FEMTELLE upa/pai-1 REF 899. C 42 2Cl8C. (Beschichtete Mikrotiterstreifen und Reagenzien für 2 x 96 Messungen)

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1 FEMTELLE upa/pai-1 REF 899 (Beschichtete Mikrotiterstreifen und Reagenzien für 2 x 96 Messungen) C 42 2Cl8C EC REP M Sekisui Diagnostics GmbH Kaplaneigasse 35, D Pfungstadt, Germany Tel / Fax / Sekisui Diagnostics, LLC 500 West Avenue, Stamford, CT Tel. (203) Fax (203) questions@sekisui-dx.com VERWENDUNGSZWECK FEMTELLE ist ein in vitro Test zur quantitativen Bestimmung von humanem Plasminogen Aktivator vom Urokinasetyp (upa) und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor Typ-1 (PAI-1) in Tumorgewebe-Extrakten. Die Testergebnisse sind für folgende Indikationen nützlich: 1) Prognose: Abschätzung derjenigen Brustkrebspatienten die nach operativer Entfernung des Tumors, ein geringes bzw. ein hohes Risiko für einen Rückfall der Krankheit tragen. 7,8,13,15,16,20,23 Wenn sowohl die upa als auch die PAI-1 Konzentration niedrig ist, d.h. die Werte unter den etablierten en (3 ng upa/mg Gesamtprotein und 14 ng PAI-1/mg Gesamtprotein) liegen, gehört der Patient zur Gruppe mit niedrigem Rezidivrisiko. Liegen die Konzentrationen für upa und/oder PAI-1 über den entsprechenden en, gehört der Patient zur Gruppe mit hohem Rezidivrisiko. 2) Prädiktion: Es wurde beschrieben, dass die upa/pai-1 Konzentrationen dazu benutzt werden können, um das Therapieansprechen des Patienten auf eine adjuvante Chemotherapie vorherzusagen. 8,13,20 Klinische Untersuchungen deuten darauf hin, dass Brustkrebspatienten mit niedrigen upa und PAI-1 Werten wahrscheinlich nicht von einer adjuvanten Chemotherapie profitieren werden, während Patienten mit hohen upa und PAI-1 Werten wahrscheinlich von einer adjuvanten Chemotherapie profitieren werden. 8,10,13,20 Die relevanten e sind die gleichen wie für die Prognose. upa und PAI-1 Werte sollten durch klinische oder andere diagnostische Verfahren für das Management von Brustkrebserkrankungen ergänzt werden. 20,23 ERKLÄRUNG DES TESTVERFAHRENS Das Plasminogen Aktivator (PA) System besteht aus einem Plasminogen Aktivator vom Urokinasetyp (upa) - einer Serinprotease, einem Plasminogen Aktivator Inhibitor Typ-1 (PAI-1) ein Serinprotease Inhibitor (Serpin) der spezifisch upa und tpa (Tissue-Type Plasminogen Aktivator) inhibiert, und den auf der Zelloberfläche lokalisierten Urokinase Plasminogen Aktivator Rezeptor (upar). Dieses System wurde ausgiebig von verschiedenen Arbeitsgruppen untersucht Es gibt bestätigende Befunde, dass upa and PAI-1 wichtige biologische Tumormarker sind und eine entscheidende Rolle bei der Zellproliferation, Invasion und Metastasierung spielen. 1,3,20,23 Tumorzellen synthetisieren und sezernieren upa in einer enzymatisch inaktiven Einzelketten Form (sc-upa). Sc-uPA bindet an den upar auf der Zelloberfläche, wo es durch verschiedene Serinproteasen (Plasmin, Plasma Kallikrein, Trypsin), Metalloproteasen oder Cysteinproteasen (Cathepsin B and L) in enzymatisch aktives upa umgewandelt wird. 1,20,21 An den Rezeptor gebundenes upa wandelt Zymogen Plasminogen in aktives Plasmin um, welches direkt und/oder indirekt durch Aktivierung verschiedener Metalloproteasen, die zelluläre Invasion und Metastasierung der Tumorzellen fördert. 