Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Universität zu Köln Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M.

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1 Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Universität zu Köln Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Krönke Rep-PCR-basierte molekularbiologische Charakterisierung von MRSA im Vergleich zur Multilocus-Sequenztypisierung, SCCmec- Typisierung und spa-typisierung Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Annika Neumann aus Stuttgart Promoviert am 25. Juli 2012

2 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln, 2012

3 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg 1. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. H. Seifert 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Dr. h. c. H. Pfister Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistungen von Frau Danuta Stefanik, Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Harald Seifert und Dr. Paul Higgins erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Arbeit wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt und ist auch noch nicht veröffentlicht. Köln,

4 Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Erreger wurden ohne meine Mitarbeit aus Untersuchungsmaterialien isoliert, die im Klinikum der Universität zu Köln und umliegenden Krankenhäusern gewonnen wurden. Die Identifizierung erfolgte im Rahmen der Routinediagnostik im Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene anhand morphologischer und einfacher physiologischer Merkmale. Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente sind nach entsprechender Anleitung durch Herrn Dr. Paul Higgins und der medizinisch-technischen Assistentin Frau Danuta Stefanik von mir selbst ausgeführt worden. Die Auswertung wurde mit Unterstützung von Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Harald Seifert von mir selbst ausgeführt.

5 Danksagung Ich danke Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Harald Seifert für das Ermöglichen meiner Promotion am Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, das Bereitstellen des interessanten Themas, seine wissenschaftliche Beratung und freundliche Unterstützung bei der Durchführung der Dissertation. Außerdem möchte ich mich ganz herzlich bei Frau Danuta Stefanik für die hervorragende Einarbeitung im Labor und ihre stets vorhandene Hilfsbereitschaft bedanken. Herrn Dr. Paul Higgins danke ich für seine fachkundige Unterstützung auf allen Ebenen der Laborarbeit sowie für die Einführung in das wissenschaftliche Arbeiten. Seine Hilfe hat sehr zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen. Mein besonderer Dank gilt meiner Familie und meinen Freunden, die mich immer wieder motiviert und unterstützt haben und Geduld und Verständnis für mich hatten.

6 Meiner Familie

7 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Staphylococcus aureus Name und Definition Mikrobiologie Pathomechanismen MRSA Definition Resistenzmechanismen Entstehung verschiedener klonaler Linien von MRSA Epidemiologie und klinische Bedeutung von Staphylococcus aureus im Allgemeinen und MRSA Epidemiologie und klinische Bedeutung von S. aureus Epidemiologie und klinische Bedeutung von MRSA Therapie von Infektionen mit Staphylococcus aureus Eradikation von MRSA Methoden zur Typisierung von MRSA Phänotypische Verfahren Genotypische Verfahren Fragestellung Material und Methoden Untersuchungsgut Typisierung mittels rep-pcr DNA-Gewinnung... 33

8 2.2.2 Automatisierte rep-pcr Analyse der PCR-Produkte Ergebnisse Stammkollektiv Praktische Durchführung der Untersuchung DNA-Extraktion Rep-PCR Chip-Analyse Auswertung der Ergebnisse der Typisierung mittels DiversiLab Einfluss der PCR und verwendeter PCR-Geräte auf die Typisierungsergebnisse des DiversiLab-Systems Effekt der Verwendung unterschiedlicher Analyse-Chips und des Alters der PCR-Produkte auf die Typisierungsergebnisse des DiversiLab-Systems Korrelation der Ergebnisse der Typisierung mittels DiversiLab mit Ergebnissen der Multilocus-Sequenztypisierung, der mec-typisierung und der spa- Typisierung Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis Lebenslauf... Fehler! Textmarke nicht definiert.

9 Abkürzungsverzeichnis µm Mikrometer agr accessory gene regulator camrsa community aquired MRSA CC - Clonal Complex EMRSA - endemische MRSA hamrsa - hospital acquired MRSA IMMIH Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene MHK - minimale Hemmkonzentration MLST - Multilocus Sequenztypisierung MRSA Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus MSSA Methicillin-sensibler Staphylococcus aureus NNIS - National Nosocomial Infections Surveillance System NRZ - Nationales Referenzzentrum für Surveillance von nosokomialen Infektionen PBP - Penicillin-Bindeprotein PCR Polymerase-chain-reaction, Polymerase-Kettenreaktion PFGE Pulsfeld-Gelelektrophorese PVL - Panton-Valentine Leukocidin rep-pcr - repetitive-sequence-based PCR S. Staphylococcus ST Sequenz-Typ UPGMA - unweighted pair group method with arithmetic mean

10 Einleitung 1. Einleitung Vorweg sei bemerkt, dass es hinsichtlich der Betrachtung von Staphylococcus aureus und MRSA nicht immer möglich ist, selbige gänzlich voneinander abzugrenzen, da diese in der Literatur häufig gemeinsam abgehandelt werden. Aus diesem Grund werden S. aureus und MRSA in den folgenden einleitenden Kapiteln teilweise gemeinsam beschrieben. Wenn immer es die Literatur erlaubt, erfahren sie jedoch eine gesonderte Betrachtung. 1.1 Staphylococcus aureus Name und Definition Staphylococcus aureus verdankt seinen Namen seiner kugeligen Gestalt aus einzelnen Zellen (gr. staphyle = Einzelzelle), welche meistens traubenförmig angeordnet sind und in Kultur eine charakteristische goldgelbe Färbung aufweisen (lat.: aureus = gold). Es handelt sich dabei um unbewegliche gram-positive Bakterien mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1,5 µm, welche keine Sporen bilden (Murray et al. 2007)(Kap.28,S.390) Mikrobiologie Staphylokokken sind stets Katalase-positiv. Die Abgrenzung von S. aureus zu anderen Staphylokokken, wie zum Beispiel S. epidermidis, S. saprophyticus oder S. hominis erfolgt durch den Koagulase-Test. Das Enzym Koagulase kann heparinisiertes Blutplasma zum Gerinnen bringen und ist bei S. aureus positiv. Bei den anderen Staphylokokken spricht man deshalb von Koagulase-negativen Staphylokokken. Baretti et al. konnten in einer Studie an Patienten mit Peritonealdialyse-assoziierter Peritonitis 1

11 Einleitung zeigen, dass Infektionen mit S. aureus ein schlechteres Outcome als Infektionen mit Koagulase-negativen Staphylokokken haben (Barretti et al. 2009). Die Spezies S. aureus ist fakultativ anaerob, es existiert aber eine Subspezies, als S. aureus subsp. anaerobius bezeichnet, welche ausschließlich anaerob wächst und erst in Subkulturen eine gewisse Aerotoleranz entwickelt (de la Fuente et al. 1985). In Kultur wird neben dem typischen Wachstum mit kleinen rundlichen, gelb-weißen Kolonien mit Hämolysezone die sogenannte Small-Colony-Variante beschrieben. Letztere zeichnet sich durch winzige, nicht-pigmentierte Kolonien ohne Hämolysezone aus (Murray et al. 2007) (Kap.28, S.390). Das Genom von S. aureus umfasst etwa 2,8 Millionen Basenpaare, wovon 32 % aus Guanin und Cytosin bestehen. Neben einem zirkulären doppelsträngigen Chromosom werden auch Plasmide beschrieben (Murray et al. 2007) (Kap.28,S.390). Durch molekulare Techniken können verschiedene klonale Linien innerhalb der Spezies S. aureus unterschieden werden (Feil et al. 2003) Pathomechanismen S. aureus besitzt zahlreiche Virulenzfaktoren. Das extrazelluläre Enzym Koagulase, welches S. aureus von anderen Staphylokokken abgrenzt, bindet im Serum an Prothrombin und aktiviert die Bildung von Fibrin aus Fibrinogen. Der Zellwand-ständige Clumpingfaktor, ebenfalls ein Enzym, bewirkt die Ausfällung von Fibrin und hat deshalb ähnliche Effekte. Einige Stämme besitzen eine Polysaccharidkapsel, welche S. aureus vor der Phagozytose durch Abwehrzellen schützt. Auf ihrer Oberfläche besitzen fast alle S. aureus Stämme Protein A. An dieses binden Immunglobuline mit ihrem F c - Fragment, wodurch letzteres nicht mehr als Rezeptor für Makrophagen zur Verfügung steht und somit wiederum einen Phagozytoseschutz für das Bakterium darstellt. Intrazelluläres Adhäsin bildet die Grundlage für die Bildung von Biofilm, in welchem Mikrokolonien wachsen und vor Abwehrzellen sicher sind. 2

12 Einleitung Intrazelluläre Virulenzfaktoren sind Fibrinolysin, Hyaluronidase, Hämolysine, Leukocidin, Exfoliatintoxine, Enterotoxine und schließlich das Toxic shock syndrome Toxin. Mittels Fibrinolysin kann S. aureus selbst erzeugte Fibringerinnsel wieder auflösen und sich dann im Gewebe verbreiten. Auch die Hyaluronidase dient der besseren Ausbreitung im Wirtsgewebe, in dem Interzellularsubstanzen aufgelöst werden. α-, β-, γ- und δ-hämolysin lösen Erythrozyten und Parenchymzellen auf. Leukocidin stellt ein wichtiges Exotoxin dar, welches Makrophagen und Granulozyten durch Porenbildung in deren Zellmembran schädigt. Das Panton-Valentine Leukocidin (PVL) gilt als Marker für camrsa (Tristan et al. 2007) und wird durch die beiden Gene lukf-pv und luks-pv kodiert (Prevost et al. 1995). Durch PVL-positive camrsa werden vor allem Furunkel, Ulcera, schwere nekrotisierende Hautinfektionen, Leukopenie und nekrotisierende Pneumonien verursacht (Nastaly et al. 2010). Die Exfoliatine A und B sind relativ selten. Sie wirken epidermolytisch und führen zu einer blasenförmigen Abhebung der Haut (Staphylococcal Scalded Skin Syndrome). Wenige Stämme können die Enterotoxine A-E bilden. Diese Toxine sind sehr hitzestabil und verursachen Lebensmittelvergiftungen (Hof 2005). Genauso wie das Toxic Shock Syndrome Toxin (TSST-1) haben sie Eigenschaften wie Superantigene und wirken pyrogen (Dinges et al. 2000). TSST-1 stimuliert Lymphozyten zur Produktion von Zytokinen. Das Toxic Shock Syndrome ist gekennzeichnet durch hohes Fieber, ein großflächiges Erythem mit Desquamation der Haut, Hypotension und Schädigung mehrerer Organsysteme (Chesney 1989). In MRSA Isolaten von Personen mit invasiven Infektionen konnten bestimmte Gene signifikant häufiger nachgewiesen werden als in Isolaten lediglich mit S. aureus besiedelter Personen. Hierbei handelt es sich um fnba, cna, sdre, sej, eta, hlg und ica. Diese Gene kodieren für Virulenzfaktoren wie Zellwand-assoziierte Adhäsine (fnba, cna und sdre) und verschiedene Toxine (sej, eta, hlg und ica), beispielsweise das oben genannte Enterotoxin A (sej). Man vermutet einen kumulativen Effekt dieser einzelnen Virulenzfaktoren (Peacock et al. 2002). 3

