H.K.GEISS, D.MACK und H.SEIFERT

Transkript

1 KONSENSUSPAPIER ZUR IDENTIFIZIERUNG VON SPEZIELLEN RESISTENZMECHANISMEN UND ZUR INTERPRETATION VON ERGEBNISSEN DER ANTIBIOTIKAEMPFINDLICHKEITSTESTUNG BEI GRAMPOSITIVEN UND GRAMNEGATIVEN ERREGERN H.K.GEISS, D.MACK und H.SEIFERT Erregerisolierung und identifizierung sind eine der wichtigsten Aufgaben im mikrobiologischdiagnostischen Labor, da das Ergebnis dieser Untersuchungen die Grundlage für die gezielte Antibiotikatherapie ist. Die Durchführung der Testung basiert auf der Hemmung von bakteriellem Wachstum in Gegenwart eines Antibiotikums unter definierten in-vitro Bedingungen. Erste Vorschläge zur Standardisierung der Testung in den 50-er Jahren wurden 1961 in einem WHO Report publiziert, wobei letztendlich die Arbeiten von Ericsson et al. (1960) und Bauer et al. (1966) zur weltweiten Etablierung des Agardiffusionsverfahrens als der am weitesten verbreiteten Methode führten. Trotz der offensichtlichen Einfachheit dieses Testverfahrens ist es bis heute nicht gelungen, weltweit verbindliche Standards für die Durchführung und die Ergebnisbewertung zu etablieren. So beziehen sich die Unterschiede auf die verwendeten Testmedien (z.b. Mueller-Hinton vs. IsoSensitest), Inokulum (konfluierendes vs. semikonfluierendes Wachstum), Beschickungsmenge der Testplättchen, Inkubationsbedingungen, Ableseverfahren sowie die Festlegung der Grenzwerte. Ähnliches gilt teilweise für die MHK-Bestimmung im Bouillon-Dilutionsverfahren, wobei diese Methode allerdings eine automatisierte Ablesung der Ergebnisse und einen höheren Grad an Standardisierung erlaubt. Zu diesen rein methodischen Fragestellungen ist in den letzten Jahren zunehmend ein Problem in den Blickpunkt des Interesses gerückt, das in seiner Bedeutung von erheblicher klinischer Relevanz ist. Erstmals offensichtlich wurde die Diskrepanz zwischen in-vitro Empfindlichkeit und in-vivo Resistenz bei Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) Stämmen, und es hat viele Jahre gedauert, bis sich in allen mikrobiologisch-diagnostischen Labors die korrekte Interpretation der Resistenztestung im Sinne der klinischen Unwirksamkeit aller ß-Laktam-Antibiotika beim Vorliegen einer Methicillin-Resistenz durchgesetzt hat. Die Änderung von Testbedingungen (erhöhter Kochsalzgehalt, verlängerte Inkubation, Grenzwertkorrektur) erhöhte die Nachweisempfindlichkeit der Methicillin-Resistenz, die aber mit phänotypischen Verfahren nicht bei 100% liegt. Mittlerweile haben eine Reihe von Untersuchungen belegt, dass die Unzulänglichkeit, einen vorhandenen Resistenzmechanismus mit Hilfe der Resistenztestung unter Zugrundelegung aktueller Grenzwerte zu erkennen, nicht nur auf MRSA beschränkt ist, sondern auch zahlreiche andere Bakterienarten und Antibiotikagruppen umfasst. Gleichzeitig werden wir weltweit mit dem Problem der sich z.t. epidemisch ausbreitenden antibiotikaresistenten Mikroorganismen konfrontiert, wodurch der schnellen und sachgerechten Empfindlichkeitstestung klinischer Isolate eine immer größere Bedeutung zukommt. Die Voraussetzung hierfür ist allerdings die Kenntnis spezifischer Resistenzmechanismen und insbesondere die Fähigkeit, diese unter Routinelaborbedingung zu detektieren und zu interpretieren. Im Oktober 2002 fand in Heidelberg ein Konsensustreffen von Mitgliedern der DGHM. DGI und PEG zu diesem Thema statt und es sollen nachfolgend die Ergebnisse dieser Veranstaltung dargestellt werden. Dabei gliedert sich die Übersicht in 4 Teile: 1

2 Methicillin- und Glykopeptid-Resistenz bei Staphylokokken, Makrolid-Resistenz bei Staphylokokken und Streptokokken und schließlich Breitspektrum-ß-Laktamase (ESBL)-bildende Enterobakterien. RESISTENZ VON STAPHYLOKOKKEN GEGEN ß-LAKTAM-ANTIBIOTIKA RESISTENZMECHANISMEN Bei Staphylokokken wird Resistenz gegen ß-Laktam-Antibiotika durch zwei Mechanismen bewirkt. Die Mehrzahl (> 80%) aller klinischen Staphylokokkenisolate bilden Penicillinase, die klassische Penicilline sowie Amino- und Ureidopenicilline inaktiviert, während die Penicillinase-festen Penicilline wie Methicillin und Oxacillin sowie Cephalosporine und Carbapeneme in ihrer Wirkung im wesentlichen nicht beeinträchtigt werden. Hervorzuheben ist, daß die Bildung der Penicillinase (Expression von blaz) durch ß-Laktam-Antibiotika induziert wird (Berger-Bächi, 1997). Ein zweiter Mechanismus der Resistenz gegen ß-Laktam-Antibiotika ist die sogenannte Methicillinresistenz, die durch das meca-gen determiniert wird. MecA ist in einem nur bei Methicillin-resistenten Staphylokokken vorkommenden zusätzlichen genetischen Element SCCmec (Staphylococcus cassette chromosome mec) lokalisiert (Ito et al. 2001, Hiramatsu et al. 2001) und kodiert für das Penicillin-Binde-Protein PBP2a. Staphylokokken besitzen 5 Penicillin-Binde-Proteine, die als membrangebundene DD-Peptidasen eine Transpeptidasereaktion katalysieren, die zur Quervernetzung des Peptidoglycans der bakteriellen Zellwand führt. ß-Laktam-Antibiotika sind Substratanaloga, die kovalent an das Serin-aktive Zentrum der PBP binden und diese damit inaktivieren. Die PBP s 1-3, die eine hohe Affinität für die meisten ß-Laktam-Antibiotika besitzen, sind essentiell für das Zellwachstum sowie das Überleben empfindlicher Stämme. Bei Methicillinresistenten Staphylokokken kann das PBP2a aufgrund seiner rund 1000-fach geringeren Bindungsaffinität für ß-Laktam-Antibiotika diese essentiellen Funktionen übernehmen und dadurch die Zellwandsynthese aufrecht erhalten (Chambers 1997, Labischinski 1992). Hierdurch kommt eine klinische Kreuzresistenz von Methicillin-resistenten Staphylokokken gegen alle ß-Laktam-Antibiotika einschließlich der Carbapeneme zustande, wie sich auch im Tiermodell exemplarisch zeigen lässt (Ling et al. 1993). Die grundsätzlichen Mechanismen der Methicillinresistenz sind bei Staphylococcus aureus und den Koagulase-negativen Staphylokokken identisch. Die phänotypische Expression der Methicillinresistenz ist außerordentlich variabel und von einer Vielzahl von Faktoren abhängig, wie z.b. Wachstumsmedium, Osmolarität, Temperatur sowie Typ des induzierenden ß-Laktam-Antibiotikums. Grundsätzlich kann man zwischen Stämmen mit einem homogenen und einem heterogenen Expressionsphänotyp unterscheiden (Tomasz et al. 1991). Bei homogenen Stämmen haben nahezu alle Zellen der Population eine MHK gegen Methicillin von mehr als 50 µg/ml. Bei heterogenen Stämmen hat ein größerer Anteil der Zellen in der Population eine Methicillin-MHK im sensiblen Bereich, während nur eine kleine Subpopulation hoch resistent ist. Bei sehr heterogen-resistenten Stämmen kann nur eine von 10 8 Zellen resistent sein. Bei Selektion der hochresistenten Population durch ß-Laktam-Antibiotika kommt es zur phänotypischen Ausprägung der homogenen Resistenz. Bei Passage ohne Selektion verliert sich der homogene Expressionstyp jedoch in der Regel wieder und die Erreger werden wieder heterogen-resistent wie der 2