1,3 PAI-1 interagiert mit dem upa-upar Komplex unter Bildung eines ternären Komplexes, der in die Zelle internalisiert wird und damit die Signaltransduktion und die Zellproliferation auslöst. PAI-1 spielt außerdem eine wichtige Rolle bei der Metastasierung, da es die adhäsiven Eigenschaften von Vitronektin behindert und damit die Tumormigration erleichtert 14. upa und PAI-1 sind klinisch validierte unabhängige Prognosefaktoren, die entsprechend des Tumor Marker Utility System 11,13,20 das höchste Evidenzniveau (Level of Evidence I, d.h. LOE I) bei Brustkrebs erreicht haben. Prospektiv randomisierte multizentrische Studien und retrospektive Metaanalysen haben gezeigt, dass die Bestimmung von upa und PAI-1 in Tumorgewebe Extrakten eine Abschätzung des Rezidivrisikos erlaubt. 5,7,8,9,13,15,16,19,20,23 Außerdem ermöglichen diese Biomarker eine Vorhersage über das Ansprechen auf eine adjuvante Chemotherapie 8,13,20 und auf eine endokrine Therapie 17 zu machen (Prädiktion). Patienten mit erhöhten upa oder PAI-1 Werten im Mammakarzinomgewebe haben ein signifikant verkürztes krankheitsfreies Überleben (=Disease Free Survival, DFS) und eine reduziertes Gesamtüberleben (=Overall Survival, OS) gegenüber Patienten mit geringen Werten. 8,15,16 Erhöhte upa und PAI-1 Werte wurden ebenso bei verschiedenen anderen Krebsarten z.b. Eierstockkrebs und Magenkrebs gefunden. 1,18,21 Für Patienten mit erhöhten upa und/oder PAI-1 Werten besteht eine erhöhte Wahrscheinlichkeit von einer adjuvanten systemischen Therapie zu profitieren, während Patienten mit niedrigen Werten die Belastung einer Chemotherapie und den damit verbundenen toxischen Nebeneffekten erspart werden kann. 8 Der HER2 Status und die upa/pai-1 Bestimmung stellen unabhängige und ergänzende Informationen bei Brustkrebs zur Verfügung. 24 Deshalb kann die Kenntnis des upa/pai-1 Status in Tumorgewebe Extrakten von Brustkrebspatienten zusammen mit anderen diagnostischen und klinischen Daten (z.b. HER2 Status)dem Arzt helfen das individuelle Rezidivrisiko abzuschätzen und unterstützt damit individualisierte adjuvante Therapieentscheidungen. 8,9,23, G_H SD

2 TESTPRINZIP FEMTELLE erkennt verschiedene Formen von upa: sc-upa, hoch molekulares (HMW) upa, upa komplexiert mit PAI-1 oder mit Plasminogenaktivator Inhibitor Typ-2 (PAI-2), sowie latente und aktive Formen von PAI-1. Der FEMTELLE Test basiert auf einem hoch spezifischen monoklonalen Maus Fängerantikörper der entweder gegen humanes upa oder humanes PAI-1 gerichtet ist. Tumorgewebeextrakte mit bekannter Gesamtproteinkonzentration werden über Nacht in den Vertiefungen der Mikrotiterstreifen inkubiert, die mit upa oder PAI-1 Fängerantikörper beschichtet sind. Nach dem Waschen wird der biotinylierte Detektionsantikörper, der entweder gegen humanes upa oder humanes PAI-1 gerichtet ist, zugesetzt. Nach kurzer Inkubationszeit, wird der biotinylierte Zweitantikörper durch ein Streptavidin Meerrettichperoxidase (HRP) Konjugat nachgewiesen. Das Substrat 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin Perborat (TMB) wird durch die HRP umgesetzt, was zu einer Blaufärbung führt. Durch Zugabe von Schwefelsäure wird die Reaktion gestoppt und die Färbung schlägt von blau nach gelb um. Die upa und PAI-1 Werte werden durch Messung der optischen Dichte bei 450 nm anhand der mitgeführten Standardkurve