läuft unter physiologischen

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1 81 BIOCHEMIEE DER KOHLENHYDRATE Gegenstand dieses Praktikumstagess ist die Biochemie der Kohlenhydrate. Dazu werden zwei Experimente durchgeführt: Enzymatische Hydrolyse von Disacchariden In diesem Versuch werden unterschiedliche Disaccharide mit m Hilfe verschiedener Enzyme in die entsprechenden monomeren Zucker gespalten. Anschließend wird mit Hilfe einer Fehling-Reaktion untersucht, welche der entstandenen monomeren Zucker eine Aldehyd- Gruppe enthalten, die zu einer Carboxyl-Gruppe oxidiert werden kann. Experiment mit dem Enzym Glykogen-Phosphorylase: In diesem Experiment reagiert Glykogen in Gegenwart der d Glykogen-Phosphorylase mit Glucose-1-phosphat. Dabei wird diee Phosphat-Gruppe vom v Glucose-1-phosphat abge- spalten und die Glucose wird in das Glykogen-Molekül eingebaut. (Die Reaktion läuft unter physiologischen Bedingungen in der umgekehrten Richtungg ab: Das Experiment zeigt, dasss eine biochemische Reaktion unter geeigneten Bedingungen ihre Richtung ändern kann.) Das begleitende Seminar soll nicht nur der Diskussion der experimentellen Ergebnissee dienen, sondernn auch einee Gelegenheit bieten, einige elementare Grundlagen der Zucker- chemie in Erinnerung zu rufen. Mitzubringen sind Kittel und Taschenrechner BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN Alle Zucker bestehen aus einem Kohlenstoffgrundgerüst, Hydroxyl- und Carbonylgruppen. Die Position der Carbonylgruppen entscheidet darüber, ob es sich beii dem Zucker um einee Aldose (Carbonylgruppe endständig) oder eine Ketosee (Carbonylgruppe am zweiten Kohlenstoffatom) handelt. D-Fructose (eine Ketose) D-Glucose (eine Aldose) L-Glucosee (eine Aldose)

2 82 Die Einordnung, ob es sich um eine D- oder L-Konfiguration handelt, geschieht anhand der Fischer-Projektion. Dabei wird das Molekül von oben nach unten notiert,, wobei das am höchsten oxidierte C-Atom oben steht. Mit der Angabe D und L wird die Konfigurationn des am höchsten priorisierten Restss des untersten Stereozentrums angegeben (hier die OH- Gruppe > H, am C-Atom Nr. 5). Dabei steht D für dexter (rechts) und L für laevus (links): Das unterste Stereozentrum ist in diesemm Fall das C-Atom 5. Die OH-Gruppsomit istt D-Konfiguration gegeben. zeigt nach rechts, Physiologisch haben meist nur Zucker in der D-Konfiguration Bedeutung (z.b. D-Glucose, D- Fructose, D-Galactose). Eine Ausnahme bildet die L-Fucose, diee in den Blutgruppenantige- nur nen des AB0- Systems enthaltenn ist. Bildung eines Halbacetals: In wässriger Lösung liegt die offenkettige Formm der Zucker zu einem geringen Prozentsatz vor. Der größte Teil liegt dagegenn in Ringformm vor. Der Ring- von C-Atom 5 an dem partiell positiv geladenen C-Atom der Carbonylgruppe an Position 1. schluss erfolgt im Fall der D-Glucose durchh Angriff des Sauerstoffatoms der Hydroxylgruppe Dadurch entsteht ein Halbacetal.. Das C-Atom 1 wird als anomeress C-Atom bezeichnet: Die Bildung der Halbacetal-Form und der Ringschluß sind reversibel. Gelöstt in Wasserr liegt Glucose im chemischen Gleichgewicht zu etwa 0,25% in der offenkettigen Aldol-Form vor. Disaccharide entstehen durch Bildung einer glykosidischen Bindung zwischen Mono- sacchariden. Dabei entsteht eine Bindung zwischen dem anomeren Kohlenstoffatom eines Zuckers mit einem weiteren Zuckermolekül.. Die Stellung des Sauerstoffatoms am anomeren Kohlenstoffatom wird durch den griechische en Buchstaben bzw. angegeben.

