Untersuchungen zur Kobalt-Versorgung von Milchkühen

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1 Aus der Klinik für Rinderkrankheiten der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Institut für Tierernährung der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft in Braunschweig Untersuchungen zur Kobalt-Versorgung von Milchkühen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades der Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Kirsten Stemme aus Auetal Hannover 2002

2 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. H. Scholz (TiHo) Univ.-Prof. Dr. agr. G. Flachowsky (FAL) Dr. sc. agr. P. Lebzien (FAL) Dr. sc. agr. U. Meyer (FAL) 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. H. Scholz (TiHo) Univ.-Prof. Dr. agr. G. Flachowsky (FAL) 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. M. Coenen Tag der mündlichen Prüfung: Die vorliegende Arbeit wurde von der H. WILHELM SCHAUMANN-Stiftung gefördert.

3 Wissenschaftliche Veröffentlichungen STEMME, K., GÄDEKEN, D., MEYER, U., DAENICKE, R., FLACHOWSKY, G., SCHOLZ, H. (2001): Investigations on vitamin B 12 concentration in the blood serum of dairy cows as related to cobalt concentration in the ration. Proc. Soc. Nutr. Physiol. 10, 152 STEMME, K., MEYER, U., GÄDEKEN, D., SCHOLZ, H., FLACHOWSKY, G. (2001): Investigations on the influence of cobalt supplements on the vitamin B 12 -status of dairy cows. In: Vitamins and Additives in the Nutrition of Man and Animal: September,26 th and 27 th,2001 Jena/Thuringia; 8 th Symposium Micro Nutrients 2001, p. 26 [Abstract] STEMME, K., MEYER, U., GÄDEKEN, D., SCHOLZ, H., FLACHOWSKY, G. (2001): Untersuchungen zum Einfluss von Kobalt-Ergänzungen auf den Vitamin B 12 -Status von Milchkühen. In: R. Schubert, G. Flachowsky, G. Jahreis u. R. Bitsch (Hrsg.): Vitamine und Zusatzstoffe in der Ernährung von Mensch und Tier. 8. Symposium, 26./ , Jena/Thüringen. Informations- und Datenzentrum der FAL, Braunschweig, S STEMME, K., MEYER, U. FLACHOWSKY, G., SCHOLZ, H. (2002): Vitamin B 12 -concentration in serum and liver tissue of dairy cows as affected by cobalt intake. Proc. Soc. Nutr. Physiol. 11, 59 STEMME, K. LEBZIEN, P., FLACHOWSKY, G., SCHOLZ, H. (2002): Investigations on the microbial vitamin B 12 -synthesis of dairy cows as related to the cobalt concentration in the ration. Proc. Soc. Nutr. Physiol. 11, 70 SPOLDERS, M., MEYER, U., GÄDEKEN, D., STEMME, K., FLACHOWSKY, G. (2001): Evaluation of the physical structure value of different rations for dairy cattle applying measurements on ruminanting activity. Proc. Soc. Nutr. Physiol. 10, 40

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5 Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT Kobalt-Vorkommen im Boden Faktoren, die den Kobalt-Gehalt der Pflanze beeinflussen Verfügbarkeit des Kobalts für die Pflanze Einfluss der Pflanzenart auf ihren Kobalt-Gehalt Weitere Faktoren, die den Kobalt-Gehalt von Pflanzen beeinflussen Vitamin B Vitamin B 12 -Synthese im Pansen Absorption, Exkretion und Speicherung von Vitamin B Absorption und Metabolismus von Kobalt Vitamin B 12 im Intermediärstoffwechsel Adenosyl-Cobalamin-abhängige Reaktionen Methyl-Cobalamin-abhängige Reaktionen Auswirkungen eines Kobalt- bzw. Vitamin B 12 -Mangels auf den Intermediärstoffwechsel Klinische Erscheinungen bei Kobalt-Mangel Regionale Verteilung von Kobalt-Mangelgebieten Möglichkeiten zur Vermeidung bzw. zur Behandlung eines Kobalt-Mangels Bedarfsempfehlungen für Wiederkäuer Kobalt-Intoxikation Möglichkeiten zur Diagnostik eines Kobalt-Mangels Bestimmung von Kobalt in verschiedenen Matrizes Vitamin B 12 -Messungen in Proben tierischen Ursprungs Ermittlung von Enzymaktivitäten Messung von Methylmalonylsäure oder Fomiminoglutamat Referenzwerte zur Beurteilung der Kobaltversorgung von Wiederkäuern Ableitung der Aufgabenstellung 45

6 Inhaltsverzeichnis 3 MATERIAL UND METHODEN Überblick über die durchgeführten Versuche Beschreibung der verwendeten Futtermittel Grundfutter Kraftfutter Untersuchungen an ruminal und duodenal fistulierten Milchkühen Versuchsaufbau Versuchstiere, Fütterung und Haltung Rationsgestaltung Bestimmung der pansenphysiologischen Parameter Ermittlung des Nährstoff-Flusses am Dünndarm Herstellung und Verabreichung des Chrommarkers Gewinnung und Aufbereitung der Chymusproben Vorversuch zum Fütterungsversuch Versuchsaufbau, Versuchstiere, Haltung, Fütterung und Probenahme Fütterungsversuch Versuchsaufbau, Versuchstiere und Haltung (Teil I) Versuchsaufbau, Versuchstiere und Haltung (Teil II) Rationsgestaltung (Fütterungsversuch Teil I und II) Probennahme Futterproben Blutproben Milchproben Leberproben Kälberversuch Chemische Analysenmethoden Weender-Rohnährstoffe, ADF, NDF Mengen- und Spurenelemente in den Futtermitteln Chrom Flüchtige Fettsäuren im Pansensaft Ammoniak-Stickstoff im Pansensaft Mikrobielles Rohprotein Kobalt-Gehalt im Darmsaft Vitamin B 12 im Darmsaft Blutparameter Vitamin B 12 und Folsäure Glukose, Gesamtbilirubin, Harnstoff, ß-Hydroxy-Buttersäure, AST, GLDH und γ-gt Eisen Milchinhaltsstoffe Vitamin B 12 in der Milch Kobalt im Lebergewebe Vitamin B 12 im Lebergewebe Statistische Auswertung 64

7 Inhaltsverzeichnis 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Versuch an fistulierten Milchkühen Versuchsablauf, Rohnährstoffgehalte der Futtermittel, Futteraufnahme und Milchleistung Mineralstoff-Aufnahme Kobalt Weitere Mineralstoffe Pansenphysiologische Untersuchungen ph-werte Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren NH 3 -N-Konzentrationen Bewertung der pansenphysiologischen Parameter Fluss an Trockensubstanz und organischer Substanz Stickstofffluss am Duodenum Mikrobielle Proteinsynthese im Pansen Kobalt- und Vitamin B 12 -Konzentrationen im Darmsaft Vorversuch zum Fütterungsversuch Fütterungsversuch (Teil I) Versuchsverlauf Rohnährstoffgehalte und Futteraufnahme Mineralstoff-Aufnahme Kobalt Weitere Mineralstoffe Milchleistung und Milchinhaltsstoffe Lebendmasseentwicklung Vitamin B 12 -Status der Milchkühe Vitamin B 12 -Konzentration im Serum Kobalt- und Vitamin B 12 -Konzentrationen in Lebergewebe und Milch Beurteilung weiterer Blutparameter Eisen Folsäure Glucose Harnstoff, ß-Hydroxy-Buttersäure, Gesamtbilirubin und Leberenzyme (AST, GLDH und γ-gt) Fütterungsversuch (Teil II) Versuchsverlauf, Rohnährstoffgehalte der Ration und Futter-aufnahme Mineralstoff-Aufnahme Kobalt Weitere Mineralstoffe Milchleistung und Milchinhaltsstoffe Vitamin B 12 -Konzentration im Serum Kobalt- und Vitamin B 12 -Konzentrationen im Lebergewebe Vitamin B 12 -Konzentrationen in Milch und Kolostrum Kälberversuch Versuchsdurchführung Vitamin B 12 -Konzentration im Serum 106