ermittelt. Die Bestimmung der Gesamtprotein-konzentration des Gewebextrakts erfolgt durch einen chromogenen Protein Assay. Die gemessenen Werte werden entweder als ng upa/mg Gesamtprotein oder als ng PAI-1/mg Gesamtprotein im Tumorgewebeextrakt angegeben. KITKOMPONENTEN R1: anti-human upa IgG beschichtete Mikrotiterplatten (farblos): 6 Streifen mit je 16 Vertiefungen, mit Halter und Abdeckung R2: anti-human PAI-1 IgG beschichtete Mikrotiterplatten (rot markiert): 6 Streifen mit je 16 Vertiefungen, mit Halter und Abdeckung 6 Fläschchen upa Standard: R3: 0, R4: 0.1, R5: 0.25, R6: 0.5, R7: 0.75, R8: 1.0 ng/ml (lyophilisiert) 6 Fläschchen PAI-1 Standard: R9: 0, R10: 1.0, R11: 2.5, R12: 5.0, R13: 7.5, R14: 10.0 ng/ml (lyophilisiert) R15: 2 Fläschchen upa Detektionsantikörper, biotinyliertes anti-human upa (lyophilisiert) R16: 2 Fläschchen PAI-1 Detektionsantikörper, biotinyliertes anti-human PAI-1 (lyophilisiert) R17: 1 Fläschchen upa Enzym Konjugat, Streptavidin HRP (60 µl) R18: 1 Fläschchen PAI-1 Enzym Konjugat, Streptavidin HRP (60 µl) R19: 2 Fläschchen Enzymkonjugat Verdünner (lyophilisiert) R20: 4 Packungen PBS Puffer (PBS), ph 7.4 R21: 2 Fläschchen Detergenz, 25% Triton X-100 (12 ml) R22: 2 Packungen Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS), ph 8.5 (lyophilisiert) R23: 2 Fläschchen Peroxidase Substrat, TMB (11 ml) (REIZEND) NOTWENDIGE MATERIALIEN, DIE NICHT MITGELIEFERT WERDEN 0.22 µm gefiltertes deionisiertes H2O (1 Liter) Achtkanal Multipipette für den Volumenbereich µl Einkanalpipette für den Volumenbereich µl Photometer für Mikrotiterplatten, Meßwellenlänge 450 nm Kryogefäße - 1mL (Nunc, Wiesbaden, Germany) Flüssiger Stickstoff Tank für flüssigen Stickstoff oder -80 C Gefrierschrank mit Aufbewahrungssystem Ultrazentrifuge mit Rotor für max. Geschwindigkeit von xg Ultrazentrifugenröhrchen Test Röhrchen 2 ml Mikro-Dismembrator (zur Pulverisierung von gefrorenem Material, z.b. B. Braun Biotech International, Germany Model S or U) Schüttler für Mikrotiterplatten Schüttler für Reaktionsgefäße 0.5 M H2SO4 Rinderserum Albumin (BSA, Sigma A-7030) BCA Protein Bestimmungstest (Pierce Chemical Co. - #23225; Pierce, Rockford, IL, wird empfohlen) Kontrollproben (Tumorgewebeextrakte aus Nacktmäusen die Transplantate der humanen Brusttumorzellinie-MDA-MB231 tragen, z.b. American Diagnostica GmbH REF 899C) 2 WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN Keine Komponenten des Testkits nach dem Verfallsdatum verwenden. Keine Reagenzien aus verschiedenen Kits oder Chargen zusammen verwenden. Mikrobielle Kontamination der Kit Komponenten vermeiden. Nicht mit dem Mund pipettieren oder Reagenzien aufnehmen. upa standards PAI-1 standards Detektions antikörper Enzym Konjugat Enzymkonjugat Verdünner H319, P264, P280, P305+P351+P338, P337+P313 H319, P264, P280, P305+P351+P338, P337+P313 H319, P264, P280, P305+P351+P338, P337+P313 CONT 2-Methyl-4-isothiazol-3-one H317, P261, P272, P280, P302+P352, P333+P313, P362 Gefahr CONT Polyethylene glycol octylphenol ether H318, H412, P280, P273, P305+P351+P338 PBS H319, P264, P280, P305+P351+P338, P337+P313 Detergenz TBS Gefahren Aussagen: Sicherheitshinweise: Gefahr CONT Polyethylene glycol octylphenol ether H318, H411, P280, P273, P305+P351+P338, P310 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol CONT hydrochloride, Tris-(hydroxymethyl)aminomethane H315, H319, H335, P261, P264, P271, P280, P337+P313, P403+P233 H315 Verursacht Hautreizungen. H317 Kann allergische Hautreaktionen verursachen. H318 Verursacht schwere Augenschäden. H319 Verursacht schwere Augenreizung. H335 Kann die Atemwege reizen. H411 Giftig für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung. H412 Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung. P261 Einatmen von Staub vermeiden. P264 Nach Gebrauch gründlich waschen. P272 Kontaminierte Arbeitskleidung nicht außerhalb des Arbeitsplatzes tragen. P273 Freisetzung in die Umwelt vermeiden. P280 Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. P310 Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen. P302 + P352 BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Wasser und Seife waschen. P305 + P351 + P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen.. Weiter spülen.. P333 + P313 Bei Hautreizung oder -ausschlag: Ärztlichen Rat einholen / ärztliche Hilfe hinzuziehen. P337 + P313 Bei anhaltender Augenreizung: Ärztlichen Rat einholen / ärztliche Hilfe hinzuziehen. P362 Kontaminierte Kleidung ausziehen und vor erneutem Tragen waschen. P403 + P233 Behälter dicht verschlossen an einem gut belüfteten Ort aufbewahren. 3

3 VORBEREITUNG DER REAGENZIEN A. upa und PAI-1 Standards 1. Je 1 ml gefiltertes deionisiertes H2O in die 0.10, 0.25, 0.50, 0.75 und 1.0 ng/ml upa Standard Fläschchen geben. Je 2 ml gefiltertes deionisiertes H2O in das 0.0 ng/ml upa Standard Fläschchen geben. 2. Je 1 ml gefiltertes deionisiertes H2O in die 1.0, 2.5, 5.0, 7.5 und 10 ng/ml PAI-1 Standard Fläschchen geben. Je 2 ml gefiltertes deionisiertes H2O in das 0.0 ng/ml PAI-1 Standard Fläschchen geben. 3. Vorsichtig 3 Minuten mischen. Nicht vortexen! B. Detektionsantikörper 1. Je 5.5 ml gefiltertes deionisiertes H2O in die upa und PAI-1 Detektionsantikörper Fläschchen geben. 2. Vorsichtig 3 Minuten mischen. C. Enzymkonjugat Verdünner 20 ml gefiltertes deionisiertes H2O zugeben und gut durchmischen. D. Waschpuffer 1. Den Inhalt einer Packung PBS in 900 ml gefiltertem deionisiertem H2O lösen ml des 25% Triton X-100 Detergenz zugeben. 3. Mit gefiltertem deionisiertem H2O ad 1 Liter auffüllen. 4. Gut mischen. E. Proben Puffer BSA zum Waschpuffer in einer Endkonzentration von (1% w/v) zugeben. Ausreichende Menge des Probenpuffers herstellen (ca. 2 ml Probenpuffer/Probe). F. 10% Triton X ml 25% Triton X-100 zu 6 ml gefiltertem deionisiertem H2O zugeben. G. Tris-gepufferte Salzlösung, TBS, ph 8,5 1. Den Inhalt einer Packung TBS in 900 ml gefiltertem deionisiertem H2O lösen. 2. Mit gefiltertem deionisiertem H2O ad 1 Liter auffüllen. 3. Gut mischen. LAGERUNG UND STABILITÄT DER REAGENZIEN Die unbenutzen Teststreifen, sowie die flüssigen und lyophilisierten Reagenzien sollen bei +2 bis +8 C gelagert werden. Sie sind bis zu dem auf dem Etikett befindlichen Verfallsdatum zu verwenden. Rekonstituierte Reagenzien können gelagert werden bei: PROBENVORBEREITUNG 2 Wochen +2 bis +8 C A. Pulverisierung des Gewebes 1. Ca mg des tiefgefrorenen Gewebes entnehmen (z.b. aus flüssigem Stickstoff Tank). 2. Den gefrorenen Gewebeblock in ein vorgekühltes Dismembratorgefäß (in flüssigem Stickstoff gekühlt) überführen. 3. Das Gewebe 30 sec im Mikro-Dismembrator pulverisieren. 