DIALOG. Methylmalonsäure: Ein Biomarker für. Vitamin B 12 -Mangel 2014/1. ChromSystemS. 10 E-Book-Reader zu gewinnen

Transkript

1 ChromSystemS Methylmalonsäure: Ein Biomarker für Vitamin B 12 -Mangel Prof. Dr. Rima Obeid, Abteilung für klinische Chemie und Labormedizin, Universitätsklinikum des Saarlandes, omburg 10 E-Book-Reader zu gewinnen Seite 1 3 Methylmalonsäure: Ein Biomarker für Vitamin B 12 -Mangel Vitamin B 12 -Mangel Ein subklinischer Vitamin B 12 -(Cobalamin) Mangel tritt häufig auf, und über Jahre hinweg können sich zahlreiche klinische Symptome ausprägen [1, 2]. Dazu zählen neurologische und psychische Störungen, Anämien, Schwangerschaftskomplikationen und Fehlgeburten. Durch eine frühzeitige Diagnose und Vitamin B 12 -Gabe können jedoch irreversible neurologische Schäden und sonstige gesundheitliche Beeinträchtigungen verhindert werden. Kürzlich durchgeführte Studien haben gezeigt, dass eine zusätzliche Einnahme von Vitamin B 12 (zusammen mit B 6 und Folsäure) in Form von Nahrungsergänzungsmitteln vor altersbedingten Erkrankungen schützen kann [3]. Im Gegensatz zu Bakterien, von denen einige selbst Vitamin B 12 synthetisieren können, muss der Mensch das Vitamin über den Verzehr von Lebensmitteln tierischen Ursprungs zuführen. So findet man bei Veganern (83 %) und Vegetariern (65 % des Gesamtkollektivs) erhöhte Werte von Methylmalonsäure im Plasma/Serum, die auf einen gestörten Vitamin B 12 -Stoffwechsel hindeuten. Bei Vegetariern kann der Bedarf an Vitamin B 12 nicht über den Verzehr von Eiern, Milch und Milchprodukten gedeckt werden, und die Einnahme des Vitamins sollte daher über Nahrungsergänzungsmittel erfolgen [4]. Im Allgemeinen liegt die Aufnahme von Vitamin B 12 mit der Nahrung in der westlichen Bevölkerung über der empfohlenen Tagesdosis für Erwachsene von 2,4 µg pro Tag. Dieser Wert liegt in der deutschen Bevölkerung unabhängig vom Geschlecht etwa doppelt so hoch (NVS II-Studie, Die Nationale Verzehrsstudie 2012) [5] und bietet keine hinreichende Erklärung für den weitverbreiteten Vitamin B 12 -Mangel in manchen Bevölkerungsgruppen. Gerade bei älteren Menschen (> 60 Jahre) und bei Menschen, die das mit der Nahrung aufgenommene Vitamin B 12 aufgrund einer Störung nicht resorbieren können, kann es zu einem klinisch relevanten Vitamin B 12 -Mangel kommen, und dies, obwohl sie genügend Vitamin B 12 über die Nahrung aufnehmen [6]. Darüber hinaus können bestimmte Erkrankungen die Aufnahme von Vitamin B 12 stark beeinflussen [7]. So werden gastrointestinale Störungen mit einem Vitamin B 12 -Mangel in Verbindung gebracht, darunter die Achlorhydrie (eine Störung der Säureproduktion im Magen), die Präsenz von Antikörpern gegen den Intrinsic-Faktor, die Einnahme von 2-Blockern sowie eine Infektion mit elicobacter pylori. Physiologie Um zu verstehen, wie es zu einem Vitamin B 12 -Mangel kommt, muss zunächst die Physiologie des Vitamins betrachtet werden. Im Plasma sind % des Vitamin B 12 an das Transportprotein aptocorrin gebunden. Dieser Anteil ist inaktiv und kann nicht von den Körperzellen aufgenommen werden (Abb. 1). Bei Transcobalamin handelt es sich um ein weiteres Transportprotein des Blutserums, das die übrigen % des Vitamin B 12 bindet und daher auch als olotranscobalamin (olo-tc) oder aktives B 12 bezeichnet wird. Denn nur olo-tc kann über einen spezifischen Rezeptor an Zellen binden und so die Versorgung mit Vitamin B 12 sicherstellen. In der Zelle dient Vitamin B 12 als Cofaktor zweier wichtiger Enzymreaktionen. Nach Bindung an die cytosolische Methioninsynthase kann omocystein (CY) in Methionin umgewandelt werden. In Mitochondrien ist es für die Umwandlung von Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA erforderlich. Ein Überschuss an Methylmalonyl-CoA wird in Methylmalonsäure (MMA) umgewandelt. Der Mangel an Vitamin B 12 führt deshalb zu einer erhöhten Konzentration an CY und MMA im Plasma [8] sowie zum Anstieg der MMA-Menge im Urin [9]. Im Falle eines Vitamin B 12 -Mangels durch unzureichende Aufnahme oder durch eine gestörte Absorption sinkt im Plasma zunächst der olo-tc-spiegel ab. Danach kann sukzessive der Konzentrationsanstieg von MMA und CY im Plasma detektiert werden. Klinische Symptome, die häufig unspezifische Erscheinungsformen aufweisen, treten aber erst in einem relativ fortgeschrittenen Stadium der Unterversorgung auf. Eine sichere Diagnose für einen Vitamin B 12 -Mangel gelingt daher nur durch die kombinierte Bestimmung von olo-tc und MMA im Serum. In klinischen Studien, bei denen olo-tc oder Gesamt-B 12 - Konzentrationen mit MMA-Konzentrationen verglichen wurden, zeigte sich, dass olo-tc ein besserer Indikator für eine Vitamin-B 12 -Unterversorgung im Vergleich zu Gesamt-B 12 ist [10]. Daher lässt ein erhöhter MMA-Spiegel einen niedrigeren olo-tc-wert erwarten [10]. Folglich kann anhand der MMA-Konzentration über den Vitamin B 12 -Status eine Aussage getroffen werden [11, 12]. Der olo-tc-spiegel im Plasma ist ein direkter Indikator für die den Zellen zur Verfügung stehende Menge an aktivem B 12. Ist die olo-tc-konzentration gering allgemein ab < 35 pmol/l, gibt es zwei Möglichkeiten: 1. Beim Betroffenen liegt entweder ein Zustand einer frühen Negativbalance vor (B 12 -Depletion), oder 2. Es handelt sich Prof. Dr. Rima Obeid, Universitätsklinikum des Saarlandes, omburg Seite 3 4 LC-MS/MS-Analytik von MMA im Plasma/Serum und Urin Katrin Bernhardt, Dr. habil. Richard Lukačin, Chromsystems Gmb Seite 5 7 Ernährungsphysiologische Bedeutung von Vitamin D Prof. Dr. Jutta Dierkes, Dr. Frank irche, University of Bergen, Norway, Martin-Luther-Universität alle-wittenberg Seite 8 9 Spezielle Vitamin D-Diagnostik bei Kleinkindern: Bedeutung der C3- Epimere Dr. Inga Unterieser, Dr. habil. Richard Lukačin, Chromsystems Gmb Seite Vitamin B 1 und B 6 -Analytik in der Veterinärmedizin PLC und UPLC Methodenvergleich Dr. Anja Müller, Sebastian Raich, Samuel Bauder, Vet Med Labor Gmb, Ludwigsburg Seite 12 Aktuelles/Termine/Gewinnspiel/ Impressum

2 Seite 2 um einen fortgeschrittenen Mangel, durch den es bereits zu Störungen der B 12 -abhängigen Zellreaktionen kommt, die einen erhöhten MMA-Spiegel im Plasma bzw. Urin zur Folge haben. Eine erhöhte Plasmakonzentration von MMA tritt vor allem bei Menschen mit einem olo-tc < 35 pmol/l auf, wurde aber auch bei Konzentrationen von bis zu 75 pmol/l festgestellt [10]. Daher wird dringend empfohlen, den MMA- Spiegel mindestens in den Proben zu messen, die einen olo- TC-Wert unter 75 pmol/l aufweisen. Patienten, die diesen Grenzwert unterschreiten und darüber hinaus ungeklärte neurologische Symptome, gastrointestinale Störungen, Diabetes mellitus oder Nierenerkrankungen aufweisen, sollten im besonderen Maße auf einen Mangel an Vitamin B 12 untersucht werden. Die Einnahme bestimmter Medikamente, eine vegetarische Ernährungsweise sowie fortgeschrittenes Alter erhöhen darüber hinaus die Wahrscheinlichkeit für eine Vitamin B 12 - Unterversorgung. Labordiagnostik von MMA Die Referenzmethode zur Analyse von MMA im Plasma ist die GC-MS, eine zeitraubende Methode, die nur in wenigen Laboren durchgeführt werden kann. Jedoch gibt es seit Kurzem eine LC-MS/MS-Methode (siehe Folgeartikel), mit der eine schnelle, zuverlässige und reproduzierbare Bestimmung dieses Biomarkers möglich ist. Zur Beurteilung des Vitamin B 12 -Status sollte die MMA-Konzentration im Plasma/Serum oder Urin bestimmt werden: 1. Die MMA-Konzentration steigt spezifisch im Blut und Urin von Personen mit Vitamin B 12 -Mangel an. Die CY- Konzentration im Blut erhöht sich ebenfalls bei Vitamin B 12 - Mangel, allerdings auch bei Mangel an Folat, weshalb CY nicht als spezifischer Marker zur Beurteilung einer Vitamin B 12 - Unterversorgung herangezogen werden kann. 2. In Kombination mit einem olo-tc-labortest ist die Bestimmung der MMA-Konzentration ein wichtiges Beurteilungskriterium zur Unterscheidung einer Vitamin B 12 -Depletion von einem intrazellulären Mangel an diesem Cofaktor. Ein niedriger olo-tc-plasmaspiegel bei normaler MMA- Konzentration deutet darauf hin, dass das Vitamin B 12 nur im Plasma in zu geringer Konzentration vorliegt. Im Gegensatz dazu weist ein niedriger olo-tc-spiegel im Plasma, bei gleichzeitig hoher MMA-Konzentration von > 270 nmol/l im Plasma, darauf hin, dass kein Vitamin B 12 für B 12 -spezifische intrazelluläre Prozesse verfügbar ist. 3. MMA ist ein wertvoller Marker zur Feststellung und Optimierung der Wirkung von supplementiertem Vitamin B 12 und zur Überwachung des Erfolgs der B 12 -Therapie. Die MMA-Konzentration sinkt etwa 1 2 Wochen nach Beginn der Vitamin B 12 -Supplementierung in Abhängigkeit von der Dosierung und der MMA-Ausgangskonzentration ab. 4. Da bei Patienten mit Nierenerkrankungen sowohl der MMA- als auch der olo-tc-spiegel erhöht sind, ist ein erheblicher Rückgang der MMA-Konzentration (um > 270 nmol/l) nach einer Vitamin B 12 -Behandlung ein einfacher und zuverlässiger Weg, einen bei diesen Patienten vor der Behandlung vorhandenen Vitamin B 12 -Mangel zu beurteilen. Die MMA-Diagnostik sollte vor und 2 4 Wochen nach der Vitamin B 12 -Substitution durchgeführt werden [13]. 5. Die Bestimmung von MMA im Serum/Plasma ermöglicht eine verlässliche Diagnostik von Vitamin B 12 -Mangel bei Patienten, die mit Metformin (einem Arzneistoff zur oralen Behandlung von Diabetes mellitus) behandelt werden. Der Vitamin B 12 -Plasmaspiegel (olo-tc und Gesamt-Vitamin B 12 ) ist bei mit Metformin behandelten Patienten niedrig [14]. Daher wird seit Langem angenommen, dass Metformin einen Vitamin B 12 -Mangel hervorrufen könnte. Jedoch konnte bisher die Abnahme der Vitamin B 12 und/oder olo-tc-konzentration im Plasma bei mit Metformin behandelten Patienten nicht mit einer Veränderung der MMA-Plasmakonzentration in Zusammenhang gebracht werden [15, 16]. 