Vom Labor in die Klinik: Prognosefaktoren upa und PAI 1 als anerkannte Biomarker zur Therapieentscheidung

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1 Vom Labor in die Klinik: Prognosefaktoren upa und PAI 1 als anerkannte Biomarker zur Therapieentscheidung bei Brustkrebspatientinnen Die Invasionsmarker upa und PAI-1 wurden mehr als zwei Jahrzehnte in zwei großen prospektiven klinischen Studien auf Validität getestet und können zur individualisierten Therapieplanung von Brustkrebspatientinnen ohne Lymphknotenbefall eingesetzt werden. Jährlich wird bei etwa Frauen in Deutschland Brustkrebs neu entdeckt dies ist somit die häufigste Krebserkrankung der Frau. Aufgrund der Optimierung diagnostischer Methoden und verbesserter Therapien in den letzten Jahren können heute mehr als 70 % der Patientinnen geheilt werden. Voraussetzung ist, dass die Tumore frühzeitig erkannt und ergänzend zur Opera tion konsequent durch begleitende ( adjuvante ) Therapien behandelt werden. Chemotherapie, endokrine Therapien, Bestrahlung und zielgerichtete Therapien sollen ein erneutes Auftreten verhindern. Wenn Fernmetastasen auftreten, kann die Erkrankung nicht mehr geheilt werden ( palliativ ). Beim frühen Brustkrebs ohne Fernmetastasen besteht trotz vieler Therapieoptionen die Gefahr einer Übertherapie für die einzelne Patientin. Besonders die Indikation der Chemotherapie mit Nebenwirkungen sollte sorgfältig abgewogen werden. Es ist ein wichtiges Ziel der modernen Medizin, Art und Ausmaß der Therapien individuell anzupassen. Der Weg zur individualisierten Krebstherapie erfordert die zuverlässige Abschätzung des voraussichtlichen Krankheitsverlaufs einer Patientin. Die aktuell übliche Abschätzung anhand klinisch-pathologischer Faktoren ist wenig effektiv, weniger als 10 % aller Patientinnen können der low risk -Gruppe ohne Bedarf an Chemotherapie zugeordnet werden. Deshalb versucht die klinische Forschung bereits seit Jahren, neue und zusätzliche Krebsbiomarker zu entdecken und entsprechende Testsysteme zu etablieren, um den Ärzten und Patientinnen weitere Informationen über die Biologie und besonders über das Metastasierungspotential des jeweiligen Tumors zu geben [1]. Bevor neue Biomarker, bzw. die entsprechenden Testsysteme in den klinischen Alltag Einzug halten, müssen sie in prospektiven klinischen Studien geprüft werden (s. Abb. 1). Als erste prognostische Biomarker, bestimmt im Tumorgewebe, wurde für Brustkrebs-Patientinnen die klinische Relevanz der Proteine upa und PAI-1 des Plasminogen-Aktivator-Systems in einer Metaanalyse mit > Patientinnen aufgezeigt [2]. Der prognostische Wert dieser Krebsbiomarker wurde in zwei großen prospektiven, randomisierten multizentrischen Therapie-Studien validiert. Die PiA-Studie (Prognose im Alltag) wertet die Relevanz der Prognosemarker prospektiv an einer repräsentativen, konsekutiven Kohorte an fünf Brustzentren aus. 24 DZKF 9/