8 Inhaltsverzeichnis 5 VERGLEICHENDE DISKUSSION SCHLUSSFOLGERUNGEN ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY LITERATURVERZEICHNIS ANHANG 141

9 Tabellenverzeichnis TABELLENVERZEICHNIS Tabelle 1: Tabelle 2: Tabelle 3: Tabelle 4: Allgemeine Beziehung zwischen Gesteinstypen und Kobalt-Gehalten im Boden (nach PATERSON, 1988) 3 Kobalt-Gehalte verschiedener Pflanzenspezies bei gleichen Aufwuchsbedingungen (nach LATTEUR, 1962 und POOLE et al., 1972) 6 Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Kobalt-Quellen beim Schaf (nach HENRY, 1995) 20 Vitamin B 12 abhängige biochemische Reaktionen (nach ZAGALAK, 1982 und GRUNER et al., 1998) 21 Tabelle 5: Empfehlungen zur Kobalt-Versorgung von Milchkühen (mg Co/kg T) 37 Tabelle 6: Tabelle 7: Tabelle 8: Vitamin B 12 -Konzentrationen bei Rind und Schaf im Serum und deren Interpretation 43 Vitamin B 12 -Konzentrationen im Lebergewebe und deren Interpretation 44 Interpretation der Konzentrationen von Methylmalonylsäure (MMA) und Vitamin B 12 im Plasma von Schafen (nach McMURRAY et al., 1985) 44 Tabelle 9: Übersicht über die durchgeführten Versuche 47 Tabelle 10: Kobalt-Gehalte (mg/kg T) von Grassilagen der Versuchsstation der FAL in Braunschweig 48 Tabelle 11: Zusammensetzung der Kraftfuttermischungen (%) 49 Tabelle 12: Versuchseinteilung 49 Tabelle 13 : Tägliche Milchleistung und inhaltsstoffe der fistulierten Kühe (n=5) zu Versuchsbeginn 50 Tabelle 14: Tabelle 15: Leistungsdaten der im Fütterungsversuch verwendeten Tiere zu Versuchsbeginn (n=18; MW ± SD) 55 Zuteilung des Milchleistungsfutters (IV) in Abhängigkeit von der Milchleistung 56 Tabelle 16: Variationskoeffizienten (VK) in der Analysenpräzision der Mengenund Spurenelemente 59

10 Tabellenverzeichnis Tabelle 17: Variationskoeffizienten (VK) der Analysenpräzision der flüchtigen Fettsäuren 60 Tabelle 18: Übersicht über die verwendeten Testverfahren mit Variationskoeffizienten der Präzision 62 Tabelle 19: WEENDER-Rohnährstoff- und ADF/NDF-Gehalte der im Fistelkuhversuch eingesetzten Futtermittel 65 Tabelle 20: Mittlere tägliche Trockensubstanz- und Rohnährstoffaufnahme der Milchkühe während der Darmsaftsammelwochen (MW ± SD; n=10) 66 Tabelle 21: Energiegehalt der Ration, Energie- und nxp-aufnahme sowie ruminale N-Bilanz (RNB) pro Tier und Tag 66 Tabelle 22: Milchleistung und Gehalt an Milchinhaltsstoffen (n=5; MW ± SD) 67 Tabelle 23: Kobalt-Gehalte der im Versuch mit fistulierten Kühen eingesetzten Futtermittel (mg Co/kg T) 67 Tabelle 24: Kobalt-Aufnahmen pro Tier und Tag in mg/tag sowie mg/kg T 67 Tabelle 25: Mittlere Mengen- und Spurenelement-Aufnahmen pro Tier und Tag sowie die Mengen- und Spurenelement-Gehalte der Ration im Fistelkuhversuch 68 Tabelle 26: Empfehlung für die Versorgung von Milchkühen mit Mengenelementen (g/tag) bei einer Milchleistung von 15 und 20 kg/tag ( nach GfE, 2001) 68 Tabelle 27: Empfehlungen zur Versorgung von Milchkühen mit Spurenelementen (mg/kg Futter-T) (nach GfE, 2001) 69 Tabelle 28: Maximal tolerierbare Spurenelement-Konzentrationen in der Tagesration (mg/kg Futter-T) bei Milchkühen (NRC, 1980; PULS, 1988) 69 Tabelle 29: Gesamtkonzentration an flüchtigen Fettsäuren sowie molare Anteile der einzelnen Fettsäuren im Pansensaft der Milchkühe drei Stunden nach Beginn der Morgenfütterung (MW ±SD; n=5) 71 Tabelle 30: Mittlerer Fluss an Trockensubstanz und organischer Substanz am proximalen Duodenum von fistulierten Milchkühen (n=5) bei Fütterung von Rationen mit unterschiedlichem Kobalt-Gehalt (MW ± SD) 73 Tabelle 31: Stickstoffaufnahme und Stickstofffluss am Duodenum bei Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=5; MW ± SD) 74

11 Tabellenverzeichnis Tabelle 32: Anteil des mikrobiellen Stickstoffs (MN) am Nicht-Ammoniak- Stickstoff (NAN) sowie Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese (n=5; MW ± SD) 75 Tabelle 33: Mikroben-Protein je kg fermentierbarer organischer Substanz (g MP/kg FOS) nach verschiedenen Autoren 75 Tabelle 34: Kobalt-Konzentrationen im Duodenalinhalt sowie Kobalt-Flüsse und Wiederfindungsraten bei Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung 77 Tabelle 35: Maximal mögliche und tatsächlich analysierte Vitamin B 12 -Menge (mg/tag) im Duodenalinhalt sowie die Effizienz der ruminalen Vitamin B 12 -Synthese (%) 78 Tabelle 36: Blutparameter von Milchkühen im Verlauf von 24 Stunden (MW ± SD; n=5) 81 Tabelle 37: WEENDER-Rohnährstoffe und ADF/NDF der im Fütterungsversuch verwendeten Futtermittel 83 Tabelle 38: Trockensubstanzaufnahme in Abhängigkeit von der Kobalt- Versorgung (SCHWARZ et al., 2000) 84 Tabelle 39: Tägliche Trockenmasse- und Rohnährstoffaufnahme (kg/tag) der Milchkühe mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung im Mittel über 112 Versuchstage (n=18, MW ± SD) 85 Tabelle 40: Energiehalt der Ration, mittlere Energie- und nxp-aufnahme sowie ruminale Stickstoffbilanz (RNB) pro Tier und Tag (n=54; MW ± SD; 112 Versuchstage) 85 Tabelle 41: Kobalt-Gehalte der im Fütterungsversuch eingesetzten Futtermittel (mg Co/kg T) 86 Tabelle 42: Tägliche Kobalt-Aufnahme im Mittel für die Versuchsgruppen (MW ± SD; n=18) 86 Tabelle 43: Mittlere Mengen- und Spurenelement-Aufnahmen pro Tier und Tag sowie deren Gehalte der Ration 87 Tabelle 44: Mittlere Milchmenge und Gehalt an Milchinhaltsstoffen über 112 Versuchstage (n=18; MW ± SD) 87 Tabelle 45: Tägliche Produktion an Fett, Protein und Laktose bei unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=18; MW ± SD) 89 Tabelle 46: Lebendmasse-Entwicklung von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=18; MW ± SD; Versuchsdauer 112 Tage) 89