4. Das gefrorene Pulver in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführen. B. Gewebeextraktion ml 10% Triton-X 100 in 1.8 ml TBS, ph 8.5 geben um eine 1% Triton-X Lösung zu erhalten. 6. Das Gewebepulver in 2 ml kaltem TBS, ph 8.5 mit 1% Triton X-100 resuspendieren. 7. Die Gewebesuspension vorsichtig für h bei 4 C schütteln (z.b. Überkopfschüttler). 8. Die Suspension bei x g für 1 h bei 4 C zentrifugieren, um Zelltrümmer abzutrennen. 9. Mögliche Lipidreste, die sich in dem Überstand befinden vorsichtig entfernen und den klaren Überstand (Gewebe Extrakt) in vorbereitete Kryoröhrchen (auf Eis) überführen. Das Pellet bzw. die Zelltrümmer verwerfen Den Überstand (Gewebeextrakt) in 100 µl Portionen aliquotieren und aus einem Aliquot die Gesamtproteinkonzentration des Gewebeextrakts bestimmen (siehe auch PROTEINBESTIMMUNG). Den Gewebeextrakt in flüssigem Stickstoff oder bei C bis zum weiteren Gebrauch lagern. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren ist unbedingt zu vermeiden, da es die Messergebnisse verfälschen kann. 11. Für die Anwendung im ELISA den Gewebeextrakt 1:20 in Probenpuffer verdünnen. PROTEINBESTIMMUNG Die Gesamtproteinkonzentration der Gewebeextrakte sollte mit dem BCA Proteintest von Pierce bestimmt werden, da dieser Proteintest nicht durch Detergenzien gestört wird und durch Triton X-100 Konzentrationen bis zu 1% nicht beeinflusst wird. Falls nötig, sollte die Gesamtproteinkonzentration des Gewebeextrakts durch Zugabe von TBS, ph 8.5 mit 1% Triton X-100 auf 2-3 mg Gesamtprotein/ml eingestellt werden. Beachte: Da Triton X-100 andere Proteinbestimmungs-Tests stört wird nur der BCA Protein Assay von Pierce zur Bestimmung der Proteinkonzentration der Proben empfohlen. upa/pai-1 ELISA TESTDURCHFÜHRUNG ERSTER TAG 1. Benötigte Anzahl der beschichteten upa Mikrotiterstreifen aus der Verpackung nehmen und in den Halter einlegen. Die restlichen Teststreifen gut verschlossen in der Folien Verpackung bei +2 bis +8 C lagern. 2. Benötigte Anzahl der beschichteten PAI-1 Mikrotiterstreifen aus der Verpackung nehmen und in den Halter einlegen. Die restlichen Teststreifen gut verschlossen in der Folien Verpackung bei +2 bis +8 C lagern. 3. Je 100 µl der rekonstituierten upa Standards, Kontrollen und verdünnten Gewebeextrakt Proben in die mit upa Antikörper beschichteten Vertiefungen zur Bestimmung von upa geben. Je 100 µl der rekonstituierten PAI-1 Standards, Kontrollen and verdünnten Gewebeextrakt Proben in die mit PAI-1 Antikörper beschichteten Vertiefungen zur Bestimmung von PAI-1 geben. (Immer Doppelbestimmungen durchführen; Empfohlene Verteilung der Proben siehe nächste Seite). 4. Abdecken und über Nacht bei +4 C in feuchter Kammer inkubieren. ZWEITER TAG 5. Inhalt verwerfen und Teststreifen je 4 x mit Waschpuffer waschen. 6. Je 100 µl upa Detektionsantikörper in die upa beschichteten Vertiefungen geben. Je 100 ul PAI-1 Detektionsantikörper in die PAI-1 beschichteten Vertiefungen geben. 7. Abdecken und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren (20 25 C). 8. Inhalt verwerfen und Teststreifen 4 x mit Waschpuffer waschen. 9. Für die Messung einer kompletten Platte mit 96 Vertiefungen 12 µl des Enzymkonjugats in 12 ml Enzymkonjugat Verdünner geben (falls nicht die komplette Platte genutzt wird, 2 µl Enzymkonjugat in 2 ml Verdünnerlösung pro Teststreifen (16 Vertiefungen) geben). 