6. Zur Feststellung des Vitamin B 12 -Status bzw. zur ernährungsphysiologischen Einschätzung der Vitamin B 12 -Versorgung der Bevölkerung reicht die Bestimmung des Vitamin B 12 Gesamtgehalts nicht aus (Österreichischer Ernährungsbericht 2012). Vielmehr sollten zunächst der olo-tc-spiegel und in der Folge die MMA-Konzentration bestimmt werden. Kritische Betrachtungen zu MMA Bei der Nutzung von MMA als Biomarker für den Vitamin B 12 -Status gibt es einige Einschränkungen: 1. Der MMA-Plasmaspiegel kann bei Patienten mit Niereninsuffizienz unspezifisch erhöht sein [12, 17, 18]. Diesem falschpositiven Ergebnis kann jedoch durch Messen des MMA- Spiegels vor und nach Supplementierung mit Vitamin B 12 entgegengetreten werden. 2. Der MMA-Plasmaspiegel kann bei Personen mit bakterieller Überbesiedlung deutlich erhöht sein, da Darmbakterien unter anderem Propionsäure produzieren, die in der Folge zu MMA umgesetzt wird [19]. In diesem Falle ist der olo- TC-Spiegel im Normbereich, die MMA-Konzentration ist erhöht und sinkt nach der Behandlung mit Vitamin B 12 nicht wesentlich ab. 3. Auch bei Rauchern kann der MMA-Plasmaspiegel erhöht sein. Im Vergleich zu Nichtrauchern kann eine verlangsamte Abnahme der MMA-Konzentration bei Vitamin B 12 -Supplementierung beobachtet werden [9]. Die Gründe hierfür sind derzeit nicht bekannt. 4. Normwerte für die MMA-Konzentration im Plasma liegen unterhalb von 271 nmol/l. Verschiedene Studien weisen höhere Grenzwerte aus, und unserem Ermessen nach ist erst ein erhöhter MMA-Plasmaspiegel von > 450 nmol/l wahrscheinlich klinisch relevant, während Werte von nmol/l grenzwertig sind, aber dennoch durch Supplementierung gesenkt werden sollten. Es herrscht weitgehend Übereinstimmung darüber, dass ein subklinisch auftretender Vitamin B 12 -Mangel häufig ist. Allerdings ist bis heute nicht eindeutig geklärt, ob bei Patienten mit niedrigem olo-tc- und erhöhtem MMA-Spiegel tatsächlich bereits ein klinisch relevanter Mangel an Vitamin B 12 vorliegt. In den meisten Fällen wird zur Festsetzung des Vitamin B 12 -Status einfach der Plasmaspiegel für das Gesamtvitamin gebunden an die Transportproteine bestimmt, obwohl bekannt ist, dass nur der aktive an Transcobalamin gebundene Anteil betrachtet werden sollte. Damit ist dieser Test in der Mehrzahl der Fälle unzureichend. So wurde beispielsweise bei der Messung von 1034 Proben nur bei 27 ein zu niedriger Vitamin B 12 -Spiegel festgestellt [12]. ingegen wurden nach Bestimmung des olo-tc-werts 254 Proben und nach Messung der MMA-Konzentration im Plasma 184 Proben identifiziert, die einen kritisch niedrigen Vitamin B 12 -Status aufwiesen [12]. Zurzeit ist die MMA- Bestimmung teurer als Tests zur Bestimmung des Gesamt- Vitamin B 12 -Gehaltes. Betrachtet man jedoch die Anzahl der Fälle mit tatsächlichem Vitamin B 12 -Mangel und setzt das mit den hohen Kosten bei klinischen Komplikationen durch falsch-negative Testergebnisse in Beziehung, so zeigt sich, dass die etwas höheren Kosten durch eine frühzeitige Gabe von Vitamin B 12 Präparaten amortisiert werden könnten. Fazit Die MMA-Bestimmung liefert wertvolle Informationen zum Vitamin B 12 -Status und ermöglicht so die frühe und spezifische Diagnose eines Vitamin B 12 -Mangels. Gleichzeitig eignet sie sich zur Überwachung des Therapieerfolgs einer Vitamin B 12 - Supplementierung und ist bei der Wahl einer geeigneten Darreichungsform, der Dosierung sowie der Festlegung der Therapiedauer von großem Nutzen. Literatur [1] Obeid R, Schorr, Eckert R, errmann W. (2004) Vitamin B 12 status in the elderly as judged by available biochemical markers. Clin Chem 50(1): [2] errmann W, Obeid R, Schorr, Geisel J. (2005) The usefulness of holotranscobalamin in predicting vitamin B 12 status in different clinical settings. Curr Drug Metab 6(1): [3] Douaud G, Refsum, de Jager CA, Jacoby R, Nichols TE, Smith SM, Smith AD. (2013) Preventing Alzheimer s disease-related gray matter atrophy by B-vitamin treatment. PNAS 110(23): [4] errmann W, Schorr, Obeid R, Geisel J. (2003) Vitamin B 12 status, particularly holotranscobalamin II and methylmalonic acid concentrations, and hyperhomocysteinemia in vegetarians. Am J Clin Nutr 78(1): [5] Deutsche Gesellschaft für Ernährung e. V. Bonn. (2012) 12. Ernährungsbericht. DGE [6] enoun LN, Noel E, Ben AM, Locatelli F, Blickle JF, Andres E. (2005) Cobalamin deficiency due to non-immune atrophic gastritis in elderly patients. A report of 25 cases. J Nutr ealth Aging 9(6): 462. [7] oward JM, Azen C, Jacobsen DW, Green R, Carmel R. (1998) Dietary intake of cobalamin in elderly people who have abnormal serum cobalamin, methylmalonic acid and homocysteine levels. Eur J Clin Nutr 52(8): Abbildung 1: Entstehungsweise eines Vitamin B 12 -Mangels. Ein Vitamin B 12 -Mangel entsteht entweder durch zu geringe Aufnahme oder eine unzureichende Absorption. In beiden Fällen sinkt zunächst der olo-tc im Plasma ab, dann erhöhen sich die Konzentrationen der biochemischen Marker (MMA und cy). Nur olo-tc kann in die Zelle gelangen, um B 12 einzuschleusen. Ein erhöhter MMA-Spiegel deutet darauf hin, dass die Zellen nicht genügend Vitamin B 12 für eine optimale Aktivität des Mitochondrienenzyms (Methylmalonyl-CoA-Mutase) erhalten. [8] vas AM, Lous J, Ellegaard J, Nexo E. (2002) Use of plasma methylmalonic acid in diagnosing vitamin B 12 deficiency in general practice. Scand J Prim ealth Care 20(1): [9] ill M, Flatley JE, Barker ME, Garner CM, Manning NJ, Olpin SE, Moat SJ, Russell J, Powers J. (2013) A vitamin B 12 supplement of 500 µg/d for eight weeks does not normalize urinary methylmalonic acid or other biomarkers of vitamin B 12 status in elderly people with moderately poor vitamin B 12 status. J Nutr 143(2):

3 Seite 3 [10] errmann W, Obeid R. (2013) Utility and limitations of biochemical markers of vitamin B 12 deficiency. Eur J Clin Invest 43(3): [11] Bor MV, Nexo E, vas AM. (2004) olo-transcobalamin concentration and transcobalamin saturation reflect recent vitamin B 12 absorption better than does serum vitamin B 12. Clin Chem 50(6): [12] Clarke R, Sherliker P, in, Nexo E, vas AM, Schneede J, Birks J, Ueland PM, Emmens K, Scott JM, Molloy AM, Evans JG. (2007) Detection of vitamin B 12 deficiency in older people by measuring vitamin B 12 or the active fraction of vitamin B 12, holotranscobalamin. Clin Chem 53(5): [13] Obeid R, Kuhlmann MK, Kohler, errmann W. (2005) Response of homocysteine, cystathionine, and methylmalonic acid to vitamin treatment in dialysis patients. Clin Chem 51(1): [14] de Jager J, Kooy A, Lehert P, Wulffelé MG, van der Kolk J, Bets D, Verburg J, Donker AJ, Stehouwer CD. (2010) Long term treatment with metformin in patients with type 2 diabetes and risk of vitamin B 12 deficiency: randomised placebo controlled trial. BMJ 340: c2181. [15] Obeid R, Jung J, Falk J, ermann W, Geisel J, Friesenhahn-Ochs B, Lammert F, Fassbender K, Kostopoulus P. (2013) Serum vitamin not reflecting vitamin B 12 status in patients with type 2 diabetes. Biochimie 95(5): [16] Greibe E, Trolle B, Bor MV, Lauszus FF, Nexo E. (2013) Metformin lowers serum cobalamin without changing other markers of cobalamin status: A study on women with polycystic ovary syndrome. Nutrients 5(6): [17] Lindgren A. (2002) Elevated serum methylmalonic acid. ow much comes from cobalamin deficiency and how much comes from the kidneys? Scand J Clin Lab Invest 62(1): [18] vas AM, Juul S, Gerdes LU, Nexo E. (2000) The marker of cobalamin deficiency, plasma methylmalonic acid, correlates to plasma creatinine. J Intern Med 247(4): [19] Lindenbaum J, Savage DG, Stabler SP, Allen R. (1990) Diagnosis of cobalamin deficiency: II. Relative sensitivities of serum cobalamin, methylmalonic acid, and total homocysteine concentrations. Am J ematol 34(2): Zentralatom Vitamin B 12 Das Coenzym B 12 ist die aktive Form des Vitamin B 12 und ein wichtiger Vertreter der Cobalamine, die das Spurenelement Cobalt als Zentralatom enthalten. Es ist ein Cofaktor zweier Enzyme, die unter anderem an der Synthese von Aminosäuren beteiligt sind. Seinen Bedarf an Vitamin B 12 kann der menschliche Organismus fast nur durch den Verzehr von Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs wie Fisch, Fleisch, Eiern oder Milch decken. LC-MS/MS-Analytik von MMA im Plasma/Serum und Urin Katrin Bernhardt, Dr. habil. Richard Lukačin, Chromsystems Gmb Vitamin B 12 -Mangel tritt in der Bevölkerung häufiger auf, als man erwarten würde; eine Unterversorgung kann verschiedene hämatologische, gastrointestinale und neurologische Erkrankungen hervorrufen [1]. Die durch Vitamin B 12 - Mangel auftretenden Störungen des Nervensystems erscheinen unspezifisch, führen aber unbehandelt zu bleibenden Schäden. Zu den betroffenen Risikogruppen zählen vor allem ältere Menschen, Vegetarier, Schwangere, Raucher, außerdem Patienten mit Autoimmun-, Nieren- sowie verschiedenen intestinalen Erkrankungen [2, 3]. Eine angemessene Diagnostik zur frühzeitigen Erkennung eines Vitamin B 12 - Mangels ist daher unbedingt erforderlich. Normalerweise wird der Gehalt dieses Vitamins als olo- Transcobalamin (olo-tc), die metabolisch aktive Form des Vitamin B 12, im Serum bestimmt. Dieser Laborparameter ist aufgrund seiner unzureichenden Spezifität und Sensitivität nur bedingt aussagefähig, was im ungünstigen Fall zu einer Fehleinschätzung des körperlichen Versorgungsstatus führen kann. Immerhin weisen 10 % der Patienten mit normalem olo-tc-spiegel im Serum einen Mangel an dem lebensnotwendigen Cofaktor des Aminosäurestoffwechsels auf [4]. Einer möglichen Fehleinschätzung kann durch die zusätzliche Propionyl-CoA Carboxylase D,L-Methylmalonyl-CoA-Racemase L-Methylmalonyl-CoA-Mutase Propionyl-CoA D-Methylmalonyl-CoA L-Methylmalonyl-CoA Succinyl-CoA biotinabhängig Vitamin B 12 -abhängig Abbildung 1: Umsetzung von Propionyl-Coenzym A zu Succinyl-Coenzym A Methylmalonsäure O O O O C 3