12 Tabellenverzeichnis Tabelle 47: Tägliche Lebendmassezunahme von Mastbullen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (SCHWARZ et al., 2000) 90 Tabelle 48: Eisen-Konzentration im Serum von Milchkühen bei unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (µmol/l) 92 Tabelle 49: Folsäure-Konzentrationen (ng/ml) im Serum von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung im Verlauf der Laktation (n=18; MW ± SD) 93 Tabelle 50: Glucose-Konzentration im Plasma von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=18; MW ± SD) 94 Tabelle 51: WEENDER-Rohnährstoffe und ADF/NDF der im Fütterungsversuch (Teil II) verwendeten Futtermittel 96 Tabelle 52: Tägliche Rohnährstoffaufnahme (kg/tag) von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (Dauer ca. 168 Tage; MW ± SD, n=10) 96 Tabelle 53: Energiegehalt der Ration, tägliche Energie- und nxp-aufnahme sowie ruminale N-Bilanz (RNB) (n=10) 97 Tabelle 54: Kobalt-Gehalte der im Fütterungsversuch (Teil II) eingesetzten Futtermittel (mg Co/kg T) 97 Tabelle 55: Tägliche Kobalt-Aufnahme (n=10) 97 Tabelle 56: Mittlere Mengen- und Spurenelement-Aufnahmen pro Tier und Tag sowie Mengen- und Spurenelement-Gehalte der Ration 98 Tabelle 57: Mittlere Milchleistung und Gehalt an Milchinhaltsstoffen sowie mittlere täglich produzierte Menge an Fett und Eiweiß im zweiten Teil des Fütterungsversuchs (n=10; MW ± SD) 98 Tabelle 58: Vitamin B 12 -Konzentration (pg/ml) im Serum von Milchkühen während des Fütterungsversuchs (Versuchsdauer etwa 280 Tage; MW ± SD; n=10) 100 Tabelle 59: Kobalt-Konzentration im Lebergewebe von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (µg Co/kg FS; MW ± SD; n=4) 101 Tabelle 60: Mittlere Lebendmasse der zur Leberbiopsie verwendeten Milchkühe mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (MW ± SD) 103 Tabelle 61: Lebermassen von Milchkühen und Formeln zu deren Errechnung 103 Tabelle 62: Vitamin B 12 -Ressourcen in der Leber von 8 Milchkühen und geschätzte Gesamt-Cobalamin-Menge (mg) an drei Probenterminen (MW ± SD) 104

13 Tabellenverzeichnis Tabelle 63: Vitamin B 12 -Konzentration (ng/ml) in Milch und Kolostrum von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=10; MW ± SD) 104 Tabelle 64: Vitamin B 12 -Konzentration in der Kuhmilch (ng/ml) und deren Interpretation in Bezug auf die Kobalt-Versorgung (nach PULS, 1994) 106 Tabelle 65: Vitamin B 12 -Konzentration im Serum von Kälbern am Tag der Geburt sowie am 1., 2. und 5. Lebenstag (MW ± SD; n=10) bei unterschiedlicher Kobalt-Versorgung der Muttertiere 107 Tabelle 66: Effizienz von Kobalt in der ruminalen Vitamin B 12 -Synthese 109 Tabelle 67: Cobalamin-Absorptionshöhe (%) nach verschiedenen Autoren 109 Tabelle 68: Gegenüberstellung von Versuchsergebnissen an Mastbullen (STANGL et al., 1999 a und b) und Milchkühen (eigene Versuche) 111

14 Abbildungsverzeichnis ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abbildung 1: Kobalt-Gehalte zweier Weiden in Norwegen im Verlauf mehrerer Jahre (nach ULVUND und PESTALOZZI, 1996) 8 Abbildung 2: Strukturformel des Vitamin B 12 -Moleküls (nach SMITH, 1997) 9 Abbildung 3: Vitamin B 12 -Konzentration im Panseninhalt von Schafen mit bzw. ohne Kobalt-Zulage (n=2) (nach SMITH und MARSTON, 1970a) 11 Abbildung 4: Vitamin B 12 -Produktion im Pansen von Schafen nach Absetzen einer täglichen Co-Gabe von 1 mg/d (nach SMITH und MARSTON, 1970a) 12 Abbildung 5: Beziehung zwischen der Kobalt-Konzentration im Panseninhalt von Schafen und dem Prozentsatz, der als Vitamin B 12 vorliegt (nach SMITH und MARSTON, 1970a) 13 Abbildung 6: Modelle für freien und gebundenen Intrinsic Factor (nach GRASBECK, 1969 und SEETHARAM, 1999) 16 Abbildung 7: Übersicht über die Endozytose von Cobalamin (nach SEETHARAM, 1999) 17 Abbildung 8: Wege des Vitamin B 12 im Körper (nach GRUNER et al., 1998) 19 Abbildung 9: Vitamin B 12 abhängige Umlagerung von Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA (nach GRUNER et al., 1998) 22 Abbildung 10: Metabolische Schlüsselstellung des Adenosyl-Cobalamins (nach ZAGALAK, 1982) 23 Abbildung 11: Bedeutung des Methyl-Cobalamins bei der Methylgruppen- Übertragung (nach FRIEDRICH, 1987) 24 Abbildung 12: Zusammenhänge zwischen Folsäure-, Vitamin B 12 - und Homocystein-Stoffwechsel (nach REFSUM, 2001) 25 Abbildung 13: Zeitliche Abfolge unterschiedlicher Phasen bei der Entstehung eines klinischen Kobalt-Mangels (nach UNDERWOOD und SUTTLE, 1999) 30 Abbildung 14: Schema einer Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen Spurenelement-versorgung und Wirkung (nach UNDERWOOD und SUTTLE, 1999) 35

15 Abbildungsverzeichnis Abbildung 15: Mittlerer ph-wert-verlauf im Pansensaft von Milchkühen ohne und mit Co-Zulage während der ersten 300 Minuten nach Beginn der Morgenfütterung (MW ± SD; n=5) 70 Abbildung 16: NH 3 -N-Konzentrationen im Pansensaft der Milchkühe mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung in den ersten 300 Minuten nach Fütterung (MW ± SD; n=5) 71 Abbildung 17: Vitamin B 12 -Synthese je kg T-Aufnahme (Mittel aus 4 Analysen) ohne und mit Co-Zulage bei den 5 Fistelkühen 79 Abbildung 18: Mittlere tägliche Trockensubstanzaufnahme der Versuchsgruppen im Versuchsverlauf (n=18) (Gruppe I,II und III entsprechen den Kobalt-Versorgungsstufen 0,10 ; 0,20 und 0,30 mg Co/kg Futter-T) 84 Abbildung 19: Entwicklung der Milchleistung (FCM) bei unterschiedlicher Kobalt- Versorgung (n=18; Versuchsdauer 112 Tage) 88 Abbildung 20: Vitamin B 12 -Konzentration im Serum von Milchkühen in Abhängigkeit von ihrer Kobalt-Versorgung mit fortschreitender Laktation (n=18) 91 Abbildung 21: Milchmenge, -Fett und -Eiweiß im Versuchsverlauf (n=10) 99 Abbildung 22: Vitamin B 12 -Konzentration im Serum von Milchkühen im Verlauf der Laktation bei unterschiedlicher Kobalt- Versorgung (n=10) 100 Abbildung 23: Vitamin B 12 -Konzentration im Lebergewebe von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (mg/kg; n=4) 102 Abbildung 24: Beziehung zwischen Kobalt-Aufnahme und Vitamin B 12 - Konzentration im Lebergewebe von Schafen (nach MARSTON, 1970) 102 Abbildung 25: Vitamin B 12 -Konzentration in der Milch von Kühen in Abhängigkeit vom Laktationsstadium (nach GREGORY et al., 1958) 105 Abbildung 26: Vitamin B 12 -Konzentration in Serum und Lebergewebe von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=4) 111 Abbildung 27: Vitamin B 12 -Konzentration im Serum (pg/ml) und tägliche Milchmenge (kg/tag) von Kühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=18) 112

16 Abkürzungsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS γ-gt ADF ARC Ado-Cbl AST C 2 C 3 C 4 C 5 Cbl Co CoA Cr 2 O 3 DM FAL FFS FCM FOS FS GfE GLDH ICP IF IF-Cbl IFCR INRA LMZ ME Gamma-Glutamyl-Transferase Säure-Detergentien-Faser (Acid detergent fiber) Agriculture Research Council Adenosyl-Cobalamin Aspatat-Aminotransferase Essigsäure Propionsäure Buttersäure Valeriansäure Cobalamin Cobalt Coenzym A Chromoxid Dry matter Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Flüchtige Fettsäuren Fettkorriegierte Milch (fat corrected Milk) Fermentierbare organische Substanz Frischsubstanz Gesellschaft für Ernährungsphysiologie Glutamat-Dehydrogenase Inductively-coupled-plasma Intrinsic Factor Intrinsic Factor-Cobalamin Intrinsic Factor Cobalamin-Rezeptor Institut National de la Recherche Agronomique Lebendmassezunahme Umsetzbare Energie