3 Ausgangsstamm. Bei klinischen Isolaten von Koagulase-negativen Staphylokokken ist der Expressionstyp in der Regel noch heterogener als bei S. aureus. Bei einem Teil der Methicillin-resistenten Staphylokokken ist die Expression von meca durch verschiedene ß-Laktam-Antibiotika induzierbar, was durch das Repressorgen meci und das Responseregulatorgen mecr1 reguliert wird (Berger-Bächi und Rohrer 2002). Beide Elemente sind ebenfalls auf SCCmec kodiert. Zusätzlich hängt die phänotypische Expression der Methicillinresistenz von einer Vielzahl unabhängiger Stoffwechselmerkmale (fem- oder aux- Faktoren) sowie regulatorisch wirksamen Genen ab, die bisher am besten für S. aureus charakterisiert sind (Berger-Bächi und Rohrer 2002, Mack et al. 2002). Bei Staphylokokken mit einer geringfügig über dem Grenzwert liegenden Oxacillin-MHK sind verschiedene Resistenzmechanismen möglich. Enthalten diese Stämme meca, handelt es sich um extrem heterogen exprimierende Methicillin-resistente Stämme, bei denen unter ß-Laktam- Exposition homogen resistente Stämme selektioniert werden können. Sind diese Stämme mecanegativ, wird die Methicillinresistenz meistens durch eine Überexpression der Penicillinase (borderline resistant S. aureus: BORSA) oder durch eine Modifikation der Penicillin-bindenden Proteine (modified PBP S. aureus: MODSA) bewirkt. Die Prävalenz von BORSA und MODSA ist sehr niedrig und therapeutisch werden bei Infektionen mit diesen Stämmen ß-Laktam-Antibiotika zumeist als ausreichend wirksam angesehen (Chambers 1997). EPIDEMIOLOGIE Das epidemische Auftreten von Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) ist international ein ständig wachsendes Problem. In Deutschland hat der Anteil von MRSA bei klinischen S. aureus Isolaten seit 1990 dramatisch zugenommen und hat in der jüngsten Studie der PEG die 20%-Marke überschritten 1, wobei lokal erhebliche Unterschiede beobachtet werden. Koagulase-negative Staphylokokken weisen im Gegensatz hierzu weltweit einheitlich eine Methicillinresistenz von 60-80% auf. DIAGNOSTIK Penicillinresistenz Der Nachweis der Penicillinresistenz von Staphylokokken ist nach DIN oder NCCLS M100-S13 im Agardiffusionstest und durch MHK-Bestimmung ohne Probleme möglich (Grenzwerte nach DIN: Agardiffusion < 28 mm resistent; MHK: > 0,125 µg/ml resistent; bzw. nach NCCLS: Agardiffusion < 28 mm resistent; MHK: > 0,1 µg/ml resistent). Da Penicillin G bei Infektionen mit empfindlichen Staphylokokken wegen seiner höheren Aktivität das Mittel der Wahl ist, muss in diesen Fällen die Bestätigung der Penicillin-Empfindlichkeit mit Hilfe des Penicillinase- Tests (z.b. Cefinase ) durchgeführt werden. Da die Penicillinase der Staphylokokken induzierbar ist, sollen Staphylokokken erst nach Induktion mit subinhibitorischen Konzentrationen eines ß- Laktam-Antibiotikums getestet werden. Hierzu kann entweder Koloniematerial vom Hemmhofrand eines Oxacillin-Plättchens im Agardiffusionstest oder Zell-Suspension aus subinhibitorischen Konzentrationen der MHK-Bestimmung verwendet werden (Swenson et al. 1999). 1 ( 3

4 Methicillinresistenz Die Detektion der Methicillinresistenz bei Staphylokokken ist mit genotypischen und phänotypischen Verfahren möglich. Der Nachweis des meca Gens mittels PCR oder anderer molekularbiologischer Verfahren hat sich heute als Goldstandard etabliert, der zur Validierung der phänotypischen Verfahren verwendet wird (Fluit et al. 2001). Jedoch sind die genotypischen Verfahren derzeit noch so aufwendig und teuer, dass sie als Standardtests zur Bestimmung der Methicillinresistenz im Routinelabor nicht in Frage kommen. Zur Detektion der Methicillinresistenz bei Staphylokokken sind Methicillin und Oxacillin geeignet, verwendet wird jedoch meist Oxacillin. Andere ß-Laktam-Antibiotika sind nicht geeignet und dürfen zur Bestimmung der Methicillinresistenz bei Staphylokokken nicht verwendet werden. Die nachfolgenden Verfahren orientieren sich an den Empfehlungen des DIN bzw. NCCLS (Tabelle 1). Phänotypische Verfahren zur Bestimmung der Methicillinresistenz sind MHK-Bestimmung, Agardiffusionstest, Agar-Screen-Test, Oxacillin E-Test sowie der immunchemische Nachweis des PBP2a mittels Latexagglutination automatisierte Resistenzbestimmung. Tabelle 1: Verfahren zur Bestimmung der Methicillinresistenz bei Staphylokokken Verfahren Medium Substanz Grenzwert (resistent) Temperatur Zeit MHK (NCCLS) S. aureus Koagulase-negative Staphylokokken MH + 2% NaCl MH + 2% NaCl Oxacillin Oxacillin 4µg/ml 0,5 µg/ml 35 o C 35 o C MHK (DIN) MH + 3% NaCl Oxacillin 2 µg/ml 36 ± 1 o C 24 h Agardiffusion (NCCLS) S. aureus Koagulase-negative Staphylokokken MHA MHA Oxacillin 1 µg Oxacillin 1 µg 10-13mm* 17 mm Agardiffusion (DIN) MHA Oxacillin 5 µg 15 mm 36 ± 1 o C 18 ± 2 h Agar-Screen (NCCLS) S. aureus Koagulase-negative Staphylokokken E-Test (AB Biodisk) S. aureus Koagulase-negative Staphylokokken MHA + 4% NaCl MHA + 4% NaCl MHA + 2% NaCl MHA + 2% NaCl Oxacillin 6 µg/ml Oxacillin 6 µg/ml Oxacillin Oxacillin Wachstum Wachstum NCCLS/DIN 4/2 µg/ml 0,5/2 µg/ml 35 o C 35 o C 35 o C 35 o C 35 o C 35 o C * resistent 10 mm; sensibel 13 mm; bei intermediärem Testergebnis muß ein Agar-Screen Test durchgeführt MHK-Bestimmung mittels Bouillon-Dilutionstest (Mikrodilution) 4 24 h 24 h 24 h 24 h h h

5 Dieses Verfahren stellt die Standardmethode für die Bestimmung der Empfindlichkeit gegen Oxacillin dar. Im NCCLS-Dokument M100-S13 werden Mueller-Hinton Bouillon + 2% NaCl, eine Einsaatdichte von 3-7 x 10 5 KBE/ml und Inkubation bei 35 o C für 24 h empfohlen. Die Grenzwerte für die Bewertung sind für S. aureus und Koagulase-negative Staphylokokken verschieden (Tab. 1). Gemäß DIN (Fassung vom Oktober 2002) wird Mueller-Hinton Bouillon + 3% NaCl 2, eine Einsaatdichte von 1-5 x 10 5 KBE/ml und eine Bebrütungsdauer von mindestens 24 h bei 36 ± 1 o C für S. aureus empfohlen. Für Koagulase-negative Staphylokokken werden in der DIN-Norm keine spezifischen Empfehlungen gegeben. Der Grenzwert ist für S. aureus und Koagulase-negative Staphylokokken identisch, unterscheidet sich jedoch von den empfohlenen Grenzwerten der NCCLS (Tab. 1). Die von NCCLS in der Mikrodilution für S. aureus und Koagulase-negative Staphylokokken festgelegten Grenzwerte wurden mit der meca-pcr als Goldstandard von verschiedenen Autoren validiert. Dabei konnten für S. aureus eine exzellente Sensitivität und Spezifität nachgewiesen werden. Dies ist insbesondere für die Studie von Swenson et al. (2001a) bemerkenswert, bei der MRSA-Stämme mit besonders heterogenem Expressionstyp und MSSA-Isolate mit einer Oxacillin- MHK nahe am Grenzwert untersucht wurden. Gleiches gilt bei Koagulase-negativen Staphylokokken mit dem seit 1999 gültigen NCCLS-Grenzwert von 0,5 µg/ml nur für die Spezies S. epidermidis und S. haemolyticus, während insbesondere bei S. saprophyticus und S. lugdunensis eine sehr schlechte Spezifität nachgewiesen wurde (Gradelski et al. 2001, Horstkotte et al. 2001a, Louie et al. 2001, Yamazumi et al. 2001a). Agardiffusionstest Die NCCLS empfiehlt für den Agardiffusionstest Mueller-Hinton Agar ohne NaCl- Supplementierung und ein 1 µg Oxacillinplättchen. Die Bebrütung soll für 24 h bei 35 o C erfolgen. Für S. aureus und Koagulase-negative Staphylokokken werden seit 1999 verschiedene Grenzwerte angegeben. Für S. aureus muß bei Ergebnissen im intermediären Bereich ein Agar-Screen-Test (s.u.) angeschlossen werden. Die DIN-Richtlinie empfiehlt für den Agardiffusionstest zur Bestimmung der Oxacillinresistenz von Staphylokokken kein vom normalen Verfahren abweichendes Vorgehen. Die Testung erfolgt mit Mueller-Hinton Agar ohne NaCl-Supplementierung und einem 5 µg Oxacillinplättchen. Das Inokulum soll dicht, jedoch noch einzeln stehende Kolonien ergeben. Die Bebrütung erfolgt bei 36 ± 1 o C für 18 ± 2 h. Das Verfahren der NCCLS wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen für S. aureus und Koagulasenegative Staphylokokken mit der meca-pcr validiert. Die Sensitivität war für alle Staphylokokken gut und lag in einem Bereich von 93,5% bis 100%. Die Spezifität für eine besonders problematische Population von S. aureus (MRSA mit besonders heterogenem Expressionstyp und MSSA mit einer Oxacillin-MHK nahe am Grenzwert) lag bei 89% (Swenson et al. 2001a). Die Spezifität lag bei Koagulase-negativen Staphylokokken niedriger, was zu einem erheblichen Teil auf Koagulasenegative Staphylokokken der Spezies S. saprophyticus und S. lugdunensis zurückzuführen war (Louie et al. 2001, Monsen et al. 2002). 2 Die Empfehlung für den höheren Anteil von 3% NaCl hat historische Gründe, wobei Vergleichsuntersuchungen mit einem NaCl-Anteil von 2% keine Unterschiede ergaben (pers. Mitteilung Dr. Schmalreck, München) 5