4 Seite 4 Bestimmung eines weit sensitiveren, selektiveren und ebenfalls endogen vorhandenen Biomarkers, der Methylmalonsäure (MMA), einer Dicarbonsäure, vorgebeugt werden. Vitamin B 12 ist unter anderem ein Cofaktor des Methioninstoffwechsels und wird auch bei der Umsetzung von Methylmalonyl-Coenzym A (Methylmalonyl-CoA) zu Succinyl-CoA gebraucht (Abb. 1). Eine Vitamin B 12 -Unterversorgung führt zu einem starken Konzentrationsanstieg der MMA im Plasma, Serum und Urin [1], und das zu einem sehr frühen Zeitpunkt, an dem die Abnahme der Vitamin B 12 -Konzentration im Serum analytisch noch nicht unbedingt feststellbar ist [5]. Auch die im Vergleich zum Vitamin B 12 -Molekül deutlich höhere Stabilität der MMA-Moleküle in den Patientenproben, insbesondere im inblick auf die Lichtempfindlichkeit, lässt die Dicarbonsäure in den Fokus der Labormedizin rücken. Diesem Umstand trägt die Chromsystems Gmb nun Rechnung und hat einen Reagenzienkit zur spezifischen Bestimmung der Methylmalonsäure im Plasma, Serum und Urin mittels LC-MS/MS entwickelt. Wesentlicher Aspekt dieser innovativen Methodik ist die Verwendung von sogenannten Clean-up Tubes, mit denen die Patientenproben schonend aufgereinigt werden. Ferner die sichtbare chromatographische Abtrennung der zur MMA isobaren Bernsteinsäure, zur Vermeidung falsch positiver Analysenergebnisse (Abb. 2 und 3). Schließlich der Einsatz eines spezifischen internen Standards, der Matrixeffekte minimiert und damit die Präzision und Robustheit der Methode gewährleistet (Abb. 3A und B). Darüber hinaus stehen für die Kalibrierung des Messsystems matrixspezifische 3PLUS1 Multilevel Kalibratoren für Plasma/Serum sowie für Urin zur Verfügung. Qualitätskontrollen sind ebenfalls für Plasma/Serum und Urin erhältlich. Fazit Zur frühzeitigen Erkennung eines Vitamin B 12 -Mangels wird immer häufiger MMA als labordiagnostischer Parameter herangezogen. Die Analytik von MMA hat den Vorteil, dass dieser sensitive und spezifische Biomarker viel früher Mangelsituationen aufzeigen kann als die klassische Analytik von Vitamin B 12 und so eine frühzeitige Diagnose erlaubt. Chromsystems bietet hierfür eine Komplettlösung für LC-MS/ MS an, die sich durch eine schnelle Probenvorbereitung, minimierte Matrixeffekte, hohe Präzision und Robustheit auszeichnet. Der neue MassChrom -Reagenzienkit zur Bestimmung von MMA im Serum/Plasma und Urin ermöglicht die sichere, zuverlässige und schnelle Bestimmung des Vitamin B 12 -Status und erlaubt so z. B. bei einer Unterversorgung einen zügigen Therapiestart. (A) Plasmaprobe O O 100 % 90 % Bernsteinsäure 80 % 70 % 60 % 50 % 40 % 30 % 20 % Methylmalonsäure 10 % 0 % 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 Zeit, min O C3 Summenformel C 4 6 O 4 O Methylmalonsäure O Abbildung 2: Chemische Strukturen der isobaren Verbindungen Methylmalonsäure und Bernsteinsäure O O Summenformel C 4 6 O 4 Bernsteinsäure O (B) Urinprobe 100 % 90 % Bernsteinsäure 80 % 70 % 60 % 50 % 40 % Methylmalonsäure 30 % 20 % 10 % 0 % 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 Zeit, min 100 % Interner Standard 90 % 80 % 70 % 60 % 50 % 40 % 30 % 20 % 10 % 0 % 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 Zeit, min Literatur [1] Erdogan E, Nelson GJ, Rockwood AL, Frank EL. (2010) Evaluation of reference intervals for methylmalonic acid in plasma/serum and urine. Clin Chim Acta 411(21 22): [2] errmann W, Obeid R. (2008) Ursachen und frühzeitige Diagnostik von Vitamin B 12 - Mangel. Dtsch Ärztebl 105(40): [3] Müller MJ. (2007) Ernährungsmedizinische Praxis: Methoden-Prävention-Behandlung, Springer-Verlag. [4] Koch CA. (2005) Diskussion zu dem Beitrag Gesundheitliche Bedeutung der Folsäurezufuhr. Dtsch Ärztebl 102(4): A215. [5] Rasmussen K, Nathan E. (1990) The clinical evaluation of cobalamin deficiency by determination of methylmalonic acid in serum or urine is not invalidated by the presence of heterozygous methylmalonic-acidaemia. J Clin Chem Clin Biochem 28(6): % Interner Standard 90 % 80 % 70 % 60 % 50 % 40 % 30 % 20 % 10 % 0 % 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 Zeit, min Abbildung 3: Chromatogramme einer (A) Plasmaprobe und (B) Urinprobe mit physiologisch normaler Methylmalonsäure- Konzentration MMA im Plasma Kit für 400 Bestimmungen MMA im Urin Urin-Set für 200 Bestimmungen Spezifikationen Informationen zum Produkt Linearität: μg/l Bestimmungsgrenze: 3,5 μg/l Wiederfindungsrate: 104 % Intraassay: Vk = 2,3 2,5 % Interassay: Vk = 3,2 3,6 % Analysendauer: 3,5 min Linearität: μg/l Bestimmungsgrenze: 86 μg/l Wiederfindungsrate: 98 % Intraassay: Vk = 1,8 2,2 % Interassay: Vk = 2,4 2,9 % Analysendauer: 3,5 min Probenvorbereitung 100 μl Probe/Kalibrator/ Kontrolle in Clean-Up-Tubes vorlegen. 50 μl Internal Standard zugeben und kurz vortexen. 10 min bei x g zentrifugieren. Filtrat in Autosampler-Vial pipettieren. Injektionsvolumen: µl 200 μl Probe/Kalibrator/ Kontrolle in transparentes Reaktionsgefäß vorlegen. 25 μl Internal Standard zugeben und 10 s vortexen. 10 min bei x g zentrifugieren. Probenlösung mit Dilution Buffer in Autosampler-Vial verdünnen. Injektionsvolumen: µl

5 Seite 5 Ernährungsphysiologische Bedeutung von Vitamin D Prof. Dr. Jutta Dierkes, Dr. Frank irche, Institute of Medicine, Section of Clinical Nutrition, University of Bergen, Norway; Institut für Agrar- und Ernährungswissenschaften, Martin-Luther-Universität alle-wittenberg Das Interesse am Vitamin D ist seit einiger Zeit sowohl in der wissenschaftlichen als auch in der Laienpresse enorm gestiegen. Illustriert wird dies durch die Anzahl der wissenschaftlichen Publikationen in PubMed ( der Datenbank des National Institute of ealth (Abb. 1), durch eine steigende Nachfrage von Anforderungen zur Bestimmung des Vitamin D-Status und durch zahlreiche Veröffentlichungen. Abbildung 1: Anzahl der Publikationen mit dem Schlagwort Vitamin D in der Datenbank des National Institute of ealth ( durchgeführt bis Ende Ein wichtiger Grund für das steigende Interesse am Vitamin D ist die Erkenntnis, dass diesem vom Cholesterin abgeleiteten Vitamin offensichtlich über den Calcium-, Phosphat- und Knochenstoffwechsel hinaus wichtige Funktionen im Metabolismus zukommen, deren Bedeutung und Mechanismen erst in der jüngeren Vergangenheit aufgeklärt werden konnten, bzw. immer noch nicht vollständig verstanden sind. Epidemiologische Studien stützen diese Befunde und legen den Zusammenhang zwischen einer Vitamin D-Unterversorgung und dem Auftreten verschiedener chronischer Erkrankungen, wie Diabetes mellitus, Bluthochdruck, Krebs, sowie ausgesprochen kritisch zu beurteilen, was in verschiedenen Bevölkerungsstudien sowohl in den USA als auch in Europa gezeigt werden konnte [3, 4]. So weisen in Deutschland nach Untersuchungen der Nationalen Verzehrsstudie I ca. 2 % der Erwachsenen einen schweren und ca. 15 % einen moderaten Vitamin D-Mangel auf [5]. Wenn man eine 25-ydroxy-Vitamin D-(25-OD) Konzentration von 50 nmol/l als Grenzwert für eine ausreichende Versorgung festlegt, sind nur etwa 60 % der Erwachsenen ausreichend mit Vitamin D versorgt [5, 6]. Bei Kindern und Jugendlichen ist die Versorgungslage ähnlich ungünstig [7]. Daten aus anderen europäischen Ländern zeigen ein vergleichbares Bild [8]. Ursachen für diese schlechte Versorgungslage sind eine zu geringe Vitamin D-Aufnahme über die Nahrung und unzureichende Sonnenexpositionszeiten, die die hauteigene Vitamin D-Produktion induzieren könnten. Daten der Nationalen Verzehrsstudie II zeigen, dass die mittlere Vitamin D-Aufnahme ca. 2 3 µg pro Tag beträgt. Dabei stammen mehr als 40 % des Vitamins aus Fisch und Fischgerichten, so dass Personen, die keinen Fisch verzehren, noch weniger davon aufnehmen [9]. In anderen europäischen Ländern wie Großbritannien oder den Niederlanden ist die Menge der Vitamin D-Aufnahme vergleichbar gering. Diese Zahlen belegen, dass die Mehrheit der Bevölkerung bereits die bis Anfang 2012 geltenden DGE-Empfehlungen zur Vitamin D-Aufnahme in öhe von 5 µg am Tag nicht erreicht. Nach der aktuellen Erhöhung der Aufnahmeempfehlung auf 20 µg am Tag ist eine sichere Vitamin D-Versorgung allein mit Lebensmitteln nicht mehr möglich [10]. Allerdings ist die Beurteilung des Vitamin D-Status anhand der Aufnahme von Vitamin D aus Lebensmitteln problematisch, da bei ausreichender UVB Exposition genügend Vitamin D in der aut gebildet werden kann, so dass eine nutritive Zufuhr eigentlich nicht notwendig ist. Daher wird zur Bestimmung des Vitamin D-Status die Konzentration von 25-OD 3 /D 2 in Serum/Plasma herangezogen. Tabelle 1: Übersicht der verschiedenen ypothesen, dass eine erhöhte Vitaminaufnahme die Prävention oder Therapie chronischer Erkrankungen bewirken könnte. Jahre Vitamine Angenommene Effekte 1980er Antioxidantien (Vitamin E, Vitamin C, Carotinoide) Anti-Krebs-Wirkung, Anti-Aging (ox. Stress als Taktgeber des Alterns) 1990er B-Vitamine (Folat, Vitamin B 12, Vitamin B 6 ) erzinfarktprävention (Senken der omocystein-blutkonzentration) 2000er Vitamin D Anti-Krebs-Wirkung, etc. Vitamin D-Gehalt in 82 Serumproben bestimmt und anschließend die Leistungsfähigkeit der Tests verglichen. Es wurden folgende Methoden getestet: 1. Radioimmunassay (IDS, Frankfurt/Deutschland) 2. LC-MS/MS (MassChrom Reagenzienkit Chromsystems, München/Deutschland). Obwohl die Möglichkeit zur Bestimmung der Vitamin 25-OD 3 /25-OD 2 -Konzentration mittels PLC bestand, entschied man sich aufgrund der einfacheren Probenvorbereitung (einfache Fällung der Proteine und Entnahme des Überstandes versus Festphasenextraktion bei der PLC mit UV-Detektion) und der störungsfreieren Analytik für die Messung mittels LC-MS/MS. Angesichts des zur Verfügung stehenden Massenspektrometers (API 2000 von AB Sciex) mussten zunächst die methodenspezifischen Parameter, insbesondere die Sensitivität ermittelt werden. Dazu wurde der Variationskoeffizient bei verschiedenen Konzentrationen bestimmt und daraus eine untere Bestimmungsgrenze von < 13 nmol/l für 25-OD 2 und < 19 nmol/l für 25-OD 3 ermittelt. Die relativ geringe Sensitivität ist gerätespezifisch, und die untere Bestimmungsgrenze ließe sich durch Verwendung empfindlicherer Geräte deutlich herabsetzen. Nach Aufnahme der Messdaten und der Gegenüberstellung mittels Passing-Bablok-Regression ergab sich ein y-wert von 1,05 x 6,77, und die Grenzen des 95 %-Konfidenzintervalls y = 0,97 x -10,98 und y = 1,14 x -2,48 (Abb. 2) zeigen eine Verschiebung der Regressionsgeraden. Die Ursache dieser Verschiebung und der Ausreißerwerte lässt sich wahrscheinlich auf die Kreuzreaktivität des im RIA verwendeten Antikörpers zurückführen. LC-MS/MS, 25-OD OD2, nmol/l erz-kreislauf- und Autoimmunerkrankungen nahe [1, 2]. In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass sich die Untersuchungen zum Vitamin D in eine Reihe von verschiedenen ypothesen über Vitamine einordnen lassen, die in den letzten 30 Jahren zu einem regelrechten Vitaminhype geführt haben. Letztlich fehlen aber gesicherte Nachweise zur Kausalität der vermehrten Aufnahme dieser Vitamine und der Vermeidung chronischer Erkrankungen (Tab. 1). Bei diesem Vergleich fällt jedoch auf, dass die Ausgangslage beim Vitamin D völlig anders ist als bei den antioxidativ wirkenden Vitaminen, die in den 1980er-Jahren oder den B-Vitaminen, die in den 1990er-Jahren im Fokus standen. Im Gegensatz zu diesen ist die Versorgungslage beim Vitamin D Für die Analyse dieser einfach-hydroxylierten Transportform des Vitamin D stehen eine Reihe von verschiedenen Methoden zur Verfügung, deren Messergebnisse aufgrund methodischer Unterschiede nur bedingt miteinander vergleichbar sind [11]. Dies macht stets Angaben zum verwendeten Assay notwendig, und diese Problematik legt die Notwendigkeit der Teilnahme der Labore an externen Qualitätsstudien, z. B. DEQAS, nahe [12]. In unserem Labor sollte eine Methode zur Messung von 25-OD etabliert werden. Zur Auswahl einer geeigneten Messmethode wurde eine immunologische Methode einem LC-MS/MS-Verfahren gegenübergestellt. ierfür wurde der RIA, 25-OD, nmol/l Abbildung 2: Bestimmung der 25-OD-Konzentrationen mittels LC-MS/MS und RIA in Patientenproben (n = 82) nach Passing und Bablok. Die Ausreißer bei den RIA-Werten sind wahrscheinlich auf Kreuzreaktionen des Antikörpers zurückzuführen. Der Methodenvergleich mittels Bland-Altman-Diagramm zeigte eine mittlere Differenz von 4,7 nmol/l mit einem 95 %- Konfidenzintervall der Differenz von 15 und 24,4 nmol/l (Abb. 3).

6 Seite 6 Tabelle 2: Vergleich der Vitamin D-Zufuhrempfehlungen in verschiedenen Ländern (alle Angaben in µg/tag; die in allen Ländern empfohlene Rachitisprophylaxe für Säuglinge ist nicht berücksichtigt) [10, 14 17] Skandinavien (2004) USA und Kanada (2010) Deutschland (2012) Großbritannien (1998) Niederlande (2000) Zielkonzentration 25-OD nmol/l Säuglinge > 6 Monate: Monate: 8,5 > 7 Monate: 7 5/10* Kinder und Jugendliche 7, * < 4 Jahre: 7 ab 4 Jahre: /10* 1 3 Jahre: 5/10* 4 18 Jahre: 2,5/5* Erwachsene Männer und Frauen 7, * 10* < 50 Jahre: 2,5/5* Jahre: 5/10* Jahre: 7,5/10* Senioren > 61 Jahre: 10* 20 20* 10 > 71 Jahre: 12,5/15* Abbildung 3: 25-OD-Konzentration in Patientenproben (n = 82), bestimmt mittels RIA und LC-MS/MS im Methodenvergleich nach Bland und Altman. Nach Etablierung des Chromsystems MassChrom Reagenzienkits wurde zur weiteren Qualitätsprüfung der verwendeten Methode eine Kontrollprobe über 39 Serien mit einem Mittelwert von 49 nmol/l und einem Variationskoeffizienten von 7,8 % bestimmt. Die Teilnahme an sechs aufeinander folgenden Ringversuchen der DEQAS und die Einhaltung der durch den Veranstalter festgelegten Intervalle bestätigte darüber hinaus die hohe Qualität der verwendeten Methode ( org). Abgesehen von methodenspezifischen Unterschieden bei der Ermittlung der 25-OD-Serumkonzentrationen erscheint auch die Festsetzung eines unteren Grenzwertes zur Definition eines Vitamin D-Mangels nicht einfach. * Zusätzlich 10 µg als Supplement bei fehlender Sonnenexposition Als gesichert gilt, dass 25-OD-Serumspiegelwerte unter 25 nmol/l zu gering sind, und vielfach geht man davon aus, dass die optimale 25-OD-Konzentration bei 50 nmol/l erreicht ist. Einige bekannte Autoren widersprechen dieser Meinung und geben einen Wert von 75 nmol/l für eine optimale Versorgung an [13]. Dabei sollte der Gesundheitszustand der Probanden jedoch in die Bewertung mit einbezogen werden. Da der 25-OD-Spiegel einer ausgeprägten Jahresrhythmik unterliegt, stellt sich auch die Frage, ob dieser Grenzwert ganzjährig oder als Peak- Konzentration am Ende des Sommers erreicht werden soll. Generell geht man davon aus, dass 50 nmol/l 25-OD ausreichend sind, und amerikanische sowie deutsche Fachgesellschaften empfehlen, diesen Grenzwert einzuhalten (Tab. 2). * Bei unzureichender UVB-Exposition * Bei fehlender Sonnenexposition * Bei unzureichender UVB- Exposition Interessanterweise gibt es widersprüchliche Aussagen zur Einnahme der dazu benötigten Vitamin D-Menge. Amerikanische Fachgesellschaften empfehlen die Einnahme von 15 µg Vitamin D, in Deutschland gelten 20 µg als optimal. Daraus folgt, dass keine übereinstimmenden Aussagen zu diesem Sachverhalt vorliegen. Allgemein geht man davon aus, dass eine zusätzliche Vitamin D-Aufnahme von 2,5 µg (100 Internationale Einheiten) den 25-OD-Serumspiegel durchschnittlich um 1 2 nmol/l erhöhen kann. Jedoch hängt der Effekt wohl stark vom 25-OD-Ausgangsspiegel ab. Zudem kommt es bei Einnahme von Vitamin D-Supplementen erst nach einer Einnahmedauer von ca. 6 8 Wochen zum Erreichen eines neuen Plateaus der Serumkonzentration. Außerdem kann Vitamin D 3 den 25-OD-Serumspiegel stärker erhöhen als Vitamin D 2 [18, 19]. Diese und weitere individuelle Faktoren führen dazu, dass es schwierig ist, von der täglichen Vitamin D-Zufuhrmenge auf den 25-OD Serumspiegel zu schlieβen [20]. Effekt von UVB-Strahlung Vereinfachte Darstellung des Vitamin D-Stoffwechsels im Körper In der aut befindet sich natürlicherweise das 7-Dehydrocholesterol, aus dem bei Sonneneinstrahlung das Vitamin D gebildet wird. Das Vitamin D-bindende Protein DBP transportiert das Molekül weiter in die Leber, wo die erste ydroxylierung zu 25-O-Vitamin D (25-OD) stattfindet. Diese Transport- und Speicherform zirkuliert im Blutkreislauf, weshalb zur Bestimmung des individuellen Vitamin D-Status 25-OD herangezogen wird. In der Niere wird nach Bedarf das 25-OD erneut hydroxyliert und führt zur biologisch aktiven Form 1,25-Dihydroxy-Vitamin D, die unter anderem beim Knochenstoffwechsel eine bedeutende Rolle spielt. Allgemein gilt die genuine Vitamin D-Bildung nach UVB- Exposition als die beste und bedeutendste Vitamin D- Quelle für den Menschen. Ist diese ausreichend, dann ist die zusätzliche Einnahme von Ergänzungspräparaten nicht notwendig. Dies wird auch in den meisten Empfehlungen zur Vitamin D-Zufuhr berücksichtigt (Tab. 2). Dabei hängt die Definition einer ausreichenden UVB-Exposition von zahlreichen Faktoren ab, so dass es sehr schwierig ist, eine allgemein gültige Zeitangabe hierfür festzusetzen. Wichtiger Faktor ist u. a. der auttyp, wobei Personen mit dunklerem auttyp weniger Vitamin D bilden als Personen mit heller aut. Ferner die Verwendung von Sonnencremes oder autpflegeprodukten mit Lichtschutzfaktoren, die die Vitamin D-Bildung in der aut nahezu vollständig blockieren können, sowie die Tageszeit, Jahreszeit und geographische Breite. In Mittel- und Nordeuropa ist die UVB-Strahlung von Oktober bis März so gering, dass praktisch kein Vitamin D in der aut gebildet werden kann. ier wird bereits deutlich, dass die gegenwärtigen Empfehlungen zum Schutz der aut vor übermäßiger Sonneneinstrahlung und vor autkrebs im Widerspruch zu den Empfehlungen zur Vitamin D-Bildung stehen. Es bedarf sicher weiterer Forschung, um präzisere Empfehlungen für eine Sonnenexposition geben zu können, die sowohl der endogenen Vitamin D-Synthese als auch dem Schutz der aut Rechnung tragen. Ein integriertes Forschungsprojekt: Vitamin D und kardiovaskuläre Gesundheit Von 2010 bis 2013 wurde durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung ein ernährungswissenschaftliches Verbundprojekt gefördert, in dem in einem integrierten Ansatz die

