Entwicklung und Bewertung von praxisorientierten Maßnahmen zur Verringerung des Mycosphaerella anethi-befalls von Fenchelfrüchten

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1 Entwicklung und Bewertung von praxisorientierten Maßnahmen zur Verringerung des Mycosphaerella anethi-befalls von Fenchelfrüchten Laufzeit Forschungsstelle Projektleitung Förderung Julius Kühn - Institut (JKI) Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen Institut für Epidemiologie und Pathogendiagnostik Erwin-Baur-Str Quedlinburg Prof. Dr. Thomas Kühne Dr. Kerstin Taubenrauch Gefördert durch das Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft unter dem Förderkennzeichen aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestags. Problemstellung/Zielsetzung Der pilzliche Erreger Mycosphaerella anethi (anamorph Passalora punctum) führt im Arzneifenchelanbau (Foeniculum vulgare Mill.) seit ca. 20 Jahren zu hohen Ertragsausfällen. Im vorangegangenen Projekt ( ) wurde erstmals eine objektive Methode (semi-quantitativer PTA-ELISA) zur Bestimmung und zum Vergleich der M. anethi-befallsstärken an Fruchtchargen entwickelt, der zur präzisen Untersuchung des Schadauftretens und der Ausbreitung von M. anethi in Arzneifenchelbeständen eingesetzt werden kann. Im aktuellen Projekt soll ein quantitativer genombasierter Pilznachweis (qpcr) entwickelt werden. Diese Methode soll den quantitativen PTA-ELISA ergänzen bzw. ersetzen, dessen Empfindlichkeit für den Nachweis des Pilzes bei latenter Infektion von Jungpflanzen bisher nicht ausreicht. Nachfolgend soll der Pilzbefall von Fruchtproben, die bereits im PTA-ELISA getestet wurden, mittels qpcr quantifiziert werden, um die Sensitivität und Reproduzierbarkeit der Methoden zu vergleichen. Zur Untersuchung der Beeinflussbarkeit des Schadniveaus von M. anethi sollen Feldversuche angelegt werden, die pflanzenbauliche Maßnahmen sowie Pflanzenschutzmaßnahmen aufgreifen, die zur schnellen und nachhaltigen Verbesserung des praxisüblichen Anbaus geeignet wären. Die Wirkung von Fungiziden zur Bekämpfung von M. anethi wurde durch verschiedene Versuchsansteller in der Vergangenheit in Feldversuchen bereits intensiv untersucht. Bewer- 1

2 tungskriterien waren entweder Ertragsunterschiede oder der Doldenbefall nach visueller Bonitur. Allerdings fehlten in allen Versuchen Isolierstreifen zwischen den Parzellen zur Verhinderung der Konidienverbreitung im Gesamtbestand. Die zu erfassenden Unterschiede zwischen den Versuchsvarianten waren deshalb gering, weil die Sekundärinfektionen jeweils über den gesamten Versuch gleichmäßig verteilt waren. Der Einsatz von Beizmitteln wurde bisher kaum wissenschaftlich untersucht bzw. es existieren keine verlässlichen Literaturangaben zu ihrer Wirkung. Alle bisherigen Versuche zur Ermittlung des Pflanzenabstandes, der Wirkung von Zwischensaaten und des Einflusses von Dünger auf die Pflanzenentwicklung und die Epidemiestärke wurden ebenfalls ohne Berücksichtigung der Wirkung des Konidienflugs durchgeführt. Die daraus resultierenden Ergebnisse sind deshalb zwingend durch Versuche mit entsprechenden Isolierungsstreifen zu überprüfen. Der Fruchtbefall der Varianten soll anschließend in der qpcr quantifiziert werden. Bei Fungiziden werden neben der Pflanzenverträglichkeit auch die Wirksamkeit der Mittel sowohl zur Eindämmung der epidemischen Verbreitung des Erregers als auch zur Verminderung des latenten Befalls geprüft. Daneben sollen Versuche mit nachweislich pilzfreien Pflanzen von Hochleistungssorten durchgeführt werden, die in vitro angezogen und vermehrt wurden. Vor einer gezielten Vermehrung von erregerfreiem Saatgut für den Praxisanbau muss geklärt werden, welche Abstände zu natürlich infizierten Feldbeständen und welche zeitlichen Anbaupausen im Fall einer nachgewiesenen Bodenübertragbarkeit des Pilzes gewählt werden müssen, damit ein Bestand gesund erhalten werden kann. Zu diesem Zweck soll die Ausbreitung des Erregers von einer Infektionsquelle in einen unbefallenen Bestand untersucht werden. Weiterhin ist zu klären, ob der Erreger im Boden überdauern und auf diesem Weg Fenchelpflanzen infizieren kann. Zur Bewertung des