3 83 Reduzierende Zucker zeichnen sich dadurch aus, dass siee über eine freie Aldehydgruppe verfügen bzw. in der Lage sind, durch Ringöffnung eine freie Aldehydgruppe zu bilden. Die Aldehydgruppe kann leichtt zu einer Carboxylgruppe oxidiert werden. Der Zucker hat dabei reduzierende Eigenschaften, denn er reduziert das Oxidationsmittel. Beispiele für Zucker mit reduzierendr den Eigenschaften sind die Monosaccharide Glucose, Fructose und Galactose (Gleichgewicht in wässriger Lösung mit der offenkettigenn Form, bei Fructose gefolgt von einer Keto-Enol-Tautomerie), handelt es sich um Halbacetale, diee in wässriger Lösung ebenfalls im Gleichgewicht mit einer offenkettigen Form vorliegen. Die Öffnung der Halbacetalbindung und die damit verbundene Bildung der Aldehydgruppe ist hier für die Maltose gezeigt: aber auch die Disaccharide Lactose und Maltose. Bei diesen Disacchariden Ringöffnung von Maltose Ein nicht-reduzierender Zucker ist nicht in der Lage, eine freie Aldehydgruppe zu bilden. Ein Beispiel dafür ist das Disaccharid Saccharose. Dieser Zucker ist chemisch gesehen ein Vollacetal, welches im basischen bzw. neutralen Milieu stabil vorliegt. Saccharose In der Saccharose sind -D-Glucos se und -D-Fructose über eine -1,2-glykosidische Bindung aneinander gekoppelt. Anders als bei der Maltose ist eine Ringöffnung nicht möglich, es kann sich keinee Aldehydgruppe bilden ( Keinee reduzierenden Eigenschaften).

4 84 Fehling-Probe Anhand der Fehling-Probe können reduzierende Zucker nachgewiesen werden. Die Fehling- der Probe wurde von dem Chemikerr Hermann Christian Fehling im Jahr J 1848 entwickelt. In Nachweis-Lösunder Weinsäure, einer Dicarbonsäure.) Diee Komplexierung hältt die Cu(II) )-Ionen stabil in liegen Cu(II)-Ionen durch Tartrat komplexiert vor. (Tartrat ist das Anion Lösung. Wird ein reduzierender Zucker hinzugefügt, erfolgt bei Erwärmung eine Redox- Zucker zur Carboxylgruppe oxidiert. Die bei der Oxidation anfallenden Elektronen werden letztlich von den Kupferionen aufgenommen: 1. Oxidation: Die Aldehydgruppe des Zuckers wird durch OH - -Ionenn zur Carbonsäure oxidiert. reaktion, die mehreree Schritte umfasst. Dabei wird die Aldehydgruppe der jeweiligen 2. Reduktion: Die Cu(II)-Ionen werden zu Cu(I) reduziert. Das entstehende Kupfer(I)-oxid ist unlöslichh und bildet einen rotbraunen Niederschlag. Das Kupfer(I)-oxid entsteht nur bei einer Reaktion mit reduzierenden Zuckern, also mit Zuckern wie Glucose oder Maltose. Mit Saccharose kann die Reaktion nicht ablaufen.. Die Reaktion wurde zeitweise zur quantitativen Bestimmung von Glucose G verwendet und zur Diagnose von Diabetes mellitus eingesetzt. Glykogen und die Glykogen-Phosphorylase Glykogen ist in den Zellen eine leicht mobilisierbare Speicherform m der Glucose. Ähnlich wie in der Maltose sind im Glykogen die Glucose-Einheiten über -1 4-glyk kosidische Bindungen miteinander verbunden.. Die Verzweigungsstellen des Glykogens enthalten glykosidische Bindungen. Große Mengen ann Glykogen sind insbesondere in der Leber und in der Skelettmuskulatur gespeichert. Am Abbau des Glykogens sind mehrere Enzyme beteiligt, amm wichtigsten ist dabei die Aktivität der Glykogen-Phosphorylase. Das Enzym katalysiert keine Hydrolyse (!) der glykosidische Bindungen, sondern eine Reaktion mit freien Phosphationen. Es liegt also keine Hydrolyse vor, sondern eine Phosphorolyse. Aus diesem Grund wird das Enzym auch als Glykogen-Phosphorylase bezeichnet. Als Abbauprodukt entsteht dabei Glucose-1- phosphat.. Zu beachten ist dabei: An der Reaktion der Glykogen-Phosphorylase Phosphat stammt t nicht aus ATP ist kein ATP beteiligt! Das für die Reaktion benötigte anorganische sondern aus dem Gemisch der verschieden nen Salzionen in der Zelle. Die Glykogen-Phosphorylase katalysiert somit die folgende Reaktion: (Glykogen) n + P a (Glykogen) n-1 + Glucose-1-phosphat