17 Abkürzungsverzeichnis Me-Cbl MJ MMA MN MP MW n N NAN NDF NEL NH 3 NPN NRC nxp OS p RNB SD T TC (I III) U/min VK XA XF XL XP XX Methyl-Cobalamin Megajoule Methylmalonylsäure (Methylmalonic acid) Mikrobieller Stickstoff Mikrobenprotein Mittelwert Stichprobenumfang Stickstoff Nicht-Ammoniak-Stickstoff Neutral-Detergentien-Faser (neutral detergent fiber) Nettoenergie Laktation Ammoniak Nicht-Protein-Stickstoff National Research Council Verdauliches Rohprotein Organische Substanz Irrtumswahrscheinlichkeit Ruminale Stickstoff-Bilanz Standarddifferenz Trockensubstanz Transcobalamin (I III) Umdrehungen pro Minute Variationskoeffizient Rohasche Rohfaser Rohfett Rohprotein n-freie Extraktstoffe (NfE)

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19 Einleitung 1 EINLEITUNG Vitamin B 12 (auch Cobalamin genannt) kann nur von einigen Bakterien und Hefen synthetisiert werden und ist aus diesem Grund in pflanzlichen Futtermitteln nicht enthalten (COSTIGAN und GERDES, 1991). Während der Mensch und die meisten Säugetiere auf eine Zufuhr von Vitamin B 12 mit der Nahrung angewiesen sind, können die Mikroorganismen in den Vormägen der Wiederkäuer Vitamin B 12 synthetisieren. Vorraussetzung hierfür ist jedoch eine ausreichende Versorgung mit Kobalt (Co), welches das Zentralatom des Vitamin B 12 - Moleküls darstellt. Bei ausreichender Kobalt-Zufuhr und physiologischem Pansenmilieu kann in den Vormägen genügend Cobalamin synthetisiert werden, um den Bedarf der Pansenmikroorganismen und des Wiederkäuers zu decken. Nach BIGGER et al. (1976) und ZINN et al. (1987) beläuft sich die Vitamin B 12 -Synthese auf Werte zwischen 0,33 und 2,0 mg/kg Trockensubstanzaufnahme. Angaben zur täglich am Dünndarm anflutenden Vitamin B 12 -Menge schwanken zwischen 0,6 und 10 mg/tag (STEINBERG und KLÜNTER, 1995), von der etwa 1-3% absorbiert werden (GIRARD, 1998). Vitamin B 12 fungiert im Stoffwechsel höherer Organismen als Co-Enzym bei bisher zwei bekannten Reaktionen. Bei der ersten handelt es sich um einen Reaktionsschritt beim Abbau der im Pansen durch Fermentationsprozesse entstehenden Propionsäure. Das Enzym Methylmalonyl-CoA-Mutase katalysiert die Umwandlung von Methylmalonyl-CoA in Succinyl-CoA. Weil die Propionsäure beim Wiederkäuer eine wichtige Energiequelle darstellt (SCOTT, 1999), kommt es durch Kobalt- bzw. Vitamin B 12 -Mangel zu Störungen im Energiehaushalt des Wiederkäuers. Bei der zweiten Reaktion, bei der Vitamin B 12 Co-Enzym- Funktion hat, handelt es sich um die Umwandlung von Homocystein in Methionin. Durch die gleichzeitige Regenerierung von Folsäure wird beim Kobalt- bzw. Vitamin B 12 -Mangel auch der Folsäuremetabolismus beeinträchtigt. Bei Kobalt-Mangel zeigen betroffene Tiere verminderte Futteraufnahme bei gleichzeitig abnormem Appetit auf zum Teil unverdauliche Stoffe, wie zum Beispiel Holz, Erde aber auch verschmutzte Einstreu (WIESNER, 1970). Weiterhin können fortschreitender Gewichtsverlust und/oder Rückgang der Leistung sowie Fruchtbarkeitsstörungen beobachtet werden. Da die bisherigen Empfehlungen zur Spurenelementversorgung von Milchkühen hauptsächlich auf Versuchen mit Schafen und Mastrindern beruhen, war die Zielstellung der vorliegenden Untersuchung, den Einfluss von Kobalt-Ergänzungen auf die mikrobielle Vitamin B 12 -Synthese und die Vitamin B 12 -Konzentrationen in Serum, Lebergewebe und Milch von Kühen sowie weitere Parameter (Trockensubstanzaufnahme, Milchleistung, Gehalt an Milchinhaltsstoffen) zu untersuchen, um damit die Datenbasis für Empfehlungen zur Kobalt-Versorgung von Milchkühen auf experimenteller Grundlage zu erweitern. 1

20 Einleitung Da nach ALLAWAY (1975) der Zusammenhang zwischen dem Kobalt-Gehalt in Boden und Pflanze einerseits und der Gesundheit vom Wiederkäuer andererseits ein eindrucksvolles Beispiel für die Beziehung Boden-Pflanze-Tier darstellt (The relationship of the levels of Co in soils and plants to the health of ruminants is one of the striking examples of a soil and plant relationship to animal health.), soll zunächst ein Literaturüberblick über Kobalt in Boden, Pflanze und Tier gegeben werden. 2

21 Literaturübersicht 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Kobalt-Vorkommen im Boden Kobalt zählt zu den essentiellen Spurenelementen für Mensch und Tier sowie für einige Mikroorganismen. Während der Mensch und die meisten monogastrischen Säugetiere dieses Element jedoch nicht direkt verwerten können, ist der Wiederkäuer auf Grund seiner Pansenmikroorganismen dazu in der Lage. Da über Kobalt-Mangel nur aus regional stark begrenzten Gebieten berichtet wird, liegt die Vermutung nahe, dass die geochemischen Verhältnisse und der Zustand der Böden einen Einfluss auf die Kobalt-Versorgung der Tiere haben. Kobalt kommt im Boden in nur sehr geringer Konzentration vor (REID und HORVATH, 1980; SMITH, 1997), wobei die Angaben zwischen 0,05 und 300 mg/kg schwanken (SMITH und PATERSON, 1999). Der mittlere Kobaltgehalt liegt in unseren Breiten etwa in der Größenordnung von 10 bis 15 mg Co/kg und ist je nach Bodentyp in größerem Umfang schwankend. Grundsätzlich liegen nur wenige Daten über Kobalt-Gehalte in Böden vor und diese stammen in der Regel aus Gebieten, in denen Kobalt-Mangel beobachtet wurde (LATTEUR, 1962). Der Kobalt-Gehalt der Böden wird primär durch das jeweilige Ausgangsgestein bestimmt (SMITH und PATERSON, 1999). Als Faustregel kann folgendes angenommen werden: Hohe Kobaltgehalte treten in ultrabasischen Gesteinen mit Gehalten von mg/kg auf. Deutlich geringere Gehalte weisen basische (30-45 mg/kg) sowie saure oder neutrale (5-10 mg/kg) Böden vulkanischen Ursprungs auf. Arm an Kobalt sind vor allem Sandböden, Kalksteine und Lehm (0,1-5 mg/kg; REID und HORVATH, 1980). Weiterhin gilt, dass Böden aus ariden und semi-ariden Gebieten höhere Kobalt-Gehalte aufweisen, als solche aus polaren, gemäßigten oder tropischen Zonen (AUBERT und PINTA, 1977). In Tabelle 1 ist eine vereinfachte Übersicht über den Zusammenhang zwischen Kobalt-Gehalt im Boden und Ausgangsgestein dargestellt. Tabelle 1: Allgemeine Beziehung zwischen Gesteinstypen und Kobalt-Gehalten im Boden (nach PATERSON, 1988) Hohe Kobalt- Gehalte Erstarrungsgesteine Sedimentgesteine Metamorphite Ultrabasische und basische Gesteine z.b. Dunit Tonige Gesteine z.b. Tonschiefer Metamorphe Gesteine mit Fe-Mg-Mineralien z.b. Serpentin Niedrige Kobalt- Gehalte Saure Gesteine z.b. Granit Sandige Gesteine z.b. Sandsteine Metamorphe silicatreiche Gesteine z.b. Gneis 3

