Protein-Engineering. Antibodies

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1 Protein-Engineering Antibodies

2 Target: Specific Affinity Abb Allgemeiner Bau von IgG-Antikörpern. IgG Antikörper bestehen aus je zwei identischen leichten Ketten und zwei identischen schweren Ketten. Alle vier Keilen sind parallel angeordnet und über verschiedene Disulfidbrücken miteinander zu einem Molekül verknüpft. Am N.Terminus der einzelnen Proteinketten befinden sich antigenbindende Bereiche (VH = variabler Bereich der schweren Kette; VL variabler Bereich der leichten Kette). Hier sind die verschiedenen Antikörper zum Teil extrem variabel. Man unterscheidet framework regions (FRI FR4) und complernentadty determining regions (CDRI CDR3). Diesen Teil der Antikörper bezeichnen wir auch als Fv-Bereich 1= Fragment mit den variablen Bereichen). CL und OH kennzeich nen Domänen im konstanten Bereich der leichten und schweren Ketten. Der als II gekennzeichnete Bereich zwischen den Ohr und Oft-Regionen ist der sogenannte Scharnier-(hinge)-Bereich,

3 1. Fab region 2. Fc region 3. Heavy chain with one variable (VH) domain followed by a constant domain (CH1), a hinge region, and two more constant (CH2 and CH3) domains. 4. Light chain with one variable (VL) and one constant (CL) domain 5. Antigen binding site (paratope) 6. Hinge regions.

4 Synthetic Antibody fragments

5 Figure 1 Schematic representation of different antibody formats, showing intact classic IgG molecules alongside camelid VhH-Ig and shark Ig-NAR immunoglobulins. Camelid VhH-Ig and shark Ig-NARs are unusual immunoglobulin -like structures comprising a homodimeric pair of two chains of V-like and C-like domains (neither has a light chain), in which the displayed V domains bind target independently. Shark Ig-NARs comprise a homodimer of one variable domain (V-NAR) and five C-like constant domains (C-NAR). A variety of antibody fragments are depicted, including Fab, scfv, single-domain VH, VhH and V-NAR and multimeric formats, such as minibodies, bis-scfv, diabodies, triabodies, tetrabodies and chemically conjugated Fab multimers (sizes given in kilodaltons are approximate). VOLUME 23 NUMBER 9 SEPTEMBER 2005 NATURE BIOTECHNOLOGY

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7 Antibody mimetics Antibody mimetic Framework Molar mass Affibodies Staphylococcus ProteinA, Z domain 6 kda Affitins Sac7d (from Sulfobolus acidocaldarius) 7 kda Anticalins ] Human Lipocalins 20 kda Avimers A domains 9 18 kda DARPins Ankyrin repeat motif kda Fynomers Fyn, SH3 domain 7 kda Kunitz domain peptides Variousprotease inhibitors 6 kda Monobodies Fibronectin, 10 th Type III domain 10 kda

8 Anticalins are potentially therapeutic proteins belonging to the class ofantibody mimetics. They are synthesized from human lipocalins which are a family of naturally binding proteins. Anticalins are being used in lieu of monoclonal antibodies, the former having a size of about 20 kda, the latter of about 150 kda. 3D structure model of an anticalin (ribbon) in complex with digitoxigenin (sticks) Monobodies consist of 94 amino acids and have a molecular mass of about 10 kda, fifteen times smaller than an IgG type antibody and comparable to the size of a single variable domain of an antibody. They are based on the structure of human fibronectin, more specifically on its tenth extracellular type III domain. This domain has a structure similar to antibody variable domains, with seven beta sheets forming a barrel and three exposed loops on each side corresponding to the three complementarity determining regions.[5] Monobodies lack binding sites for metal ions and the central disulfide bond. Monobodies with specifity for different proteins can be tailored by modifying the loops BC (between the second and third beta sheets) and FG (between the sixth and seventh sheets).[6] The tenth fibronectin type III domain (human, PDB 1TTG Variable domain of an antibody's lambda light chain (human, PDB 2RHE