5 85 Die Reaktion kann grundsätzlich in beide Richtungen ablaufen, sie ist reversibel. In vitro (also "im Reagenzglas") liegt das Gleichgewicht der Reaktion sogar auf der Seite des Glykogens. Es bildet sich also leichter das Glykogen als das Glucose-1-phosphat. In den Zellen, in vivo, wird das entstehende Glucose-1-phosphat aber sehr schnell in den Stoffwechsel einbezogen. (Es wird zu Glucose-6-phosphat isomerisiert.) Die Konzentration an Glucose-1-phosphat ist in den Zellen deshalb stets sehr gering, und aus diesem Grund wird in den Zellen von der Glykogen-Phosphorylase primär der Abbau des Glykogens katalysiert. Die Glykogen-Phosphorylase ist ein dimeres Enzym, das aus zwei identischen Monomeren aufgebaut ist. Jede Untereinheit enthält 841 Aminosäuren. Die Aktivität des Enzyms wird durch reversible Phosphorylierung gesteuert, also durch Interkonversion. Die Phosphorylierung wird von dem Enzym Phosphorylase-Kinase katalysiert. Es phosphoryliert das Serin in Position 14 der Aminosäuresequenz der beiden Untereinheiten. Durch diese Phosphorylierung wird die inaktive Phosphorylase b in die aktive Phosphorylase a überführt: Die Inaktivierung, d.h. die Überführung der Phosphorylase a in die Phosphorylase b, wird durch die Phosphorylase-Phosphatase katalysiert, wobei der Phosphatrest hydrolytisch abgespalten wird. Neben dieser kovalenten Modifikation gibt es weitere Möglichkeiten, die Enzymaktivität zu beeinflussen. So kann AMP (Adenosin-5'-monophosphat) an das Enzym binden und es dadurch aktivieren. In diesem Fall liegt keine Interkonversion vor, sondern eine allosterische Aktivierung. Bindung des AMP führt im Enzym zu Konformationsänderungen, die mit einer gesteigerten Umsatzgeschwindigkeit in den aktiven Zentren des Enzyms verbunden sind. Die Glykogen-Phosphorylase liegt gewebespezifisch in drei unterschiedlichen Isoformen vor. Im Praktikum wird eine Isoform verwendet, die aus Skelettmuskel (des Kaninchens) isoliert wurde. Alle Isoformen enthalten Pyridoxalphosphat (PALP). Dieses ist im Reaktionszyklus der Glykogen-Phosphorylase lediglich an der Übertragung eines H + beteiligt. Anders als in vielen anderen Enzymen, hat es in diesem Fall keinen Bezug zum Aminosäurestoffwechsel.

6 86 DIE EXPERIMENTE 1. Enzymatische Spaltung der Disaccharide Lactose, Maltose und Saccharose Zum biochemischen Hintergrund: Neben Polysacchariden enthält die Nahrung auch Monosaccharide und Disaccharide. Wichtige Beispiele für solche Disaccharide sind Lactose (Milchzucker), Maltose (Abbauprodukt der Stärke) und Saccharose (Haushaltszucker). Um vom Körper aufgenommen zu werden, müssen Disaccharide zunächst extrazellulär zu Monosacchariden hydrolysiert werden. Diese Aufgabe übernehmen Enzyme aus der Gruppe der Glycosidasen, welche in den Mikrovilli der Dünndarmschleimhaut verankert sind. Beispiele für solche Enzyme sind die Saccharase-Isomaltase (aus der Gruppe der Invertasen, sie spalten Saccharose) und die β-galactosidase (Lactase, spaltet Lactose). In diesem Versuch wird zudem eine α-amylase zur Spaltung von Maltose verwendet. α- Amylasen werden in den menschlichen Speicheldrüsen und in der Bauchspeicheldrüse gebildet. 1. Teil: Enzymreaktion Dieser Versuchsteil besteht aus drei parallel durchgeführten Enzymreaktionen. Diese werden in 1,5ml-Plastikgefäßen ( Eppis ) nach folgendem Pipettierschema angesetzt. Anschließend erfolgt die enzymatische Reaktion für 20 Minuten bei der unter dem jeweiligen Pipettierschema angegebenen Temperatur. Ansatz A Ansatz B Maltose (100 mg/ml) 800 µl Lactose (50 mg/ml) 800 µl 0,1M Phosphatpuffer 33 mm NaCl ph=6,9 200 µl 0,1M Phosphatpuffer 33 mm NaCl ph=7,3 200 µl Amylase 25 µl β-galactosidase 25 µl 20 min, Raumtemperatur 20 min, 37 C (Wasserbad) Ansatz C Saccharose (100 mg/ml) 800 µl 0,1M NaAcetatpuffer 200 µl ph=4,5 Invertase 25 µl 20 min, 55 C (Heizblock)