22 Literaturübersicht Auch innerhalb der Böden ist die Verteilung des Kobalts recht unterschiedlich. So ist Kobalt in der Regel in solchen Zonen vermehrt, die reich an organischer Substanz und Tonen sind. Mit wenigen Ausnahmen kann bei der Beschreibung der vertikalen Verteilung von Kobalt im Boden das von LATTEUR (1962) aufgestellte Schema angewendet werden: - In der oberen, in der Regel durch Humus angereicherten Schicht befindet sich ein befriedigender Kobaltgehalt. Diese Schicht ist meist nur gering ausgeprägt. Die meisten Pflanzen, deren Wurzeln sich in diesem Bereich befinden, können Kobalt nur in geringem Umfang verwerten. - Die sich anschließende Zwischenschicht ist arm an Kobalt, da dieses größtenteils ausgewaschen wurde. Die in diesem Bereich wurzelnden Pflanzen wie z.b. die Leguminosen haben auf Grund ihrer im Wurzelbereich vorhandenen Rhizobium- Bakterien einen Kobalt-Bedarf. - Unter diesen Schichten beinhalten die Bodenbereiche hohe Kobalt-Gehalte. Sie sind jedoch für die Wurzeln der Pflanzen meist nicht mehr zu erreichen. Darüber hinaus ist es entscheidend, in welcher Form Kobalt vorliegt. Oxid-, Hydroxid- und Karbonatverbindungen sind nur schwer löslich und in alkalischer Umgebung immobil. In saurem Milieu sind sie leichter löslich, was Auswaschungsprozesse begünstigt. Aus diesem Grunde weisen alkalische Böden in der Regel höhere Gesamtkobaltgehalte auf als saure Böden (SMITH und PATERSON, 1999). Neben den Ausgangsgesteinen sind sowohl die Art der Bodenbearbeitung als auch die Art und Intensität der Düngung für den Kobalt-Gehalt von Bedeutung (CLARK, 1998). Durch Bodenbearbeitung können je nach Intensität die oben genannten Schichten mehr oder weniger miteinander vermischt werden. Auch Veränderungen des Wasserhaushalts des Bodens durch Drainage können den Auswaschungsprozess beschleunigen (LATTEUR, 1962). Einen recht großen Einfluss hat die Verwendung von Düngemitteln, wobei Art und Menge des Düngers von entscheidender Bedeutung sind. Der Einfluss auf den Kobalt-Gehalt erfolgt, da die Düngemittel selbst meist nur wenig Kobalt enthalten (LATTEUR, 1962), über eine Veränderung des Bodenmilieus. Aus den dargestellten Zusammenhängen ist ersichtlich, dass eine pauschale Aussage über den Kobalt-Gehalt im Boden nicht zu treffen ist. Aus Struktur vom Boden und Ausgangsgestein können lediglich Anhaltspunkte gewonnen werden. Bei der Beurteilung eines Bodens bezüglich seines Kobalt-Gehalts ist demnach eine Analyse des Spurenelement-Gehalts von großer Bedeutung. 4

23 Literaturübersicht 2.2 Faktoren, die den Kobalt-Gehalt der Pflanze beeinflussen Verfügbarkeit des Kobalts für die Pflanze Bisher gibt es keine Hinweise darauf, dass Kobalt auch für Pflanzen ein essentielles Spurenelement darstellt (MARSTON, 1952; SMITH und PATERSON, 1999). Ein Kobalt- Bedarf wurde bisher nur für Leguminosen nachgewiesen (WHITEHEAD, 2000), wobei das Kobalt von den stickstoff-fixierenden Bakterien im Wurzelbereich benötigt und angereichert wird (YOUNG, 1979; SMITH und PATERSON, 1999). Die Bakterien verwenden Kobalt zum einen zur Bildung von Vitamin B 12, zum anderen dient es ihnen als Wachstumsfaktor. Bei höheren Kobalt-Gehalten im Boden sind die Bakterien in der Lage, mehr Stickstoff zu binden, was ein verstärktes Wachstum mancher Leguminosenarten zur Folge hat (YOUNG, 1979). Obwohl alle übrigen Grünpflanzen keinen Kobalt-Bedarf haben, nehmen sie es aus dem Boden auf, wobei die Höhe der Kobaltaufnahme durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst wird. Neben der Art der Pflanze ist hierbei vor allem die Verfügbarkeit des Kobalts zu nennen. Generell gilt, dass Pflanzen auf kobaltarmen Böden geringere Kobalt-Gehalte aufweisen als vergleichbare Arten auf kobaltreicheren Böden (YOUNG, 1979; SMITH und PATERSON, 1999). Diese Beziehung ist jedoch nicht allgemeingültig (ULVUND und PESTALOZZI, 1996), da die Verfügbarkeit des Kobalts durch den Wassergehalt, den ph-wert und die Präsenz anderer Mineralstoffe und Spurenelemente beeinflusst wird (SMITH und PATERSON, 1999). Böden mit hohem Wassergehalt weisen im Vergleich zu gut entwässerten Böden deutlich höhere Gehalte an extrahierbarem und für die Pflanzen verfügbarem Kobalt auf. Neben dem Wassergehalt spielt hierbei vor allem der ph-wert eine große Rolle. Bei einem hohen BodenpH-Wert ist nach WHITEHEAD (2000) die Verfügbarkeit von Kobalt für Pflanzen vermindert. MITCHELL (1972) stellte fest, dass durch einen Anstieg des ph-wertes von 5,4 auf 6,4 der Kobalt-Gehalt in Rotklee um etwa 40 % reduziert wurde. Eine mögliche Erklärung hierfür ist eine Komplexbildung. Wie bereits in Kapitel 2.1 aufgeführt, liegt Kobalt bei hohen ph-werten in nur schwer löslichen Verbindungen vor, so dass eine Aufnahme durch Pflanzen erschwert wird. Durch den ph-wert wird auch ein weiterer Faktor beeinflusst, der bei der Diskussion der Kobalt-Verfügbarkeit für Pflanzen in Betracht gezogen werden muss. Kobalt ist in vielen Fällen in der Natur mit Mangan vergesellschaftet. Bei Bildung von Manganoxiden lagern sich schnell Kobalt-Ionen zunächst locker an (ADAMS et al., 1969), die später durch eine Oxidation das Mangan ersetzen können. Mit steigendem ph-wert wird die Bildung dieser Komplexe gefördert. Untersuchungen in Australien ergaben, dass durchschnittlich 79 % des Boden-Kobalts in Manganmineralien enthalten ist (McKENZIE, 1972). Kobalt, das in dieser Form gebunden ist, kann von den Pflanzen nicht aufgenommen werden (SMITH und PATERSON, 1999). 5

