie kann EF1α-GTP regeneriert werden? Eukaryoten EF1α EF1βγ EF2 Prokaryoten EF-Tu EF-T (GDP-GTP exchange factor) EF-G

131 Modell basierend auf cryoelektronenmikroskopischen Aufnahmen

132 Termination der Proteinsynthese erf1 erkennt Stopcodons UAA, UGA, UAG (Form von erf1 ist ähnlich wie trna) Abspaltung der fertigen Polypeptidkette ist gekoppelt an GTP Hydrolyse an/durch erf3

133 Inaktive Ribosomenuntereinheiten werden separiert und binden wieder an ihre Initiationsfaktoren (IF)

134 Zahlreiche Ribosomen arbeiten simultan an der gleichen mrna (Polysomen)

135 PABPI vernetzt das 3 Poly-A-Ende der mrna mit dem 5 Cap, so dass freiwerdende Ribosomenuntereinheiten sofort wieder starten können

136 Manche Antibiotika hemmen spezifisch die Proteinsynthese in Bakterien Antibiotikum Streptomycin Tetracyclin Chloramphenicol Cycloheximid Erythromycin Puromycin Wirkung und andere Aminoglykoside hemmen die Initiation und verursachen Fehlablesungen der mrna (bei Prokaryoten) lagert sich an die 30S-Untereinheit an und hemmt die Bindung der Aminoacyl-tRNAs (bei Prokaryoten) hemmt die Peptidyltransferaseaktivität der 50S-Ribosomenuntereinheit (bei Prokaryoten) hemmt die Peptidyltransferaseaktivität der 60S-Ribosomenuntereinheit (bei Eukaryoten) lagert sich an die 50S-Untereinheit an und hemmt die Translokation (bei Prokaryoten) verursacht vorzeitigen Kettenabbruch, weil es als Analogon der Aminoacyl-tRNA wirkt (bei Prokaryoten und Eukaryoten)

137 Manche bakteriellen Toxine wirken, in dem sie die Proteinsynthese im Wirt inhibieren (Diphtherietoxin) Ein modifizierter Histidinrest in EF2 (Diphthamid) wird von Diphtherietoxin ADP-ribosyliert

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139 Post-transkriptionale Regulation der Genexpression -RNA interference/silencing -RNA editing -Alternatives Spleissen

140 micrornas sind Nukleotide lang und verhindern die Translation ihrer komplementären Ziel-mRNA(s)

141 mirnas werden durch Prozessierung von Primärtranskripten gewonnen

142 Die Bindung von mehreren mirna/risc-komplexen an den 3 UTR einer mrna bewirkt Translationsinhibition

143 1000 menschliche mirnas regulieren ca. 1/3 aller Gene

144 Dicer prozessiert neben Prä-miRNAs auch lange, doppelsträngige RNA (z.b. viralen Ursprungs) zu kurzer, ds RNA mirna und sirna unterscheiden sich nicht in ihrer Struktur, wohl aber in ihrer Wirkung.

145 Der silencing complex (RISC) kann die Genexpression über zwei unterschiedliche Mechanismen ausschalten

146 sirna wird experimentell eingesetzt, um Expression eines Gens auszuschalten (knock-down)

147 Lokale bzw. systemische Applikation von sirna eröffnet neue therapeutische Anwendungen P2X3 sirna (Kationenkanal) bei neuropathischem Schmerz VEGF sirna gegen makulare Degeneration der Retina Fas/Caspase 8 sirna gegen Hepatitis HBV sirna gegen HBVinduzierte Hepatitis SARS/Influenza sirna gegen Lungen- Infektionen mit dsrna Viren

148 RNA editing erzeugt zwei unterschiedliche Proteine vom gleichen Primärtranskript in der Leber und im Darm

149 Einfache Transkriptionseinheiten (~40%) kodieren für nur eine Polypeptidkette

150 Komplexe Transkriptionseinheiten (60%) kodieren für >1 Polypeptid

151 Alternatives Spleissen ermöglicht die Produktion membranständiger und löslicher Antikörper vom gleichen Primärtranskript

152 Alternatives Spleissen ermöglicht die Produktion membranständiger und löslicher Antikörper vom gleichen Primärtranskript

153 Alternatives Spleissen ermöglicht die Produktion der Fibronektin-Isoformen in der extrazellulären Matrix und im Serum Exone IIIA und B kodieren für Domänen, die Fibronektin an die Zelloberfläche binden. Lösliches Fibronektin ist dagegen an der Blutgerinnung beteiligt.

154 Genetische Vielfalt: Genumordnung (Rekombination) -Homologe Rekombination -Ortsspezifische Rekombination -Transposons und Retrotransposons -Exon shuffling

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159 Ortsspezifische Rekombination: Beispiel Antikörperdiversität

160 Die Spezifität eines Antikörpers wird durch seine hypervariable Region bestimmt

161 Die Antikörpervielfalt wird durch somatische Rekombination generiert im Menschen: 250 V-Gensegmente 15 D-Gensegmente 4 J-Gensegmente =45000 Kombinationen

162 Somatische Rekombination erfordert eine Signalsequenz

163 Kompatible Gensegmente lagern sich über ihre Signalsequenzen zusammen Die Rag-Rekombinasen stabilisieren den Komplex 12/23-Spacer-Regel: nur Signalsequenzen mit unterschiedlich langen Spacerregionen können sich zusammenlagern.