6 Agar-Screen Test Der Agar-Screen Test ist ein Breakpointverfahren, das von der NCCLS zur Bestimmung der Methicillinresistenz für S. aureus empfohlen wird. Der Teststamm wird in physiologischer Kochsalzlösung mit einer Keimdichte entsprechend 0,5 McFarland suspendiert. Mit einem in der Suspension getränkten und von überschüssiger Flüssigkeit befreiten Tupfer wird das Inokulum auf einer Fläche von mm Durchmesser aufgebracht (Spot-Inokulation) oder auf einen Quadranten einer mit 4% NaCl supplementierten Mueller-Hinton Agarplatte, die 6 µg/ml Oxacillin enthält, ausgestrichen. Alternativ kann auch eine kalibrierte 1 µl Einmalöse zur Applikation des Inokulums auf einer Fläche von mm Durchmesser (Spot) verwendet werden. Die Bebrütung erfolgt bei 35 o C für 24 h (S. aureus) oder für 48 h (Koagulase-negative Staphylokokken). Als positiv gilt Wachstum von mindestens 2 Kolonien. Es ist zu beachten, dass nach der Umstellung der MHK- Grenzwerte für Koagulase-negative Staphylokokken durch die NCCLS der Agar-Screen Test nicht mehr für die Bestimmung der Methicillinresistenz von Koagulase-negativen Staphylokokken empfohlen wird (Tenover et al. 1999). Eine kürzlich veröffentlichte Studie zum Vergleich der Sensitivität der unterschiedlichen Applikationsarten im Agar-Screen Test zeigte für das Spot-Verfahren (mit Tupfer) und den Quadranten-Ausstrich eine gleich hohe Sensitivität und Spezifität, während sie bei der Applikation mit einer Einmalöse vermindert waren. Aus diesem Grund sollten nur die (Tupfer-)Spot- und die Quadrantenmethode zum Einsatz kommen (Swenson et al. 2001b). Darüberhinaus zeigte sich auch die eingangs erwähnte deutliche Chargenabhängigkeit von den verwendeten Mueller-Hinton-Medien. Untersuchungen verschiedener Arbeitsgruppen zur Spezifität und Sensitivität des Agar-Screen Tests zeigten für S. aureus und Koagulase-negative Staphylokokken sehr gute Werte (Tab. 2). Probleme traten auf bei BORSA-Stämmen, MRSA-Isolaten mit gering ausgeprägter Resistenz gegen andere Antibiotikaklassen und extrem heterogen exprimierenden MRSA-Stämmen. Bei Koagulasenegativen Staphylokokken zeigte sich der Agar-Screen Test in zwei Untersuchungen nach 48 h Bebrütung als äußerst sensitiv und spezifisch (Louie et al. 2001, Horstkotte 2003). Tabelle 2: Detektion von MRSA und MRSE mittels Agar-Screen Test Anzahl (N) Sensitivität Spezifität (%) Bemerkungen Autor (%) ,0 98,0 Yamazumi 2001b ,0 85,5 37 BORSA Louie 2000, Merlino ,3 100 NMDR MRSA Merlino 2002 problematisch ,0 98,1 Sakoulas ,5 91,7 Challenge set Sakoulas (KNST)* (Louie 2001) 201 (KNST)* 97,6 99,2 98,7 96 Spot Quadrant (Horstkotte, 2003) KNST: koagulasenegative Staphylokokken, * NCCLS-Grenzwerte nach 48 h bei 35 o C NMDR: non-multidrug-resistant 6

7 Als Kontrollstämme sind im Agar-Screen Test ein heterogen-exprimierender meca-positiver S. aureus (z.b. ATCC 43300) sowie ein meca-negativer S. aureus (z.b. ATCC 29213) mitzuführen. Oxacillin MHK-Bestimmung mittels E-Test Der E-Test (AB Biodisk, Solna, Schweden) hat sich mittlerweile als leicht durchführbare Alternative zur Mikrodilutions-Methode für die MHK-Bestimmung bewährt. Nach Empfehlungen des Herstellers soll für den Oxacillin E-Test Mueller-Hinton Agar mit 2% NaCl sowie ein Inokulum mit einer Dichte entsprechend 1,0 McFarland angelegt werden. Die Bebrütung erfolgt bei 35 o C für 24 h (S. aureus) oder 48 h (Koagulase-negative Staphylokokken). Bei der Ablesung der MHK muss schleierförmiges Wachstum, Mikrokolonien und einzeln stehende Kolonien im Bereich der Hemmhofellipse als Wachstum berücksichtigt werden. Der Kontrollstamm S. aureus ATCC soll eine MHK von 16 bis 64 µg/ml aufweisen. Die Bewertung erfolgt nach den DIN- bzw. NCCLS-Kriterien. Die Validierung des Oxacillin E-Testes für S. aureus und Koagulase-negative Staphylokokken (Felten et al. 2002, Frebourg et al. 1998, Huang et al. 1993, Louie et al. 2001, Merlino et al. 1993, Monsen et al. 2002) ergab bei S. aureus eine etwas schlechtere Sensitivität als die MHK- Bestimmung mittels Mikrodilutions-Test nach NCCLS. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, daß bei sehr heterogen exprimierenden MRSA die Ablesung der maximalen MHK der Gesamtpopulation schwieriger ist als bei einer konventionellen MHK-Bestimmung. Die Spezifität erwies sich als sehr gut. Die Untersuchungen des Oxacillin E-Testes bei Koagulase-negativen Staphylokokken spiegeln die Probleme der Grenzwertfestlegung bei diesen Erregern wieder. In zwei Studien war die Sensitivität bei Anwendung der Grenzwerte der DIN ( 2 µg/ml) deutlich unter 90%, während der Grenzwert der NCCLS ( 0,5 µg/ml) zu einer sehr guten Sensitivität führte (Frebourg et al. 1998, Monsen et al. 2002). Auch beim Oxacillin E-Test zeigte sich, dass die neuen Grenzwerte der NCCLS für Koagulase-negative Staphylokokken anderer Spezies als S. epidermidis und S. haemolyticus zu einer deutlich schlechteren Spezifität führen (Louie et al. 2001). Immunchemischer Nachweis von PBP2a mittels Latexagglutination Eine neue, attraktive Möglichkeit zur Detektion der Methicillin-Resistenz bei Staphylokokken ist der direkte Nachweis des PBP2a mittels Latexagglutination mit einem für PBP2a spezifischen monoklonalen Antikörper (MRSA-Screen, Denka Seiken, Japan; PBP2 Latex Agglutination Kit, Oxoid, UK). Der Test ist von der FDA zur Bestimmung der Methicillinresistenz bei S. aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken zugelassen und wird von der NCCLS auch für Koagulasenegative Staphylokokken empfohlen. Wichtig bei diesem Test ist die exakte Durchführung nach den Angaben des Herstellers, da es sonst leicht zu falschen Ergebnissen kommen kann. Darüber hinaus wird für Koagulase-negative Staphylokokken die Präparation des Testinokulums von einer Kultur empfohlen, die für 24 h unter Induktion mit einem 1 µg Oxacillin-Plättchen subkultiviert wurde. Als Kontrollstämme sollen MRSA ATCC bzw. der MSSA ATCC mitgeführt werden. Zwar kann das Inokulum von Kulturen, die auf verschiedenen Agarmedien angezüchtet wurden, hergestellt werden, die besten Ergebnisse werden jedoch mit Kolonien von Blutagar-Medien erzielt. Das Testergebnis liegt innerhalb von 30 Minuten vor und trägt damit zur erheblichen Beschleunigung des MRSA-Nachweises bei. 7