Befallsniveaus der Varianten stehen ein semi-quantitativer PTA-ELISA und eine qpcr-methode zur Verfügung. Für den Praxisanbau sollen nachfolgend geeignete Vorgehensweisen zur Reduzierung von Ertragsausfällen, zum optimierten Pflanzenschutzmitteleinsatz und zur Produktion von möglichst gesundem bzw. erregerfreiem Saatgut entwickelt werden. Sachstand 1. Optimierung der qpcr Die im vorangegangenen Projekt entwickelte erste Variante eines quantitativen PCR- Nachweises von Mycosphaerella anethi wurde fortlaufend optimiert und zu einer quantitativen Real-Time-PCR (qpcr) weiterentwickelt. Bei der Verwendung des Farbstoffes SybrGreen war der Erregernachweis bei sehr gering befallenem Pflanzen- und Samenmaterial nicht immer eindeutig positiv. Aus diesem Grund wurde der bisher verwendete Test weiter modifiziert, um den Feinnachweis zu verbessern und falsch positive Werte auszuschließen. Dazu wurden die Primersequenzen leicht verändert und eine Sonde entwickelt, erprobt und optimiert. Sie war an einem Ende mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff (hier FAM), am anderen Ende mit einem Quencher markiert (hydrolysis probe). Der Einsatz dieser Sonde erhöhte die Testsensivität deutlich. Mit der qpcr konnte der Pilzbefall in Fenchelfrüchten und Pflanzen molekularbiologisch sicher quantifiziert werden. Der Feinnachweis des Pilzes war aber generell schwierig, weil das Erregermycel in diesem Pflanzenentwicklungsstadium nur in äußerst geringer Menge vorhanden war, oft unterhalb der Nachweisgrenze. Erst bei ca. 50 Tage alten Pflanzen aus Freilandanzucht war M. anethi im Stängelgewebe erstmals sicher zu detektieren. Bei Fenchelpflanzen war die Probenaufbereitung und DNA-Extraktion durch zahlreiche Einzelschritte (Präparation, Trocknung, Gewichtsbestimmung, Mahlung, Absiebung, Extraktion, Reinigung, Verdünnung) sehr zeit- und kostenintensiv. Die Testung von Früchten war aufgrund des homogenen Probenmaterials einfacher. Der PTA-ELISA erlaubte dagegen eine schnellere, vereinfachte Testung von größeren Probenchargen. PTA-ELISA und qpcr lieferten bei Vergleichstestungen hochkorrelierte Ergebnisse bezüglich der Befallsrangfolge. Die ermittelten Erregerkonzentrationen unterschieden sich erwartungsgemäß stark voneinander. Mit dem 2

3 serologischen Test wurde die Pilzmenge anhand des Gehalts von speziellen Proteinen und Polysacchariden, die in Hyphen und Konidien vorlagen, gemessen. Der molekularbiologische Test ermittelte dagegen den DNA-Gehalt des vorhandenen Pilzmycels und der Konidien. Beide Testanleitungen (qpcr, PTA-ELISA) wurden an die FAH übergeben und sollen zukünftig für Saatgutbefallstestungen verwendet werden können. 2. Vermehrung der Gewebekulturpflanzen und Erzeugung von erregerfreiem Saatgut Die in Gewebekultur gewachsenen, erregerfreien Hochleistungssorten wurden dreimalig in Erdkultur überführt und im Freiland zur Erzeugung von erregerfreiem Ausgangssaatgut ausgepflanzt. Die Erregerfreiheit der Früchte des Ernteguts (jährlich ca. 40 Mischproben aus je vier Pflanzen) wurde in der qpcr überprüft. Parallel dazu wurden die verbliebenen Pflanzen in Gewebekultur als definierte Gesundkontrolle für die molekularbiologischen Arbeiten erhalten. Das von diesen Pflanzen gewonnene Saatgut wurde im Frühjahr 2014 ausgesät. Von den Pflanzen wurden regelmäßig Proben genommen und auf Befallsfreiheit getestet. Im Jahr 2015 wurde ein Freilandversuch zur weiteren Vermehrung des Saatguts angelegt, fernab von anderen Fenchelbeständen. Es soll geprüft werden, ob die Erregerfreiheit über einen längeren Zeitraum erhalten werden kann. Die im Frühbeet überwinterten Pflanzen aus ehemaliger Gewebekulturvermehrung werden auch in 2015 einer Saatguttestung unterzogen. 