7 Seite 7 Bedeutung von Vitamin D für die kardiovaskuläre Gesundheit untersucht wurde. Integriert bedeutet hierbei, dass das Projekt lebensmittelwissenschaftliche, ernährungsphysiologische, medizinische und epidemiologische Ansätze an verschiedenen Standorten (alle, Potsdam, eidelberg) berücksichtigt und vereint: Zum einen wurden die Vitamin D-Gehalte verschiedener Lebensmittel und insbesondere die Varianz der Vitamin D-Konzentrationen in tierischen Lebensmitteln in Abhängigkeit von Fütterung, altung der Tiere und dem Aufenthalt in natürlicher Umgebung untersucht [21]. Zum anderen wurden Möglichkeiten erforscht, wie die Vitamin D-Konzentrationen insbesondere in Süβwasserfischen erhöht werden könnten. Süβwasserfische und Fische aus Aquakulturen enthalten, genau wie Seefische, Vitamin D, jedoch ist über den Einfluss der altung und der Fütterung auf den Vitamin D-Gehalt nicht viel bekannt. Zusätzlich wurden die Effekte eines Vitamin D-Mangels auf den Lipidstoffwechsel und die Atherosklerose an Modelltieren untersucht. ierbei sollte herausgefunden werden, inwiefern ein Vitamin D-Mangel zu einem erhöhten Risiko für erz-kreislauf-erkrankungen beitragen kann und welche Mechanismen dabei wirksam sind [22]. Darüber hinaus wurden in klinischen Studien mit freiwilligen Versuchspersonen Auswirkungen einer Vitamin D-Supplementierung auf den 25-OD-Serumspiegel, auf Blutlipide und den Blutdruck untersucht. Dabei wurde auch die Wirksamkeit der verschiedenen Formen des Vitamin D (Vitamin D 2 und Vitamin D 3 ) miteinander verglichen [18]. Daneben wurde der Zusammenhang zwischen öhe der 25-OD-Serumkonzentration und dem Risiko, an Diabetes mellitus, erzinfarkt und Schlaganfällen zu erkranken, in einer Subkohorte der EPIC Studie untersucht [23, 24]. EPIC steht für European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition, und ist ein europäisches Forschungsprojekt, in dem in 10 europäischen Ländern zwischen 1994 und 1998 ca Personen einbezogen wurden, die seitdem nachbeobachtet werden. In Deutschland nehmen in den beiden EPIC-Zentren eidelberg und Potsdam ca Personen an dieser Langzeitstudie teil. Für die erwähnte Fragestellung wurden von den Studienteilnehmern ca Personen untersucht, von denen etwa 1000 im Laufe der Studie entweder an Diabetes mellitus erkrankt sind oder einen erzinfarkt oder Schlaganfall erlitten haben. Die seit ca. 15 Jahren bei -196 C gelagerten Proben der EPIC-Studie sind ein besonders wertvolles Probenmaterial. Daher war es sehr wichtig, dass die Bestimmung des 25-OD aus einer möglichst geringen Probenmenge erfolgen konnte. Deshalb wurde zur Bestimmung des 25-OD in allen Studien der Chromsystems MassChrom 25-OD 3 /D 2 Reagenzienkit verwendet, so dass wir über den geringen Probeneinsatz (100 µl) hinaus auch die Ergebnisse der verschiedenen Studien miteinander vergleichen konnten. Auch unterstreichen viele Arbeiten die Vorteile der LC-MS/MS-Analytik zur Klärung des Vitamin D-Status, weshalb alle weiteren Vitamin D-Bestimmungen innerhalb der groß angelegten EPIC-Studie mittels LC-MS/MS unter Verwendung des MassChrom 25-OD 3 /D 2 Reagenzienkits durchgeführt wurden. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Vitamin D- Forschung noch kein Plateau erreicht hat und das Interesse auf diesem Feld ungebrochen ist. Literatur [1] Afzal S, Bojesen SE, Nordestgaard BG. (2013) Low 25-ydroxyvitamin D and risk of type 2 diabetes: A prospective cohort study and metaanalysis. Clin Chem 52(2): [2] olick MF. (2007) Vitamin D deficiency. N Engl J Med 357(3): [3] Turer CB, Lin, Flores G. (2013) Prevalence of vitamin D deficiency among overweight and obese US children. Pediatrics 131(1): e [4] Looker AC, Johnson CL, Lacher DA, Pfeiffer CM, Schleicher RL, Sempos CT. (2001) Vitamin D status: United States, NCS Data Brief no. 59, National Center for ealth Statistics, yattsville, MD. [5] intzpeter B, Mensink GB, Thierfelder W, Müller MJ, Scheidt-Nave C. (2008a) Vitamin D status and health correlates among German adults. Eur J Clin Nutr 62(9): [6] Lip P. (2004) Which circulating level of 25-hydroxyvitamin D is appropriate? J Steroid Biochem Mol Biol 89 90(1 5): [7] intzpeter B, Scheidt-Nave C, Müller MJ, Schenk L, Mensink GBM. (2008b) igher prevalence of vitamin D deficiency is associated with immigrant background among children and adolescents in Germany. J Nutr 138(8): [8] Brouwer-Brolsma EM, Bischoff-Ferrari A, Bouillon R, Feskens EJ, Gallagher CJ, ypponen E, Llewellyn DJ, Stoecklin E, Dierkes J, Kies AK, Kok FJ, Lamberg-Allardt C, Moser U, Pilz S, Saris W, van Schoor NM, Weber P, Witkamp R, Zittermann A, de Groot LC. (2013) Vitamin D: do we get enough? A discussion between vitamin D experts in order to make a step towards the harmonisation of dietary reference intakes for vitamin D across Europe. Osteoporos Int 24(5): [9] Max Rubner Institut (rsg). Ergebnisbericht Teil 2, Nationale Verzehrsstudie II. Karlsruhe [10] German Society for Nutrition (DGE). (2012) New reference values for vitamin D. Ann Nutr Metab 60: [11] Binkley N, Krueger D, Cowgill CS, Plum L, Lake E, ansen KE, DeLuca F, Drezner MK. (2004) Assay variation confounds the diagnosis of hypovitaminosis D: A call for standardization. J Clin Endocrinol Metab 89(7): [12] Carter GD, Carter R, Jones J, Berry J. (2004) ow accurate are assays for 25-hydroxyvitamin D? Data from the international vitamin D external quality assessment scheme. Clin Chem 50(11): [13] Bischoff-Ferrari, Giovannucci E, Willett WC, Dietrich T, Dawson-ughes B. (2006) Estimation of optimal serum concentrations of 25-hydroxyvitamin D for multiple health outcomes. Am J Clin Nutr 84(1): [14] Becker W, Lyne N, Pedersen A, Aro A, Fogelholm M, Thorsdottir I, Alexander J, Anderssen S, Meltzer M, Pedersen J. (2004) Nordic Nutrition recommendations 2004 Integrating nutrition and physical activity. Scand J Nutr 48: [15] Ross AC, Institute of Medicine (US). Committee to review dietary reference intakes for vitamin D and calcium. Dietary reference intakes: calcium, vitamin D. National Academies Press, Washington/DC [16] Department of ealth (1998) Nutrition and Bone health. London, the stationary office. [17] ealth council of the Netherlands: Dietary reference values. The ague 2000, publ. no. 2000/12. [18] Lehmann U, irche F, Stangl GI, inz K, Westphal S, Dierkes J. (2013) Bioavailability of Vitamin D2 and D3 in ealthy Volunteers, a randomised placebo-controlled trial. J Clin Endocrinol Metab doi: /jc [19] Tripkovic L, Lambert, art K, Smith CP, Bucca G, Penson S, Chope G, yppönen E, Berry J, Vieth R, Lanham-New S. (2012) Comparison of vitamin D 2 and vitamin D 3 supplementation in raising serum 25-hydroxyvitamin D status: a systematic review and meta-analysis. Am J Clin Nutr 95(6): [20] Cranney A, Weiler A, O Donnell S, Puil L. (2008) Summary of evidence-based review on vitamin D efficacy and safety in relation to bone health. Am J Clin Nutr 88(2): 513S 19S. [21] Lietzow J, Kluge, Brandsch C, Seeburg N, irche F, Glomb M, Stangl GI. (2012) Effect of short-term UVB exposure on vitamin D concentration of eggs and vitamin D status of laying hens. J Agric Food Chem 60(3): [22] Max D, Brandsch C, Schumann S, Kühne, Frommhagen M, Schutkowski A, irche F, Staege MS, Stangl GI. (2013) Maternal vitamin D deficiency causes smaller muscle fibers and altered transcript levels of genes involved in protein degradation, myogenesis, and cytoskeleton organization in the newborn rat. Mol Nutr Food Res doi: /mnfr [23] Kühn T, Kaaks R, Teucher B, irche F, Dierkes J, Weikert C, Katzke V, Boeing, Stangl GI, Buijsse B. (2013) Plasma 25-hydroxyvitamin D and its genetic determinants in relation to incident myocardial infarction and stroke in the European prospective investigation into cancer and nutrition (EPIC)-Germany study. PLoS One 8(7): e [24] Buijsse B, Boeing, irche F, Weikert C, Schulze MB, Gottschald M, Kühn T, Katzke VA, Teucher B, Dierkes J, Stangl GI, Kaaks R. (2013) Plasma 25-hydroxyvitamin D and its genetic determinants in relation to incident type 2 diabetes: a prospective case- cohort study. Eur J Epidemiol 28(9): Zwei neue Parameter-Sets für die MassTox TDM Serie A Antiarrhythmika und Anti-IV-Medikamente Das modulare System der MassTox TDM Serie A ist um zwei weitere Parameter-Sets erweitert worden. Damit können mit einer MasterColumn A über 150 Parameter ohne Säulenwechsel und mit der gleichen Probenvorbereitung zuverlässig gemessen werden. Neu im Programm ist das Parameter-Set für Antiarrhythmika, Arzneistoffe, die zur Behandlung von erzrhythmusstörungen eingesetzt werden, um diese in der äufigkeit oder der Wertigkeit zu senken. Das Parameter-Set ermöglicht die schnelle und effektive LC-MS/MS-Analytik von 27 Analyten im Serum/Plasma. Durch sorgfältige Optimierung aller Kitreagenzien sowie der chromatographischen Trennung werden Matrixeffekte minimiert und die Robustheit der Methode erhöht. Antiarrhythmika Menu: Acebutolol, Ajmalin, Amiodaron, Desethylamiodaron, Aprindin, Atenolol, Bisoprolol, Chinidin, ydrochinidin, Diltiazem, Disopyramid, Dronedaron, Debutyldronedaron, Flecainid, Flunarizin, Gallopamil, Lidocain, Metoprolol, Mexiletin, Procainamid, N-Acetylprocainamid, Propafenon, Propranolol, Sotalol, Tocainid, Verapamil, Norverapamil. Weiterhin wurde die Serie um ein Parameter-Set für Anti-IV-Medikamente erweitert, das insgesamt 18 Analyte umfasst. In der IV-Therapie kann die laufende Kontrolle der Medikamentenkonzentration von erheblicher Bedeutung sein. Eine wichtige Voraussetzung für den Therapieerfolg ist ein ausreichender Plasmaspiegel des verabreichten antiretroviralen Arzneimittels, der individuell stark variieren kann. Anti-IV-Drugs Menu: Amprenavir, Atazanavir, Darunavir, Delavirdin, Efavirenz, Elvitegravir, Etravirin, Indinavir, Lopinavir, Maraviroc, Nelfinavir, Nelfinavir-M8, Nevirapin, Raltegravir, Rilpivirin, Ritonavir, Saquinavir, Tipranavir. Für alle Parameter der Serie A gilt: Durch sorgfältige Optimierung aller Kitreagenzien sowie der chromatographischen Trennung werden Matrixeffekte minimiert und die Robustheit der Methode erhöht. Die Verwendung von stabilen isotopenmarkierten internen Standards sowie die 3PLUS1 oder 6PLUS1 Multilevel Calibrator Sets sorgen für eine hohe Präzision und eine reproduzierbare und verlässliche Quantifizierung aller Analyte.