24 Literaturübersicht Einfluss der Pflanzenart auf ihren Kobalt-Gehalt Zwischen den verschiedenen Pflanzenarten gibt es unabhängig vom Einfluss des Bodens und der klimatischen Bedingungen große Unterschiede in ihrer Fähigkeit, Kobalt aufzunehmen und zu speichern (POOLE et al., 1972). Wiesenkräuter und Leguminosen weisen unter denselben Aufwuchsbedingungen höhere Kobalt-Gehalte auf als Gräser (MENKE und HUSS, 1987). Kleearten sind bei ausreichender Kobalt-Verfügbarkeit des Bodens reicher an Kobalt. Bei ungenügenden Kobalt-Gehalten im Boden kommt es unter Umständen aber auch zwischen den einzelnen Pflanzenspezies zu einer umgekehrten Reihung bezüglich der Kobalt- Gehalte (POOLE et al., 1972). Bei ausreichendem Kobalt-Gehalt im Boden können die verschiedenen Pflanzenspezies schematisch nach hoher, mittlerer und geringer Kobalt-Aufnahme und -Speicherung eingeteilt werden (LATTEUR, 1962 ; POOLE et al., 1972). Eine Übersicht über diese Gruppen mit typischen Vertretern gibt Tabelle 2. Tabelle 2: Kobalt-Gehalte verschiedener Pflanzenspezies bei gleichen Aufwuchsbedingungen (nach LATTEUR, 1962 und POOLE et al., 1972) Hoher Kobalt-Gehalt (über 0,1 mg/kg T) Mittlerer Kobalt-Gehalt (0,07 0,1 mg/kg T) Niedriger Kobalt-Gehalt (unter 0,07 mg/kg T) Luzerne Straussgras Mais Klee Knaulgras Weizen Wicken Lieschgras Gerste Lupinen Weidelgras Hafer Rispengras Wiesenfuchsschwanz Roggen Einige Kräuter Einige Moorpflanzen Aus dieser Aufstellung ist ersichtlich, dass die für Wiederkäuer gebräuchlichsten Grundfuttermittel mittlere bis niedrige Kobalt-Gehalte aufweisen. Diese Werte sind jedoch auf Böden ermittelt worden, wo kein Kobalt-Mangel vorlag. In Gebieten, aus denen über Kobalt-Mangel berichtet wird, liegen die Gehalte in den Pflanzen oftmals um ein Vielfaches niedriger. Es gibt auch einige wenige Pflanzenarten, die in der Lage sind, Kobalt nicht nur aufzunehmen und zu speichern, sondern auch anzureichern. Bestimmte Süßhölzer (Astragalus sp.) weisen zum Teil Kobalt-Gehalte bis zu 100 mg/kg Trockenmasse auf. CLARK (1998) stellt die These auf, dass durch Züchtung Einfluss auf den Kobalt-Gehalt der Pflanzen genommen werden kann. Er ist der Ansicht, dass vor allem Gräserarten, die auf höhere Erträge gezüchtet wurden, eine geringere Fähigkeit zur Aufnahme und Speicherung von Spurenelementen besitzen. 6

25 Literaturübersicht Weitere Faktoren, die den Kobalt-Gehalt von Pflanzen beeinflussen Für die Beurteilung der Kobalt-Versorgung grasender Rinder und Schafe ist es wichtig, die Artenverteilung auf der Weide zu berücksichtigen. Weiden mit einem hohen Anteil an Klee weisen einen höheren Kobalt-Gehalt auf als solche, auf denen vornehmlich Gräser vorkommen (CLARK, 1998). Ebenso wirkt sich ein großer Anteil an Kräutern aus (YOUNG, 1979). Allgemein lässt sich feststellen, dass je artenreicher eine Weide ist, desto höher ist der Kobalt-Gehalt. Die Artenvielfalt wird neben dem Standort auch durch die Intensität der Nutzung beeinflusst. Extensiv genutzte Weiden zeigen ein größeres Spektrum verschiedener Arten als intensiv genutzte (YOUNG, 1979) oder Mahd-Weiden bzw. Wiesen. Je mehr Schnitte pro Jahr gemacht werden, desto weniger verschiedene Gräserarten kommen vor. Die unter und über den jeweiligen Kobalt-Gehalt der Pflanzen gemachten Angaben bezogen sich auf den Gehalt in den Ganzpflanzen. Da jedoch nicht immer alle Bestandteile der Pflanzen als Futtermittel verwendet werden, müssen für genauere Aussagen über für das Tier verfügbare Kobalt-Mengen, die einzelnen Teile der Pflanzen getrennt betrachtet werden. LATTEUR (1962) gibt Mittelwerte an, die er auf eine Reihe verschiedener Pflanzenspezies anwendet. Er fand in Blättern die höchsten Kobalt-Gehalte mit durchschnittlich 0,19 mg/kg T. Samen, Früchte, Wurzeln und Wurzelknollen lagen im Bereich von 0,06 bis 0,08 mg Co/kg T. Die mit Abstand niedrigsten Kobalt-Werte konnten in verholzten Teilen wie Schalen oder Kernen mit durchschnittlich 0,006 mg/kg T ermittelt werden. Demgegenüber macht WHITEHEAD (2000) die Aussage, dass generell bei Leguminosen und Gräsern der höchste Kobalt-Gehalt in den Wurzeln zu finden ist, wobei er nicht ausschließt, dass diese Verteilung durch die Menge des verfügbaren Kobalts beeinflusst werden kann. Gleiches gilt für die Verteilung des Kobalts zwischen Blatt und Stengel. FLEMING (1963) fand heraus, dass bei ausreichender Kobalt-Versorgung der Pflanzen die Anteile in den Blättern höher waren als in den Stengeln. Bei mangelhafter Versorgung mit Kobalt bestand dieser Unterschied nicht mehr. Bei Steck- und Runkelrüben befindet sich das meiste Kobalt in den Blättern. Der Rübenkörper beider Rübenarten zählt zu den kobaltarmen Futtermitteln (<0,07 mg/kg T). Einen maßgeblichen Einfluss auf den Kobalt-Gehalt in den Pflanzen hat zudem ihr Vegetationsstadium. FLEMING und MURPHEY (1968) stellten mit zunehmendem Alter der Gräser einen abnehmenden Kobalt-Gehalt fest. Verantwortlich ist hierbei einerseits das Verhältnis von Blättern zu Stengeln, das bei jungem Gras höher ist. Andererseits kommt es bei fortschreitendem Vegetationsstadium zur Bildung von Samen, die nach LATTEUR (1962) niedrigere Kobalt-Gehalte aufweisen als Blätter. Deutlich wird dies beim Mais, der zu Beginn der Kolbenbildung einen Gehalt von 0,10 mg Co/kg T aufweist, in der Teigreife nur noch 0,04 mg Co/kg T (JEROCH et al., 1993). 7

26 Literaturübersicht Ein Einfluss der Jahreszeiten auf den Kobalt-Gehalt konnte bisher nicht festgestellt werden. KLESSA et al. (1989) ermittelten auf schottischen Versuchsfeldern den niedrigsten Kobalt- Gehalt in Gräsern zwischen Juni und August. Sie machten hierfür zum einen das fortgeschrittene Vegetationsstadium und zum anderen den niedrigen Wassergehalt im Boden in diesen Monaten verantwortlich. Untersuchungen, die von ULVUND und PESTALOZZI (1996) von 1985 bis 1995 in Norwegen durchgeführt wurden, zeigen große Variationen im Kobalt-Gehalt sowohl zwischen den einzelnen Schnitten, die jeweils in der 21., 26. und 32. Kalenderwoche durchgeführt wurden, als auch über den gesamten Versuchszeitraum. (Abbildung 1). Weide A Weide B Abbildung 1: Kobalt-Gehalte zweier Weiden in Norwegen im Verlauf mehrerer Jahre (nach ULVUND und PESTALOZZI, 1996) Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass der Kobalt-Gehalt in den Pflanzen von einer Reihe Faktoren abhängt, die sich teilweise auch gegenseitig beeinflussen. Ebenso wie bei der Beurteilung des Kobalt-Gehalts und seiner Verfügbarkeit im Boden können auch bei den Pflanzen lediglich Tendenzen aufgezeigt werden. Zur Beurteilung, ob ein Futtermittel für Wiederkäuer ausreichend Kobalt enthält, ist deshalb eine Analyse des Kobalt-Gehalts unerlässlich. Eine Übersicht über den Kobalt-Gehalt ausgewählter Futtermittel ist im Anhang 1 enthalten. 8