2 Hintergrund Der Krankheitsverlauf einer Brustkrebserkrankung wird durch die Fähigkeit des Tumors zur Tumorzellausbreitung und der daraus folgenden Metastasierung bestimmt. Die adjuvante Chemotherapie im Anschluss an die Primäroperation soll frühzeitig im Körper verstreute Tumorzellen zerstören und damit ein Wiederauftreten der Erkrankung lokal an der Brust oder an anderen Organen verhindern. Wegen Unkenntnis jener Krebsbiomarker, die das Wiederauftreten der Krebserkrankung voraussagen können, wird ein Großteil der Brustkrebspatientinnen allein anhand von klinisch-pathologischen Faktoren allein übertherapiert, die Therapieentscheidung für die einzelne Patientin ist damit sehr unbefriedigend und zusätzliche Informationen z. B. über die Aggressivität des jeweiligen Tumors sind dringend erwünscht [3]. Das Ziel liegt auf der Hand, nämlich Patientinnen mit einem hohen bzw. niedrigen Rezidivrisiko identifizieren zu können: die Patientinnen mit einem hohen Rezidivrisiko ( high-risk ) sollten eine Chemotherapie erhalten, den Patientinnen mit einem niedrigen Rezidivrisiko ( lowrisk ) sollte diese Therapie erspart bleiben. Zur Identifizierung der high-risk Patientinnen eignet sich das upa/ PAI-1-System. Die Protease upa (Plasminogen-Aktivator vom Urokinasetyp) und deren Inhibitor PAI-1 (Plasminogen-Aktivator Inhibitor vom Typ 1) sind an einer Reihe von proteolytischen Prozessen, wie z. B. Gewebeumbau und zelluläre Invasivität, beteiligt [4]. Hohe Konzentrationen der Proteine korrelieren mit einem erhöhten Metastasierungspotential des Tumors und damit mit einem erhöhten Rezidivrisiko der Patientin [5]. Das Plasminogen-Aktivator-System Das Plasminogen-Aktivator-System setzt sich zusammen aus (a) dem Serinprotease Plasminogen-Aktivator vom Urokinasetyp (upa, offizielles Gensymbol PLAU), (b) dessen spezifischem membrangebundenem Rezeptor upar (CD 87) und (c) den beiden Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren Typ-1 (PAI-1, offizielles Gensymbol SER- Pilot - Studie upa / PAI-1 Therapiestudie Metaanalyse PINE 1) und Typ-2 (PAI-2, SERPINE 2). Nach Bindung der nur gering enzymatisch wirkenden Proenzym-Form des upa, pro-upa, an den Zelloberflächenrezeptor upar kann upa sein von der Leber generiertes Substrat Plasminogen effektiv in aktives Plasmin überführen; Plasmin selber fördert die Umwandlung von pro-upa zu proteolytisch aktivem upa. Als Protease baut Plasmin eine Reihe extrazellulärer Matrixproteine ab (u.a. Laminin, Fibrin) und aktiviert weitere Matrix-abbauende Proteasen, z.b. Matrixmetalloproteasen wie MMP3 und MMP9 (s. Abb. 2). Der Abbau der extrazellulären Matrix (EZM) fördert die Invasivität und Ausbreitung der Tumorzellen. Die Interaktion des reaktiven Zentrums des Inhibitors mit dem Plasminogen-Aktivator führt zu Konformationsänderungen der Protease mit der Folge, dass das katalytische Zentrum des Plasminogen-Aktivators nicht mehr funk tionsfähig ist. Dabei wird die inhibitorische Aktivität des PAI-1 durch das in der extrazellulären Matrix vorkommende Vitronektin stabilisiert. Vitronektin interagiert auch mit upar und Integrinen (speziellen Haftstellen auf Tumorzellen für die Interaktion mit extrazellulären Adhäsionsproteinen). Das Zusammenspiel zwischen upar/integrin/pai- 1 mit Vitronektin ist maßgebend für das Anheften und Loslösen der Tumorzellen von der extrazellulären Matrix und deren Ausstreuung. Aufgrund der Regulation des adhäsiven Verhaltens der Zellen über die Interaktion mit Vitronektin korrelieren erhöhte PAI-1-Werte im Primärtumor mit einem ungünstigen Krankheitsverlauf. Nachdem die Schwellenwerte für upa ( 3 ng/mg Protein) und PAI-1 ( 14 ng/mg Protein) festgelegt werden konnten, wurde folgende Risikoabschätzung postuliert: Patientinnen mit einem Gehalt an upa und/oder PAI-1 oberhalb der Schwellenwerte haben ein höheres Rezidiv-Risiko als