7 87 2. Teil: Fehling-Nachweis der Zucker mit reduzierenden Eigenschaften Dieser Versuchsteil wird nach folgendem Pipettierschema in Plastikreagenzgläsern angesetzt Wasser 1 ml Maltose - 1 ml Lactose ml Saccharose ml D-Fructose ml (100mg/ml) Glycogen ml - - Ansatz A ml - - Ansatz B ml - Ansatz C ml Fehlingreagenz 4 ml 4 ml 4 ml 4 ml 4ml 4 ml 4ml 4 ml 4 ml Die Reagenzgläser werden anschließend für 15 Minuten bei 60 C im Heizblock inkubiert. Die Müllentsorgung erfolgt im Schwermetallabfall! (Das Fehling-Reagenz enthält u.a. Kupferionen.) Qualitative Auswertung Farbe der Wasser Maltose Lactose Saccharose D-Fructose Glykogen Ansatz Ansatz Ansatz C Probe A Maltose B Lactose Saccharose blau rot Eine rote Farbe verweist auf eine Bildung von Kupfer(I)-oxid und damit auf eine Reduktion der Cu 2+ -Ionen des Fehling-Reagenz zu Cu 1+. Die Kupferionen haben in diesen Fällen die Elektronen aufgenommen, die bei der Oxidation der Aldehydgruppen der jeweiligen Zucker zu Carboxylgruppen angefallen sind.

8 88 2. Vergleich der enzymatischen Aktivität der Formen an und b der Glykogen- Phosphorylase In diesem Experiment wird Glykogen in Gegenwart der Glykogen-Phosphorylase mit Glucose-1-phosphat inkubiert. Da Glucose-1-phosphat unter den gewählten experimentellen Bedingungen in einer vergleichsweise hohen Konzentration eingesetzt wird, läuft die enzymkatalysierte Reaktion in Richtung der Glykogensynthese ab. (Unter physiologischen Bedingungen katalysiert das Enzym den Glykogenabbau!) Bei der Reaktion wird das Glucose-1-phosphat gespalten: Die Glucose wird in das Glykogenmolekül eingebaut, das Phosphat wird freigesetzt. Das Phosphat wird dann mit Hilfe einer einfachen Reaktion nachgewiesen (Bildung von Molybdänblau). Das Experiment zeigt, dass die Aktivität der Glykogen-Phosphorylase von zwei Faktoren abhängig ist: Interkonvertierung: Die Phosphorylase a (die phosphorylierte Form des Enzyms) ist aktiver als die Phosphorylase b (die dephosphorylierte Form des Enzyms). Allosterische Aktivierung: Die Aktivität der Phosphorylase b kann durch AMP gesteigert werden. (Die Aktivität der ohnehin aktiven Phosphorylase a wird durch AMP kaum beeinflusst.) Pipettierschema: Die Proben für die Enzymreaktion werden in 4 Eppi-Gefäße (1.5 ml-gefäße) pipettiert: Phosphorylase a Phosphorylase b -AMP +AMP -AMP +AMP Beschriftung AMP (µl) Wasser (µl) Glykogen (µl) Phosphorylase (µl) Die Ansätze werden 5 Min. bei 30 C im Wasserbad inkubiert. Glucose1-Phosphat (µl) Die Ansätze werden genau (!) 10 Min. bei 30 C im Wasserbad inkubiert. TCA (µl)