13 Einleitung 1.2 MRSA Definition MRSA bedeutet Methicillin-resistenter S. aureus. Diese Resistenz wurde erstmals 1960 festgestellt (Jevons et al. 1963). Da die Resistenz aber seit längerer Zeit weit über das Antibiotikum Methicillin und andere Betalaktam-Antibiotika hinaus geht, wird häufig auch der Begriff multiresistenter S. aureus angewandt Resistenzmechanismen Alle Antibiotika unterliegen bestimmten bakteriellen Resistenzmechanismen. Hierzu zählen die Bildung inaktivierender bakterieller Enzyme wie die Betalaktamasen, die Veränderung der bakteriellen Zielstruktur (Penicillin-Bindeprotein, PBP) und die Beeinträchtigung von Transportmechanismen durch eine Permeabilitätsminderung der äußeren Membran bei gram-negativen Bakterien. Bei S. aureus wird die Penicillinresistenz durch die Bildung einer bestimmten Betalaktamase, auch Penicillinase genannt, vermittelt. Diese inaktiviert durch hydrolytische Spaltung des Betalaktamrings das Wirkzentrum des Penicillins. Das Antibiotikum wird bereits vor Erreichen des Penicillin-Binde-Proteins in seiner Wirkung ausgeschaltet. Diesem Mechanismus wird in der Praxis durch Zugabe eines Betalaktamaseinhibitors zum Penicillin vorgebeugt. Gängige Kombinationen sind Amoxycillin + Clavulansäure, Ampicillin + Sulbactam und Piperacillin + Tazobactam. Einzig die Isoxazolylpenicilline Oxacillin, Dicloxacillin und Flucloxacillin sind Penicillinase-stabil und werden daher als Staphylokokken-Penicilline bezeichnet. Auch nicht betroffen von dieser Art der Resistenz sind andere Penicillinase-feste Betalaktam-Antibiotika wie einige Cephalosporine und Carbapeneme. Der Mechanismus der Methicillinresistenz bei S. aureus kommt hingegen durch eine verminderte Affinität des Antibiotikums an das Zielmolekül zustande (Brown et al. 4

14 Einleitung 1980, Georgopapadakou et al. 1982, Hartman et al. 1981). Zielmoleküle der Betalaktam-Antibiotika sind Penicillin-Bindeproteine. Sowohl MSSA- als auch MRSA- Stämme produzieren 4 verschiedene PBPs. Betalaktam-Antibiotika binden normalerweise mit hoher Affinität kovalent an das aktive Zentrum der PBPs. Bei letzteren handelt es sich um membrangebundene Transpeptidasen (Cooper 1956, Suginaka et al. 1972), welche die Quervernetzung des Peptidoglycans der bakteriellen Zellwand katalysieren. Dies wird bei ausreichender Affinität des Antibiotikums zum PBP unterbunden, die Bakterienzellwand bleibt instabil und kann sich nicht vor Angriffen von außen schützen. Es kommt zum Absterben der Bakterienzelle. Bei MRSA liegt ein modifiziertes PBP2a vor. Dieses wird von dem meca Gen kodiert, welches auf dem sogenannten SCCmec (Staphylococcal Chromosomal Cassette) Fragment lokalisiert ist und ausschließlich bei Methicillin-resistenten S. aureus Stämmen zu finden ist (Ito et al. 1999). Bei SCCmec handelt es sich um ein großes DNA- Fragment, das in das Chromosom integriert ist (Katayama et al. 2000). PBP2a hat eine verminderte Affinität gegenüber Betalaktam-Antibiotika zur Folge, woraus die Resistenz gegenüber Betalaktam-Antibiotika resultiert (Pinho et al. 2001) Entstehung verschiedener klonaler Linien von MRSA Es gibt unterschiedliche Theorien zur Entstehung verschiedener MRSA-Stämme. Die erste basiert auf der Vorstellung, dass die verschiedenen MRSA-Stämme alle vom gleichen Klon abstammen. In einer Studie mit 472 Stämmen wurden meca-gene 6 verschiedener Typen nachgewiesen. Diese ließen sich, ausgehend von evolutionären Veränderungen in Form von Mutation, Deletion oder Insertion und daraus resultierenden Unterschieden in nur einem genetischen Element, in logischer Reihenfolge voneinander ableiten (Kreiswirth et al. 1993). Dem entgegen steht die Multi-Klon-Theorie, welche auf der Vorstellung basiert, dass ein SCCmec-Element in verschiedene klonale Linien von S. aureus eingebaut wurde. Musser et al. beschreiben zusätzlich zu der eben beschriebenen Single-Klon-Theorie den horizontalen Transfer und die Rekombination des meca-gens, was als Konsequenz zu der Assoziation von 5

15 Einleitung meca zu unterschiedlichen klonalen Linien von MRSA führt (Musser et al. 1992). Auch andere Autoren beschreiben diesen horizontalen Transfer und gehen davon aus, dass sich verschiedene MRSA-Stämme in mehreren voneinander unabhängigen Ereignissen aus mehreren verschiedenen MSSA-Stämmen entwickelt haben müssen (Enright et al. 2002, Fitzgerald et al. 2001). Die Theorie der Rekombination zwischen verschiedenen SCCmec-Elementen wird durch den Nachweis neu entstandener mec-typen bestätigt (Qi et al. 2005). 1.3 Epidemiologie und klinische Bedeutung von Staphylococcus aureus im Allgemeinen und MRSA Epidemiologie und klinische Bedeutung von S. aureus Vorkommen von S. aureus S. aureus ist in der Natur weit verbreitet und findet sich auf Haut und Schleimhäuten von Säugetieren und Vögeln (Murray et al. 2007) (Kap.28,S.392). Der Keim ist als Kommensale der physiologischen Körperflora des Menschen anzusehen und findet sich dort gehäuft auf der Hautoberfläche, vor allem in der Perianalregion, der Achselhöhle und der vorderen Nasenhöhle (Asensio et al. 1996). Die Besiedelung geht einer Erkrankung meist voraus (von Eiff et al. 2001). Einteilung der durch S. aureus verursachten Erkrankungen Durch S. aureus verursachte Erkrankungen können eingeteilt werden in Toxinvermittelte und nicht-toxin-vermittelte Erkrankungen. Zu den Toxin-vermittelten Erkrankungen zählen die Lebensmittelvergiftung, das Staphylococcal Scalded Skin Syndrome und das Toxic Shock Syndrome (Dinges et al. 2000). Als nicht-toxinvermittelte Erkrankungen werden häufig Haut-Weichteil-Infektionen, Atemwegsinfektionen, muskuloskelettale Infektionen, Sepsis und Endokarditiden 6

16 Einleitung erwähnt (Diekema et al. 2001, Fowler et al. 2005, Hidron et al. 2008). Letztere zählen zu den schwerwiegendsten Komplikationen bei S. aureus Bakteriämien. 35% aller ambulant erworbenen und sogar 44% aller nosokomial erworbenen Nativklappen- Endokarditiden werden durch S. aureus verursacht (Dietel 2008). S. aureus gilt somit inzwischen als der häufigste Erreger infektiöser Endokarditiden, wobei die Eintrittspforte meistens kutan ist (Hill et al. 2006). Das Outcome von Patienten mit Endokarditis, welche durch S. aureus verursacht wurde, ist bedeutend schlechter als das von Patienten mit Endokarditis durch andere Erreger (Miro et al. 2005). Epidemiologie von S. aureus bis in die 90er Jahre In den Jahren 1997 bis 1999 war S. aureus der wichtigste Erreger bei Haut-Weichteil- Infektionen, Bakteriämien und tiefen Atemwegsinfektionen. In den USA machte er bei den Haut-Weichteil-Infektionen 41,6% aller Erreger aus, bei den Bakteriämien 25,3% und bei den tiefen Atemwegsinfektionen 25,5%. Ähnliche Werte waren für Europa zu verzeichnen mit einem Anteil an 37,1%, 18,6% und 20,4% in Bezug zu den vorgenannten Infektionen (Diekema et al. 2001) bis 1999 untersuchten Miro et al infektiöse Endokarditiden bei Patienten mit und ohne Kunstklappen in den USA und Europa. Davon wurden 29,5% durch S. aureus verursacht. 50% dieser Stämme waren Methicillin-resistent (Miro et al. 2005). Unter 20 Episoden von infektiösen Endokarditiden bei Dialysepatienten in den Jahren 1983 bis 1997 wurden 8 (40%) durch S. aureus hervorgerufen (McCarthy et al. 2000). Laupland et al. fanden in den Jahren 1999 bis ,4 invasive S. aureus-infektionen pro Einwohner. Davon waren 46% nosokomiale Infektionen (Laupland et al. 2003). Epidemiologie von S. aureus im 21. Jahrhundert Auch für spätere Jahre sind ähnliche Zahlen in der Literatur zu finden. Eine Studie in den USA über den Zeitraum von knapp 2 Jahren ( ) zeigte, dass unter Gesundheitssystem-assoziierten bakteriellen Infektionen, worunter Katheterassoziierte Bakteriämien, Katheter-assoziierte Harnwegsinfektionen, Beatmungspneumonien und chirurgische Wundinfektionen zusammengefasst wurden, 7

17 Einleitung 15 % durch S. aureus verursacht wurden. Einzig Infektionen mit Koagulase-negativen Staphylokokken waren gleich häufig. Bei 24,4% der in diesem Zeitraum festgestellten beatmungsassoziierten Pneumonien und bei 30% der chirurgischen Wundinfektionen (SSI) wurde S. aureus nachgewiesen (Hidron et al. 2008). Kollef et al. untersuchten in einer groß angelegten Studie während der Jahre 2002 und 2003 in den USA die Prävalenz von S. aureus bei verschiedenen Pneumonieformen. Hierbei bildete S. aureus bei der ambulant erworbenen Pneumonie einen Anteil von 25,5% an allen gefundenen Erregern, bei der Gesundheitssystem-assoziierten Pneumonie von 46,7%, bei der nosokomial erworbenen Pneumonie von 47,1% und bei der beatmungsassoziierten Pneumonie von 42,5%. Die Gesundheitssystem-assoziierte Pneumonie wurde in dieser Studie definiert als Pneumonie, bei welcher innerhalb von 2 Tagen nach Aufnahme des Patienten ins Krankenhaus eine positive Bakterienkultur aus respiratorischem Material nachgewiesen werden konnte, und zusätzlich eines der folgenden drei Kriterien erfüllt wurde: 1) der betroffene Patient wurde aus einer anderen Gesundheitseinrichtung verlegt, 2) der betroffene Patient erhielt eine Langzeit-Dialysebehandlung oder 3) es bestand in den vorherigen 30 Tagen ein Krankenhausaufenthalt, wobei es sich aber nicht um eine beatmungs-assoziierte Pneumonie handeln konnte (Kollef et al. 2005). Eine große Studie mit insgesamt 1779 Endokarditiden in den USA, Europa, Australien, Neuseeland und Brasilien über die Jahre 2000 bis 2003 zeigte, dass 31,6% der Erkrankungen durch S. aureus verursacht wurden. 39,5% dieser S. aureus Endokarditiden waren im Krankenhausbereich entstanden. Außerdem waren hiervon 27,4% MRSA-Infektionen (Fowler et al. 2005). Ähnliche Zahlen für die Jahre 2001 bis 2006 beziehungsweise 2000 bis 2004 finden sich auch in anderen Veröffentlichungen (de Sa et al. 2010, Hill et al. 2007). Eine Studie über MRSA bei Haut-Weichteilinfektionen zeigte, dass MRSA bei 59% aller untersuchten 422 Patienten nachgewiesen werden konnte. Dabei war festzustellen, dass der PFGE-Typ USA 300 sogar zu 97% von MRSA-Stämmen gestellt wurde (Moran et al. 2006). 8

18 Einleitung Tabelle 1: Studien zur Epidemiologie von S. aureus Zeitraum Erkrankung S. aureus Land Autor, Jahr Kollektivgröße infektiöse Endokarditis bei Dialysepatienten Endokarditis bei Nativ- und Kunstklappen Haut-Weichteil-Infektion 40% aller Erreger USA Mc Carthy Episoden 29,5 % aller Erreger, davon 50% MRSA 41,6% aller Erreger USA + Europa Miro Fälle 2328 Fälle Bakteriämie 25,3% aller Erreger USA Fälle tiefe Atemwegsinfektionen 25,5% aller Erreger 6711 Fälle Diekema 2001 Haut-Weichteil-Infektion 37,1% aller Erreger 2371 Fälle Bakteriämie 18,6% aller Erreger Europa Fälle tiefe Atemwegsinfektionen 20,4% aller Erreger 2572 Fälle invasive Infektion mit S. aureus allgmein 28,4 Infektionen pro Einwohner, davon 46% nosokomiale Infektionen Kanada Laupland Einwohner Endokarditis 31,6% aller Erreger, davon 39,5% nosokomial und 27,4% MRSA USA, Europa, Australien, Neuseeland, Brasilien Fowler Fälle CAP 25,5% aller Erreger 2221 Patienten HCAP 46,7% aller Erreger 988 Patienten USA Kollef 2005 HAP 47,1% aller Erreger 835 Patienten Endokarditis VAP 42,5% aller Erreger 499 Patienten 27-37% aller Infektionen Belgien Hill Episoden Endokarditis 30% aller Infektionen USA de Sa Fälle Gesundheitssystem-assoziierte bakterielle Infektionen 15% aller Erreger Fälle darunter VAP 24,40% USA Hidron Fälle darunter SSI 30% 7025 Fälle Epidemiologie und klinische Bedeutung von MRSA Der Methicillin-resistente S. aureus zählt zu den wichtigsten pathogenen Erregern, die nosokomiale und ambulante Infektionen verursachen (Barber 1961, Emori et al. 1993, Ibelings et al. 1998, Steinberg et al. 1996). Er wurde erstmals in den späten 1960er Jahren in England und Dänemark nachgewiesen (Barber 1961, de Lencastre et al. 2000, Ibelings et al. 1998) wurden die ersten MRSA-Fälle in der früheren DDR beobachtet (Lenz et al. 1988), 1985 dann in der damaligen Bundesrepublik (Witte et al. 1986). Bis 1990 lag die Prävalenz von MRSA im deutschsprachigen Raum unter 3 %, 9