Patientinnen mit Konzentrationen an upa und PAI-1 unterhalb der Schwellenwerte [6]. Bestimmung der upa/pai-1-konzentration aus dem Primärtumor Für die Bestimmung der upa und PAI-1 Konzentrationen im Brustkrebsgewebe wird repräsentatives Gewebe Therapiestudie Klinische Routine MaCa I Chemo-N0 Pooled Analysis unizentrisch multizentrisch Metaanalyse NNBC 3- Europe PiA- Studie multizentrisch multizentrisch Evaluierungsstudie Validierung in klinischen Studien ASCO 2007 St. Gallen 2005 Level of Evidence I, AGO Abbildung 1 Validierung von upa/pai-1 als Prognosefaktoren beim frühen Mammakarzinom DZKF 9/

3 EZM-Degradation Metastasierung Invasivität Aktivierung von MMPs Adhäsion Migration PAI-1 Plasminogen Plasmin Vitronektin upa Therapie: upa-r Inhibitor upar EZM Integrine Ras/Raf/ MEK-1/ERK1/2 Signalkaskade Endozytose upar- Recycling Zelle Zellmembran Signaltransduktion, Proliferation Abbildung 2 Biologisches Modell von upa/pai-1 siehe Text aus dem Primärtumor der Brust entnommen, schockgefroren und an das Untersuchungslabor auf Trockeneis weitergeleitet. Es kann mit Gewebe von einer Stanzbiopsie (1-3 Stanzen, ca mg) oder mit Gewebe aus dem Resektat von der Operation ( mg) gearbeitet werden [7]. Das Gewebe wird im gefrorenen Zustand in einer Schwingmühle (Dismembrator) pulverisiert und lösliche Moleküle in einem mit dem Detergens Triton X-100 versetzten wässrigen Lysispuffer über Nacht in Lösung gebracht. Die Konzentration von upa und PAI-1 wird durch einen kommerziellen ELISA-Test (FEMTELLE von American Diagnostica GmbH, Pfungstadt) bestimmt. Für die Risikoabschätzung der Patientin wird die Konzentration der Proteine, bezogen auf das Protein im Gewebeextrakt, bestimmt. Die Protein-Konzentration wird mittels des BCA- Testes von Pierce kalkuliert. Für beide Testverfahren werden Ringversuche zur Qualitätssicherung der Analysen an der Universität Nijmegen (Niederlande) durchgeführt. Die Teilnahme an diesen Kontrollexperimenten ist für die Labore, die an klinischen Studien teilnehmen, obligatorisch, sollte aber auch von den Zentren, die die Testung außerhalb von Studien anbieten, durchgeführt werden [8]. Datenlage Die ersten Experimente, Daten und Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung zu upa und PAI-1 wurden schon in der Mitte des letzten Jahrhunderts publiziert. Aus den weiteren Untersuchungen und Auswertungen konnte gefolgert werden, dass nicht nur die Aktivität der Proteine, sondern auch deren Konzentrationen im Primärtumor eine Voraussage über den Verlauf der onkologischen Erkrankung erlauben [9,10]. Um die klinische Evidenz zu belegen, dass das Plasminogen-Aktivatorsystem an Proliferation, Invasion und Metastasierung solider Tumoren beteiligt ist, folgten die ersten klinischen Erhebungen (Pilotstudie MammaCa1 in München) und multizentrische Studien (Chemo-N0 und NNBC 3-Europe), teilweise schon mit den 10-Jahres- Überlebensdaten [11] (s. Abb. 1). Klinische Studien Chemo-N0 Studie (n=647) Das vorrangige Ziel dieser multizentrisch durchgeführten klinischen Studie war es, die aus der Pilotstudie (MammaCa1) postulierte prognostische Aussagekraft und Zuverlässigkeit von upa/pai-1 in einer Phase-III-Studie zu bestätigen. Zugleich wurde geprüft, ob eine Chemotherapie bei Patientinnen mit hohem die Prognose verbessern kann. Von 1993 bis 1998 wurden 647 Brustkrebspatientinnen in elf Zentren in Deutschland und einem Zentrum in Ljubljana, Slowenien, rekrutiert [12]. Von diesen hatten 283 Patientinnen einen Tumor mit upa und PAI-1-Werten unterhalb der Schwellenwerte und bekamen somit keine Chemotherapie. Bei Patientinnen ohne Lymphknotenbefall war es damals Standard, keine adjuvante Therapie zu empfehlen, obwohl ein breiter Einsatz von Chemotherapie schon diskutiert wurde. 