8 Untersuchungen zur Wertigkeit dieses Testverfahrens wurden von zahlreichen Arbeitsgruppen durchgeführt (Andrews et al. 2000, Brown und Walpole 2001, Cuny et al. 1999, Felten et al. 2002, Gosbell et al. 2001, Horstkotte et al. 2001a, Hussain et al und 2002, Louie et al. 2000, Merlino et al. 2002, Rohrer et al. 2001, Sakoulas et al. 2001, Swenson et al. 2001a, Yamazumi et al a + b, Zbinden et al. 2001). Dabei zeigte sich generell sowohl für S. aureus als auch für Koagulase-negative Staphylokokken eine exzellente Sensitivität und Spezifität. Wenn falsch-positive Resultate bei Koagulase-negativen Staphylokokken auftraten, war das meist bei den Spezies S. lugdunensis, S. warneri, S. simulans und S. hominis zu beobachten. Da die Sensitivität des Tests letztlich von der Quantität des exprimierten PBP2a abhängt, wurden die in einigen Studien festgestellten Probleme einer geringeren Sensitivität entweder durch ein höheres Inokulum (Horstkotte et al. 2001a, Sakoulas et al. 2001), eine verlängerte Agglutinationszeit (Swenson et al. 2001) oder eine Induktion der Expression von PBP2a durch ß-Laktamantibiotika gelöst (Hussain et al und 2001, Roher et al. 2001). Diese Modalitäten sind in der aktuellen Arbeitsvorschrift berücksichtigt. Automatisierte Resistenzbestimmungsverfahren Im klinisch-mikrobiologischen Labor ergänzen bzw. ersetzen automatisierte Identifizierungs- und Resistenzbestimmungssysteme wie VITEK-2 (biomérieux), Phoenix (Becton Dickinson) und MicroScan Walkaway (Dade Behring) zunehmend die klassischen manuellen oder halbautomatisierten Verfahren. Ein Problem bei der Bewertung von Studien zur Validation dieser Systeme zur Bestimmung der Methicillinresistenz von Staphylokokken ist, dass die für diese Systeme angebotenen Reagenzien und die Auswertungssoftware einer kontinuierlichen Modifikation und Verbesserung unterworfen sind und damit Angaben in Publikationen häufig schon wieder überholt sind. Beispielhaft seien Untersuchungen zur Validierung von VITEK 2 bei S. aureus und Koagulasenegativen Staphylokokken im Vergleich zur meca-pcr dargestellt. Für S. aureus ergab sich in zwei Studien eine gute Sensitivität und Spezifität (Felten et al. 2002, Sakoulas et al. 2001). Bei diesen Studien wurde die in den VITEK 2 Karten parallel durchgeführte ausgedehnte Breakpoint-Analyse im relevanten MHK-Bereich für Oxacillin und der Oxacillinresistenz-(OR)-Test allerdings nicht getrennt ausgewertet. In einer Untersuchung mit Koagulase-negativen Staphylokokken zeigte sich eine sehr gute Sensitivität für die im VITEK-2 durchgeführten ausgedehnten Breakpoint-Analyse im relevanten MHK-Bereich mit den aktuellen Grenzwerten der NCCLS und für den OR-Test (Horstkotte et al. 2002). Die Spezifität dieser Methode war im Vergleich zum OR-Test wesentlich weniger günstig, wie sich dies auch für andere MHK-basierende Tests für Koagulase-negative Staphylokokken ergeben hat. Ähnliche Spezifitäts-Probleme bei guter Sensitivität (99,2%), die mit der Wahl der Grenzwerte durch die NCCLS für Koagulase-negative Staphylokokken zusammenhängen, zeigten sich auch für das Phoenix-System (Horstkotte et al. 2001b). Empfehlungen zur Bestimmung der Methicillinresistenz Die unterschiedlichen Untersuchungen zur Validierung der verschiedenen Verfahren zur Bestimmung der Methicillinresistenz bei Staphylokokken belegen, daß kein einzelnes Verfahren in der Lage ist, für alle denkbaren problematischen Situationen optimale Ergebnisse zu liefern. Dies gilt sicher auch für den molekularbiologischen Nachweis des meca-gens, der sich in Studienkonstellationen zwar als Goldstandard etabliert hat, im Routineeinsatz jedoch ebenfalls mit Problemen der Sensitivität und Spezifität behaftet ist. 8

9 Zur Detektion von Methicillin-resistenten S. aureus sollte grundsätzlich der Agar-Screen Test eingesetzt werden. Wegen der großen Bedeutung der sicheren Detektion von MRSA sollte dieser Test durch einen parallel durchgeführten zweiten phänotypischen Test wie z.b. Agardiffusionstest, MHK-Bestimmung in der klassischen Mikrodilutions-Methode, Oxacillin E-Test oder auch durch automatisierte Methoden der Resistenzbestimmung ergänzt werden. Wenn ein nicht eindeutiges oder unplausibles Testergebnis vorliegt, muss die Testung mit einem weiteren Referenzverfahren überprüft werden. In Frage kommen dabei der direkte Nachweis des PBP2a mittels Latexagglutination oder ein genotypischer meca-nachweis mit einer validierten Methode. Die Resistenztestung bei Koagulase-negativen Staphylokokken ist problematischer. Zwar ist die Sensitivität der meisten Verfahren gut, jedoch ist die Spezifität der Detektion von Methicillinresistenten Koagulase-negativen Staphylokokken wesentlich vom verwendeten Grenzwert (DIN oder NCCLS) abhängig. Derzeit ist die Diskussion über den "richtigen" Grenzwert nicht abgeschlossen. Es wäre denkbar, dass Grenzwerte in Abhängigkeit von der jeweiligen Spezies zur Lösung dieses Problems beitragen. Die NCCLS empfiehlt deshalb z.b. S. saprophyticus nicht routinemäßig auf Oxacillinresistenz zu testen. So ist derzeit für das Routinelabor neben der Speziesidentifizierung klinisch relevanter Koagulasenegativer Staphylokokken-Isolate zusätzlich zum Agar-Screen Test die MHK-Bestimmung empfehlenswert. Als Alternative bietet sich z.b. Agardiffusionstest nach NCCLS-Version und ergänzend der direkte PBP2a- oder ein genotypischer meca-nachweis an. Befundinterpretation Das Ziel der Resistenzbestimmung von Staphylokokken bezüglich Penicillin und Oxacillin ist die interpretative Festlegung der Empfindlichkeit der Stämme gegen eine Reihe von ß-Laktam- Antibiotika. Bei Methicillin-Resistenz werden alle Staphylokokken als resistent gegen alle ß-Laktam- Antibiotika interpretiert. Bei Methicillin-empfindlichen Staphylokokken erfolgt die Interpretation auf der Grundlage ihrer Empfindlichkeit gegenüber Penicillin: o Bei Penicillinase-positiven Staphylokokken sind alle nicht Penicillinase-festen Penicilline (klassische Penicilline, Aminopenicilline, Ureidopenicilline) als unwirksam einzustufen. Penicillinase-feste Penicilline, Penicillin- ß-Laktamase-Inhibitor- Kombinationen, parenterale und orale Cephalosporine der Gruppen 1 und 2 und Carbapeneme sind als wirksam zu bewerten. Auch die Cephalosporine der 3. und 4. Generation sind mit Ausnahme von Ceftazidim in der Regel gegen Staphylokokken wirksam, sind aber aufgrund ihrer geringeren Aktivität nicht Mittel der Wahl bei Infektionen mit Staphylokokken. o Bei Penicillinase-negativen Staphylokokken sind alle Penicilline, Penicillinase-festen Penicilline, Carbapeneme und parenterale und orale Cephalosporine der Gruppen 1 und 2 als wirksam einzustufen. Für die übrigen Cephalosporine gilt das oben gesagte. 9