9 Affibodies

10 Variable Regions of heavy and light chains Abb Je drei Detailsequenzen variabler Bereiche der schweren (A) und leichten (B) Ketten von drei Antikörpern. Die Amjnosäuresequenz ist im Einbuchstabencode dargestellt. FR = framework regions (schwarze Buchstaben), CDR = complementarity determining regions (blaue Buchstaben). Obwohl unterschiede auch innerhalb der FR-Domänen erkennbar sind, sind die unterschiede innerhalb der CDR-Domänen doch deutlich ausgeprägter.

11 Einführung von Variabilität Durch degnerierte Primer Abb Sammlung verschiedener degenerierter Primer zur Amplifikation von cdna-sequenzen für schwere (A) und leichte (B) Antikörperketten. Die Primer binden an die N-terminale Region und erkennen somit den FRl-Bereich. Man bezeichnet diese Primer auch als backward-primer. Orange markierte Buchstaben markieren degenerierte Positionen,

12 Abb Verknüpfung einer vl- mit einer vh-domäne. A Die beiden Domänen lassen sich auf unterschiedliche Weise miteinander verknüpfen: Zum einen können die fertigen Proteinketten chemisch mit Hilfe eines bifunktionellen Reagenzes verbunden werden, Eine zweite Möglichkeit besteht darin, auf Gen- Ebene Cystein-Codons einzuführen und die Ketten dann über eine artifizielle Disulfidbrücke miteinander zu verbinden. Die dritte und weitaus gebräuchlichste Methode ist die Verknüpfung der beiden Ketten über ein Linker-Fragment, das mit Hilfe einer PCR-Strategie eingeführt wird. B Mögliche Linker-Sequenzen, mit denen die beiden Ketten ver bunden werden können.

13 Abb Biosynthese eines rekombinanten Fab-Fragments. Die in pask84 vorhandene Expressionskassette ist eine Operatorfusion. Die ganzen Kassette wird unter der Kontrolle des lacz-promotors exprimiert. Von der gebildeten mrna wer den simultan zwei Proteinkeffen gebildet: eine für die schwere Kette und eine für die leichte Kette. Die gebildeten Proteine werden durch die Signalpeptide OmpA und PhoA ins Periplasma der Bakterienzelle dirigiert. Beim Durchtritt durch die Zellmembran werden die Signalpeptide abhydrolysiert. Im Periplasma herrscht ein ausreichend reduzierendes Milieu, um die Disulfidbindungen zwischen schwerer und leichter Kette knüpfen zu können.

14 Abb Splicing by overlap extension. Um die DNA- Fragmente für die leichte und die schwere Kette miteinander zu verbinden, wird ein Linker synthetisiert, das nicht nur die Information für die (GIy 4 Ser) 3 trägt, sondern das auch komplementär zu den terminalen Nukleotiden des vh- Amplimers und zu den terminalen Nukleotiden des vl-amplimers ist. Alle drei Amplimere werden zusammen in einen PCR- Ansatz gegeben. Im nächsten Schrift werden noch der backward Primer für die Amplifikation der schweren Kette und der forward-primer für die Amplifikation der leichten Kette hinzugefügt. Durch diesen Versuchsaufbau werden alle drei DNA-Fragmente miteinander verbunden und aufamplifiziert. In einem weiteren PCR Schritt werden die Amplimere nochmals terminal verlängert und dabei Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonukleasen Not I und Sfi I eingeführt.