364 von 647 Patientinnen hatten Tumoren mit upa und/oder PAI-1-Werten oberhalb der Schwellenwerte. Diese Patientinnen erhielten randomisiert eine Chemotherapie oder keine weitere Therapie. Die zweite geplante Interimsanalyse wurde 6,5 Jahre nach Studienbeginn durchgeführt. Bei einer Nachbeobachtungszeit von 52 Monaten (Median) erwies sich die Kombination aus upa und PAI-1 sowohl in der univariaten als auch in der multivariaten Analyse der Wahrscheinlichkeit des krankheitsfreien Überlebens und des Gesamtüberlebens als unabhängiger und starker Prognosefaktor (relatives Risiko multivariat 2,09 bzw. 3,19; jeweils p<0,02). In der Gruppe der highrisk -Patientinnen (hohe upa- und / oder PAI-1-Werte) 26 DZKF 9/

4 Patientinnen mit nodal-negativem Mamakarzinom (NNBC); Tumorgröße 0,5-5 cm; Alter Jahre Tumorgewebeprobe k 1 : Art der Risikoschätzung Ermittlung nach tumorbiologischen Faktoren upa und PAI-1 Ermittlung nach klinischpathologischen Faktoren k 2 : hoch vs. niedriges Risiko hoch-risiko niedrig-risiko S: Stratifizierung nach HER-2/neu-Status FE 100 C*3 Doc*3 FE 100 C*6 R Beobachtung Falls steroidhormonrezeptor-positiv: endokrine Behandlung gemäß den aktuellen Leitlinien der AGO Abbildung 3 Studiendesign NNBC 3-Europe Fragestellungen: 1. Vergleich biologische Risikoabschätzung mittels upa/pai-1 versus traditionelle Risikoabschätzung (St. Gallen), 2. Vergleich taxanhaltige Sequenz FEC-Doc versus Standard FEC beim nodalnegativen Hochrisiko- Kollektiv. konnte durch die adjuvante Chemotherapie mit CMF die Rezidivrate signifikant gesenkt werden (relatives Rezidivrisiko 0,42; p=0,019) [13]. NNBC 3-Europe Studie (n=4149) Die Investigator-initiierte Node-Negative Breast Cancer 3 (NNBC 3-Europe) Studie verfolgt das Ziel, die Risikoabschätzung von Brustkrebspatientinnen mittels traditioneller klinisch-pathologischer Faktoren (CP-Algorithmus s. Abb. 4) und den tumorbiologischen Faktoren upa und PAI-1 zu vergleichen (UP-Algorithmus s. Abb. 5). Im high-risk -Arm wird darüber hinaus die klinische Relevanz der Taxangabe beim nodal-negativen Brustkrebs geprüft. Die adjuvante Kombinationstherapie FE100C*6 wird mit einer sequenziellen Therapie FE100C*3 gefolgt von Docetaxel*3 verglichen [14]. Nach sechs Jahren Rekrutierung wurde die Studie 2009 mit insgesamt Patientinnen geschlossen. Besonders für Patientinnen ohne Lymphknotenbefall (N0) und einem mittleren Differenzierungsgrad des Tumors (G2) sind die upa und PAI-1-Werte eine Entscheidungshilfe für oder gegen eine Chemotherapie. Von Patientinnen der NNBC 3-Europe-Studie stehen die upa und PAI-1-Werte zur Verfügung. 