10 o Die oralen Cephalosporine der Gruppe 3 haben eine geringe Aktivität gegen Staphylokokken und sind zum Teil unwirksam gegen diese Erreger (Scholz et al. 1999). RESISTENZ VON STAPHYLOKOKKEN GEGEN GLYKOPEPTIDE RESISTENZMECHANISMEN Grundsätzlich lassen sich derzeit zwei unterschiedliche Formen der Glykopeptidresistenz bei Staphylokokken unterscheiden (Walsh und Howe, 2002). Erstmals beschrieben Hiramatsu et al. (1997) einen klinischen MRSA-Stamm Mu50 mit einer MHK für Vancomycin von 8 µg/ml. Die Bewertung dieses Stammes hängt entscheidend von den verwendeten Grenzwerten ab. Nach NCCLS ( 4 µg/ml sensibel, 32 µg/ml resistent) ist dieser Stamm als intermediär zu bewerten. Gleiches gilt für die Grenzwerte des DIN ( 4 µg/ml sensibel, 16 µg/ml resistent). Die British Society for Antimicrobial Chemotherapy gibt jedoch einen Grenzwert von 4 µg/ml für Vancomycin an, womit dieser Stamm als resistent zu bewerten ist (Walsh et al., 2001). Stämme dieser Art werden derzeit als VISA oder GISA bezeichnet. Die verminderte Vancomycin-Empfindlichkeit hat vermutlich auch klinische Relevanz, da ein Versagen einer Therapie mit Vancomycin bei Infektionen mit solchen Stämmen beschrieben wurde (Smith et al., 1999). Zusätzlich wurden Stämme wie der MRSA Mu3 beschrieben, die zwar eine MHK gegenüber Vancomycin von 4 µg/ml hatten, bei denen jedoch eine Subpopulation (bis zu 1 von 10 6 Zellen) eine MHK > 4 µg/ml aufwiesen (Hiramatsu, 1997). Solche Stämme werden als hetero-visa (hvisa) oder hgisa bezeichnet. Die klinische Bedeutung von hgisa ist derzeit ungewiß. Möglicherweise sind jedoch solche Stämme Vorläufer von GISA, die unter Vancomycintherapie selektioniert werden können. Alle bisherigen Untersuchungen zeigen, daß GISA und hgisa auch eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Teicoplanin aufweisen (Walsh et al., 2001). Die Grenzwerte für die Beurteilung der Teicoplanin-Empfindlichkeit sind nach NCCLS ( 8 µg/ml sensibel; 32 µg/ml resistent) und nach DIN ( 4 µg/ml sensibel; 16 µg/ml resistent) ebenfalls verschieden. Bisher wurden weltweit 21 GISA-Stämme isoliert und beschrieben (Walsh und Howe, 2002). Die Prävalenz von hgisa wird in den meisten Untersuchungen sehr niedrig angegeben (um 1%), jedoch wurde auch ein Anteil von bis zu 20% mitgeteilt (Walsh und Howe, 2002). GISA-Stämme wurden auch in Deutschland nachgewiesen, die Prävalenz ist derzeit aber sehr niedrig (Geisel et al., 1999; Bierbaum et al., 1999). Problematisch bei der Beurteilung von Studien zur Prävalenz von hgisa ist die bisher fehlende Standardisierung und Validierung der in den verschiedenen Untersuchungen angewandten Techniken zur Detektion von hgisa, so daß die epidemiologischen Aussagen derzeit unsicher sind. Von GISA/hGISA-Stämmen abzugrenzen sind S. aureus Stämme mit einer echten Vancomycin- Resistenz, die durch Transfer der vana-determinante von Vancomycin-resistenten Enterokokken entstanden sind. Erstmals wurden im Jahre 2002 zwei derartige klinische MRSA-Isolate in den USA mit einer Vancomycin-MHK von bis zu 1024 µg/ml nachgewiesen und als VRSA bezeichnet (Chang et al. 2003). Die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von vana- oder vanb-vermittelter Resistenz ist wegen der derzeit noch geringen Prävalenz von VRE in Deutschland als extrem gering anzusehen. Ein Auftreten solcher 10

11 Stämme ist allerdings auch in Deutschland nicht auszuschließen. Bei Koagulase-negativen Staphylokokken sind insbesondere bei der Spezies S. epidermidis und S. haemolyticus vereinzelt klinische Stämme mit verminderter Vancomycin-Empfindlichkeit und sogar Resistenz gegen Teicoplanin beschrieben worden (Srinivasan et al., 2002). Eine durch vana und vanb oder andere aus Enterokokken stammende Resistenzdeterminanten verursachte Resistenz gegen Glykopeptide ist bei Koagulase-negativen Staphylokokken bisher nicht aufgetreten. DETEKTION VON GISA UND VRSA Ziel der Empfindlichkeitstestung von Glycopeptiden bei Staphylokokken muß es sein, sowohl Staphylokokken mit einer vana- oder vanb-vermittelten Resistenz (VRSA) als auch GISA/hGISA zu erkennen. Der Agardiffusionstest ist für die Detektion von VRSA und GISA/hGISA nicht geeignet (Walsh and Howe, 2002). Auch mit automatisierten Resistenzbestimmungssystemen wie MicroScan und VITEK wurde über Probleme mit der Sensititvität berichtet (Srinivasan et al., 2002; Midolo et al., 2003). Für VITEK wird derzeit deswegen vom Hersteller empfohlen, alle Isolate mit einer Vancomycin- MHK von 4 µg/ml mit einem unabhängigen Verfahren auf GISA/hGISA zu prüfen (K. Kähler, BioMérieux, persönliche Mitteilung). Eine definitive Bestätigung von GISA/hGISA erfordert eine Populationsanalyse, die in der Regel nur von Referenzlaboratorien durchgeführt werden kann. Die Detektion von VRSA ist mit einem Agar-Screen Test (BHI-Agar + 4 µg/ml Vancomycin) oder auch dem Bouillon-Dilutionsverfahren nach NCCLS oder DIN oder mittels E-Test möglich. Auf der Grundlage der bisherigen wissenschaftlichen Untersuchungen ist der Agar-Screen Test wahrscheinlich am empfindlichsten. Die anderen Verfahren, die zum Nachweis Vancomycinresistenter Enterokokken empfohlen werden, sind vermutlich aber auch geeignet, es liegen allerdings noch keine ausreichenden Erfahrungen vor. Auch bei Koagulase-negativen Staphylokokken kann nur durch ein MHK-Bestimmung eine reduzierte Glykopeptidempfindlichkeit festgestellt werden. Sowohl Agardiffusionstest als auch automatisierte Verfahren weisen eine geringe Sensitivität auf (Jones et al. 2000). Dem klinisch-mikrobiologischen Labor stehen zum Screening auf GISA/hGISA verschiedene Tests zur Verfügung. Zu beachten ist, daß die wissenschaftliche Diskussion über das optimale Nachweisverfahren noch nicht abgeschlossen ist. Nach dem derzeitigen Stand sind im Routinelabor drei Verfahren möglich: Vereinfachte Populationsanalyse E-Test (Makroverfahren Walsh et al. 2001) Bouillon-Dilution nach NCCLS 1. Vereinfachte Populationsanalyse: Bei der vereinfachten Populationsanalyse werden 10 µl einer Suspension (0,5 McFarland) des Teststammes auf eine BHI-Agarplatte mit 4 µg/ml Vancomycin aufgebracht. Die Inkubation erfolgt für insgesamt 48 h bei 37 o C (Witte 1997, Walsh et al. 2001). Bei Wachstum nach 24 h kann ein GISA-Phänotyp (cave VRSA) angenommen werden. Bei Wachstum nach 48 h kann ein hgisa-phänotyp angenommen werden. Dieses Verfahren kann GISA/hGISA von normalen MRSA mit einer Sensitivität von 71% und einer Spezifität von 88% unterscheiden (Walsh et al. 2001). Eine Modifikation dieses Verfahrens sieht die Applikation von 10 µl einer BHI-Bouillon Übernachtkultur auf MHA + 5 µg/ml Teicoplanin vor. Die Bebrütung erfolgt ebenfalls für 24 bzw. 11

12 48 h. Obwohl derzeit keine publizierten Ergebnisse zur Validität dieses Verfahrens vorliegen, wird es vom European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) als besonders sensitiv zum Screening auf GISA/hGISA empfohlen (T. R. Walsh, University of Bristol, UK, persönliche Mitteilung). 2. Für den E-Test in der "Makroversion" wird der Teststamm auf eine Dichte entsprechend 2,0 McFarland eingestellt und ein Aliquot von 200 µl auf BHI-Agar ausgespatelt oder mit einem Tupfer gleichmäßig verteilt (Walsh et al. 2001). Nach Antrocknen des Inokulums werden Vancomycin und Teicoplanin E-Teststreifen appliziert. Inkubation erfolgt bei 35 o C für 48 h (AB Biodisk, Beschreibung des Herstellers). Die Ablesung der MHK erfolgt unter der Berücksichtigung von Mikrokolonien, einzeln stehenden Kolonien und schleierförmigem Wachstum. Als verdächtig für GISA/hGISA gelten Stämme mit Vancomycin und Teicoplanin- MHK 8 µg/ml oder Teicoplanin-MHK 12 µg/ml. Das beschriebene Verfahren erwies sich als das mit der besten Sensitivität (96%) und Spezifität (97%) zur Abgrenzung von GISA/hGISA von normalen MRSA (Walsh et al. 2001). 3. Die NCCLS empfiehlt beim Bouillon-Dilutionstest für Vancomycin die Einhaltung einer Inkubationszeit von 24 h, damit auch GISA erkannt werden. Bei Inkubation für nur 18 h wurde eine schlechte Sensitivität (11%) für die Abgrenzung von GISA/hGISA von normalen MRSA festgestellt, die auch bei Verwendung von Teicoplanin nur wenig besser wurde (Sensitivität 40%) (Walsh et al. 2001). Problematisch war vor allem die Detektion von hgisa. Nach dem derzeitigen Kenntnisstand ist der E-Test in der Makroversion das am besten validierte Verfahren zur Detektion von GISA/hGISA, ist jedoch mit relativ hohen Kosten verbunden. EMPFEHLUNGEN ZUR BESTIMMUNG DER WIRKSAMKEIT VON GLYKOPEPTIDEN Wenn eine Empfindlichkeitsprüfung von S. aureus Isolaten gegen Glykopeptide durchgeführt wird, muß diese mit einem geeigneten Verfahren erfolgen, das eine vana- oder vanb- oder durch andere Resistenzdeterminanten von Enterokokken vermittelte Glykopeptidresistenz ausschließt (VRSA). Hierzu kann aufgrund der Datenlage derzeit uneingeschränkt nur der Agar- Screen Test (BHI-Agar + 4 µg/ml Vancomycin) empfohlen werden. Ein Screening auf GISA/hGISA ist zumindest bei den S. aureus Stämmen von Patienten empfehlenswert, bei denen eine längerdauernde Glykopeptidtherapie (> 6 Wochen) erfolgt. Es ist sinnvoll, auf GISA/hGISA in einem zweistufigen Test zu untersuchen. Im ersten Schritt wird die vereinfachte Populationsanalyse durchgeführt. Im positiven Fall sollte wegen der relativ geringen Spezifität der vereinfachten Populationsanalyse im zweiten Schritt der E-Test in der Makroversion durchgeführt werden, der ebenfalls jedem klinisch-mikrobiologischen Labor verfügbar ist. Als Qualitätskontrolle können S. aureus Mu50 (GISA), Mu3 (hgisa) und z.b. ATCC verwendet werden. Bestätigt sich der Verdacht auf GISA/hGISA, sollten die Isolate zur weiteren Untersuchung an ein Referenzlaboratorium (z.b. Nationales Referenzzentrum für Staphylokokken, Wernigerode) versandt werden. Hierbei soll der verdächtige Stamm direkt mit der E-Testplatte versandt werden. 12