15 Phage display Abb Aufbau eines M13-Phagen. Die Hülle eines M13-Phagen besteht im wesentlichen aus fünf verschiedenen Proteinen, die von den Genen gpiii, gpvi, gpvii, gpviii und gpix des Phagengenoms codiert werden. Bei zwei Proteinen ragen die N-Termini aus der Phagenhülle heraus, so daß man an dieser Stelle einen Fusionsproteinanteil einfügen könnte, ohne den Aufbau der Phagenhülle zu stark zu stören. Dies wurde auch bereits für beide Proteine realisiert. Die Kopienzahlen pro Phagenhülle unterscheiden sich für beide Proteine deutlich, während eine Phagenhülle ca gpviii- Genprodukte besitzt, gibt es nur ca. drei bis fünf gpiii Abb Rekombinanter Phage mit einem modifizierten gpiii- Protein an der Phagenspitze.

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18 Abb Expression löslicher scf oder rekombinanter Phagen. Das Plasmid phen wird benutzt, um entweder lösliche scf,-fragmente oder rekombinante Phagen zu exprimieren. Neben einem colel- Replikationsursprung, einem Phagenrephkationsursprung (siehe auch Abb ) und einem ß-Lactamase- Gen besitzt dieses Plasmid eine Expressionskas sette, die unter der Kontrolle des bakteriellen ß- Galactosidase Promotors (IacZPromotor) steht. Es folgt eine Sequenz, die dafür sorgt, daß die löslichen Antikörperfragmente ins Periplasma der Bakterienzelle transportiert werden. Erst dort können die Disulfidbrücken geknüpft werden. Es schließt sich dann die Sequenz des gpiii-gens an, die in geeigneter Weise durch eine kurze Sequenz unterbrochen ist, in die über die Re striktionsschnittstellen Sf1 1 und Not 1 die codierende Sequenz für das scfrfragment im richtigen Leseraster eingeführt werden kann. Der schwarze Punkt symbolisiert ein Amber-Stopp-Codon, an dem die Proteinbiosynthese abbricht, wenn das Plasmid in ei nen Wildtyp-E.-col transformiert wurde. Es entstehen so mit lösliche scf (unten rechts). Wird das Plasmid al lerdings in einen E.-coI transformiert, der zusätzlich zu seiner normalen trnpt- Ausstattung noch eine trna be sitzt, die ein Amber-Stopp-Codon lesen karin, so wird auch der Rest des gplll-gens trans Wenn diese Zellen mit einem Helfer-Phagen infiziert wurden, die die restlichen Proteine für ein korrektes Phagen-Assemb!y bereitstellen, werden die modifi zierten gplll-genprodukte in die Phagen eingebaut, und wir erhal ten rekombinante Phagen mit einem scf v -Fragment an der Spitze (rechts oben).

19 Abb Biosynthese eines rekombinanten Phagen. Exprimiert man ein rekombinantes Fab- Fragment aus pfab5c.his, so wird in Gegenwart eines Helferphagen ein rekombinanter Phage gebildet, da die leichte Antikörperkette als Fusionsprotein mit gpiii translatiert wird.

20 Screening by panning Abb Phagen-Panning zur Selektion optimierter Antikörperfragmente. um aus der großen Schar unterschiedlicher Antikörperfragmente dasjenige zu finden, das am besten mit dem Antigen reagiert, wird zunächst das Antigen in einer Kulturschale fixiert. Nach Absättigung freier Valenzen mit einem inerten Protein wird die Phagenschar zugegeben. Es wird unter stringenten Bedingungen gewaschen, so daß nur Phagen zurück bleiben, die eine große Affinität zum fixierten Antigen besitzen. um diese Phagen zu amplifizieren, werden E.-coli zugegeben, in denen sich die Phagen replizieren können. Nach mehreren Selektionsrunden wird die Phagen-DNA isoliert und molekular charakterisiert.

21 Gene Recovery by Protein RNA Fusion Library of mutated genes transcription in vitro expression mrna Modification with puromycin P P P P In vitro translation P Screening for protein function selected Gene Removal of tag P Reverse transcription with modified primer (tag) modified after Seelig and Szostak (2007) Nature 448,828