19 Einleitung 1995 bereits bei 12,9% (Kresken et al. 1999). Diesem Trend folgend lag sie 2001 bei 20,7 % (Kresken et al. 2004). Zwischen 1999 und 2002 war ein MRSA-Anteil von 13,8% an allen S. aureus-infektionen zu verzeichnen (Tiemersma et al. 2004). Nach Datenlage des Nationalen Referenzzentrums für Surveillance von nosokomialen Infektionen (NRZ) steigt die Gesamtinzidenzdichte (entspricht MRSA-Fälle pro 1000 Patiententage im Krankenhaus) von MRSA-Infektionen in Deutschland stetig. Betrug ihr Wert 2004 noch 0,63, lag sie 2010 bei 1,32 (NRZ 2011). Einteilung von MRSA In der Literatur sind verschiedene Einteilungen von MRSA zu finden. In den meisten Fällen wird zwischen MRSA Stämmen, die ambulant erworben wurden ( communityacquired MRSA oder community-associated MRSA, camrsa) und MRSA Stämmen, die nosokomial erworben wurden ( hospital-acquired MRSA oder hospitalassociated MRSA, hamrsa) unterschieden (Boucher et al. 2010, Kobayashi et al. 2009, Skov et al. 2009). Ursprünglich galten grundsätzlich alle Infektionen als nosokomial erworben oder healthcare-associated, wenn sie nach der Aufnahme ins Krankenhaus nachgewiesen wurde und es keinen Anhalt dafür gegeben hatte, dass die Infektion bereits bei Aufnahme bestand. Dies wurde für unterschiedlichste Krankheitsbilder im Hinblick auf das klinische Erscheinungsbild und den Nachweis der Erkrankung konkretisiert (Garner et al. 1988). Heute wird zur Unterscheidung zwischen nosokomial und ambulant erworben meistens der Zeitpunkt der Krankenhausaufnahme in Bezug zum Zeitpunkt des Nachweises der Infektion herangezogen. Dabei werden in den meisten Fällen Infektionen, die innerhalb von 48 h im Krankenhaus nachgewiesen wurden, als ambulant erworben, bzw. als communityacquired bezeichnet (Salgado et al. 2003). Diese Definition scheint jedoch mit den sich immer weiter entwickelnden medizinischen Möglichkeiten und der Verlagerung der Versorgung von immer mehr Patienten in den nicht-stationären Bereich unpräzise (David et al. 2008, Millar et al. 2007, Tacconelli et al. 2004). Bereits 2003 Haben Salgado et al. in einer Metaanalyse herausgefunden, dass ein Großteil der Patienten mit in den betreffenden Studien ausgewiesenen camrsa mindestens einen Gesundheitssystem-assoziierten Risikofaktor für eine MRSA-Infektion hatte. Die 10

20 Einleitung camrsa-prävalenz bei Patienten ohne Risikofaktoren betrug lediglich 0,24%. Deshalb haben die Autoren eine Unterscheidung in community onset MRSA jeweils mit und ohne Risikofaktoren vorgeschlagen. Hierbei wurde ausschließlich der Ort des Patienten bei Ermittlung der Infektion angeben und die Bezeichnung community-acquired umgangen, welche implizierte, dass der Ort der MRSA-Infektion sicher bekannt war (Salgado et al. 2003). Inzwischen wird die Bezeichnung community-onset healthcareassociated MRSA für Stämme benutzt, die bei Patienten auftreten, welche außerhalb des Krankenhauses erkranken, jedoch Kontakt zum Gesundheitssystem hatten (Hulten et al. 2006). Witte hat 2009 den analogen Begriff healthcare-associated community MRSA eingeführt (Witte 2009). Desweiteren wurde 2008 der Begriff livestockassociated MRSA (lamrsa) eingeführt, eine Bezeichnung für das Vorkommen von MRSA bei Masttieren. camrsa Vor allem Haut- und Weichteilinfektionen werden von camrsa hervorgerufen, jedoch wurden auch lebensbedrohliche Infektionen mit Bakteriämie und nekrotisierender Pneumonie beschrieben, dann oftmals auch in der Kombination mit der Trägerschaft des PVL-Gens (Francis et al. 2005, Fridkin et al. 2005, Gillet et al. 2002, Gonzalez et al. 2005, Mongkolrattanothai et al. 2003, Tinelli et al. 2009) wurden erstmals Fälle von Haut-Weichteilinfektionen durch camrsa bei ansonsten gesunden Aborigines in Australien beschrieben (Udo et al. 1993). Es folgte 2001 ein Bericht über camrsa bei Kindern mit Bakteriämie. Diese Kinder hatten vorher keinen Kontakt zu Bereichen des Gesundheitssystems (Chambers 2001). Neben der klinischen Definition von camrsa sind auch typische molekulare Eigenschaften für camrsa festgestellt worden. So haben die meisten camrsa-stämme in den USA den SCCmec-Typ IV (Baba et al. 2002). Desweiteren haben die meisten camrsa-isolate ein Allel für den akzessorischen Gen-regulator (agr) der Gruppe I oder III, außerdem verfügen 97% der camrsa-stämme über luks-pv und lukf-pv, welche für das PVL kodieren (Dufour et al. 2002, Tristan et al. 2007, Tsuji et al. 2007). Im Großen und Ganzen sind weltweit fünf klonale Linien für die meisten camrsa- Infektionen verantwortlich. Hierzu zählen (Diep et al. 2008): 11

21 Einleitung 1. der Midwest Clone, welcher in seiner klonalen Linie derer der bei oben erwähnten Aborigines isolierten Stämme entspricht und zum Multilocus Sequenz-Typ 1 (ST 1) gehört 2. der Southwest Pacific / Oceania Clone, zugehörig zu ST 30 und vorkommend vor allem in Australien, Griechenland, Mexico und den USA 3. der European Clone, welcher vor allem in Europa auftritt und dem ST 80 zugehörig ist 4. der Pacific Clone, welcher zum ST 59 gehört und insbesondere in den USA, in Taiwan und in Vietnam isoliert wurde 5. USA 300. Dieser Stamm gehört zum ST 8 und erhielt seinen Namen nach seinem PFGE-Muster. Die folgende Tabelle gibt Auskunft über die Häufigkeit verschiedener klonaler Linien von camrsa und deren Vorkommen bei bestimmten Krankheitsbildern in Deutschland im Jahr Tabelle 2: Klinische Herkunft und Zuordnung zu klonalen Linien/Gruppen von camrsa, basierend auf Einsendungen an das NRZ Auszüge aus (RKI 2009) klinische Herkunft ST001 ST005 ST008 ST22 ST30 ST059 ST080 ST152 ST617 Anzahl der Isolate Abszesse Furunkel, Panaritiden Wundinfektionen Follikulitis Phlegmone 1 Pneumonie 1 1 Septikämie nasale Besiedlung Summe Nach Datenlage des NRZ (Nationales Referenzzentrum für Surveillance von nosokomialen Infektionen), wurden von insgesamt 87 deutschen Isolaten im Jahr aus Haut- und Weichgewebeabszessen isoliert. Davon gehörten 32 dem ST 8 ( USA 300 ) und 27 dem ST 80 ( European Clone ) an. camrsa USA 300 ist in den USA 12

22 Einleitung überaus häufig und macht, je nach Autor, 57% bis 97% der MRSA-Isolate aus notfallmäßigen Krankenhausaufnahmen, zumeist wegen Haut- und Weichgewebsinfektionen, aus (Moran et al. 2006, Patel et al. 2007). Insgesamt ist in Deutschland ein Anstieg der Häufigkeit von camrsa ST8 und ein Rückgang von camrsa ST80 zu verzeichnen (Witte et al. 2007). Abbildung 1 zeigt, dass camrsa ST8 im gesamten Bundesgebiet vertreten ist. Abb 1: Auftreten von camrsa in Deutschland, basierend auf Einsendungen an das NRZ 2008 (RKI 2009) Das sporadische Auftreten anderer Stämme deutet darauf hin, dass es sich hierbei um aus dem Ausland eingeschleppte Fälle handeln könnte (RKI 2009). So tritt beispielsweise die klonale Linie camrsa ST 59 besonders häufig in Südostasien und China auf (Huang et al. 2007, RKI 2009, Wu et al. 2010, Yao et al. 2010). camrsa ST 1, auch bekannt als USA 400, ist zurzeit der zweithäufigste MRSA-Stamm in den USA. In Deutschland trat er 2008 nur 3 mal auf (RKI 2009). hamrsa Auch unter den hamrsa treten bestimmte klonale Linien besonders häufig und weit verbreitet auf (Witte et al. 2008) wurde dies in London erstmals beobachtet und 13

23 Einleitung die Nomenklatur der Epidemiestämme (endemische MRSA, EMRSA) eingeführt (Duckworth et al. 1988). Die häufigsten klonalen Linien von hamrsa mit den zugehörigen Sequenz-Typen, mec-typen und deren häufigsten spa-typen sind der folgenden Tabelle zu entnehmen. Tabelle 3: klonale Linien von hamrsa. Daten aus Deurenberg et al 2007 und RKI 2009 Klon ST SCCmec spa UK EMRSA-3 5 I 001, 002, 003, 010, 045, 053, 062, 105, 178, 179, 187, 214, 311, 319, 389, 443 New York / Japan 5 II 001, 002, 003, 010, 045, 053, 062, 105, 178, 179, 187, 214, 311, 319, 389, 443 Pediatric 5 IV 001, 002, 003, 010, 045, 053, 062, 105, 178, 179, 187, 214, 311, 319, 389, 443 Irish-1 8 II 008, 024, 064, 190, 206, 211 UK EMRSA-2/-6 8 IV 008, 024, 064, 190, 206, 211 UK EMRSA-15/Barnim 22 IV 002, 005, 022, 032, 223, 309, 310, 417, 420 UK EMRSA II 018, 253, 418, 419 Berlin 45 IV 004, 015, 026, 031, 038, 050, 065, 204, 230, 390 Rhein-Hessen- 225 II 3 Epidemiestamm Southern Germany 228 I 001, 023, 041, 188, 201 Brazilian/Hungarian 239 III 030, 037, 234, 387, 388 Iberian/Norddeutscher 247 I 008, 051, 052, 054, 200 Epidemiestamm Archaic 250 I 008, 009, 194 Seit mehr als 10 Jahren wird beobachtet, dass sich die Häufigkeit des Auftretens bestimmter hamrsa-stämme an verschiedenen Orten immer wieder verändert (Witte et al. 2001). 14