8 Seite 8 Spezielle Vitamin D-Diagnostik bei Kleinkindern: Bedeutung der C3-Epimere Dr. Inga Unterieser, Dr. habil. Richard Lukačin, Chromsystems Gmb Seit Mitte des 17. Jahrhunderts ist das Krankheitsbild der Rachitis (Englische Krankheit) bei Kindern bekannt. ervorgerufen durch Vitamin D-Mangel, führt sie aufgrund fehlender Mineralisierung zu Knochendeformationen und Wachstumsstörungen. Aktuelle Studien zeigen, dass Vitamin D und seine aktiven Metaboliten eine Reihe weiterer wichtiger Funktionen im menschlichen Organismus erfüllen. Dazu zählen die Förderung der Epithelzell-Differenzierung in der aut, die Beeinflussung der Aktivität des Immunsystems, die Regulation der Insulinausschüttung und der Schutz vor kardiovaskulären Erkrankungen [1]. Darüber hinaus wird Vitamin D-Mangel mit vielen Erkrankungen, wie z. B. Brustund Darmkrebs, multipler Sklerose, Demenz, rheumatischer Arthritis, Diabetes, der Parkinsonschen und Alzheimer Krankheit in Verbindung gebracht, wobei häufig Belege für einen direkten Zusammenhang fehlen. Aufnahme und Metabolismus Vitamin D ist ein fettlösliches Vitamin, dessen Grundstruktur sich vom Steroidgerüst des Cholesterols ableitet. Die wichtigsten Vertreter sind das bei Menschen und Tieren vorkommende Cholecalciferol (Vitamin D 3 ) und das bei Pflanzen und Pilzen vorherrschende Ergocalciferol (Vitamin D 2 ). Beide unterscheiden sich nur geringfügig in der chemischen Struktur der Seitenkette (Abb. 1). Die Aufnahme über die Nahrung spielt für die Vitamin D- Versorgung eine untergeordnete Rolle. Vielmehr wird in der aut gespeichertes 7-Dehydrocholesterol durch das Sonnenlicht in das zunächst inaktive Vitamin D umgewandelt und so dem Organismus zugeführt. Folglich ist die regelmäßige Sonnenexposition wichtig für die Vitamin D-Versorgung, und die Serumkonzentration unterliegt damit jahreszeitlichen Schwankungen. Daher wird für die westliche Population während der Wintermonate auch häufig eine Vitamin D-Supplementierung empfohlen, wobei in einigen wenigen Ländern nur Vitamin D 2 -Präparate für diesen Zweck verfügbar sind [2]. Die Metabolisierung des Vitamin D 3 /D 2 erfolgt in der Leber, wo es zu 25-ydroxyvitamin D 3 bzw. D 2 (25-OD) hydroxyliert wird (Abb. 1). Beide Formen dienen dem Transport und der Speicherung und haben eine albwertszeit von wenigen Wochen, so dass der Serumspiegel an 25-OD 3 /D 2 die anerkannte Messgröße zur Feststellung des Vitamin D- Status ist. Eine weitere ydroxylierung, die insbesondere in der Niere, aber auch lokal und zellspezifisch erfolgen kann, führt dann zum aktiven und hormonell wirksamen 1,25-Dihydroxyvitamin D 3 bzw. D 2. O O O O O 3 O 3 O 3 O 3 25-O-Vitamin D 3 25-O-Vitamin D 2 3-epi-25-O-Vitamin D 3 3-epi-25-O-Vitamin D 2 Abbildung 1: Chemische Strukturen der Vitamine 25-OD 3, 25-OD 2, 3-epi-25-OD 3 und 3-epi-25-OD 2.

9 Seite 9 Darüber hinaus sind die Kalibratoren und Kontrollen für die 3-epi-25-O-Vitamin D 3 /D 2 sowie 25-OD 3 /D 2 Analytik auf das NIST-Referenzmaterial 972 rückführbar. Das C3-Epimer In einer im Jahr 2006 veröffentlichten Studie beschrieben Singh und Mitarbeiter, dass ein erheblicher Anteil des 25 OD in Säuglingen und Kleinkindern bis zu einem Jahr als C3-Epimer vorliegen kann. Dabei kann der Anteil an 3-epi-25-O-Vitamin D bis zu 60 % der Gesamt-25-OD- Konzentration betragen [3]. Tendenziell gilt: Je jünger das Kind, desto höher ist im Mittel der Anteil an epimeren Formen, wobei eine starke Streuung beobachtet wird. Das C3-Epimer des 25-OD unterscheidet sich strukturell nur durch die räumliche Ausrichtung der ydroxylgruppe in Position C3 des Grundgerüstes (Abb. 1). Sein aktiver Metabolit 3-epi-1,25-(O) 2 -Vitamin D 3 /D 2 weist darüber hinaus Unterschiede hinsichtlich der biologischen Wirksamkeiten auf. So ruft die epimere Form zwar eine vergleichbare emmung der Parathyroidhormon-Ausschüttung hervor, calciuminduzierte Effekte im Knochenstoffwechsel sind aber deutlich reduziert. Aufgrund dieser unterschiedlichen Wirksamkeit ist es von erheblicher Bedeutung, die Konzentrationsanteile von 25-OD 3 /D 2 getrennt von deren epimeren Formen zu ermitteln, um so den jeweils individuellen Beitrag der verschiedenen Moleküle am Gesamt-Vitamin D-Status zu ermitteln. Mit etwa einem Jahr werden bei Kleinkindern mit Erwachsenen vergleichbare, zumeist sehr geringe Konzentrationen von 3-epi-25-O-Vitamin D erreicht [3 13]. Es wird vermutet, dass die Epimerisierung vor allem eine Eigenschaft eines noch nicht maturierten Vitamin-D-Stoffwechsels ist. Versorgungslage bei Kindern und Jugendlichen Dank systematischer Prophylaxe sind schwere Krankheitsausprägungen wie die Rachitis und ihre Begleiterscheinungen selten geworden. Dennoch ist ein Vitamin D-Mangel gerade bei Kindern auch heute noch ein viel zu wenig beachtetes Problem. Erst kürzlich wurde in einer umfangreichen vierjährigen repräsentativen US-Studie gezeigt, dass 61 % der 9- bis 21-jährigen US-Amerikaner (ca. 50,8 Millionen) einen Vitamin D-Mangel (37 72 nmol/l 25-OD) aufweisen und weitere 9 % dieser Bevölkerungsgruppe (ca. 7,6 Millionen) sogar an einer Vitamin D-Unterversorgung (< 37 nmol/l 25-OD) leiden [14]. Gerade bei Kindern sollte der Gehalt an 25-O-Vitamin D 3 /D 2 und 3-epi-25-O-Vitamin D 3 /D 2 in Serumproben ermittelt werden, um eine differenzierte Bewertung der Versorgungslage in den wichtigsten frühkindlichen Entwicklungsphasen Abbildung 2: Exemplarisches Chromatogramm einer Serumprobe eines Kleinkindes, die mit dem neuen Epimer-Upgrade zum MassChrom 25-O- Vitamin D 3 /D 2 Reagenzienkit analysiert wurde. Neben 25-OD 3 und 25-OD 2 wurden die epimeren Formen 3-epi-25-O-Vitamin D 3 und 3-epi-25-O-Vitamin D 2 in signifikanten Mengen gefunden. zu ermöglichen. An dieser Stelle ist ausdrücklich darauf hinzuweisen, dass diagnostische Tests, die den Beitrag des 3-epi-25-O-Vitamin D 3 /D 2 am Gesamt-Vitamin-D-Status nicht berücksichtigen oder ihn unzureichend wiedergeben, zumindest für Kleinkinder unter einem Jahr nicht geeignet sind. Die Methode der Wahl Das neue Upgrade zur MassChrom 25-O-Vitamin D 3 /D 2 - Analytik ermöglicht neben der Bestimmung der auptmetabolite der Vitamine D 3 und D 2, 25-ydroxycholecalciferol und 25-ydroxyergocalciferol, die schnelle und simultane Bestimmung von 3-epi-25-O-Vitamin D 3 /D 2 mittels LC-MS/MS im Serum/Plasma (Abb. 2). Dabei beschränkt sich die manuelle Probenvorbereitung auf eine einfache sowie effektive Proteinfällung. Analog zur 25-OD 3 /D 2 - Bestimmung werden die Analyte mithilfe einer Trap-Säule systemisch angereichert und so störende Matrixbestandteile abgetrennt. Über ein einfaches Schaltventil ist die Trap- Säule mit einer speziellen hochauflösenden analytischen Säule verbunden, die die chromatographische Trennung und die sichere Quantifizierung der Analyte in weniger als 10 Minuten ermöglicht (Abb. 2). Zur Ionisierung der stabilen Vitamin D-Moleküle dient die APCI-Technik (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation). Die Verwendung von zwei an die epimeren Formen angepassten isotopenmarkierten internen Standards gleicht Matrixeffekte aus und stellt die hohe Präzision und Robustheit dieser Methode sicher. Zurzeit bietet nur Chromsystems Multilevel Serum-Kalibratoren (3PLUS1 ) und Serum-Kontrollen für diese Analytik an. Upgrade 3-epi-25-OD3/D2 Upgrade-Set separat erhältlich Spezifikationen Informationen zum Produkt Linearität: 1,0 250 μg/l Bestimmungsgrenzen: 1,0 μg/l 3-epi-25-OD2 2,0 μg/l 3-epi-25-OD3 Intraassay: Vk < 5 % Interassay: Vk < 5 % Analysendauer: 8,5 10 min Literatur [1] Deutsche Gesellschaft für Kinder- und Jugendmedizin e.v. (2011) Stellungnahme: Vitamin D-Versorgung im Säuglings-, Kindes- und Jugendalter. [2] olick MF. (2007) Vitamin D deficiency. N Engl J Med 357(3): [3] Singh RJ, Taylor RL, Reddy GS, Grebe SK. (2006) C3-epimers can account for a significant proportion of total circulating 25-hydroxyvitamin D in infants, complicating accurate measurement and interpretation of vitamin D status. J Clin Endocrinol Metab 91(8): [4] Strathmann FG, Sadilkova K, Laha TJ, LeSourd SE, Bornhorst