27 Literaturübersicht 2.3 Vitamin B 12 Vitamin B 12 weist in vielerlei Hinsicht Besonderheiten innerhalb der Gruppe der Vitamine auf. So ist es das letzte Vitamin, welches entdeckt wurde. Seine Isolierung erfolgte erst im Jahre 1948, aber bereits lange vor seiner Entdeckung gab die Substanz Anlass zu Forschungen. Bereits im Jahre 1926 stellten MINOT und MURPHEY fest, dass der damals als Antiperniziosa-Faktor bezeichnete Bestandteil im rohen Lebergewebe dazu benutzt werden konnte, beim Menschen die pernizinöse Anämie zu heilen. Nach Aufklärung der Strukturformel (HODGKIN et al., 1955; Abb. 2) konnte eine Reihe von Eigenschaften am Molekül festgestellt werden, die es von anderen Vitaminen unterscheidet. Abbildung 2: Strukturformel des Vitamin B 12 -Moleküls (nach SMITH, 1997) So weist das Vitamin B 12 -Molekül im Vergleich zu anderen Vitaminen eine recht komplizierte Molekülstruktur auf, was auch durch das Molekulargewicht von 1355 deutlich wird und mit dem Kobalt-Atom als Zentralatom hat es als einziges Vitamin ein Metallzentralatom. Der Anteil des Kobalts am Gesamtmolekül beträgt 4,35% (UNDERWOOD, 1975; YOUNG, 1979). Bei der chemischen Grundstruktur der Cobalamine handelt es sich um ein Corrinringsystem aus vier teilweise hydrierten Pyrrolringen. In diesem Corrinring ist das Kobalt-Atom als dreiwertiges Kobalt über vier Bindungen fest eingebunden (FRIEDRICH, 1987; BUDDECKE, 1994). Darüber hinaus liegen am Kobalt-Atom noch zwei weitere Bindungen vor, wobei in α-position eine 5,6 Dimethylbenzimidazol-Gruppe gebunden ist. Der Ligand in β-position (Abb. 2: R ) ist verantwortlich für die chemischen und biochemischen Eigenschaften des Cobalamins (FRIEDRICH, 1987). Bei den vier am häufigsten 9

28 Literaturübersicht vorkommenden Vitamin B 12 -Verbindungen handelt es sich um eine 5 Desoxyadenosyl-, Methyl- oder Hydroxy-Gruppe sowie Wasser in β-stellung (REHNER und DANIEL, 1999; FRIEDRICH, 1987), so dass die entstehenden Verbindungen Adenosyl-, Methyl-, Hydroxooder Äquocobalamin sind. Bei der als Cyanocobalamin bezeichneten Verbindung handelt es sich vermutlich nicht um eine physiologisch wirksame Verbindung, bei der der entsprechende Ligand eine Cyano-Gruppe ist (FRIEDRICH, 1987; SEETHARAM und ALPERS, 1982; SCOTT, 1999). Als Cobalamin-Analoga werden solche Verbindungen bezeichnet, die eine andere Gruppe als 5,6 Dimethylbenzimidazol an α-position des Kobalt-Atoms aufweisen (FRIEDRICH, 1987; McDOWELL, 2000). Diese haben im Stoffwechsel höherer Tiere keine Bedeutung, da sie keine Co-Enzymfunktion ausüben (KÜNEMUND, 1977: ELLIOT, 1979). 2.4 Vitamin B 12 -Synthese im Pansen Kobalt wird als essentielles Spurenelement für alle Säugetiere bezeichnet. Während jedoch die meisten Säugetiere das Kobalt in gebundener Form als Vitamin B 12 benötigen, sind die Wiederkäuer in der Lage das Kobalt in seiner elementaren Form zur mikrobiellen Vitamin B 12 -Synthese zu verwerten (LATTEUR, 1962; SMITH, 1987). Vitamin B 12 wird ausschließlich von Bakterien, Blaualgen und einigen Hefearten produziert (FRIEDRICH, 1987; SMITH, 1987). Eine Synthese im Stoffwechsel höherer Organismen ist nicht möglich, weshalb den meisten Säugetieren Vitamin B 12 mit der Nahrung zugeführt werden muss. Aus diesem Grund erfolgte die Einordnung der Cobalamine in die Gruppe der Vitamine, die per definitionem lebensnotwendige Stoffe und in kleinsten Mengen wirksam sind. Futtermittel pflanzlicher Herkunft enthalten kein Vitamin B 12. Geringe Cobalamin-Mengen in Futtermitteln werden von McDOWELL (1992) auf eine Kontamination mit Bakterien bzw. Hefen zurückgeführt. Weil die beim Wiederkäuer im Pansen vorkommenden Bakterien unter strikt anaeroben Bedingungen Cobalamine synthetisieren können (COSTIGAN und GERDES, 1991), spricht man beim Wiederkäuer anstelle eines Vitamin B 12 -Bedarfs vom Kobalt-Bedarf, wobei es sich im engeren Sinne um den Kobalt-Bedarf der Pansen-Bakterien handelt. Von der Vielzahl der im Pansen auftretenden Bakterienstämme sind jedoch nur wenige in der Lage, Vitamin B 12 zu bilden. DRYDEN et al. (1962) konnten unter 48 im Pansen auftretenden Bakterienstämmen nur 8 ermitteln, die Cobalamine oder deren Analoga synthetisieren. Vitamin B 12 -Produzenten sind zum Beispiel manche Nocardia-, Streptomyces- und Bacillusarten sowie Propionsäurebakterien (BENDER, 1970; ZAGALAK, 1982). Letztere zählen zu den aktivsten Vitamin B 12 -Bildnern, wobei besonders Propionibacterium shermanii zu erwähnen ist, das auch zur industriellen Herstellung von Cobalaminen verwendet wird (STÀRKA, 1968; FRIEDRICH, 1987). Die im Pansen vorkommenden Protozoen können kein Vitamin B 12 10

29 Literaturübersicht synthetisieren. Sie sind wie der Wiederkäuer auf das von den Bakterien produzierte Vitamin B 12 angewiesen (LATTEUR, 1962). Hohe Kobalt-Konzentrationen senkten in Versuchen von KISIDAYOVÀ et al. (2001) sogar die Anzahl an Protozoen. Ob von Protozoen aufgenommenes Cobalamin für den Wiederkäuer noch zur Verfügung steht, ist bislang ungeklärt. Der Zusammenhang zwischen Kobalt und Vitamin B 12 wurde schon kurz nach der Entdeckung des Vitamins noch vor Aufklärung seiner Struktur in einer Reihe von Versuchen nachgewiesen. Verschiedene Autoren (HALE et al., 1950; HINE und DAWBARN, 1954; KERCHER und SMITH, 1956) stellten fest, dass die Konzentration des Vitamin B 12 im Panseninhalt von der Anwesenheit von Kobalt in der Ration abhängig ist. Da hierbei jedoch keine konkreten Angaben zur erforderlichen Kobalt-Menge für die Cobalamin-Synthese gemacht werden konnten, wurden weitere Versuche durchgeführt. Eine umfangreiche Arbeit stellt in diesem Zusammenhang die von SMITH und MARSTON (1970a) durchgeführte Untersuchung zur Produktion, Absorption und Exkretion von Vitamin B 12 beim Schaf dar. Hierbei wurden in einem Stoffwechselversuch pansenfistulierte Australische Merinoschafe mit einer kobaltarmen Grundration ernährt. Während eine Gruppe ohne Supplementierung blieb, wurde der anderen Gruppe täglich oral 1 mg Kobalt (als Kobalt-Chlorid) in Wasser gelöst eingegeben. Abbildung 3 zeigt die Vitamin B 12 -Konzentration im Panseninhalt innerhalb der ersten 8 Stunden nach Kobalt-Gabe. Hierbei wurde die erste Probe unmittelbar nach Kobalt-Gabe entnommen. µg Vitamin B12/g Panseninhalt frisch µg Vitamin B12/g Panseninhalt trocken Stunden nach Kobalt-Applikation Abbildung 3: Vitamin B 12 -Konzentration im Panseninhalt von Schafen mit bzw. ohne Kobalt-Zulage (n=2) (nach SMITH und MARSTON, 1970a) 11