9 89 Sicherheitshinweis: TCA (= Trichloressigsäure) kann die Haut verätzen. Bei Benetzung der Haut oder der Augen ist die TCA sofort mit Wasser abzuspülen. Um eine eventuelle Phosphatverunreinigung in den Ansätzen berücksichtigen zu können, werden während der Inkubationszeit die zwei Leerwerte (LW A und LW B, ebenfalls im Reaktionsgefäß) hergestellt. Wichtig ist in diesem Fall, dass Substrate und Effektoren erst nach der Trichloressigsäure (TCA)-Zugabe zu dem Enzym pipettiert werden, so dass keine enzymatische Reaktion ablaufen kann. Die Leerwerte brauchen nicht inkubiert werden. Wichtig: Die Reihenfolge des Pipettierschemas ist genau einzuhalten! Beschriftung LW A LW B Phosphorylase a bzw. b (µl) TCA (µl) AMP (µl) Wasser (µl) Glykogen (µl) Glucose-1-phosphat (µl) Die 4 Reaktionsansätze und die beiden Leerwerte werden zusammen für 10 min bei 2000 rpm zentrifugiert, um das durch TCA denaturierte und präzipitierte Protein abzutrennen. ACHTUNG: Der Zentrifugenrotor ist auf beiden Seiten mit der gleichen Anzahl an Reaktionsgefäßen zu bestücken (3 links und 3 rechts)! Während der Zentrifugation 6 Reagenzgläser beschriften und für die Phosphatbestimmung vorbereiten: Wasser NH 4 + -Molybdat Reduktionslösung ANSA 1,8 ml 2,0 ml 0,2 ml Nach der Zentrifugation werden jeweils 0,5 ml des Überstandes in die Reagenzgläser pipettiert und vorsichtig durch Schwenken gemischt. 10 min. bei Raumtemperatur inkubieren, anschließend wird zu jeder Probe 1ml 2,9 M Na- Acetat-Lösung gegeben. Aus allen Reagenzgläsern werden ca. 3 ml der Ansätze in Küvetten gefüllt (vorsichtig schütten, Küvettenvolumen beträgt 4 ml) und die Extinktion bei 720 nm bestimmt.

10 90 Zuerst Photometer mit dem Leerwert A eichen, dann die restlichen Proben für Phosphorylase a messen. Anschließend analog das Photometer mit dem Leerwert B eichen und die Phosphorylase b- Proben messen. Übersichtstabelle der zu berechnenden Daten: Probe Gemessene nmol Enzymaktivität Relative Spezifische Extinktion 720nm Phosphat pro Ansatz (Phosphat- Eichkurve) Volumenaktivität nmol Phosphat x µmol x min 1 x ml -1 Aktivität % Aktivität µmol x min -1 x mg -1 Phosphorylase A - AMP Phosphorylase A + AMP Phosphorylase B - AMP Phosphorylase B + AMP AUSWERTUNG Berechnen Sie die Phosphorylase a und b Aktivitäten (µmol min -1 ml -1 ) anhand der Eichkurve und anschließend stellen Sie Ihre Ergebnisse auf Millimeterpapier in Säulendiagrammen dar. Nehmen Sie die Aktivität der Phosphorylase b (Reagenzglas 4) in Gegenwart von AMP und die der Phosphorylase a (Reagenzglas 1) ohne AMP als 100% und geben Sie die beiden anderen Aktivitäten als relative Aktivitäten (in %) an. In Kenntnis der Proteinkonzentration der beiden Phosphorylasen (ausgehängte Legende und Skript) berechnen Sie die entsprechenden spezifischen Aktivitäten. Proteinkonzentration: Phosphorylase A 35µg/ml Phosphorylase B 25µg/ml

11 91 Berechnung der Enzymaktivität: Bei der Aktivitätsmessung wird 100 µl Enzym eingesetzt, die Aktivität wird auf 1 ml Enzymlösung bezogen, deswegen x 10 Für die Phosphatbestimmung wird nur die Hälfte des Ansatzes genommen x 2 Die Inkubation dauert 10 min, aber die Aktivität wird pro Minute berechnet x 1/10 Die Aktivität wird auf µmol berechnet x 1/1000 d.h.: nmol Phosphat x 10 x 2 x 1/10 x 1/1000 = nmol Phosphat x 0,002 Enzymaktivität in µmol x min 1 x ml -1

12 92 Spezifische Aktivität: Volumenaktivität in µmol x min -1 x ml -1 dividiert durch die Proteinkonzentration in mg x ml -1 Spezifische Aktivität der Phosphorylase in µmol x min -1 x mg -1 Phosphat-Eichkurve 0,8 0,7 0,6 Extiktionsdifferenz bei 720 nm 0,5 0,4 0,3 0,2 0, nmol Phosphat/Ansatz