24 Einleitung In Deutschland ist derzeit der sogenannte Barnim-Epidemiestamm (ST 22) am häufigsten, gefolgt vom Rhein-Hessen-Epidemiestamm (ST 225). Beide Stämme sind nahezu im gesamten Bundesgebiet vertreten. Unter den im Jahr 2008 erfolgten 898 Einsendungen an das NRZ stammten 464 (51%) Isolate aus Wundinfektionen, 138 (15%) aus Beatmungspneumonien, 95 (11%) aus Bakteriämie oder Sepsis und 89 (10%) aus Harnwegsinfektionen (RKI 2009), was der allgemeinen Epidemiologie von S. aureus Infektionen entspricht. Eine Differenzierung dieser Stämme ergab, dass unter allen genannten Infektionsarten Stämme des klonalen Komplex 22 (CC 22) und dem Barnim-Epidemiestamm entsprechend, am häufigsten auftraten (RKI 2009). (Eine genaue Erklärung des Begriffs klonaler Komplex oder Clonal Complex erfolgt in dieser Arbeit im Abschnitt unter Multilocus- Sequenztypisierung.) Einen Überblick über die aktuelle Verbreitung von Epidemiestämmen in Deutschland gibt Abbildung 2. Abb. 2: Verbreitung von MRSA-Epidemiestämmen, basierend auf Einsendungen an das NRZ 2008 (RKI 2009) 15

25 Einleitung Abhängig von klinischen Disziplinen sind Infektionen mit hamrsa unterschiedlich häufig. Im Vordergrund stehen Infektionen bei Intensiv-pflichtigen Patienten und Patienten der Inneren Medizin, gefolgt von Patienten der Chirurgie und der Neurologie (RKI 2009). Die meisten hamrsa gehören zur agr-gruppe II. In vielen hamrsa-stämmen ist der agr locus herunter reguliert. Dies ist assoziiert mit einer intermediären Sensibilität bzw. Resistenz dieser Stämme gegenüber Vancomycin und persistierenden Bakteriämien (Fowler et al. 2004, Sakoulas et al. 2003). Resistenzen von camrsa und hamrsa Im Allgemeinen haben hamrsa ausgeprägtere Antibiotika-Resistenzen als camrsa. So beschreiben Huang et al. in einer Studie mit 127 camrsa-stämmen und 147 hamrsa- Stämmen aus Sacramento in Kalifornien, dass 100% aller camrsa sensibel gegenüber Gentamicin, Rifampicin, Vancomycin und der Kombination aus Trimethoprim und Sulfamethoxazol waren, 96% gegenüber Clindamycin, 80% gegenüber Tetracyclin, 53% gegenüber Ciprofloxacin und nur 7% gegenüber Erythromycin. Bei den hamrsa liegen Werte von 100% nur für Vancomycin vor, gefolgt von Gentamicin, Tetracyclin, Rifampicin und der Kombination aus Trimethoprim und Sulfamethoxazol mit 98% sowie von Clindamycin mit 48%. Nur 14% aller hamrsa waren sensibel gegenüber Ciprofloxacin und nur 8% gegenüber Erythromycin. Ein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Resistenzraten von hamrsa und camrsa wurde für Clindamycin und für Ciprofloxacin festgestellt (Huang et al. 2006). Ähnliche Resistenzraten für camrsa und dessen vorherrschenden Stamm USA 300 werden auch von Moran et al. beschrieben (Moran et al. 2006). Außerdem findet sich in der Literatur eine Studie aus Detroit mit ebenfalls ähnlichen Resistenzraten von camrsa und hamrsa wie den zuvor beschriebenen (Tsuji et al. 2007). Für die Situation in Deutschland liegen Daten des Robert-Koch-Instituts vor. Hier wiegen andere klonale Linien vor als in den USA, welche aktuell ein etwas günstigeres Resistenzprofil aufweisen. 45% aller in Deutschland isolierten camrsa sind resistent gegen Erythromycin. Zu 100% betroffen von dieser Resistenz sind camrsa ST 8, USA 300, welche zusätzlich häufig gegen Clindamycin, Ciprofloxacin und Moxifloxacin 16

26 Einleitung resistent sind. Weitere Resistenzen existieren gegen Oxytetrazyklin, Fusidinsäure- Natrium und zu sehr geringem Anteil gegen Mupirocin, wobei hierbei vor allem camrsa ST 80 betroffen sind. Gegen die bei Haut-/Weichteilinfektionen häufig angewandten Antibiotika Cotrimoxazol, Rifampicin und Linezolid lag bis Ende 2008 unter den camrsa keine Resistenz vor (RKI 2009). Anders verteilt sind die Häufigkeiten von Resistenzen deutscher hamrsa-isolate gegen bestimmte Antibiotika. Während hohe Resistenzraten bei den Fluorchinolonen Ciprofloxacin und Moxifloxacin sowie dem Makrolid Erythromycin und bei Clindamycin auftreten, gibt es eine Reihe von Antibiotika, bei denen der Anteil der resistenten Stämme unter 10 % liegt. Bis Ende des Jahres 2008 wurde keinerlei Resistenz gegen Glycopeptide und Tigecyclin festgestellt. Auch Fusidinsäre, Rifampicin und Fosfomycin wiesen bis zu diesem Zeitpunkt noch gering ausgeprägte Resistenzen auf. Zum Vergleich der unterschiedlichen Antibiotika-Resistenz zwischen camrsa und hamrsa in Deutschland dient die folgende Abbildung. Abb. 3: Häufigkeit der Resistenz gegen Antibiotika von camrsa und hamrsa, basierend auf Einsendungen an das NRZ In Anlehnung an (RKI 2009) Teicoplanin Vancomycin Mupirocin Daptomycin Tigecyclin Linezolid Fosfomycin Fusidinsäure-Natrium Cotrimoxazol Rifampicin Oxytetracyclin Gentamicin Clindamycin Erythromycin Moxifloxacin Ciprofloxacin Oxacillin hamrsa camrsa 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 17

27 Einleitung Übertragung von MRSA Die Problematik der Übertragung von MRSA in medizinischen Einrichtungen wird immer wieder diskutiert. Grundsätzlich ist eine Übertragung von Erregern vom Patienten auf das Personal, aber auch umgekehrt möglich. Hierbei können kontaminierte Materialien, wie beispielsweise medizinische Instrumente, die Vektoren darstellen. Häufiger jedoch geschieht die Übertragung durch direkten Kontakt zwischen Patient und medizinischem Personal. Vonberg et al untersuchten 191 MRSA- Ausbrüche innerhalb der Jahre 1966 bis Unter diesen gingen 11 Ausbrüche von Beschäftigten im Gesundheitssektor aus. In 8 von 11 Fällen waren diese Beschäftigten infiziert, in den anderen 3 nur besiedelt (Vonberg et al. 2006). Im Allgemeinen ist die Besiedelung von medizinischem Personal mit MRSA ist in den meisten Fällen nur vorübergehend (Kappstein 2006). Ausgehend von einer Besiedelung des Nasenvorhofs können auch weitere Regionen wie die Axillen, der Rachen, die Perianalregion und vor allem die Hände besiedelt sein. Gesundheitsökonomische Bedeutung von MRSA Resch et al. veröffentlichten 2009 eine retrospektive Studie, in der sie Patienten mit MRSA-Infektion mit Patienten mit ähnlichen Krankheitsbildern ohne MRSA-Infektion verglichen. Sie konnten zeigen, dass Patienten mit MRSA-Infektion im Durchschnitt 11 Tage länger hospitalisiert sind, zu 7% häufiger maschinell beatmet werden müssen, eine um 7% höhere Mortalität aufweisen, und signifikant höhere Gesamtkosten verursachen. Diese höheren Kosten entstehen entweder durch den längeren Krankenhausaufenthalt, höhere Kosten pro Krankenhaustag oder beides (Resch et al. 2009). Infektionen mit S. aureus werden also zu einer immer größeren Last für das Gesundheitssystem und schöpfen die vorhandenen Ressourcen immer weiter aus (Chu et al. 2005). Verbreitung von MRSA in Europa Die Prävalenz von MRSA ist in den nördlich gelegenen Ländern Europas weitaus niedriger als im Süden, was unter anderem in einer Studie von Tiemersma et al. 18

28 Einleitung herausgearbeitet wurde. Hier zeigte sich in den Jahren 1999 bis 2002 beispielsweise in den skandinavischen Ländern ein Anteil von nur 0,6% bis 1,0% an allen S. aureus Infektionen, in Kroatien, Italien, Malta, oder Griechenland dagegen von 36,7% bis 44,4% (Tiemersma et al. 2004). Seit 2008 zeigt sich insgesamt ein Trend in Richtung eines abnehmenden oder sich zumindest stabilisierenden Anteils von MRSA an allen S. aureus Infektionen. Obwohl der MRSA-Anteil noch in 10 Ländern über 25% liegt, scheint sich das Problem in vielen Ländern langsam zu verringern. Die stetigste Abnahme des MRSA-Anteils ist in Frankreich zu verzeichnen. Lag er 2001 bei ca. 33%, wird er im Jahr 2008 nur noch mit knapp 25% und 2009 mit ungefähr 22,5% angegeben. Auch in Österreich, Lettland, Bulgarien, Zypern, Griechenland und England ist der Trend rückläufig, wohingegen in Slovenien, Tschechien, Spanien, Malta und Portugal der Anteil an Methicillinresistentem S. aureus weiter steigt (EARSS 2008, ECDC 2010). Einen Überblick über den Anteil von MRSA an allen S. aureus Bakteriämien in Europa gibt die Abbildung 4. Abb. 4: Staphylococcus aureus: Anteil der Methicillin resistenten-isolate in Europa, 2009 (ECDC 2010). 19

29 Einleitung Verbreitung von MRSA in Nordamerika In Kanada wurden im Jahre 2003 insgesamt Krankenhauseinweisungen wegen Infektionen mit MRSA verzeichnet (Laupland et al. 2003). Klevens et al. untersuchten in den Jahren 2004 und Fälle invasiver MRSA-Infektionen in den USA. Die meisten dieser Fälle waren Gesundheitssystem-assoziiert. 58,4 % traten außerhalb des Krankenhauses, 26,6% während einer Hospitalisierung auf. 13,7 % waren camrsa, und 1,3 % der Infektionen konnten nicht klassifiziert werden (Klevens et al. 2007). Nach dem National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report machte MRSA innerhalb der Jahre 1998 bis 2002 circa 50%, im Jahr 2003 bereits nahezu 60% und im Jahr % der S. aureus Isolate auf US-amerikanischen Intensivstationen aus (NNIS 2004). Ähnliche Zahlen sind auch in einer Studie von Klevens et al zu finden. Hiernach lag der MRSA-Anteil an allen S. aureus Infektionen im Jahr 1992 bei 35,9%, im Jahr 2003 bei 64,4%. Dies entspricht einem jährlichen linearen Zuwachs von 3,1% (p<0,0001)(klevens et al. 2006). 1.4 Therapie von Infektionen mit Staphylococcus aureus Die Wahl eines geeigneten Medikaments zur Therapie von Infektionen mit S. aureus, vor allem mit MRSA wird immer schwieriger. Zahlreiche, unterschiedlich häufige Resistenzen der einzelnen Bakterienstämme gegen verschiedene Antibiotika müssen hierbei berücksichtigt werden. Beim Umgang mit MRSA Infektionen spielt das Ausmaß und die Art der Infektion eine entscheidende Rolle. Die Wahl eines bestimmten Antibiotikums geschieht deshalb individuell von Fall zu Fall. Ein Nachweis von S. aureus in einer Blutkultur sollte neben dem Beginn einer empirischen Antibiotikatherapie eine rasche Fokussuche und Folge-Blutkulturen nach sich ziehen (Cosgrove et al. 2008). Infiziertes Fremdmaterial, zum Beispiel intravaskuläre Katheter, sollte möglichst entfernt werden, andere Herde für Bakteriämien wie beispielsweise Endokarditiden gegebenenfalls operativ saniert werden. 20