JA, oofnagle AN, Jack R. (2012) 3-epi-25-hydroxyvitamin D concentrations are not correlated with age in a cohort of infants and adults. Clin Chim Acta 413(1 2): [5] Midasch O, Erlenfeld G, Yueksekdağ N, Fabian D, Burki D, Korall, Wallner S, Lukačin R. 25-OD 3 and its C3-epimer: Determination by LC-MS/MS. MSACL rd Annual Conference & Exhibits, San Diego, CA (PosterSplash Track 3/29). [6] Schleicher RL, Encisco SE, Chaudhary-Webb M, Paliakov E, McCroy LF, Pfeiffer CM. (2011) Isotope dilution ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for simultaneous measurement of 25-hydroxyvitamin D 2, 25-hydroxyvitamin D 3 and epi-25-hydroxyvitamin D 3 in human serum. Clin Chim Acta 412(17 18): [7] Shah I, James R, Barker J, Petroczi A, Naughton DP. (2011) Misleading measures in vitamin D analysis: A novel LC-MS/MS assay to account for epimers and isobars. Nutr J 10: 46. [8] van den Ouweland JMW, Beijers AM, van Daal. (2011) Fast separation of 25-hydroxyvitamin D 3 from 3-epi-25-hydroxyvitamin D 3 in human serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Variable prevalence of 3-epi-25-hydroxyvitamin D 3 in infants, children, and adults. Clin Chem 57(11): [9] Stepman MC, Vanderroost A, Stöckl D, Thienpont LM. (2011) Full-scan mass spectral evidence for 3-epi-25-hydroxyvitamin D 3 in serum of infants and adults. Clin Chem Lab Med 49(2): [10] Lensmeyer G, Poquette M, Wiebe D, Binkley N. (2012) The C-3 epimer of 25-hydroxyvitamin D 3 is present in adult serum. J Clin Endocrinol Metab 97: [11] Baecher S, Leinenbach A, Wright JA, Pongratz S, Kobold U, Thiele R. (2012) Simultaneous quantification of four vitamin D metabolites in human serum using high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for vitamin D profiling. Clin Biochem 45(16 17): [12] Wright MJP, alsall DJ, Keevil BG. (2012) Removal of 3-epi-25-hydroxyvitamin D 3 interference by liquid chromatography-tandem mass spectrometry is not required for the measurement of 25-hydroyvitamin D3 in patients older than 2 years. Clin Chem 58(12): [13] Bailey D, Veljkovic K, Yazdanpanah, Adeli K. (2013) Review: Analytical measurement and clinical relevance of vitamin D 3 C3-epimer. Clin Biochem 46(3): [14] DiMeglio LA. (2010) Pediatric endocrinology: Vitamin D and cardiovascular disease risk in children. Nat Rev Endocrinol 6(1): [15] Thomas L. Labor und Diagnose. 7. Aufl, Verlag T-Books Frankfurt/Main (2008). Probenvorbereitung 100 μl Probe/Kalibrator/Kontrolle in Reaktionsgefäß vorlegen. 25 µl Precipitation Reagent zugeben. 200 μl Internal Standard zugeben. 20 s vortexen. 10 min bei + 4 C inkubieren. 5 min bei x g zentrifugieren. 200 µl Überstand in Autosampler-Vial pipettieren. Injektionsvolumen: µl

10 Seite 10 Vitamin B 1 und B 6 -Analytik in der Veterinärmedizin PLC und UPLC Methodenvergleich Dr. Anja Müller, Sebastian Raich, Samuel Bauder, Vet Med Labor Gmb, Ludwigsburg Die B-Vitamine sind nicht nur beim Menschen, sondern auch bei Tieren für den Kohlenhydratstoffwechsel von entscheidender Bedeutung. Eine Vitamin B-Unterversorgung aufgrund von Fehlfütterungen kann bei Tieren zu verschiedenen Mangelerscheinungen führen. Experimentell ist gezeigt, dass die Vitamin B 1 -Konzentration in erz, Leber und Niere bei reduzierter Thiaminaufnahme schneller als im Gehirn abfällt, und zentralnervöse Erkrankungen treten bereits bei einem um 20 % reduzierten Vitamin B 1 -Spiegel auf [1, 2]. Den Verdacht eines Vitamin B 1 - oder Vitamin B 6 -Mangels kann der Tierarzt im veterinär-diagnostischen Labor abklären lassen. Die Methode der Wahl zur Bestimmung der Vitamine B 1 und B 6 aus Vollblut oder Serum/Plasma ist die Flüssigkeitschromatographie (PLC), die seit Jahrzehnten in der umandiagnostik etabliert ist. Als Erweiterung der bestehenden Technik wird die UPLC angesehen, die viele Vorteile wie beispielsweise einen deutlich verminderten Lösungsmittelverbrauch bei gleichzeitig höherer Probendurchsatzrate und verbesserter Sensitivität bietet und die deshalb in der Praxis immer mehr an Bedeutung gewinnt. In der hier vorliegenden Vergleichsstudie wurden die Werte von Vitamin B 1 und B 6 aus EDTA-Vollblut verschiedener Tierarten mittels PLC und UPLC bestimmt. Darüber hinaus wurde der Frage nachgegangen, ob kommerziell erhältliche Komplettkits, die in der klinischen umandiagnostik Anwendung finden, auch innerhalb der Veterinärdiagnostik verlässliche Daten liefern können. Vitamin B 1 -Mangel bei Tieren Vitamin B 1 -Mangel bei Tieren äußert sich in speziesspezifischen und vielfältigen Symptomen. Generell werden in diesen Fällen folgende Krankheitserscheinungen beobachtet: Krämpfe, Unsicherheit im Gang, Paralysen ( Sternguckerkrankheit z. B. bei jungen Löwen oder Katzen), Nahrungsverweigerung, Wachstumsstörungen sowie Bradykardie. Bei Wiederkäuern ist die irnrindennekrose (Cerebrocorticalnekrose, CCN), eine metabolisch-toxische irnerkrankung, auf einen Vitamin B 1 -Mangel zurückzuführen. Der Vitamin B1-Bedarf steht in engem Zusammenhang mit der Nahrungsaufnahme, da zum Abbau der Kohlenhydrate und der damit einhergehenden Energiegewinnung Vitamin B 1 unbedingt erforderlich ist. Darüber hinaus nimmt das Thiamin (Vitamin B 1 ) bei der Umwandlung von Glucose in Nukleinsäuren, Fettsäuren und Aminosäuren eine Schlüsselrolle ein. Eine häufige Ursache für Mangelzustände ist die Akkumulation von Thiaminasen im Verdauungstrakt, die das aufgenommene oder gebildete Vitamin B 1 enzymatisch abbauen. Thiaminasen treten bei Wiederkäuern im Pansen unter Bedingungen der Pansenacidose auf. Des Weiteren können bei Pferden thiaminasehaltige Pflanzen wie Adlerfarn und Sumpfschachtelhalm regelrechte Avitaminosen hervorrufen. Mangelerscheinungen bei unden, Katzen und Pelztieren treten durch häufige Fütterung mit rohem Fisch auf. In hitzebehandelter Nahrung sind Thiaminasen weitestgehend inaktiv. Bei Geflügel kann das Coccidiostaticum Amprolium als Thiamin-Antagonist wirksam werden. Diese Verbindung wird als Futterzusatzmittel verwendet, um Coccidiosen, eine durch Protozoen hervorgerufene Enteritis, zu verhindern, die vor allem in Geflügel und Kaninchen auftritt. Die Substitution mit Vitamin B 1 -Präparaten erfolgt bei Thiaminmangel sowie bei auffälligen Störungen, die auf ungenügende Bildung, verstärkten Abbau oder erhöhten Verbrauch von Vitamin B 1 schließen lassen. Dies ist unter anderem wie bereits oben erwähnt bei Überfütterung mit Kohlenhydraten (Pansenacidose), bei paralytischer Myoglobinurie (Pferd) sowie bei Vergiftungen durch Adlerfarn und Sumpfschachtelhalm gegeben. Eine Thiamingabe ist auch bei Neuritis, Lähmungen periphärer Nerven und Wachstumsstörungen indiziert und erfolgt meist in Form von Vitamin B-Kombinationspräparaten parenteral oder oral [3]. Vitamin B 6 -Mangel bei Tieren Die wirksame Form von Vitamin B 6 ist das Pyridoxal-6-phosphat, das als Coenzym für die Aktivität vieler Enzyme benötigt wird. Vitamin B 6 -Mangel führt demzufolge zu Beeinträchtigungen aller pyridoxal-6-phosphat-abhängigen katalytischen Umsetzungen, die überwiegend dem Proteinstoffwechsel zuzuordnen sind. Als Folgeerscheinungen sind schlechte Futterverwertung, verzögertes Wachstum, Abwehrschwäche und mikrocytäre hypochrome Anämie bei erhöhtem Eisengehalt im Serum beschrieben. Bei schweren Fällen werden Delfin Delfin und Delfin Katze Abbildung 1: PLC-Chromatogramm (oben; Vitamin B 1 = 492 µg/l, Vitamin B 6 = 190 µg/l) und UPLC- Chromatogramm (unten; Vitamin B 1 = 377 µg/l, Vitamin B 6 = 155 µg/l) von aufgearbeiteten Delfinproben (EDTA-Vollblut). Die Trennung der drei Analyte Vitamin B 1, B 6 und Interner Standard wurde mit der UPLC in weniger als der älfte der Zeit erreicht. Abbildung 2: UPLC-Chromatogramme aufgearbeiteter EDTA-Vollblutproben verschiedener Tierarten. Delfin (oben; Vitamin B 1 = 377 µg/l, Vitamin B 6 = 155 µg/l) mit sehr hohem Gehalt an Vitamin B 1, und (Mitte, Vitamin B 1 = 108 µg/l, Vitamin B 6 = 70 µg/l) mit normalen Konzentrationen an Vitamin B 1 und B 6 und Katze (unten; Vitamin B 1 = 31 µg/l, Vitamin B 6 = 1265 µg/l) mit sehr hohem Vitamin B 6 -Wert.