30 Literaturübersicht Aus Abbildung 3 ist ersichtlich, dass nach Zulage von Kobalt die Vitamin B 12 -Konzentration deutlich höher ist als ohne Kobalt-Zulage. Offensichtlich setzt die Vitamin B 12 -Synthese unmittelbar nach Kobalt-Gabe ein, fällt aber bis etwa 4-6 Stunden nach der Fütterung auf das Produktionsminimum. In einem weiteren Versuch erhielten zwei Tiere zunächst über 16 Wochen täglich oral 1 mg Kobalt. Danach entfiel die tägliche Kobalt-Zulage, woraufhin innerhalb von 5 Tagen die aus den im Panseninhalt gemessenen Konzentrationen geschätzte tägliche Vitamin B 12 - Produktion von µg/tag auf ungefähr 50 µg/tag fiel. Über die weiteren 115 Tagen wurde dieses Produktionsniveau beibehalten (Abbildung 4). Die Schätzung der Vitamin B 12 - Produktion erfolgte mittels Markermethode unter Verwendung von Lignin als Markersubstanz. Vitamin B12-Produktion (µg/tag) Tage nach Kobalt-Entzug Abbildung 4: Vitamin B 12 -Produktion im Pansen von Schafen nach Absetzen einer täglichen Co-Gabe von 1 mg/d (nach SMITH und MARSTON, 1970a) HALE et al. (1950) sowie HINE und DAWBARN (1954) stellten die These auf, dass Kobalt bei geringerer Verfügbarkeit im Pansen effizienter zur Vitamin B 12 -Synthese genutzt wird, was SMITH und MARSTON (1970a) bestätigten. Sie leiteten aus ihren Versuchen ab, dass es einen nahezu linearen Zusammenhang zwischen dem in Form von Vitamin B 12 gebundenen Kobalt (%) und der Kobalt-Konzentration im Panseninhalt gibt. So wurde bei Tieren mit Kobalt-Mangel etwa 15 % des Kobalts zu Vitamin B 12 umgewandelt, während es bei Tieren, die 1 mg Co/d erhielten nur etwa 3 % waren. In Abbildung 5 ist diese Beziehung dargestellt, wobei Lignin als Marker diente. 12

31 Literaturübersicht Anteil des Co im Vitamin B12 (%) µg Co/g Lignin Abbildung 5: Beziehung zwischen der Kobalt-Konzentration im Panseninhalt von Schafen und dem Prozentsatz, der als Vitamin B 12 vorliegt (nach SMITH und MARSTON, 1970a) SINGH und CHHABRA (1995) stellten in einem Versuch mit pansenfistulierten Rindern fest, dass der Kobalt-Gehalt in der Ration einen signifikanten (p<0,01) Einfluss auf die Vitamin B 12 -Konzentration im Panseninhalt hatte. Bei höheren Kobalt-Gehalten in der Ration konnte auch ein Anstieg der Vitamin B 12 -Konzentration im Panseninhalt festgestellt werden. Es wurde jedoch beobachtet, dass nur bei Kobalt-Gehalten bis 0,37 mg Co/kg T ein linearer Zusammenhang zwischen Kobalt-Zulage und Vitamin B 12 -Konzentration bestand. Bei einer weiteren Erhöhung der Kobalt-Gaben konnte kein entsprechender Zusammenhang mehr festgestellt werden. Da das Verhältnis der einzelnen Bakterienarten im Pansen zueinander und die Gesamtzahl der Pansenmikroorganismen von der jeweiligen Rationsgestaltung abhängen, kann es auch bei ausreichender Kobalt-Versorgung zu einer Einschränkung der Vitamin B 12 -Synthese kommen (WALKER und ELLIOT, 1972; GIRARD, 1998). Die Effizienz der Vitamin B 12 -Synthese ist demnach nicht nur von der Menge an verfügbarem Kobalt sondern auch von weiteren Faktoren, wie Rohfasergehalt in der Ration und der Höhe der Trockensubstanzaufnahme abhängig (SMITH und MARSTON, 1970a; WALKER und ELLIOT, 1972; HEDRICH et al., 1973). Es gibt Hinweise, dass bei kraftfutterreicher Fütterung prozentual weniger Vitamin B 12 synthetisiert wird (WALKER und ELLIOT, 1972; HALPIN et al., 1984). Gleichzeitig fördern Rationen mit hohem Kraftfutteranteil die Produktion von Propionsäure (BAUMAN et al., 1971; LEBZIEN, 1980). Da Vitamin B 12 für den Abbau von Propionat benötigt wird (Kapitel 2.7.1), kommt es zusätzlich zu einem Anstieg des Vitamin B 12 -Bedarfs sowohl der Bakterien als auch des Wirtes. 13

32 Literaturübersicht Die meisten Vitamin B 12 synthetisierenden Bakterien bilden gleichzeitig auch unwirksame Analoga (Kap. 2.3). Bei Veränderung der Rationszusammensetzung kann auch das Verhältnis von Vitamin B 12 zu den Analoga verschoben werden. Panseninhalte von Kühen (WALKER und ELLIOT, 1972) und Schafen (BIGGER et al., 1976), die kraftfutterreiche, rohfaserarme Rationen erhielten, wiesen signifikant höhere Analoga-Konzentrationen auf als solche von Tieren mit dominierendem Grundfuttereinsatz. Einen weitaus größeren Einfluss als die Zusammensetzung der Ration hat in Bezug auf die Synthese der Analoga der Kobalt-Gehalt in den Futtermitteln. Während bei einem Kobalt- Gehalt von 0,34 mg/kg T 35 % der Cobalamine vitaminwirksam sind, liegt dieser Anteil bei einer Kobalt-Versorgung mit 0,04 mg/kg T in der Ration bei 63% (GAWTHORNE, 1970a). Diese in-vivo-ergebnisse konnten in einem in-vitro-versuch bestätigt werden (GAWTHORNE, 1970b). Warum es zur verstärkten Bildung von Analoga bei höherer Kobalt-Zufuhr kommt, ist noch nicht bekannt. Als Ursache hierfür kommen nach GAWTHORNE (1970b) sowohl Verschiebungen in der Mikrobenpopulation als auch veränderte Produktionsmengen der Bakterien in Betracht. Auch eine Kombination aus beidem schließt er nicht aus. GALL et al. stellten 1949 bei Tieren mit Kobalt-Mangel eine deutlich reduzierte Anzahl an Mikroorganismen fest. Gleichzeitig war auch die Zahl der Bakterien-Arten reduziert. Es ist jedoch nicht bekannt, in wie weit Cobalamin-synthetisierende Arten davon betroffen sind. SINGH und CHHABRA (1995) konnten einen signifikanten Anstieg (p<0,05) der Bakterienund Protozoen-Population bei höheren Kobalt-Gehalten in der Ration nachweisen, wobei jedoch nur die Gesamtzahl betrachtet wurde. Im Gegensatz dazu stellten KISIDAYOVA et al. (2001) fest, dass bei hohen Kobalt-Gehalten in der Ration die Zahl der Protozoen (Ciliaten) signifikant reduziert ist. 2.5 Absorption, Exkretion und Speicherung von Vitamin B 12 Während der Mechanismus der Vitamin B 12 -Absorption beim Menschen weitestgehend aufgeklärt ist, wird dieser Vorgang beim Wiederkäuer im Allgemeinen und beim Rind im Speziellen in der Literatur sehr kontrovers diskutiert. Bei der Cobalamin-Absorption des Menschen wird zwischen der aktiven, durch verschiedene Co-Faktoren vermittelten Absorption und der Vitamin B 12 -Aufnahme durch Diffusion (FRIEDRICH, 1987; ELLENBOGEN und COOPER, 1991) unterschieden. Letztere findet im gesamten Dünndarm statt und spielt mit etwa 1 bis 2 % nur eine untergeordnete Rolle (ZAGALAK, 1982). Nach DONALDSON et al. (1967) wird ihre Effektivität beim Vorhandensein eines Intrinsic Factors stark eingeschränkt. Demgegenüber stellten einige Autoren (ELLENBOGEN und COOPER, 1991; SEETHARAM und ALPERS, 1991) fest, 14