39 % der Patientinnen konnten anhand der upa und PAI-1-Werte der Gruppe der low-risk -Patientinnen zugeordnet werden. Im Vergleich zur bisher verwendeten klinisch-pathologischen Einteilung ist das eine Erhöhung des Anteils der Chemotherapie-freien Patientinnen auf das Doppelte. Es konnte bisher die gute Verträglichkeit der Chemotherapie-Kombinationen gezeigt werden [15]. Auch wurde gezeigt, dass upa/pai-1 in den wichtigen Brustkrebs-Typen (eingeteilt immunhistochemisch nach Hormonrezeptor-Status und HER2) eine Unterscheidung in low- und high-risk er- laubt [16]. Die ersten Daten zu Verlaufsbeobachtungen der Studie zum Vergleich der Risikoabschätzungs-Methoden bzw. der Chemotherapie-Arme werden in 2012 erwartet. Beobachtungsstudie PiA (n=1000) An fünf Zentren der PiA-Studie (Prognose im Alltag) werden prospektiv bei allen Patientinnen mit neu diagnostiziertem Mammakarzinom ohne Fernmetastasierung bei vorliegendem Einverständnis die Prognosefaktoren upa/pai-1 bestimmt. Es erfolgt die Dokumentation aller klinischen und pathologischen Faktoren. Gewebe wird frisch gefroren und Formalin-fixiert zentral zur Bestimmung weiterer Tumormarker gesammelt. Die Behandlung erfolgt nach nationalen Leitlinien am jeweiligen Krankenhaus. An dieser repräsentativen Kohorte kann die unterschiedliche Risikoabschätzung der verschiedenen Tumormarker von eingeschlossenen Patientin- Ohne Lymphknotenbefall Wenn ein Faktor zutrifft: G3, HER2 pos., <35 Jahre, PgR-neg./ER-pos., PgR-neg./ER-neg., vaskuläre Invasion mind. ein Faktor trifft zu keine endokrine Therapie Hohes T2 2cm G2 T2 < <2cm keiner trifft zu ggf. endokrine Therapie G1 Niedriges Abbildung 4 Risikoabschätzung mittels klinisch-pathologischer Faktoren CP-Algorithmus DZKF 9/

5 G1 nen ( ) verglichen werden. Eine Beurteilung der praktischen Realisierbarkeit der einzelnen Methoden im Alltag wird möglich. Eine Auswertung des Krankheitsverlaufs ist in der Zukunft geplant. Schlussfolgerungen Aufgrund ihrer hohen prognostischen Aussagekraft, die in prospektiven Studien bestätigt wurde, sind die tumorbiologischen Invasions-Marker upa und PAI-1 anerkannte Prognosefaktoren. Diese ermöglichen eine Verbesserung der Risiko-Abschätzung bei Brustkrebspatientinnen [17]. Nach Erreichen des höchsten Evidenzniveaus (Level of Evidence, LoE-1) sind sie als prognostische Faktoren beim nodal-negativen Brustkrebs international anerkannt und deren Messung wird von der American Society of Clinical Oncology (ASCO) und der Arbeitsgemeinschaft Gynäkologische Onkologie (AGO) zur Therapieentscheidung empfohlen [18]. Nodal-negativen Brustkrebspatientinnen mit niedrigem Rezidivrisiko sollte somit eine adjuvante Chemotherapie erspart bleiben. Die Prognosefaktoren upa/pai-1 sind ein gutes Beispiel, wie Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung über translationale Forschungsansätze und klinische Studien zum Vorteil für Krebspatienten zur Anwendung kommen können. AUTOREN Vetter M. Kantelhardt E. Schmitt M. Jänicke F. Harbeck N. Thomssen C. upa und PAI-1 niedrig niedriges Ohne Lymphknotenbefall 35 Jahre G2 upa und/oder PAI-1 hoch hohes Abbildung 5 Risikoabschätzung mittels upa/pai-1 UP-Algorithmus < 35 Jahre G3 DR. RER. NAT. MARTINA VETTER Forschungslabor der Klinik für Gynäkologie Universitätsklinikum der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Ernst-Grube-Str. 40, D Halle an der Saale Tel.: martina.vetter@uk-halle.de LITERATUR [1] Vetter, M; Kantelhardt, EJ; Annecke, K; Dittmer, J; Paepke, D; Precht, A; Schmitt, M; Jaenicke, F; Minckwitz, GV; Kiechle-Bahat, M; Thomssen, C; Harbeck, N: Invasion factors upa and PAI-1 in node-negative breast cancer: Transfer of laboratory data into clinical practice as exemplified by the ongoing NNBC 3-Europe trial. 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