13 Für Koagulase-negative Staphylokokken können diese Verfahren sinngemäß angewendet werden, jedoch liegen keine Untersuchungen zur Sensitivität und Spezifität der Detektion von Koagulase-negativen Staphylokokken mit verminderter Empfindlichkeit gegen Glykopeptide vor. MLS B -RESISTENZ BEI STAPHYLOKOKKEN UND STREPTOKOKKEN RESISTENZMECHANISMEN Die Resistenz gegenüber Makroliden und Lincosamiden ist durch drei Mechanismen bedingt (Douthwaite 2001, Leclercq 2002): Veränderungen an der ribosomalen Bindungsstelle durch Methylierung oder Mutation (target-site modification) Effluxmechanismen Enzymatische Inaktivierung Im Vordergrund stehen dabei die ersten beiden Mechanismen, während die enzymatische Inaktivierung der Antibiotika nur eine untergeordnete Rolle spielt. Der Wirkmechanismus der Makrolide und der anderen Vertreter der MLS B -Antibiotika, zu denen die Lincosamide, Ketolide und Streptogramine der Gruppe B gehören (Tab. 3), beruht auf der Hemmung der bakteriellen Proteinsynthese durch ihre Bindung im Bereich des Peptidyl-Transferase- Zentrums innerhalb der 50S-Untereinheit des bakteriellen Ribosoms, welche dazu führt, dass die Translation der Messenger-RNA verhindert wird (Douthwaite und Champney 2001). Makrolide binden an die Nukleotide A2058 und A2059 der Domäne V der 23S rrna sowie in geringerem Ausmaß an A752 der Domäne II. Die Ketolide zeichnen sich gegenüber den Makroliden durch eine erheblich stärkere Bindung an A752 aus. Letztendlich kommt es zu einer Blockierung des Peptid- Exit-Channels der ribosomalen 50S-Untereinheit und einem Abbruch der wachsenden Peptidkette. Außerdem verhindern Makrolide und Ketolide offenbar den Aufbau neuer 50S-Untereinheiten des bakteriellen Ribosoms aus ihren Vorstufen, u.a. 5S- und 23S rrna (Douthwaite und Champney 2001). 13

14 Tab. 3: Übersicht über MLS-Antibiotika Substanzklasse Antibiotikum Handelsname (Auswahl) Makrolide mit 14-gliedrigem Laktonring mit 15-gliedrigem Laktonring (Azalide) mit 16-gliedrigem Laktonring Erythromycin Clarithromycin Dirithromycin Oleandomycin Roxithromycin Azithromycin Josamycin Rokitamycin Spiramycin Erythrocin Klacid Rulid Zithromax Wilprafen Selectomycin Ketolide Telithromycin Ketek Lincosamide Streptogramine 1 Gruppe A Gruppe B Lincomycin Clindamycin Dalfopristin Pristinamycin IIA Virginiamycin M Quinupristin Pristinamycin IA Albiotic Sobelin 1 Im Handel befindliche Streptogramin-Antibiotika enthalten ein Gemisch aus jeweils einem Streptogramin- Antibiotikum der Gruppe B und A: Pristinamycin IA und Pristinamycin IIA (Pristinamycin), Quinupristin und Dalfopristin (Synercid ) Target-site Modifikationen Methylierung der ribosomalen Bindungsstelle Durch Methylierung der Bindungsstelle A2058 der 23S rrna innerhalb der großen ribosomalen 50S-Untereinheit erfolgt eine Konformationsänderung der 23S rrna, durch die die Bindung von Erythromycin an seine Zielstruktur verhindert wird (Leclercq 2002). Als Folge ihrer überlappenden ribosomalen Bindungsstellen wird auch die Bindung von Lincosamiden und Streptograminen der Gruppe B beeinträchtigt, wodurch eine Kreuzresistenz gegenüber allen Makroliden, Lincosamiden und Streptograminen der Gruppe B (sogenannter MLS B -Resistenzphänotyp) resultiert. Durch ihre erhaltene Bindung an die Domäne II (A752) wird die Aktivität der Ketolide gegenüber S. pneumoniae, S. pyogenes und anderen Streptokokken dagegen in der Regel nur unwesentlich vermindert (MHK mg/l gegenüber mg/l bei S. pneumoniae Wildtyp-Stämmen). 14

15 Bei S. aureus mit induzierbarer MLS B -Resistenz (s.u.) liegen die MHK-Werte zwischen 0.06 und 0.25 mg/l, bei konstitutiver Expression der MLS B -Resistenz dagegen bei = 128 mg/l (Felmingham 2001). Die für die Methylierung verantwortliche Methylase wird durch Plasmid- oder Transposonübertragene erm-gene (erythromycin ribosome methylase) kodiert, von denen bisher über 40 verschiedene Gene beschrieben sind. Die wichtigsten gehören den bei Staphylokokken vorkommenden Klassen erm (A) und erm (C) sowie der bei Streptokokken und Enterokokken vorkommenden Klasse erm (B) an. Die Expression der MLS B -Resistenz kann konstitutiv oder induzierbar sein. Im ersteren Fall wird aktive Methylase-mRNA auch ohne einen Induktor gebildet, während im Falle der induzierbaren MLS B -Resistenz eine inaktive mrna gebildet wird, die erst in Anwesenheit eines Induktors aktiv wird und die Produktion der Methylase erlaubt. Diese Induktion ist abhängig von der Anwesenheit eines Attenuators strangaufwärts des erm-gens. Bakterienstämme mit induzierbarem erm-gen sind resistent gegenüber dem Induktor, bleiben aber empfindlich für Non-Induktoren wie z.b. Clindamycin und Telithromycin. Während die konstitutive Methylase-Produktion zu dem oben erwähnten charakteristischen MLS B -Resistenz-Phänotyp führt, kann die Diversität der induzierbaren Makrolidresistenz dagegen zu sehr unterschiedlichen Resistenz-Phänotypen führen. Expression der MLS B -Resistenz bei Staphylokokken Bei Methicillin-resistenten Staphylokokken dominieren die auf Transposons kodierten Gene der erm(a) Klasse, während bei Methicillin-sensiblen Staphylokokken Plasmid-übertragene Gene der erm(c) Klasse für die Makrolid-Resistenz verantwortlich sind. Die Resistenzphänotypen bei induzierbarer Expression sind ähnlich, die Stämme sind resistent gegenüber Makroliden mit 14- und 15-gliedrigem Laktonring, welche als Induktoren fungieren, während Makrolide mit 16-gliedrigem Laktonring, Lincosamide, Streptogramine der Gruppe B und Ketolide nicht als Induktoren fungieren und aktiv bleiben. Allerdings kann die induzierbare Expression der Resistenz durch eine einzige Punktmutation in der Attenuator-Region der induzierbaren ermc Methylase in eine konstitutive Expression der MLS B -Resistenz übergehen, so dass in vitro in Anwesenheit von Lincosamiden eine Selektion konstitutiv resistenter Mutanten in einer Häufigkeit von 1:10 7 KBE auftritt (Leclercq 2002). Bei Infektionen mit hohen bakteriellen Inokula wie Pneumonie, Mediastinitis und ausgedehnten Haut- /Weichteilinfektionen kann eine solche Selektion auch in vivo erfolgen und bei einer Therapie mit Lincosamiden zu einem Therapieversagen führen (Drincovic et al. 2001). Auch bei Ketoliden ist eine in vitro Selektion konstitutiv resistenter Mutanten beschrieben (T. Wichelhaus, Frankfurt, persönl. Mitteilung). Beide Substanzen stellen daher bei Infektionen mit Staphylokokken mit induzierbarer MLS B -Resistenz keine vertretbare Therapieoption dar (siehe Tab. 4). Expression der MLS B -Resistenz bei Streptokokken und Enterokokken Hier ist die Resistenz in der Regel durch Gene der erm(b) Klasse, seltener durch Gene der erm(tr) Untergruppe der erm(a) Klasse bedingt. Die allerdings viel seltener bei S. pneumoniae als bei S. pyogenes vorkommende induzierbare Resistenz (Montanari et al. 2001) kann im Gegensatz zu den Staphylokokken zu ganz unterschiedlichen Resistenz-Phänotypen führen, wobei sowohl Low-Level- Resistenz als auch Hochresistenz gegenüber Makroliden und Empfindlichkeit aber auch Resistenz gegenüber Clindamycin beobachtet wird. Im Gegensatz zu den Staphylokokken fungieren bei den Streptokokken die meisten MLS- 15