10. Je 100 µl des verdünnten Enzymkonjugats in die entsprechenden Vertiefungen geben (Beachte: upa Enzym Konjugat nur in die mit upa Antikörper beschichteten Vertiefungen geben. PAI-1 Enzym Konjugat nur in die mit PAI-1 Antikörper beschichteten Vertiefungen geben.) 11. Abdecken und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren (20 25 C). 12. Inhalt verwerfen und Teststreifen 4 x mit Waschpuffer waschen. 13. Je 100 µl TMB Substratlösung in die Vertiefungen geben, abdecken und 20 min bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. Eine blaue Farbentwicklung ist zu beobachten. 14. Abstoppen der Reaktion durch Zugabe von je 50 µl 0.5 M H2SO4. Kurz mischen (durch Antippen der Platte) um eine gleichmäßige Verteilung zu bewirken. Die Lösung färbt sich gelb. 15. Die Messung soll innerhalb von 10 min bei einer Meßwellenlänge von 450 nm erfolgen. Der Mittelwert der Extinktion des Nullwerts (Standard 0 ng/ml) ist von den Standards und den Proben abzuziehen. 5

4 GRENZEN DES VERFAHRENS Da PAI-1 an Wundheilungsprozessen beteiligt ist, kann eine prä-operative Gewebeentnahme (Biopsie) vor Bestimmung der upa/pai-1 Werte bei einem primären Tumor eventuell zu (zumindest zeitweise) erhöhten PAI- 1 Werten in vivo führen. Dies sollte mit Vorsicht beobachtet werden. QUALITÄTSKONTROLLE Aus Qualitätssicherungsgründen sollten Patientenproben immer zusammen mit den Kontrollproben für upa und PAI-1 getestet werden. Externe Qualitätskontrollen zu diesem ELISA wurden ebenfalls durchgeführt (REF 899). 2,22 REPRÄSENTATIVE STANDARDKURVEN Die Standardkurve zur Bestimmung der upa Konzentrationen wird erstellt, indem man die Mittelwerte der gemessenen Extinktionswerte jedes einzelnen upa Standards gegen die entsprechende upa Konzentration aufträgt. Die Standardkurve zur Bestimmung der PAI-1 Konzentrationen wird erstellt, indem man die Mittelwerte der gemessenen Extinktionswerte jedes einzelnen PAI-1 Standards gegen die entsprechende PAI-1 Konzentration aufträgt. Bei jeder Testdurchführung (REF 899) ist eine Standardkurve zu erstellen. Die untenstehende quadratische Kurvenanpassung (quadratic fit) wird empfohlen, um die upa und PAI-1 Konzentrationen der verdünnten Proben aus den entsprechenden Mittelwerten der Absorptionswerte zu interpolieren. Standardeichkurven upa und PAI-1 ELISA (nur zu Demonstrationszwecken): 2.5 Standard Kurve für die upa Bestimmung Extinktion bei 450 nm BERECHNUNG DER ERGEBNISSE 2 1 Standard Kurve für die PAI-1 Bestimmung PAI-1 Konzentration, ng/ml 1. Unter Verwendung des jeweiligen Extinktionsmittelwerts der verdünnten Probe, wird die entsprechende upa und PAI-1 Konzentration in ng/ml anhand der Standardkurve abgelesen. 2. Um die upa und PAI-1 Konzentrationen des Gewebeextrakts zu erhalten, ist der Probenwert mit 20 zu multiplizieren (Beachte: Der Gewebeextrakt wurde 20 fach verdünnt im Test eingesetzt). 3. Um die upa und PAI-1 Konzentrationen in ng/mg Gesamtprotein zu erhalten, sind die upa und PAI-1 Werte (ng/ml) durch die Gesamtproteinkonzentration (mg/ml) des Gewebeextrakts (siehe oben) zu teilen, Extinktion bei 450 nm upa Konzentration, ng/ml 6 ERWARTETE WERTE Für upa ist der in Extrakten aus Brustkrebsgewebe zur Abschätzung eines geringen bzw. eines hohen Rezidivrisikos und des Ansprechens auf eine Chemotherapie 3 nglmg Gesamtprotein. Für PAI-1 ist der in Extrakten aus Brustkrebsgewebe 14 ng/mg Gesamtprotein zur Abschätzung eines geringen bzw. eines hohen Rezidivrisikos und des Ansprechens auf eine Chemotherapie. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE (siehe Schaubild unten) PROGNOSE Eine Abschätzung des prospektiven Krankheitsverlaufs, d.h. das Risiko eines Rezidivs kann bei nodalnegativen Brustkrebspatienten aus den Ergebnissen der upa und PAI-1 Bestimmung ermittelt werden. 7,8,13,15,16,19,23 Für Gewebeextrakte die mit einem detergenzhaltigem Puffer hergestellt wurden, weisen upa Konzentrationen unter 3 ng/mg Gesamtprotein und PAI-1 Konzentrationen unter 14 ng/mg Gesamtprotein auf ein geringes Rezidivrisiko und ein verlängertes krankheitsfreies Überleben und ein verlängertes Gesamtüberleben hin. upa Konzentrationen über 3 ng/mg Gesamtprotein und/oder PAI-1 Konzentrationen über 14 ng/mg Gesamtprotein weisen auf ein hohes Rezidivrisko hin. BEACHTE: Durch Gewebeverletzungen und Heilungsprozesse, die durch Biopsien hervorgerufen wurden kann PAI-1 zumindest in denjenigen Tumorarealen, die direkt an eine Biopsiestelle grenzen, artifiziell erhöht sein. Aus diesem Grund sollten erhöhte PAI-1 Werte (z.b. über 14 ng/mg) in den entnommenen Proben mit Vorsicht betrachtet werden, wenn die Möglichkeit besteht das die Werte durch eine prä-operative Biopsie beeinflusst wurden. PRÄDIKTION Vorhersagen über das voraussichtliche Ansprechen auf eine adjuvante Chemotherapie kann bei Brustkrebspatienten aus den Ergebnissen der upa und PAI-1 Bestimmung der entsprechenden Tumorgewebeextrakte ermittelt werden. 8,13 upa Gewebekonzentrationen unter 3 ng/mg Gesamtprotein und PAI-1 Gewebekonzentrationen unter 14 ng/mg Gesamtprotein, weisen auf eine geringe Wahrscheinlichkeit des Ansprechens auf eine adjuvante Chemotherapie hin. upa Gewebekonzentrationen über 3 ng/mg 7

5 Gesamtprotein, und/oder PAI-1 Gewebekonzentrationen über 14 ng/mg Gesamtprotein weisen auf eine hohe Wahrscheinlichkeit des Ansprechens auf eine adjuvante Chemotherapie hin. Es wird empfohlen die upa und PAI-1 Werte zusammen mit weiteren klinischen und pathologischen Patientendaten zu benutzen, um möglichst genaue Daten für die individuelle Risikoabschätzung und Festlegung einer adäquaten Therapie zu erhalten. 23 LEISTUNGSMERKMALE Präzision Der Test (REF 899) wurden in einem Qualitätskontroll-Labor mit Gewebeextrakten aus Nacktmäusen, die mit der humanen Brustkrebs Zellinie MDA-MB231 transplantiert waren, getestet. Hierzu wurden die Proben in 20 Testläufen jeweils doppelt bestimmt (n=40). Für upa wurden folgende Werte ermittelt: Mittelwert (ng/ml) = 0.34 ng/ml, der entsprechende Variationskoeffizient (CV) der Intra-Assay Variation = 5.4% und der CV der Inter-Assay Variation = 2.3%. Für PAI-1 wurden folgende Werte ermittelt: Mittelwert (ng/ml) = 5.1 ng/ml, CV der Intra-Assay Variation = 6.7% und CV der Inter-Assay Variation = 4.7%. Sensitivität Die untere Nachweisgrenze des upa Tests beträgt 25 pg upa/ml Probe. 25 Die untere Nachweisgrenze des PAI- 1 Tests beträgt 125 pg PAI-1/ml Probe. 