30 Einleitung Zur Behandlung von MRSA steht eine Reihe von verschiedenen Antiinfektiva zur Verfügung. Die wichtigsten sollen hier eine kurze Erläuterung erfahren. Vancomycin gehört in der Behandlung von MRSA zu den etabliertesten Substanzen und gilt hier als Mittel der Wahl. In den meisten Fällen wird das Antibiotikum immer noch als gut wirksam beschrieben, jedoch nimmt die seit einigen Jahren bestehende Problematik der Vancomycin-intermediären S. aureus Stämme zu und macht dieses Medikament nur bedingt verlässlich. Es ist schlecht gewebegängig und vor allem in hohen Dosierungen nephro- und gelegentlich ototoxisch (Dassinger et al. 2011). Daptomycin ist ein zyklisches Lipopeptid, welches wie auch Vancomycin ausschließlich gegen grampositive Erreger bakterizid wirkt. Es ist bei Verdacht auf Mischinfektion daher nur in Kombination mit anderen Antibiotika zu verwenden. Vereinzelt kann es zu Rhabdomyolyse führen, weshalb Vorsicht bei Patienten mit Niereninsuffizienz geboten ist und die Creatinkinase unter Therapie kontrolliert werden muss. Es gilt als Mittel der Wahl bei Bakteriämien und Endokarditiden durch MRSA. Linezolid gehört zur Gruppe der Oxazolidinone und wirkt gegen Staphylokokken bakteriostatisch. Wegen der seltenen Nebenwirkung in Form von Thrombopenie sind Blutbildkontrollen von Nöten. Die Wirksamkeit von Linezolid bei MRSA-Infektionen wird als gleich gut und besser als die von Vancomycin beschrieben (Howden et al. 2004, Shorr et al. 2005, Stevens et al. 2002), jedoch sind in der Literatur auch Berichte über Therapieversagen mit Linezolid bei Endokarditis zu finden (Ben Mansour et al. 2003, Ruiz et al. 2002). Cotrimoxazol wird vor allem zur Therapie von tiefen Haut- und Weichteilinfektionen eingesetzt. Es kann oral oder parenteral angewendet werden und wirkt gegen camrsa und hamrsa bakterizid (Kaka et al. 2006). Vor allem für camrsa ist Clindamycin eine gute Therapieoption. Es gehört zur Gruppe der Lincosamine und wirkt durch Hemmung der bakteriellen Proteinsynthese bakteriostatisch. Wegen seiner guten Gewebegängigkeit kann es auch zur Therapie bei Osteomyelitis angewendet werden. 21

31 Einleitung 1.5 Eradikation von MRSA Um einer Infektion und der Übertragung von MRSA weitmöglichst vorzubeugen, müssen besiedelte Patienten dekolonisiert werden. Dies beansprucht in der Regel 5 Tage. Die kolonisierten Patienten sollten isoliert werden. Außerdem sind bei Kontakt zu diesen Patienten besondere Hygienemaßnahmen wie das Tragen von Schutzkleidung, Handschuhen, Hauben und Masken einzuhalten (Muto et al. 2003). An der Uniklinik Köln wird die Sanierung wie folgt empfohlen (Fätkenheuer G. 2009): Die Sanierung der Rachen- und Mundhöhle erfolgt mit antiseptischen Spülungen, z.b. mit Polyhexanid oder Octenidin, die der Nasenschleimhaut mit Mupirocin Nasensalbe. Haut und Haare können mit Polyhexamid-Waschlotion saniert werden, bei bettlägerigen Patienten wird Octenidin verwendet. Besiedelte Kathetereintrittsstellen und Wunden sollten mit Wundantiseptikum und alkoholischem Hautantiseptikum behandelt werden. 1.6 Methoden zur Typisierung von MRSA Phänotypische Verfahren Zur phänotypischen Detektion von MRSA eignen sich die kulturelle Anzüchtung auf selektiven Nährmedien, der Agardiffusionstest oder auch die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK). Zunächst erfolgt mittels Koagulase-Test der biochemische Nachweis von S. aureus. Oft enthalten sogenannte Objektträgertests auch noch zusätzlich spezifische Antikörper gegen Strukturbestandteile von S. aureus, zum Beispiel gegen das Protein A. Der nun bewiesene S. aureus Stamm kann dann auf speziell aufbereitetem Mueller- Hinton-Agar, welcher 4% NaCl und 6 µg/ ml Oxacillin enthält, kultiviert werden. Bei Wachstum muss es sich somit um MRSA handeln. 22

32 Einleitung Beim Agardiffusionstest diffundieren Antibiotika aus getränkten Plättchen in den Agar hinein und hemmen wenn der Stamm empfindlich ist das Wachstum der Bakterien. Die Größe des Hemmhofs wird zur MHK und den erreichbaren Serumspiegeln des Antibiotikums in Beziehung gesetzt. Norm-Hemmhöfe sind in Ableseschablonen festgelegt, mit welchen der Hemmhof verglichen wird. Hierbei kann nach der CLSIoder der DIN-Methode gearbeitet werden. Das Ergebnis kann sensibel, intermediär oder resistent sein. Das so erhaltene Antibiogramm liefert auch epidemiologische Aussagen zur Unterschiedlichkeit von MRSA-Stämmen untereinander. Der Agardiffusionstest gilt aber als am wenigsten zuverlässig und weist nur eine Spezifität von 80% auf (Chambers 1993). Die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration ist ein quantitativer Test und erfolgt entweder per Buillondilution oder per Agardilution. Beim Bouillondilutionstest wird eine Verdünnungsreihe des Antibiotikums in Bouillon hergestellt und jedes Röhrchen mit einer definierten Menge des zu testenden Bakterienstamms beimpft. Nach Bebrütung wird das Wachstum beurteilt. Die MHK entspricht hier der geringsten Konzentration, in der kein Wachstum vorhanden ist. Der E-Test ist ein Agardiffusionstest, bei dem ein mit einem Konzentrationsgradienten des Antibiotikums beschickter Papierstreifen auf eine mit Bakterien beimpfte Agarplatte aufgelegt wird. Es kann so die MHK dort abgelesen werden, wo kein Wachstum mehr stattfindet. Als neuere Option zur Detektion von Methicillin-Resistenz bietet sich ein immunologisches Verfahren an, bei dem anhand monoklonaler Antikörper gegen das PBP2a, die auf Latex-Partikel geladen wurden, ein Agglutinationstest durchgeführt werden kann. Der Nachweis von PBP2a als Marker für Methicillin-Resistenz ist in mehreren Studien erfolgreich gewesen (Cavassini et al. 1999, van Griethuysen et al. 1999). 23

33 Einleitung Genotypische Verfahren Pulsfeld-Gelelektrophorese Die Pulsfeld-Gelelektrophorese gilt als Goldstandard bei der Typisierung von MRSA (Bannerman et al. 1995, Klevens et al. 2007, McDougal et al. 2003, Moran et al. 2006). Sie wurde 1984 entwickelt (Schwartz et al. 1984). Hierbei wird das bakterielle Chromosom mit Hilfe von Restriktionsenzymen in relativ wenige DNA-Fragmente unterteilt und danach elektrophoretisch aufgetrennt. Dies stellt eine relativ einfache, jedoch zeitaufwändige Methode zur Typisierung von Ausbruchstämmen dar. Ihr Vorteil liegt in der hohen Diskriminierungsfähigkeit und der damit verbundenen guten Typisierbarkeit. Als Nachteil muss die, vor allem innerhalb unterschiedlicher Labore, mangelnde Reproduzierbarkeit dieser Methode genannt werden, welcher aber mittels standardisierter Protokolle für unterschiedlichste Spezies entgegengewirkt wird (Graves et al. 2001, Mulvey et al. 2001, Ribot et al. 2001). Hierzu wurden bereits regionale Datenbanken erstellt, um eine bessere Vergleichbarkeit zu ermöglichen (McDougal et al. 2003, Murchan et al. 2003). Für unerfahrene Benutzer ist die Auswertung der Bandenmuster schwierig, und so wurden 1995 Richtlinien herausgegeben, welche die Einteilung in Typen und Subtypen erleichtern und vereinheitlichen soll. Demnach gelten Erreger als genetisch nicht unterscheidbar, wenn sie nach Auftrennung mit demselben Restriktionsenzym die gleiche Zahl an Banden aufweisen und letztere auch jeweils die gleichen Molekulargewichte besitzen. Bei einer Bandendifferenz von 1-3 Banden kann im Allgemeinen von einer genetischen Verwandtschaft ausgegangen werden. Dieser geringe Unterschied innerhalb der Restriktionsfragmente ist meistens auf eine einzelne genetische Veränderung zurückzuführen, welche recht schnell durch Insertion, Deletion oder Rearrangements entstehen kann. Bei einer Bandendifferenz von über 6 Banden muss man von generell unterschiedlichen Stämmen ausgehen, da hier mindestens 3 voneinander unabhängige genetische Veränderungen stattgefunden haben (Tenover et al. 1995). 24

34 Einleitung Multilocus Sequenztypisierung Die Multilocus Sequenztypisierung (kurz: MLST) basiert auf den etablierten Prinzipien der Multilocus-Enzymelektrophorese. Statt der Beurteilung der Gen-Produkte werden jedoch bei der MLST die Allele unterschiedlichster Gene direkt durch DNA- Sequenzierung bestimmt (Feil et al. 2004). Dabei werden 7 Gene auf verschiedenen Loci verwendet (Maiden et al. 1998, Robinson et al. 2004), wozu die Nukleotid- Sequenz von Fragmenten sogenannter Housekeeping-Gene bestimmt wird (Spratt 1999). Unter letzteren versteht man Gene, welche unabhängig von Zelltyp, Zellstadium oder Wachstumsbedingungen dauerhaft exprimiert werden. Die Housekeeping-Gene von S. aureus im MLST-Schema sind: Carbamatkinase (arcc), Shikimatdehydrogenase (aroe), Glycerolkinase (glpf), Guanylatkinase (gmk), Phosphatacetyltransferase (pta), Triosephosphatisomerase (tpi) und Acetyl-Coenzym A-Acetyltransferase (yqil)(enright et al. 2000). Allen erstmalig auftretenden Sequenzen werden Allel-Nummern zugeordnet und in einem Allel-Profil kombiniert, so dass ein Sequence-Typ (ST) zugeordnet werden kann. Die Anzahl der unterschiedlichen Nukleotide hat dabei keinen Einfluss bei der Vergabe von Allelnummern, weshalb nahe beieinander liegende Allelnummern nicht mit dem Verwandtschaftsgrad der beiden Stränge korrelieren. Die Anzahl der Allele variiert von Gen zu Gen und liegt zwischen 11 (glpf, gmk) und 17 (arcc, aroe). Dementsprechend sind über 100 x 10 6 Sequenz-Typen möglich (Enright et al. 2000). Auf der MLST-Website ( (Aanensen 2007, Aanensen et al. 2005) können unter Anwendung der Software UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) Dendrogramme von eigenen und Datenbank-Isolaten konstruiert werden. Die Dendrogramme basieren auf den paarweisen Vergleichen von Allel- Profilen. Allerdings eignet sich diese Methode nur für die Betrachtung einer begrenzten Anzahl an Isolaten. Für die Analyse größerer Isolatmengen steht das eburst (enhanced version of Based Upon Related Sequence-Types) System zur Verfügung. Hierbei werden Daten über Allel-Profile der gesamten MLST-Datenbank genutzt und sogenannte Clonal Complexes (CC) gebildet (Feil et al. 2004). 25

35 Einleitung In der folgenden Abbildung sind beispielhaft die Verwandtschaftsverhältnisse einiger verschiedener Sequenz-Typen des CC 8 dargestellt. Die hier vorliegende eburst- Analyse verdeutlicht, dass ST 239 sowohl zu ST 241 als auch zu ST 8 jeweils in einem Locus unterschiedlich ist: Die jeweiligen Sequenz-Typen sind direkt miteinander verbunden. Zwischen ST 241 und ST 8 besteht hingegen eine zweischrittige Verbindung über ST 239. Somit ist ST 241 double locus-variant zu ST 8. Abb. 5: eburst-analyse der Verwandtschaftsbeziehungen von Stämmen des CC 8 ( 2007) 26