16 Antibiotika, einschließlich der Makrolide mit 16-gliedrigem Laktonring und Clindamycin, nicht dagegen Telithromycin, als Induktoren der MLS B -Resistenz (Douthwaite und Champney 2001, Leclercq 2001). Wie bei Staphylokokken wird auch bei Streptokokken mit induzierbarer MLS B - Resistenz von einer Therapie mit Clindamycin abgeraten (Leclercq 2002), während die Ketolide in der Regel wirksam bleiben (Felmingham 2001). Target-Site-Mutationen Mutationen im Bereich der ribosomalen Bindungsstelle A2059 sowie innerhalb der Gene, die für die ribosomalen Proteine L4 und L22 kodieren, sind weitere Mechanismen, die zur Resistenz von S. pneumoniae gegenüber Makroliden, nicht aber gegenüber Clindamycin führt (Vester und Douthwaite 2001). Mutationen an der Position 2058 (A2058G bei S. pneumoniae) führen dagegen zur klassischen MLS B -Resistenz. Die Häufigkeit und klinische Bedeutung dieser und anderer Mutationen ist aber bisher nicht ausreichend geklärt. Efflux Effluxmechanismen, die zur Makrolid-Resistenz führen, sind bei grampositiven Bakterien auf zwei Transportsysteme zurückzuführen. Dies sind bei Staphylokokken ABC (ATP binding cassette) Transporter, die durch Plasmid-übertragene msr (A) Gene (macrolide streptogramin resistance) kodiert werden und als spezifische Effluxpumpe für Makrolide mit 14- und 15-gliedrigem Laktonring und Streptogramine der Gruppe B fungieren, während Makrolide mit 16-gliedrigem Laktonring, Lincosamide und Telithromycin nicht transportiert werden. Der resultierende Resistenz-Phänotyp ist der MS B -Phänotyp. Makrolide mit 16-gliedrigem Laktonring, Clindamycin, Telithromycin und Streptogramine der Gruppe A bleiben gegenüber Stämmen mit diesem Resistenz-Mechanismus daher uneingeschränkt wirksam (Leclercq 2001, Felmingham 2001, Leclercq 2002). Bei S. pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae sowie weiteren Streptokokken-Spezies und bei Enterokokken wird der Effluxmechanismus auf einen Transporter der major facilitator superfamily (MFS) zurückgeführt, für den mef (A) Gene (macrolide-specific efflux) kodieren. Von diesem Effluxmechanismus sind lediglich die Makrolide mit 14- und 15-gliedrigem Laktonring betroffen, nicht dagegen Makrolide mit 16-gliedrigem Ring, Ketolide, Lincosamide und Streptogramine der Gruppe B. Der resultierende Resistenz-Phänotyp wird daher als M-Phänotyp bezeichnet, er geht in der Regel mit einer Low-level-Resistenz gegenüber Makroliden einher (Appelbaum 2002). Enzymatische Inaktivierung Die enzymatische Inaktivierung von MLS-Antibiotika spielt bisher keine wesentliche Rolle. In einer Häufigkeit von < 1% bei S. aureus und 1-7% bei Koagulase-negativen Staphylokken tritt eine Lincosamid-Nukleotidyltransferase auf, die von lnu (A) und lnu (B) kodiert wird und zu einer Resistenz gegenüber Lincomycin, nicht aber gegenüber Clindamycin führt. Die Detektion dieses Resistenzmechanismus ist daher nur bei Testung von Lincomycin möglich. Bei den von diesem Resistenzmechanismus betroffenen Stämmen geht allerdings die ohnehin nur schwache bakterizide Wirkung von Clindamycin vollständig verloren (Leclercq et al. 1987). 16

17 EPIDEMIOLOGIE Bei S. pneumoniae und in geringerem Ausmaß auch bei S. pyogenes ist es in den letzten Jahren weltweit zu einem erheblichen Anstieg der Makrolid-Resistenz gekommen (Appelbaum 2002). In Deutschland liegt die Prävalenz bei S. pneumoniae z. Zt. zwischen 15 und 25%, bei S. pyogenes bei etwa 14% (Reinert et al. 2003). Während in einzelnen Ländern wie Frankreich, Spanien und Ungarn der erm (B) Resistenzmechanismus und damit der MLS B -Phänotyp bei S. pneumoniae mit über 95% bei weitem überwiegt, sind in Deutschland erm (B)- und mef (A)-Resistenz (M-Phänotyp) etwa gleich häufig nachzuweisen. In den USA dagegen dominiert die mef (A)-bedingte Resistenz (M-Phänotyp) mit einem Anteil von über 60% (Farell et al. 2002). Diese regional unterschiedliche Prävalenz der verschiedenen Resistenzmechanismen bei S. pneumoniae muß bei der empirischen Therapie von ambulant erworbenen Atemwegsinfektionen, insbesondere der ambulant erworbenen Pneumonie, bei denen Pneumokokken eine entscheidende Rolle spielen, berücksichtigt werden, da bei überwiegend Efflux-bedingter Low-level-Resistenz Makrolide noch eine gewisse Bedeutung haben können, während bei Vorherrschen der erm bedingten MLS B -Resistenz der empirische Einsatz von Makroliden zunehmend hinterfragt werden muss. Die Prävalenz der MLS B -Resistenz bei S. aureus korreliert eng mit der MRSA-Prävalenz, d.h. bei MRSA-Stämmen liegt in über 80% der Fälle gleichzeitig eine in der Regel konstitutive erm (A)- bedingte MLS B -Resistenz vor. Eine Efflux-bedingte Makrolid-Resistenz ist bei MRSA dagegen äußerst selten (Schmitz et al. 2000). Bei MSSA-Stämmen liegt die Resistenzhäufigkeit gegenüber Makroliden in Deutschland aktuell bei 14% und gegenüber Clindamycin bei etwa 3% (PEG-Studie M. Kresken, Bonn, persönliche Mitteilung). In einer europäischen Studie betrug die Prävalenz des MLS B -Phänotyps bei Makrolid-resistenten MSSA Stämmen 82% (bei etwa gleich häufigem Auftreten des konstitutiven und des induzierbaren Resistenzphänotyps) gegenüber einer Prävalenz der Efflux-bedingten Resistenz (MS B -Phänotyp) von nur 13% (Schmitz et al. 2000). DIAGNOSTIK Der Nachweis der Makrolid-Resistenz mit den üblichen Methoden der Resistenzbestimmung Agardiffusion, Agardilution, Mikroboullion-Dilution, etc. unter Verwendung der anerkannten Grenzwerte für Hemmhofdurchmesser bzw. MHK ist unproblematisch. Aufgrund der immer vorhandenen Kreuzresistenz innerhalb der Makrolide mit 14- und 15-gliedrigem Laktonring ist es zweckmäßig, Erythromycin stellvertretend für die ganze Gruppe zu testen, stellvertretend für die Gruppe der Lincosamide wird üblicherweise Clindamycin verwendet. Problematischer dagegen ist der phänotypische Nachweis der einzelnen Resistenz-Mechanismen, welche ja eine erhebliche Auswirkung auf die Wirksamkeit der anderen Antibiotika aus der Gruppe der MLS-Antibiotika, insbesondere Clindamycin, Streptogramine und Ketolide haben. Der einfachste und zuverlässigste phänotypische Test zum Nachweis einer erm-bedingten induzierbaren oder konstitutiven MLS B -Resistenz ist der Agardiffusionstest in Form des Doppeldisk- Annäherungstests (DD-Test), bei dem man ein Erythromycin-(15 µg)-testplättchen sowie ein Clindamycin-(2 µg)-testplättchen in einem Abstand von ca. 25 mm auf die Agarplatte aufbringt (Waites et al. 2000, Montanari et al. 2001). Am einfachsten ordnet man hierzu die beiden Antibiotika-Testplättchen im routinemäßig verwendeten Agardiffusionstest nebeneinander an. 17