25 Spezifität Der upa ELISA (REF 899) erkennt sowohl hochmolekulares upa als auch upa komplexiert mit PAI-1 oder PAI- 2. Der Test wurde auf Interferenzen untersucht. Die Testergebnisse werden nicht beeinflusst durch tpa, PAI-1, tpa Komplexen und PAI Der PAI-1 ELISA (REF 899) erkennt sowohl latente als auch aktive Formen von PAI-1 und PAI-1 Komplexen. Der Test wurde auf Interferenzen getestet, die Testergebnisse werden nicht beeinflusst durch PAI-2, PAI-2 Komplexe, tpa, and HMW-uPA Formen. 25 RÜCKFÜHRBARKEIT DES STANDARD MATERIALS Informationen zur Rückführbarkeit des Standard Materials in diesem Kit sind bei Sekisui Diagnostics auf Anfrage erhältlich. 25 GRENZEN DES VERFAHRENS FEMTELLE (REF 899) ist nicht für die Bestimmung in Serum oder Plasma geeignet und kann nicht an Proben aus formalin-fixiertem Gewebe angewendet werden. LITERATURSTELLEN 1. Andreasen, P. A., et al. International Journal of Cancer 1997; 72: Review. 2. Benraad, T. J., et al. European Journal Cancer 1996; 32A(8): Duffy, M., et al. Clinical Chemistry 2002; 48:8: Foekens, J. A., et al. Journal of Clinical Oncology 1994; 12: Foekens, J. A., et al. Cancer Research 2000; 60: Harbeck, N., et al. Breast Cancer Research and Treatment 1999; 54: Harbeck, N., et al. Journal of Clinical Oncology 2002; 20 (4): Harbeck, N., et al. Cancer Research 2002; 62: Harbeck, N., et al. Clinical Breast Cancer 2002; 3(3): Review. 10. Harbeck, N. et al. Thrombosis and Haemostasis 2004; 91(3): Review. 11. Hayes, D. F., et al. Journal of Cancer Institute 1996; 88: Janicke, F., et al. Cancer Research 1994; 54: Janicke, F., et al. Journal of National Cancer Institute 2001; 93 (12): Kanse, S. M., et al. Experimental Cell Research 1996; 224: Look, M., et al. Journal of National Cancer Institute 2002; 94 (2): Look, M., et al. Thrombosis and Haemostasis 2003; 90: Meijer Van Gelder, M., et al. Cancer Research 2004; 64 (13): Nekarda, H., et al. Cancer Research 1994; 54: Prechtl, A., et al. International Journal of Biological Markers 2000; 15(1): Schmit, M., et al. Expert Rev Mol Diagn 2011, 11: Schmitt, M., et al. Thrombosis and Haemostasis, 1997; 78: Sweep, C. G. J., et al. British Journal of Cancer 1998; 78: Thomssen, C., et al. Onkologie 2003; 26: Review Article. 24. Zemzoum, I., et al. Journal of Clinical Oncology 2003; 21(6): Daten liegen bei Sekisui Diagnostics, LLC, Stamford, Connecticut Empfohlenen Verteilung der Proben bei Verwendung eines Teststreifens mit 16 Vertiefungen 1 2 A S1 S1 B S2 S2 C S3 S3 D S4 S4 E S5 S5 F S6 S6 G T1 T1 H T2 T2 S = Standard T = Testprobe oder Kontrolle 8 9

6 Algorithmus zur Interpretation der Ergebnisse aus dem FEMTELLE Test (REF 899) Operative Entfernung des Mammkarzinom Gewebes Herstellung des Mammkarzinomgewebe Extrakts aus tiefgefrorenem Frischgewebe Durchführung des Proteinbestimmungs Tests Und des FEMTELLE Tests 2 C 8 C Bedeutung der Symbole Gebrauchsanleitung beachten SDS konsultieren Medizinisches Produkt zur in vitro- Diagnostik Hergestellt durch Bei 2 C bis 8 C lagern Charge Verfallsdatum PROGNOSE PRÄDIKTION* Katalog-Nr CE-Siegel upa und PAI-1 unter dem upa und/oder PAI-1 über dem upa und PAI-1 unter dem upa und/oder PAI-1 über dem Inhalt ausreichend für <n> Tests Autorisierte Vertetung für Europa Geringes Rezidivrisiko Hohes Rezidivrisiko Geringe Wahrscheinlichkeit Von Einer Adjuvanten Chemotherapie Zu Profitieren Hohe Wahrscheinlichkeit Von Einer Adjuvanten Chemotherapie Zu Profitieren *) Entsprechend Literatur Nr. 8,13,