36 Einleitung mec-typisierung Diese Methode basiert auf der Analyse der SCCmec-Kassette von S. aureus. Hierbei handelt es sich um einen Genabschnitt, welcher nur bei Methicillin-resistenten S. aureus Stämmen zu finden ist und somit deren Antibiotika-Resistenz kodiert (Ito et al. 1999). Bereits 1975 wurde die genetische Determinante für die Methicillin-Resistenz auf dem S. aureus Chromosom gefunden und zwischen dem Genabschnitt für Protein A und Purin A lokalisiert (Sjostrom et al. 1975). SCCmec besteht aus invertierten und direkten Repeats, welche an beiden Enden des Genabschnitts liegen, spezifischen Rekombinase-Genen (ccra und ccrb), welche umgeben sind von offenen Leserastern (open reading frames, ORF) und dem mec- Komplex (Ito et al. 1999, Katayama et al. 2000). Bei der mec-typisierung werden jeweils relevante Genabschnitte mit spezifischen Primern amplifiziert. Hierfür wurden im Laufe der Zeit unterschiedliche Verfahren angewandt, unter anderem die multiplex-pcr nach Oliveira et al (Oliveira et al. 2002). Abb. 6: Schematische Darstellung der SCCmec-Typen I bis V. Dargestellt werden die Hauptelemente von 5 SCCmec- Typen. Diese Elemente entsprechen den 6 Loci (A bis F), die zur Typisierung nach Oliveira et al.2002 verwendet werden. Abbildung aus Deurenberg et al Nach der Amplifikation wird ein Profil erstellt und der Stamm einem bestimmten mec- Typ zugeordnet. Inzwischen sind sieben SCCmec-Typen bekannt. In dieser Arbeit werden ausschließlich die Typen I bis IV verwendet, welche wie folgt charakterisiert sind (Ito et al. 2001, Ma et al. 2002): 27

37 Einleitung SCCmec I: mecb + ccr1 SCCmec II: meca + ccr2 SCCmec III: meca + ccr3 SCCmec IV: mecb + ccr2 Durch immer genauer werdende Genanalysen scheint diese Nomenklatur aber nicht mehr zeitgerecht, da bereits viele Subtypen erkannt wurden. Aus diesem Grund haben Chongtrakool et al eine neue Nomenklatur zur Beschreibung von SCCmec- Elementen asiatischer MRSA Stämme, basierend auf drei verschiedenen Kategorien, vorgeschlagen. Als erste gilt die Beschreibung des SCCmec Typs, definiert als ccr-typ und mec Klasse, beispielsweise 2A oder II für einen Stamm mit meca und ccr2. Die zweite Kategorie dient zur Beschreibung der J-Regionen, dem Bereich, in dem die SCCmec-Kassette ins Genom integriert wurde. Es werden hierbei durch Ziffern Abweichungen in der J1-Region von Stämmen eines SCCmec-Typs in Bezug auf den ursprünglich beschriebenen Typ angezeigt, wobei die Ziffer 1 der zuerst beschriebenen Variante, also einer Übereinstimmung in der dortigen Region entspricht. Die Nummer 2 entspricht einer davon abweichenden zweiten Variante, die Nummer 3 einer dritten Variante und so weiter. Die dritte Kategorie wird durch chronologische Nummern, abhängig von der Identifikation der jeweiligen J-Region oder des jeweiligen ccr-typs, beschrieben. Unter 7 Subtypen des mec-typs II (IIa, IIvariant, IIb, IIA, IIB, IIC, IID, IIE) bedeutet die Definition des Typs 2A.3.2 also folgendes: 2A entspricht dem SCCmec- Typ II mit meca und ccr2. Die J1-Region dieses Stammes gilt als dritte Variante, wofür die Ziffer 3 steht. Unter diesen Stämmen 2A.3 gibt es wiederum mehrere Subtypen, welche sich durch Unterschiede in der J2-3-Region auszeichnen. Diese wird äquivalent zur zweiten Kategorie beziffert. Bei dem Beispiel mit der Ziffer 2 in der dritten Kategorie handelt es ich also um die zweite Variante unter den 2A.3-Stämmen (Chongtrakool et al. 2006). 28

38 Einleitung spa-typisierung Diese Typisierungsform ist ein verlässliches und schnelles, einfach zu handhabendes Instrument zur Typisierung von MRSA mit guter interlaboratorischer Reproduzierbarkeit (Shopsin et al. 1999). Die spa-typisierung basiert auf der DNA- Analyse des Gens für das Staphylokokken-spezifische Protein A (spa). Hierbei wird zunächst die spa-repeat-region anhand einer PCR amplifiziert und danach sequenziert. Diesen Repeats, also den sich wiederholenden Basen-Sequenzen, ist ein numerischer Code zugeordnet. Somit ist der spa-typ abhängig von der Reihenfolge der spezifischen Repeats. Seit 2003 existiert die Software Ridom Staph Type, welche im Internet zugänglich ist. Diese ermöglicht eine schnelle Analyse von spa-typen und stellt außerdem alle bereits bekannten spa-profile bereit (Harmsen et al. 2003). Aktuell existieren 413 unterschiedliche Repeats und 7174 bekannte spa-typen. Auf der Homepage des Ridom SpaServers können die Zuordnungen und Basen-Sequenzen den unterschiedlichen Repeats des spa-gens eingesehen werden (Ridom-GmbH 2005). Mehrere spa-typen können einem einzigen Sequenz-Typen zugeordnet sein, jedoch wurden auch Beispiele von Isolaten mit dem gleichen spa-typ beschrieben, die zu verschiedenen Single-Locus-Variant Sequenz-Typen gehören (Aires de Sousa et al. 2003, Crisostomo et al. 2001, Oliveira et al. 2001). Die spa-typen 002, 084 und 015 sind die am häufigsten vertretenen Typen unter in Europa kollektivierten MSSA-Stämmen. Darunter bildet spa-typ 002 einen Anteil von 4,8%, spa-typ 084 von 4,6% und spa-typ 015 von 4,4%. Unter den MRSA-Stämmen in Europa machen die drei häufigsten spa-typen zusammen bereits 34,2 % aus. Dabei ist der spa-typ 032 mit 14,5% der am häufigsten auftretende Stamm, gefolgt von spa-typ 008 mit 12,4% und spa-typ 014 mit 7,4% (Grundmann et al. 2010). In Deutschland wurden die spa-typen 008, 084 und 015 als die drei häufigsten Vertreter der MSSA-Stämme, die spa-typen 032, 003 und 001 als die drei häufigsten Vertreter bei MRSA gefunden (Grundmann et al. 2010). 29

39 Einleitung DiversiLab Bei der Typisierung mit DiversiLab wird aus Bakterienstämmen extrahierte DNA mittels automatisierter repetitiver extragen-palindromer Sequenz-basierter PCR (repetitivesequence-based PCR, rep-pcr) vervielfältigt und danach unter Verwendung von Microfluid-Chips und einem Bioanalyzer aufgetrennt und visualisiert. Die so erhaltenen Muster werden automatisch in die internetbasierte DiversiLab-Software hochgeladen und dort analysiert (Healy et al. 2005). Vom Benutzer können sogenannte Reports erstellt werden, in denen ausgewählte Proben mittels der DiversiLab-Software miteinander verglichen werden können. Es kann zwischen verschiedenen Darstellungen der Proben in Form von virtuellen Gelen und Elektropherogrammen, bezeichnet als Sample-Graphs, Dendrogrammen, einer Similarity Matrix und Scatterplots ausgewählt werden. Die Ähnlichkeit zweier Proben wird als Similarity Index in Prozent angegeben, basiert auf Vorhandensein und Intensität von Banden beziehungsweise Peaks und kann vom Benutzer auch manuell durch Vergleichen der Elektropherogramme oder der Banden im virtuellen Gel überprüft werden. Dieses System ermöglicht eine äußert schnelle und einfach durchzuführende Analyse von MRSA-Stämmen, die eine hohe Reproduzierbarkeit aufweist (Te Witt et al. 2009). In Abbildung 7 werden die einzelnen Arbeitsschritte schematisch dargestellt. Eine genauere Beschreibung dieser Typisierungsmethode erfolgt in dieser Arbeit im Abschnitt Material und Methoden. 30

40 Einleitung Abb. 7: Schematische Darstellung der DiversiLab Arbeitsschritte (Healy et al. 2005). (A)rep-PCR-Primer bindet an unterschiedlichen Stellen an die DNA, unterschiedlich große Amplikons werden generiert. (B) Die Amplikons werden durch Mikrofluide auf dem LabChip aufgetrennt, die Daten werden automatisch gesammelt und von der DiversiLab- Software analysiert. (C) Ein endgültiger Report wird erstellt. 1.7 Fragestellung MRSA ist weltweit für einen Großteil aller nosokomialen Infektionen verantwortlich (Grundmann et al. 2006). Der Keim gilt als Hauptverursacher von Haut- Weichteilinfektionen, tiefen Atemwegsinfektionen, Bakteriämien und Endokarditiden. Zur effektiven Kontrolle nosokomialer Infektionen ist die Kenntnis über Art und Häufigkeit von Erregern, sowie über deren Verbreitungswege unerlässlich. Die Infektionsepidemiologie befasst sich mit diesen Fragestellungen. Durch genaue Analyse von Erregern lässt sich zwischen Epidemien und sporadischen Einzelfällen unterscheiden. Das Wissen über molekulare Eigenschaften von Erregern im Vergleich innerhalb eines Krankenhauses, zwischen mehreren Krankenhäusern, regional oder auch global lässt Rückschlüsse über deren Verbreitung und Evolution zu. Somit können gute Typisierungsmethoden zu besseren Präventionsmaßnahmen und gezielter Infektionskontrolle führen. Ziel dieser Arbeit ist die Evaluation des Systems DiversiLab zur Genotypisierung von MRSA. Dabei sollen folgende Gesichtspunkte untersucht werden: 31

41 Einleitung 1. Wie aufwendig ist die praktische Arbeit? Funktioniert die Typisierung so, wie vom Hersteller angegeben? Erfordert die Methode spezifisches Können? 2. Erfolgt die automatische Auswertung von Amplifikaten mittels Bioanalyzer zuverlässig? 3. Wie ist die Reproduzierbarkeit der Methode? Erhält man nach wiederholter Testung das gleiche Ergebnis? Hat die Benutzung unterschiedlicher Laborgeräte oder das Alter von Amplifikaten einen Einfluss? 4. Verfügt die Methode über eine ausreichend hohe Diskriminationsfähigkeit beziehungsweise ist letztere zu hoch, so dass nicht relevante Unterschiede überinterpretiert werden könnten? 5. Können MRSA-Stämme klar typisiert werden? 6. Wie spezifisch ist die Typisierung mittels rep-pcr im Vergleich zur Multilocus- Sequenztypisierung, mec-typisierung oder spa-typisierung? Für die Untersuchung wurden MRSA aus der Stammsammlung des Institutes für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Universität zu Köln ausgewählt und mittels DiversiLab analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mit denen anderer Typisierungsmethoden verglichen und ausgewertet. 32

42 Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1 Untersuchungsgut Im Rahmen dieser Arbeit wurde auf ein Kollektiv von MRSA-Stämmen zurückgegriffen, welche in den Jahren 1984 bis 2006 aus Patientenmaterial isoliert wurden. Grundlage dafür bildete Material aus verschiedenen Kölner Krankenhäusern, welches dem Institut für medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene (IMMIH) der Universität zu Köln zur Untersuchung zugesandt wurde. Die Bakterienstämme wurden auf laborübliche Weise isoliert und kultiviert und in jeweils 1ml Tryptic Soy-Boullion (+20% Glycerin, IMMIH), eingefroren bei -80 C, aufbewahrt. Für die vorliegende Untersuchung wurden 198 Bakterienstämme unterschiedlicher Resistenzprofile und MLST-Typen ausgewählt. Dabei stammten 154 Stämme von Patientenmaterial aus dem Universitätsklinikum und 41 Stämme von Patientenmaterial aus peripheren Krankenhäusern. 3 Stämme waren Referenzstämme. Ein Großteil der Stämme wurde mit VITEK auf ihre Antibiotika-Resistenz getestet. Informationen über Sequenz-, mec- und spa-typen lagen teilweise vor und stammten aus vorangegangenen Analysen der Stämme. 2.2 Typisierung mittels rep-pcr DNA-Gewinnung Kulturen Alle MRSA-Stämme wurden mittels 3-Ösen-Ausstrich (Impfschlingen der Firma Saarstedt) auf Schafsblutagar (heipha Dr. Müller GmbH) kultiviert und über Nacht bei 36 C inkubiert (Inkubator der Firma Heraeus-Instruments GmbH). Nach optischer 33