11 Seite 11 Abbildung 3: Methodenvergleich zwischen der bestehenden PLC- und der neuen UPLC- Methodik von Chromsystems zur Analyse von Vitamin B 1 aus EDTA-Vollblutproben verschiedener Tiere (unde, Pferde, Delfine und Rinder). Der Korrelationskoeffizient von 0,964 weist auf eine sehr gute Übereinstimmung zwischen beiden Methoden hin. Abbildung 4: Methodenvergleich zwischen der bestehenden PLC- und der neuen UPLC- Methodik von Chromsystems zur Analyse von Vitamin B 6 aus EDTA-Vollblutproben verschiedener Tiere (unde, Pferde, Delfine und Rinder). Der Korrelationskoeffizient von 0,983 weist auf eine sehr gute Übereinstimmung zwischen beiden Methoden hin. Ausfallerscheinungen des Nervensystems (Polyneuritis), Krämpfe sowie aut- und Bindehautentzündungen beobachtet. Auch anfallsweise auftretende Krämpfe bei Schweinen und Karnivoren, Leber- und Nierenerkrankungen, sowie Fälle von Anorexie und verzögertem Wachstum bei Welpen und Ferkeln können auf Mangelerscheinungen hindeuten und sind mit einer entsprechenden Vitamin B 6 -Therapie zu behandeln. Dabei erfolgt die Applikation ebenfalls oral oder parenteral [1]. Die Interassay-Reproduzierbarkeit wurde bei den Tierproben aufgrund der geringen Probenmenge nur 6-fach bestimmt. Zusammenfassend zeigt die hier vorliegende Studie, dass die kommerzielle Methode von Chromsystems zur Bestimmung von Vitamin B 1 /B 6 aus Serum und Plasma als UPLC-Version über den humanen Bereich hinaus auch für die Veterinärmedizin einsetzbar ist. Sie liefert dabei ähnlich verlässliche Ergebnisse wie die bereits etablierte PLC-Methode, darüber hinaus aber mit einem deutlich verminderten Lösungsmittelverbrauch sowie einer schnelleren Messgeschwindigkeit. Literatur [1] Butterworth RF. (1987) Thiamin malnutrition and brain development. Current topics in Nutr and Dis 16: Zitiert in Biesalski K, Schrezenmeir J, Weber P, Weiß (rsg.). Vitamine. Physiologie, Pathophysiologie, Therapie. Georg Thieme Verlag Stuttgart, [2] aas R. (1988) Thiamin and the brain. Annu Rev Nutr 8: [3] Frey, Löscher W. (2002) Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie für die Veterinärmedizin. Enke Verlag Stuttgart, 2. Aufl, Studiendurchführung EDTA-Blutproben verschiedener Tierarten (und, Katze, Pferd, Rind und Delfin) wurden unter Verwendung von Chromsystems-Kits zur Bestimmung von Vitamin B 1 /B 6 nach Anleitung des erstellers aufgearbeitet und mit der entsprechenden PLC- bzw. UPLC-Methode analysiert. Die Chromatographien erfolgten an einer Dionex RS-LC ULTIMATE 3000 UPLC-Anlage mit umschaltbarem FLD (Abb. 1). Kleinere Schwierigkeiten ergaben sich nur bei der Etablierung der UPLC-Methode hinsichtlich des Gradientenprofils, die ein angepasstes Umschalten auf Laufmittel B bei zeitnaher Wellenlängenumschaltung erforderte. Die Minimierung des Totvolumens gelang dabei durch Ausbau des Gradientenmischers. Ein typischer UPLC-Lauf dauerte etwa 3 Minuten und war damit doppelt so schnell wie die Chromatographie an einer PLC-Anlage (Abb. 1). Zudem sank der Lösungsmittelverbrauch von ca. 10 auf 2 ml pro Probe, also um etwa 80 %. Ein weiterer Unterschied ergab sich bezüglich der Peakform UPLC-Signale erschienen schärfer und schlanker. Ergebnisse Alle Tierproben sowie Kalibratoren und Kontrollen konnten reproduzierbar gemessen werden. Im Gegensatz zu umanproben gab es zum Teil große tierartspezifische Unterschiede bezüglich des Vitamin B 1 - und B 6 -Gehalts, die entsprechend berücksichtigt werden mussten. Beispielsweise haben Katzen im Gegensatz zu unden und anderen Tieren sehr hohe Vitamin B 6 -Werte bzw. Delfine hohe Vitamin B 1 -Werte (Abb. 2). ingegen weisen Rinder, Pferde und unde im Normalfall vergleichbare Vitamin B 1 - und B 6 - Konzentrationen im Serum auf. Die Auswertung der mittels UPLC und PLC gemessenen Werte ergab eine sehr gute Korrelation, die für Vitamin B 1 im Bereich von r2 = 0,964 (Abb. 3) und für Vitamin B 6 bei r2 = 0,983 (Abb. 4) lag. Die Untersuchungen zur Intra- sowie Interassay-Reproduzierbarkeit wurden für die Chromsystems- Kontrollen Level I und II sowie für zwei undeproben, eine Katzen- und eine Pferdeprobe durchgeführt (Tab. 1, 2). Tabelle 1: Intra- und Interassay-Reproduzierbarkeit der UPLC-Technik (Chromsystems) zur Bestimmung von Vitamin B 1 aus EDTA-Vollblut verschiedener Tierarten; Chromsystems-Kontrollen Level I und II zum Vergleich. Vitamin B1 Intra-/Interassay Mittelwert (µg/l) Standabw. (µg/l) Vk (%) Chromsystems-Kontrolle Level I Intra (N = 10) 22,2 0,7 3,0 Chromsystems-Kontrolle Level I Inter (N = 10) 23,4 1,0 4,4 Chromsystems-Kontrolle Level II Intra (N = 10) 92,7 1,0 1,1 Chromsystems-Kontrolle Level II Inter (N = 10) 90,8 3,3 3,6 und-edta Intra (N = 10) 52,0 1,8 3,4 und-edta Inter (N = 6) 52,9 2,2 4,1 Pferd-EDTA Intra (N = 10) 14,0 0,6 4,1 Pferd-EDTA Inter (N = 6) 14,4 0,7 4,9 Katze-EDTA Intra (N = 10) 47,4 1,6 3,3 Katze-EDTA Inter (N = 6) 47,1 3,0 6,4 und-edta Intra (N = 10) 94,8 2,7 2,8 und-edta Inter (N = 6) 99,3 3,8 3,8 Tabelle 2: Intra- und Interassay-Reproduzierbarkeit der UPLC-Technik (Chromsystems) zur Bestimmung von Vitamin B 6 aus EDTA-Vollblut verschiedener Tierarten; Chromsystems-Kontrollen Level I und II zum Vergleich. Vitamin B6 Intra-/Interassay Mittelwert (µg/l) Standabw. (µg/l) Vk (%) Chromsystems-Kontrolle Level I Intra (N = 10) 8,1 0,3 4,2 Chromsystems-Kontrolle Level I Inter (N = 10) 8,8 1,1 12,5 Chromsystems-Kontrolle Level II Intra (N = 10) 29,8 0,8 2,7 Chromsystems-Kontrolle Level II Inter (N = 10) 28,9 2,1 7,1 und-edta Intra (N = 10) 76,9 2,9 3,8 und-edta Inter (N = 6) 77,7 5,4 7,0 Pferd-EDTA Intra (N = 10) 37,2 1,7 4,5 Pferd-EDTA Inter (N = 6) 37,5 3,1 8,3 Katze-EDTA Intra (N = 10) 619,4 19,2 3,1 Katze-EDTA Inter (N = 6) 616,2 69,4 11,3 und-edta Intra (N = 10) 186,7 4,3 2,3 und-edta Inter (N = 6) 192,8 16,0 8,3

12 Seite 12 AKTUELLES DEBUTYLDRONEDARONE DESETYLAMIODARONE DILTIAZEM DISO DE DRONEDARONE FLECAINIDE FLUNARIZINE GALLOPAMIL YDRO NE LIDOCAINE METOPROLOL MEXILETINE NORVERAPAMIL PROCA ACEBUTOLOL AJMALINE AMIODARONE APRINDINE ATENOLOL BIS Der neue Katalog ist da! ChromSystemS DIAGNOSTICS BY PLC & LC-MS/MS PROPAFENONE PROPRANOLOL QUINIDINE SOTALOL TOCAINIDE C RAM DESMETYLFLUOXETINE DULOXETINE FLUOXETINE FLUVOXAM TAZAPINE PAROXETINE SERTRALINE VENLAFAXINE AMPRENAVIR AT VIR DARUNAVIR DELAVIRDINE EFAVIRENZ ELVITEGRAVIR ETRAVIRINE VIR LOPINAVIR MARAVIROC NELFINAVIR NEVIRAPINE RALTEGRAVIR RINE RITONAVIR SAQUINAVIR TIPRANAVIR CLORDIAZEPOXIDE CLO DEMOXEPAM DIAZEPAMMEDAZEPAM MIDAZOLAM NORCLOBAZAM AZEPAM OXAZEPAM PRAZEPAM TEMAZEPAM TETRAZEPAM ALPRAZ BROMAZEPAM CLONAZEPAM DESALKYLFLURAZEPAM FLURAZEPAM Auf über 160 Seiten haben wir unser gesamtes Produktportfolio der Massenspektrometrie in einem Katalog zusammengefasst. Dazu gehören natürlich auch die neuesten Produkte wie das MassChrom Kit zur Bestimmung von Methylmalonsäure oder die aktuellen Erweiterungen unseres Parametermenüs für das Baukastensystem der Serie A. Der Katalog liefert darüber hinaus wertvolle und praktische Informationen zu den Parametern und den verfügbaren Methoden. Kompakt dargestellt sind Chromatogramme, Bestellinformationen, Referenzwerte, Formeln und vieles mehr. In Kürze wird auch ein Katalog erscheinen, der unser PLC-Portfolio umfasst. LC-MS/MS LC-MS/MS Product Catalogue RAZEPAM LORAZEPAM LORMETAZEPAM NITRAZEPAM TRIAZOLAM AR ZOLE CLOZAPINE ALOPERIDOL OLANZAPINE QUETIAPINE RISPERID Informieren Sie sich und bestellen Sie Ihr persönliches Exemplar des LC-MS/MS-Katalogs per mailbox@chromsystems.de Kits, Calibrators & Controls TOSINE ITRACONAZOLE KETOCONAZOLE POSACONAZOLE VORICONAZOLE AMISULPRIDE CLORPROTIXENE LEVOMEPROMAZINE PERAZINE PIP RONE PROMETAZINE ZIPRASIDONE CASPOFUNGIN FLUCONAZOLE GEWINNSPIEL TERMINE 10 E-Book-Reader zu gewinnen Chromsystems ist 2014 u. a. auf folgenden nationalen und internationalen Messen und Kongressen vertreten: > Januar Arabealth, Dubai, UAE > März MSACL, San Diego, USA > März APS 28. Jahrestagung, Fulda, DE > April Analytica, München, DE Für weitere Termine besuchen Sie bitte unsere Website Beantworten Sie 5 Fragen zu dieser Ausgabe des DIALOGs und gewinnen Sie einen von 10 Kindle E-Book-Reader. Einsendeschluss ist der 15. März Senden Sie uns Ihre Lösungen per Fax: , mailbox@chromsystems.de oder per Post: Chromsystems Gmb, Am aag 12, Gräfelfing. Frage 1: Welches Tier wurde als Modelltier für eine Studie zur Klärung der Vitamin D-Anreicherung in tierischen Nahrungsmitteln genutzt? Frage 2: Wie viel schneller ist die UPLC im Vergleich zur PLC bei der Messung von Vitamin B 1 /B 6? Frage 3: Welche chemische Verbindung ist isobar zu MMA? Frage 4: Warum ist der MMA-Plamaspiegel bei Personen mit bakterieller Überbesiedlung im Darm erhöht? Frage 5: Wodurch unterscheidet sich das C3-Epimer des 25-OD strukturell im Grundgerüst? Teilnahmebedingungen Der Rechtsweg ist ausgeschlossen. Die Preise können nicht bar ausgezahlt werden. Mitarbeiter von Chromsystems und ihre Partnerfirmen/Lieferanten sind von der Teilnahme am Gewinnspiel ausgeschlossen. IMPRESSUM erausgeber: Chromsystems Instruments & Chemicals Gmb Am aag Gräfelfing Telefon: /-255 Telefax: mailbox@chromsystems.de Redaktion: Dr. Marc Egelhofer Dr. habil. Richard Lukačin Dr. Nihâl Yüksekdağ Gestaltung: Fred Lengnick Print- & Mediendesign Ausgabe Januar 2014