18 Die konstitutive MLS B -Resistenz ist durch eine Resistenz gegenüber Erythromycin und Clindamycin gekennzeichet, während die induzierbare MLS B -Resistenz durch einen Antagonismus zwischen Erythromycin und Clindamycin nachweisbar ist, der durch Ausbildung einer D-förmigen Wachstumszone innerhalb eines großen Clindamycin-Hemmhofs in dem Bereich, der dem Erythromycin-Testblättchen benachbart ist, erkennbar wird (positiver DD-Test als Zeichen der Resistenz-Induktion, Abb. 1). Ein negativer DD-Test spricht bei nachgewiesener Erythromycin- Resistenz dagegen für eine Efflux-bedingte Makrolid-Resistenz, also einen MS B -Phänotyp bei Staphylokokken (Abb. 2) bzw. einen M-Phänotyp bei S. pneumoniae und anderen Streptokokken. In der Regel sind die MHK-Werte von Erythromycin bei S. pneumoniae bei erm-bedingter MLS B - Resistenz mit einer MHK 90 von 128 µg/ml höher als bei Efflux-bedingter Makrolid-Resistenz mit einer MHK 90 von 16 µg/ml (range µg/ml) (Farrell et al. 2002). Dennoch ist aufgrund der erheblichen Überschneidung der MHK-Werte, die bei Makrolid-resistenten S. aureus und S. pneumoniae Stämmen mit erm-bedingter versus Efflux-bedingter Makrolid-Resistenz beobachtet wurden, eine sichere Abgrenzung der beiden wichtigsten Resistenzmechanismen insbesondere im Bereich mittlerer MHK-Werte, für Erythromycin also im Bereich von 4-32 µg/ml, nicht möglich. Besonders problematisch sind hier automatisierte Resistenzbestimmungssysteme, die nur mit der Breakpointmethode arbeiten oder bei denen die Erythromycin-MHK nur bis zu einem MHK-Wert von 8 µg/ml angegeben wird. Ein endgültiger Nachweis des jeweiligen Resistenzmechanismus lässt sich nur mit molekularbiologischen Methoden, z.b. mittels PCR-Amplifikation der entsprechenden Resistenz- Gene erreichen (Farell et al. 2001). Abb. 1: Nachweis der induzierbaren MLSb Resistenz von S. aureus durch einen positiven Doppeldisk-Annäherungstest (DD-Test): Resistenz gegenüber Erythromycin (E), Empfindlichkeit gegenüber Clindamycin (DA), jedoch mit Ausbildung einer D-förmigen Wachstumszone innerhalb des Clindamycin- Hemmhofs, Empfindlichkeit gegenüber Quinopristin/Dalfopristin (QD). Abb. 2: Nachweis der konstitutiven MLSb Resistenz von S. aureus im DD-Test: Resistenz gegenüber Erythromycin (E) und Clindamycin (DA), Empfindlichkeit gegenüber Quinopristin/Dalfopristin (QD). BEFUNDINTERPRETATION 18

19 Staphylokokken (Tab. 4) Bei Nachweis des konstitutiven MLS B -Phänotyps (erm-genotyp) besteht eine Resistenz gegenüber sämtlichen Makroliden, Lincosamiden, Telithromycin und Streptogramin B-Antibiotika, nicht aber gegenüber Streptograminen der Gruppe A. Das aus einem Streptogramin der Gruppe A und einem Streptogramin der Gruppe B bestehende Kombinationspräparat Quinupristin/Dalfopristin ist daher bei erhaltener Empfindlichkeit gegenüber Dalfopristin (ein Streptogramin der Gruppe A) durch die Resistenz gegenüber Quinupristin (ein Streptogramin der Gruppe B) zwar noch wirksam gegen S. aureus und andere Staphylokokken, seine für die Kombination nachgewiesene bakterizide Wirkung geht jedoch verloren (Cocito et al. 1997). Dies ist bedeutsam z.b. bei der Therapie von MRSA- Infektionen, insbesondere wenn - wie bei der Endokarditis - eine Therapie mit einem bakterizid wirkenden Antibiotikum erforderlich ist. Bei Nachweis einer induzierbaren MLS B -Resistenz bleiben Clindamycin, Telithromycin und Streptogramine wirksam, allerdings sollte Clindamycin und Telithromycin insbesondere bei der Behandlung schwerer Staphylokokkeninfektionen nicht eingesetzt werden, da unter dieser Therapie eine Selektion von Mutanten mit konstitutiver MLS B -Resistenz auftreten kann und ein Therapieversagen unter Clindamycin wiederholt beschrieben ist (Watanakunakorn 1976, Panagea et al. 1999, Drincovic et al. 2001). Bei induzierbarer MLS B -Resistenz bleibt die bakterizide Wirkung von Quinupristin/Dalfopristin erhalten, da Streptogramine der Gruppe B keine Induktoren der MLS B -Resistenz sind. Bei Nachweis des MS B -Resistenzphänotyps (msr (A)-Genotyp) ist der therapeutische Einsatz von Clindamycin, ebenso wie der des Ketolids Telithromycin unbedenklich. Tab. 4: MLS-Resistenz bei Staphylokokken Resistenz-Testung Phänotyp Abgeleiteter Befundinterpretation Genotyp Ery-R, Cli-R, Teli-R MLS B konstitutiv erm Ery-R, Clari-R, Azi-R, Cli-R, Teli- R, QD-S (nicht bakterizid) Ery-R, Cli-S, Teli-S Positiver DD-Test MLS B induzierbar erm Ery-R, Clari-R, Azi-R, Cli-R, Teli- R, QD-S (bakterizid) Ery-R, Cli-S, Teli-S Negativer DD-Test MS B msr Ery-R, Clari-R, Azi-R, Cli-S, Teli- S, QD-S (nicht bakterizid) Ery - Erythromycin, Clari - Clarithromycin, Azi - Azithromycin, Cli - Clindamycin, Teli - Telithromycin, QD - Quinupristin/Dalfopristin, DD-Test - Double-disk-Test Streptokokken (Tab. 5) Konstitutive MLS B -Resistenz bedeutet wiederum vollständige Kreuzresistenz zwischen allen Makroliden, Lincosamiden und Streptogramin B-Antibiotika. Die Aktivität von Telithromycin bleibt bei Streptokokken dagegen weitgehend erhalten, eine Selektion resistenter Mutanten erfolgt nicht (Felmingham 2001). Gleichermaßen wie bei Staphylokken sollten auch bei Streptokokken mit induzierbarer MLS B -Resistenz weder Makrolide noch Clindamycin in der Therapie eingesetzt 19

20 werden. Bei Nachweis des M-Resistenzphänotyps (mef (A)-Genotyp) besteht Resistenz gegenüber allen Makroliden mit 14- und 15-gliedrigem Laktonring; Makrolide mit 16-gliedrigem Laktonring, Ketolide, Clindamycin und Streptogramine bleiben dagegen wirksam. Tab. 5: MLS-Resistenz bei S. pneumoniae und anderen Streptokokken Resistenz- Phänotyp Abgeleiteter Befundinterpretation testung Genotyp Ery-R, Cli-I/R, Teli-S MLS B konstitutiv erm Ery-R, Clari-R, Azi-R, Cli-R, Teli- S, QD-S (nicht bakterizid) Ery-R, Cli-S, Teli-S Positiver DD-Test MLS B induzierbar erm Ery-R, Clari-R, Azi-R, Cli-R, Teli- S, QD-S (bakterizid) Ery-R, Cli-S, Teli-S Negativer DD-Test M mef Ery-R, Clari-R, Azi-R, Cli-S, Teli- S, QD-S (bakterizid) Ery - Erythromycin, Clari - Clarithromycin, Azi - Azithromycin, Cli - Clindamycin, Teli - Telithromycin, QD - Quinupristin/Dalfopristin, DD-Test - Double-disk-Test EXTENDED-SPECTRUM ß-LAKTAMASEN RESISTENZMECHANISMEN Die häufigste Ursache für ß-Laktamase-vermittelte Resistenz von Enterobakterien gegen Cephalosporine der Gruppe 3 (z.b. Cefotaxim, Ceftriaxon, Ceftazidim) ist die Überproduktion von chromosomal kodierten AmpC-ß-Laktamasen (auch Klasse C- oder Gruppe 1-ß-Laktamasen genannt). Dieser Resistenztyp wurde ursprünglich bei Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Serratia marcescens und dann bei Pseudomonas aeruginosa beschrieben, die damit resistent gegen Cephalosporine der Oxyimino- (Cefotaxim- und Ceftazidim-) und Cefoxitin-Gruppe und Monobactame sind. Erstmals 1980, in den folgenden Jahren zunehmend häufiger, fand man Resistenzen gegen Cephalosporine der Gruppe 3 bei Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus mirabilis und Salmonella enterica, die kein induzierbares AmpC Enzym aufwiesen. Diese Resistenz wurde durch Plasmide übertragen, die für sogenannte Extended-spectrum ß-Laktamasen (ESBL) kodieren (Stürenburg und Mack 2003). Diese Enzyme sind meist Abkömmlinge von TEM- oder SHV-ß- Laktamasen und entstanden durch Punktmutationen in einzelnen Positionen, die zu Aminosäureaustauschen führen. Das Resistenzspektrum der TEM-ß-Laktamasen umfasst die Oxyimino-Cephalosporine und Monobactame, aber nicht die 7-?-Methoxy-Cephalosporine (Cefoxitin). Ausserdem sind sie durch ß-Laktamaseinhibitoren hemmbar, die im allgemeinen nicht wirksam gegen AmpC-ß-Laktamasen sind. Plasmide mit ESBL sind oft konjugativ auch über Speziesgrenzen hinweg auf andere Enterobakterien übertragbar und fördern so eine rasche horizontale Verbreitung dieses Resistenztyps. 20