43 Material und Methoden Überprüfung auf Reinkulturen wurden die Bakterienstämme mit fortlaufenden Nummern versehen. Extraktion Zur Extraktion wurden ausschließlich Materialien des UltraClean Microbial DNA Isolation Kits (MoBio Laboratories) verwendet und genau nach Herstellerangaben verfahren. Die benutzten Pipetten stammten von der Firma Eppendorf, die Pipettenspitzen von Starlab GmbH. Mit einer Impföse wurden jeweils 10 µl der Bakterienkultur in 300 µl der Salz- und Puffer-haltigen MicroBead Lösung in einem mit etwas Sand gefüllten MicroBead-Tube resuspendiert. Dann wurde 50 µl MD1-Lösung zugegeben. Das hierin enthaltene SDS baut Fettsäuren und Lipide ab, wodurch eine Lyse der Zellwand bewirkt wird. Um die Lyse zu unterstützen, wurden die Proben 10 Minuten lang in einem Vortex-Adapter (MoBio Laboratories, Inc.) bei maximaler Geschwindigkeit geschüttelt. Danach wurden die Proben bei 10,000 x g zentrifugiert (Heraeus Sepatech GmbH). Der nun sandfreie Überstand wurde abpipettiert und mit 100 µl MD2 versetzt, wodurch überschüssiges organisches und anorganisches Material von der DNA gelöst wurde. Nach Vortexen (Vortex Genie 2, Scientific Industries, Inc) und Inkubation bei 4 C über mindestens 15 Minuten wurden Zellreste und Proteine durch Zentrifugieren von der DNA getrennt. 200 µl des DNA-haltigen Überstands wurden mit 450 µl MD3, einer hochkonzentrierten Salzlösung, versetzt und gemischt. Diese Lösung bedingt nach Überführung des Reaktionsansatzes auf Filtersäulchen die Bindung der DNA an die silikatische Filtermembran. Nach erneutem Zentrifugieren wurden 300 µl MD4, basierend auf Äthanol, auf die Säulchen pipettiert und auf diese Weise, wiederum durch Zentrifugieren, die am Filter gebundene DNA von Salzresten und Verunreinigungen befreit. Zuletzt wurden 35 µl MD5 auf den Filter übertragen und nochmals zentrifugiert. Die DNA wurde durch diesen Wasch-Puffer aus ihrer Verbindung mit der silikatischen Membran gelöst und in ein steriles Eppendorfgefäß (MoBio Laboratories, Inc.) eluiert. 34

44 Material und Methoden Zur weiteren Bearbeitung stand DNA unbekannter Konzentration, gelöst in einem Volumen von 35 µl zur Verfügung. Die Bearbeitung der Proben geschah nun nach folgendem Arbeitsschema, wobei das Analysis-Tool nicht zum Einsatz kam: Abb. 8: Workflow des DiversiLab Systems (biomérieux 2009) Automatisierte rep-pcr Verdünnung Zur Vorbereitung auf die PCR wurde die DNA-Konzentration aller Proben unter Verwendung eines Spektrophotometers (Nano Vue, GE Healthcare Europe GmbH) bei 260 nm und 280 nm Wellenlänge bestimmt. Danach wurden alle Proben unter einer sterilen Werkbank (Hera Safe, Thermo Fisher Scientific Inc.) mit DNAse-freiem Wasser (Qiagen GmbH) auf eine Konzentration von 40 ng/µl verdünnt, um die Proben nach der Amplifikation vergleichbar zu machen. 35

45 Material und Methoden Prinzip der rep-pcr Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine chemische in vitro-reaktion, bei der ausgewählte DNA-Sequenzen amplifiziert werden können (Murray et al. 2007)(Kap.16, S.220). Dies geschieht durch die Bindung spezifischer Primer an die homologe DNA- Sequenz. Bei der rep-pcr werden kurze Oligonukleotid-Primer verwendet, welche außen an homologe nichtkodierende repetitive Sequenzen binden, die sich durch das Bakteriengenom ziehen (Koeuth et al. 1995, Stern et al. 1984). Die Bereiche zwischen den repetitiven Sequenzen werden so amplifiziert (Koeuth et al. 1995, Versalovic et al. 1991). Diese Methode hat sich zur Klassifikation von Subspezies etabliert (Versalovic et al. 1991). Automatisierte rep-pcr Im DiversiLab-System wurde die rep-pcr durch die Verwendung von qualitätsgeprüften Reagenzien im Kit-Format standardisiert (Healy et al. 2004). Die Vorbereitung und Durchführung der PCR erfolgte nach Herstellerangaben. Dabei wurden Reagenzien des DiversiLab DNA-fingerprinting-Kits für Staphylokokken (Bacterial Barcodes, Inc.) verwendet. Zusätzlich wurden AmpliTaq DNA-Polymerase (5 U/µl) und GeneAmp 10 X PCR-Puffer (beides Applied Biosystems) eingesetzt. Alle Arbeiten wurden bei Kühlung der Proben und Reagenzien unter einer sterilen Werkbank durchgeführt. Mit Hilfe der DiversiLab-Software wurde ein rep-pcr Worksheet angefertigt, welchem man die genauen Angaben über Zusammensetzung des Mastermix und die Cycling- Parameter entnehmen konnte. Erforderliche Daten über die verschiedenen Proben wurden vorher in die DiversiLab-Software eingetragen. Nachdem alle DNA-Proben aufgetaut, gevortext und zentrifugiert wurden, erfolgte die Herstellung des Master-Mix. Die PCR wurde folgendermaßen angesetzt: 36

46 Material und Methoden Reagenzien Menge pro Probe Master-Mix 23 µl Rep-PCR MM1 18 µl GeneAmp 10X PCR buffer 2,5 µl Primer Mix 2 µl AmpliTaq DNA Polymerase 0,5 µl Template-DNA (40µg/ml) 2 µl Die PCR wurde mit dem Thermocycler (GeneAmp 9600 PCR-System, Perkin Elmer, im Folgenden bezeichnet als Thermocycler DS) unter folgenden Reaktionsbedingungen durchgeführt: Reaktionsschritt Temperatur ( C) Zeit (sec) Erste Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation Letzte Elongation Kühlung 4 -- Die markierten Reaktionsschritte wurden in 35 Zyklen wiederholt. Zu Vergleichszwecken kamen weitere zwei PCR-Geräte (T3000 Thermocycler, Biometra biomedizinische Analytik GmbH, im Folgenden bezeichnet als Thermocycler PW, und Primus, MWG-Biotech, im Folgenden bezeichnet als Thermocycler PH) zum Einsatz. Die Proben aus diesen Analysen werden in der folgenden Beschreibung der Arbeit jedoch gesondert betrachtet. 37

47 Material und Methoden Die PCR-Reaktionsgefäße wurden von der Firma Abgene gestellt. Bis zur weiteren Bearbeitung der amplifizierten DNA wurden die Proben bei 4 C gekühlt Analyse der PCR-Produkte Die Auftrennung und Visualisierung der DNA-Amplikons erfolgte nach Herstellerangaben mit den DiversiLab Microfluid-Chips, den zugehörigen LabChip Reagenzien (beides LabChip devices, Caliper Technologies, Inc.) und dem 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies GmbH). Beladen der Chips Hierfür wurde zunächst aus 200 µl DNA-Gel-Matrix und 10 µl DNA Dye Concentrate das so genannte Gel-Dye-Mix hergestellt. Dann erfolgte, in der Anordnung wie auf dem zuvor erstellten Chip Worksheet vorgegeben, die Beladung des Chips unter Verwendung der Chip Loading Station (Agilent Technologies GmbH). Dabei wurden DNA-Standard-Marker zur Normalisierung der zu analysierenden DNA-Proben in jede Sample-Öffnung des Chips pipettiert. Außerdem wurde 1 µl des DiversiLab-Kit Molekulargewichts-Ladder verwendet, welcher aus verschiedenen DNA-Markern besteht. Letztere hatten Molekulargewichte von 200 bp, 400 bp, 600 bp, 800 bp, 1000bp, 2000 bp, 3000 bp und 4000 bp und waren jeweils in einer Konzentration von 5 ng/µl im Ladder enthalten. Analyse durch den Bioanalyzer Nachdem sowohl die Proben als auch die nötigen Reagenzien auf den Chip überführt worden waren, wurde der Chip auf einem speziellen Chip-Vortexer (IKA Works, Inc.) geschüttelt. Die Amplikons zwischen 150 bp und 5000 bp wurden durch den Bioanalyzer über Fluoreszenz-Intensitäten und Migrationszeit erfasst und automatisch in die Diversilab-Software hochgeladen. Dort musste jeder Chip eine Qualitätskontrolle 38

48 Material und Methoden unterlaufen, bei der jede analysierte Probe eine visuelle Kontrolle durch den Benutzer erfuhr und daraufhin bestätigt oder abgelehnt wurde. Reports Die Patterns wurden mit der DiversiLab-Software (Version 3.4) unter Verwendung des Kullback-Leibler-Koeffizienten analysiert, welcher wie folgt definiert ist: KL(x,y) = x y log Die Ähnlichkeit der Proben wurde, basierend auf der relativen Intensität, berechnet (Bacbarcodes 2008)(Analysis Guide, S.9). Zur Erstellung eines Dendrogramms wird von der Software die unweighted-pair-group Methode mit dem arithmetischen Mittel angewandt. Von allen Proben wurden Reports erstellt, welche ein Dendrogramm mit individuell ausgewählten Informationen, eine Similarity-Matrix, ein Scatterplot und Sample - Informationen enthalten. Hierbei wurde der Sequenz-Typ als Class 1, der mec-typ als Class 2 und der spa-typ als Class 3 definiert. 39

49 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 Stammkollektiv Für die vorliegende Arbeit wurden 198 MRSA-Isolate unterschiedlicher MLST-Typen aus Patientenmaterial der Jahre 1984 bis 2006 ausgewählt und unter Aussparung von 61, 62 und 65 mit fortlaufenden Nummern versehen. Die verwendeten Isolate werden folgend mit MRSA 01 bis MRSA 201 bezeichnet. Von den verwendeten Bakterienstämmen wurden 154 aus Patientenmaterial des Universitätsklinikums Köln isoliert. 41 Stämme stammten von Patientenmaterial aus peripheren Krankenhäusern. Drei der verwendeten Stämme waren Referenz-Stämme des ST 45, 228 und 247. Die Isolate stammten aus verschiedensten Fachbereichen, wobei Chirurgie, Innere Medizin und Dermatologie den Hauptanteil bildeten. Vorbestehende Ergebnisse nach Typisierung mittels MLST Unter den 198 Isolaten lagen insgesamt 18 verschiedene Sequenz-Typen vor, welche den Clonal Complexes 1, 12, 22, 30, 45, 5, 8 und 80 angehörten. Stämme innerhalb eines Clonal Complex entsprachen entweder dem definierenden Sequenz-Typ, oder waren Single - oder Double-Locus-Variants. Die Locus-Varianz bezieht sich auf die 7 verschiedenen Houskeeping-Gene der Multilocus-Sequenztypisierung. Single-Locusvariante Stämme unterscheiden sich somit in genau einem Gen-Locus, double-locusvariante Stämme in genau zwei Loci. Einer der 198 MRSA-Stämme war nicht MLSTtypisierbar. Einen Überblick über die jeweiligen MLST-Profile, deren Zuordnung zu den Clonal Complexes und deren Verwandtschaftsverhältnisse und die in dieser Arbeit jeweils verwendete Anzahl an Stämmen geben die Tabellen 4 und 5. 40

50 Ergebnisse Tabelle 4: Anzahl der verwendeten Stämme in dieser Arbeit und Zugehörigkeit zu den Clonal Complexes (MLST 239 berücksichtigt 2 Stämme, welche als ST 239/241 vortypisiert wurden, nt wurde nicht mittels MLST typisiert) MLST MLST Profil Clonal Complex Locus Varianz Anzahl CC CC CC CC CC CC CC CC80 8 nt 1 41