164 Die Rekombination in B-Zellen erfordert Rag-Proteine und Komponenten der nicht-homologen Endenverknüpfung Kompatible Gensegmente lagern sich über ihre Signalsequenzen zusammen Rag-Rekombinasen schneiden je einen Strang. Die Partnerstränge werden kovalent verbunden. Die Haarnadelschleifen gehen assymetrisch oder symmetrisch auf. Überhänge werden generiert und aufgefüllt. Ligase 4 und XRCC4 ligieren die beiden Enden. => Zusätzliche Diversität entsteht durch Einfüllen von Nukleotiden, die in der Originalsequenz nicht vorkommen.

165 Pro B-Zelle wird nur ein Antikörper produziert 1. Beide homologen Chromosomen rekombinieren zunächst die D- und J-Segmente der schweren Kette. 2. Die V-DJ-Rekombination erfolgt nur auf einem Chromosom. Die Nähe von V-Promoter und Enhancer bewirkt, dass das rekombinierte Gen abgelesen werden kann. Oberflächen- Expression der schweren Kette inhibiert die V-DJ-Rekombination auf dem anderen Chromosom. 3. Ist die erste V-DJ-Rekombination unproduktiv, rekombiniert das 2. Chromosom (4.). 5. Sind beide Rekombinationen unproduktiv, stirbt die B-Zelle.

166 Jede B-Zelle kann Antikörper verschiedener Klassen exprimieren, die durch die konstante Domäne definiert sind Keimbahn-DNA rearrangierte DNA

167 Aktivierte B-Zellen können die Produktion ihrer schweren Ketten umschalten (class switch recombination)

168 Mobile Elemente (Transposons) machen 45% des menschlichen Genoms aus 45%

169 Transposons können über DNA- oder RNA-Intermediate im Genom springen (cut-and-paste vs. copy-and-paste-strategie) Retrotransposons vermehren sich bei jedem Transpositionsereignis.

170 DNA-Transposons vermehren sich nur, wenn sie in der S-Phase des Zellzyklus von bereits kopierten in nicht-kopierte Regionen springen Dieser auf den ersten Blick ineffiziente Mechanismus hat zu immerhin schon Kopien (3% der DNA) im menschlichen Genom geführt.

171 In Bakterien kommen nur DNA-Transposons vor- sie heissen IS (insertion sequence)-elemente Die invertierten Wiederholungen werden von der Transposase erkannt. Die direkten Wiederholungen an den Rändern entstehen beim Integration der Transposon-DNA in die Zielsequenz. Die zentrale Region kodiert für das Enzym Transposase.

172 Die Transposition von IS-Elementen erfolgt in 3 Schritten

173 Manche IS-Elemente können Antibiotikaresistenzen transportieren

174 LTR-Retrotransposons ähneln Retroviren, die ihr Genom ins Wirtsgenom integriert haben kodiert für reverse Transkriptase und Integrase LTR-Retrotransposons besitzen neben den kurzen zusätzlich lange direkte Wiederholungen, die für Promotor und Polyadenylierungsstelle kodieren.

175 LTR-Retrotransposons replizieren vermutlich wie Retroviren unter Ausnutzung von zellulären Enzymen

176 Die RT der LTR Retroposons schreibt das RNA-Intermediat in ds DNA um, die dann von Integrase ins Genom eingebaut werden kann

177 Lebenszyklus von Retroviren zum Vergleich

178 Non-LTR-Retrotransposons machen 34% des menschlichen Genoms aus

179 Non-LTR-Retrotransposons werden durch RNA-Pol von einem Promotor in der A/T-reichen Region abgelesen und im Cytoplasma translatiert Orf1 kodiert für ein RNA-bindendes Protein Orf2 kodiert für Reverse Transkriptase/DNA-Endonuklease SINEs sind nicht-kodierende Parasiten von LINEs.

180 In den Kern zurücktransportierte LINE RNA wird im Zuge der reversen Transkription ins Genom integriert

181 Zelluläre Enzyme bauen das RNA-Intermediat ab und füllen die Lücken auf

182 Integration von LINEs in protein-kodierende Sequenzen ist der Auslöser für einige Krankheiten ( % aller Mutationen) Faktor IX: Hämophilie B (Bluterkrankheit; 30% der Fälle spontan) Dystrophin: Duchenne Muskeldystrophie; (30% der Fälle spontan)

183 Mobile Elemente haben die Evolution eukaryotischer Organismen massgeblich vorangetrieben: Bsp. Exonverdoppelungen während der Meiose durch ungleichen Crossover L1: LINE Familie, die die Fähigkeit zur Transposition beibehalten hat.

184 Genverdoppelungen ermöglichten die Diversifizierung der β-globinfamilie

185 Exon shuffling : Austausch von Exons zwischen verschiedenen Genen durch homologe Rekombination (Doppel-Crossover) Alu: häufigster Typ von SINE.

186 Exon shuffling : Insertion eines fremden Exons durch Transposition benachbarter homologer DNA-Transposons

187 Exon shuffling : Insertion eines fremden Exons durch Überspringen eines schwachen LINE-Polyadenylierungssignals