51 Ergebnisse Tabelle 5: Verwandtschaftsverhältnisse der verwendeten ST. Angegeben wird die Anzahl der unterschiedlichen Loci Vorbestehende Ergebnisse nach mec-typisierung Zur Analyse kamen MRSA-Stämme der mec-profile I bis IV. Hierbei lagen zu 20,2% (n=40) Stämme des mec-typs I vor, zu 22,7% (n=45) Stämme des mec-typs II, zu 11,1% (n=22) Stämme des mec-typs III und zu 37,9% (n=75) Stämme des mec-typs IV. 7,6% (n=15) der Stämme waren nicht mittels mec-typisierung auswertbar (nt) und 0,5% (n=1) der Stämme des Kollektivs wurden überhaupt nicht mec-typisiert. 42

52 Ergebnisse Vorbestehende Ergebnisse nach spa-typisierung Unter den MRSA-Stämmen des Kollektivs lagen 50 verschiedene spa-typen vor. Den größten Anteil bildete der spa-typ 003 mit 11,6% (n=23) aller Stämme, gefolgt von den spa-typen 008 mit 8,6% (n=17), 002 mit 6,6% (n=13) und 037 mit 6,1% (n=12). Der spa- Typ 004 war zu 5,1% (n=10) im Kollektiv vertreten, der spa-typ 001 zu 4,0% (n=8), die spa-typen 032 und 044 jeweils zu 3,5% (n=7), die spa-typen 030 und 051 zu jeweils 3,0% (n=6), die spa-typen 018, 035 und 038 zu jeweils 2,5% (n=5). Jeweils 2,0% (n=4)der Stämme gehörten zum spa-typ 009, 040, 110, 127, 457 und 458. Die spa- Typen 015, 109, 143 und 305 waren zu jeweils 1,5% (n=3) vertreten. Je 1% (n=2)der Stämme gehörten den spa-typen 007, 068, 113, 143, 268 und 462 an. Alle anderen Typen waren jeweils nur einmal vertreten und bildeten somit einen Anteil am Gesamtkollektiv von 0,5%. In der folgenden Tabelle kommt eine Darstellung der verwendeten Sequenz-, mec- und spa-typen, sowie deren Anzahl in der vorliegenden Arbeit zur Ansicht. 43

53 Ergebnisse Tabelle 6: Epidemiologische Charakteristika der in dieser Arbeit verwendeten Stämme ST SCCmec Typ Spa Typ Anzahl im Kollektiv nt nt nt 3 1 nt nt nt nt /666/946 1 nt nt 9 4 nt nt nt 1 44

54 Ergebnisse 3.2 Praktische Durchführung der Untersuchung Die praktische Durchführung der Untersuchung mittels DNA-Extraktion, rep-pcr und Chip-Analyse erwies sich insgesamt als benutzerfreundlich und erforderte wenig praktische Fertigkeiten. Es konnten bis zu 13 Stämme innerhalb von 4 bis 6 Stunden getestet werden, wobei die DNA-Extraktion der arbeitsintensivste Schritt war. Die Software war recht einfach zu bedienen. Durch ihre internetbasierte Form war es möglich, von überall auf die Daten zuzugreifen, jedoch gestalteten sich diese etwas unübersichtlich, sobald mehrere Personen eines Instituts mit dem System arbeiteten, da sich nicht benötigte Informationen anderer Benutzer nicht in der Ansicht ausblenden ließen. Als Nachteil erwies sich, dass einmal in die Software eingegebene Informationen über verwendete Proben im Nachhinein nur teilweise verändert werden konnten. So konnte man Eingabefehler bei der Benennung der Proben nur durch komplette Inaktivierung der entsprechenden Probe beseitigen. Während der praktischen Umsetzung der hier beschrieben Analyse wurde das DiversiLab-System vom Hersteller überarbeitet. Erst nach der Testung eines Großteils des Kollektivs wurden die momentan aktuellen Leitfäden ( Diversilab Strain Typing Software Guide, Diversilab Strain Typing Analysis Guide und Diversilab Strain Typing Troubleshooting Guide ) herausgegeben und das Analysis-Tool eingerichtet. Dies ist der Grund, warum letzterer in dieser Arbeit nicht zum Einsatz kam. Auch die Berechnung der Ähnlichkeitsgrade durch die Software wurde verändert, so dass alle bis dahin erstellten Reports regeneriert werden mussten, um eine einheitliche Grundlage für alle Analysen zu schaffen DNA-Extraktion Insgesamt wurden 287 DNA-Extraktionen genau nach DiversiLab-Protokoll durchgeführt. Jeder Stamm wurde mindestens einmal extrahiert, was in den meisten 45

55 Ergebnisse Fällen mehrmals wiederholt wurde. Die hierbei erhaltenen DNA-Konzentrationen lagen zwischen 3,68 µg/ml und 252,5 µg/ml. Dabei wurden, gemäß Protokoll, DNA-Proben mit Konzentrationen, welche kleiner als 40 µg/ml waren, nicht weiter verwertet. Es konnte eine Abhängigkeit von verwendeten Filtern aus verschiedenenn Extraktionskits und erhaltenen DNA-Konzentrationen festgestellt werden. 81,19% 18,81% DNA-Konzentration < 40 µg/ml DNA-Konzentration > 40 µg/ml Abb.9: Anteile der erhaltenen DNA-Konzentrationen durch DNA-Extraktion nach dem DiversiLab Protokoll Rep-PCR Durch die Generierung von rep-pcr-worksheets, auf der die genaue Zusammensetzung des Master-Mixes durch die DiversiLab-Software angegeben wurde, erwies sich die Durchführung der rep-pcr als unkompliziert. Durch die jeweils gleiche Zusammensetzung des Master-Mixes und durch die Möglichkeit, die genaue Anordnung der PCR-Proben im PCR-Gerät auf dem rep-pcr-worksheet zu dokumentieren, unterlag die Durchführung der PCR standardisierten Bedingungen. 46

56 Ergebnisse Chip-Analyse Die durch die automatisierte rep-pcr erhaltenen Amplifikate wurden auf Microfluid- Chips geladen, durch einen Bioanalyzer und der zugehörigen Software ausgewertet und in die Form virtueller Gele, Elektropherogramme und Scatterplots übertragen. Insgesamt kamen 52 Chips zur Anwendung, wovon 13 nicht auswertbar waren und darum im System inaktiviert wurden. Bei 11 Chips (142, 143, 144, 151, 161, 163, 180, 181, 209, 210, 215) konnten einzelne Samples nicht verwendet werden. Somit waren 28 von 52 Chips ohne Probleme verwertbar. Die Ursache für eine fehlerhafte Auswertung wurde von der Software in ungenügender Migrationszeit ( check migration ), Unbenutzbarkeit der Probe ( sample unusable ), unzureichender Amplifikation der Probe ( low intensity ) oder abnorm niedriger Fluoreszenz-Einheiten der Marker-Peaks ( low intensity ) angegeben. Seltener traten Zacken, sogenannte Spikes, oder Luftblasen ( bubbles ) auf, wahrscheinlich verursacht durch den manuellen Vorgang der Beladung der Chips. Zu breite Marker- Peaks, welche dann auch meist niedrige Fluoreszenz-Einheiten aufwiesen, wurden von der Software nicht erkannt. Somit konnten betreffende Proben erst durch visuelle Kontrolle als unbrauchbar erkannt und inaktiviert werden. Mit fortgeschrittenem Alter des Gel-Dye-Mix, auch innerhalb der vom Hersteller angegebenen Haltbarkeitszeit, sanken die Marker-Peaks auf zu niedrige Werte unter 400 Fluoreszenz-Einheiten, so dass dann die Samples nicht zur Auswertung herangezogen werden konnten. 3.3 Auswertung der Ergebnisse der Typisierung mittels DiversiLab Zur Auswertung wurde die Bezeichnung der Proben (samples) wie folgt definiert: 47

57 Ergebnisse Sample ID: Class 1: Class 2: Class 3: MRSA-Stamm Sequenz-Typ mec-typ spa-typ Für diese Arbeit wurde bei einem von der Software angegebenen Clusterwert über 95% von identischen Proben ausgegangen. Stämme, die zu weniger als 95% clustern, können miteinander verwandt sein, so zum Beispiel die Stämme des Rep-PCR Typen (239-1) und (239-2), (eine Erklärung für verschiedene rep-pcr-typen erfolgt im Abschnitt 3.4). Ab einem Wert von unter 90% wird von unterschiedlichen MRSA- Subtypen ausgegangen Einfluss der PCR und verwendeter PCR-Geräte auf die Typisierungsergebnisse des DiversiLab-Systems Für die folgende Analyse wurde DNA aus derselben Extraktion verwendet. Diese wurde mit derselben PCR (PCR Worksheet 101) amplifiziert, das heißt unter Verwendung desselben Mastermixes und desselben Thermocyclers. Alle Samples wurden auf denselben Chip (No.209) aufgetragen. Die Abbildung 9 zeigt, dass alle Samples untereinander zu über 98% übereinstimmten. 48

58 Ergebnisse Abb. 9: Analyse des Stammes MRSA 46. Die DNA-Proben stammen alle aus derselben Extraktion und derselben Amplifikation und wurden unter Verwendung desselben Thermocyclers DS amplifiziert und auf demselben Chip analysiert. Es zeigte sich, dass die Verwendung unterschiedlicher PCR-Geräte Auswirkungen auf das Bandenmuster hatte. Die DNA der Stämme MRSA 108, 109, 111 und 113 wurden in 3 unterschiedlichen PCR-Geräten, bezeichnet mit DS, PW und PH, amplifiziert. Dabei handelt es sich beim Gerät DS um das standardmäßig in der gesamten Arbeit verwendete PCR-Gerät. Die folgenden Graphiken verdeutlichen die entstandenen unterschiedlich ausgeprägten Diskrepanzen trotz Verwendung desselben DNA-Materials und desselben Reaktionsansatzes für die PCR. 49

59 Ergebnisse 50

60 Ergebnisse Abb. 10: Analysen der Stämme MRSA 108, 109, 111 und 113 jeweils unter Verwendung der verschiedenen Thermocycler PW (T3000 Thermocycler, Biometra biomedizinische Analytik GmbH), DS (GeneAmp 9600 PCR- System, Perkin Elmer) und PH (Primus, MWG-Biotech). (Die ST der Stämme MRSA 108 und MRSA 111 wurden anhand vorliegender mec- und spa-typen, sowie typischer Resistenzprofile in der Antibiotika-Sensibilität abgeleitet.) 51

61 Ergebnisse Effekt der Verwendung unterschiedlicher Analyse-Chips und des Alters der PCR-Produkte auf die Typisierungsergebnisse des DiversiLab- Systems Die Analyse eines einzelnen PCR-Produkts zu unterschiedlichen Zeitpunkten (siehe Tabelle 9) auf unterschiedlichen Chips ergab übereinstimmende Ergebnisse. Dies wird in Abbildung 11 dargestellt. Tabelle 7: Alter verschiedener Amplifikate und deren Analysen auf unterschiedlichen Chips MRSA PCR-No. Chip Alter PCR- Produkt (Tage) Unter Verwendung desselben PCR-Produktes wurden die Stämme MRSA 13, 19, 21, 49 und 84, welche unterschiedlichsten Sequenz-, mec- und spa-typen zugehörig sind, auf unterschiedliche Chips aufgetragen und analysiert. Dabei waren die jeweiligen PCR- Produkte zwischen 0 und 238 Tage alt. Es zeigte sich, dass alle Stämme unabhängig von Chip oder Alter der PCR-Produkte jeweils zu mindestens 95,9% übereinstimmten. 52

62 Ergebnisse Abb. 11: Analyse desselben Amplifikats der Stämme MRSA 13, 19, 21, 49 und 84 zu unterschiedlichen Zeitpunkten unter Verwendung unterschiedlicher Chips. (Die ST der Stämme MRSA 13, 21 und 19 wurden anhand vorliegender mec- und spa-typen, sowie typischer Antibiotika-Resistenzprofile abgeleitet. Das kontrollierte Ergebnis der Multilocus-Sequenz-Typisierung von MRSA 84 zeigte Unstimmigkeiten zu vorliegenden mec- und spa-typen.) 53