3. Einfluss pflanzenbaulicher Maßnahmen In den letzten Jahren wurden neun Fungizide und ein Beizmittel auf ihre Wirkung gegen M. anethi in Fenchel in Isolierparzellen mit Maistrennstreifen in Quedlinburg (Julius Kühn-Institut Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen) und Bernburg (Landesanstalt für Landwirtschaft, Forsten und Gartenbau) getestet. Zusätzlich wurde die Wirkung alternativer Behandlungsmöglichkeiten (Pflanzenstärkungsmittel, Pflanzenabstand, Zwischensaaten, Düngung, Saatgutcoating) vergleichend untersucht. Im letzten Jahr war die Witterung während der epidemischen Phase des Pilzes im Sommer an beiden Standorten durch zahlreiche regnerische Tage ideal für unzähliche Neuinfektionen, die das Infektionspotential kontinuierlich erhöhten. In Quedlinburg kam es in vielen Parzellen zum Totalausfall der Früchte. Die verbliebenen Erntereste wurden für die Laboruntersuchungen geerntet und der Befall der Früchte mit qpcr und PTA- ELISA quantifiziert. Die geeignetsten Behandlungsvarianten werden im Jahr 2015 erneut im Feldversuch getestet, um die bisherigen Ergebnisse abzusichern bzw. noch zu verbessern. Bei den Fungiziden wird 2015 erneut die Wirkung von Askon, Luna Experience, Forum, Capitan und Opera geprüft. Zusätzlich erfolgt die Ausbringung der Mittel in Spritzfolgen (Beginn kurz nach dem Auflaufen), da sich die Behandlung der Saat zur Erregereindämmung bereits als sehr geeignet erwiesen hat. Drei Pflanzenstärkungsmittel ( Bio-Furthner s Schachelhalmpulver, Bio-Furthner s Schachelhalmextrakt Pflanzenfreund, Schachtelhalmprodukt IBD-FM-12-2-AC (Intrachem)) zeigten 2014 in je einer der beiden Parzellen eine gute Wirkung zur Befallsreduzierung. Auch diese Mittel werden 2015 intensiver in weiteren Feldversuchen geprüft. Eine perspektivisch gute Wirkung zeigten ebenfalls drei Saatgutcoatingvarianten. Durch die Behandlung der Saat könnte eine deutlich vereinfachte Erregerbekämpfung erfolgen als bei aufwändigen mehrmaligen Spritzungen. Zusätzlich wären durch die ausschließliche Anwendung von biologischen Materialien keine Rückstände im Saatgut zu erwarten, was eine Anwendung auch im ökologischen Anbau möglich machen würde. Die drei Düngervarianten (Hornspäne, Langzeitdünger, Geohumus) sowie eine E-Beizung werden 2015 ebenfalls eingehend geprüft. 4. Epidemiologische Analysen Zur Ermittlung der Ausbreitung des M. anethi-befalls nach künstlicher Inokulation in einem unbefallenen Fenchelbestand wurden 2014 mehrere Reihen der Sorte Berfena gedrillt. An einem Ende der Parzelle wurden die Pflanzen mehrmalig künstlich inokuliert. Bei Blühbeginn zeigte sich 2014 auf allen unteren Blättern im gesamten Versuch der Erregerbefall gleichmäßig auf einer Blattebene. Die Blätter konnten durch Sichtbonitur klassizifiziert werden. Der mehr- 3

4 fach inokulierte Teil des Versuchs war gleichermaßen stark infiziert. In der ersten Augustwoche war bereits die windabgewandte Seite (d. h. die Seite, wohin die vom Wind verfrachteten Konidien der befallenen Nachbarpflanzen transportiert wurden) im unteren Bereich kahl. Die ersten Blätter waren unter dem M. anethi-befall abgestorben. Die andere Seite des Versuchs war noch deutlich stärker belaubt. Der Befall der geernteten Saatgutproben wurde mittels qpcr und PTA-ELISA quantifiziert. Demnach war der dem Wind zugewandte Teil weniger stark befallen als der Teil, wohin die Mehrzahl der Konidien mit dem Wind verbreitet wurden. Diese Ergebnisse stützen die Annahmen der Sichtbonitur über die letzten Jahre. Bei M. anethi handelt es sich um einen stark sporulierenden Erreger, der überwiegend mit dem Wind verbreitet wird. Es ist demnach nicht sinnvoll, Versuchsparzellen direkt aneinander zu drillen. Die Kontrollparzelle kann die Infektionen sehr schnell über alle anderen Varianten weiterverbreiten, Unterschiede sind nicht mehr zu erkennen. Auch diese ersten Ergebnisse sollen 2015 erneut überprüft werden. Durch die zunehmende Bedeutung der Schäden durch M. anethi-befall wurde die Suche nach resistenten Herkünften und Sorten zu einem wichtigen Ziel in der Züchtungsforschung an Fenchel. In der aktuellen Fenchelzüchtung wurden noch keine modernen Labortechniken zur Befallseinschätzung von M. anethi und zur nachfolgenden Selektion von weniger anfälligen Genotypen eingesetzt. Die Auswahl der Kreuzungseltern erfolgte ausschließlich durch Sichtbonitur der Doldenstiele. Zur Ermittlung potentieller Resistenzquellen wurden Fenchelakzessionen und -sorten aus dem IPK Gatersleben auf dem Versuchsfeld in Quedlinburg ausgesät. In den beiden folgenden Jahren wurden die eingelagerten, überwinterten Wurzeln gepflanzt und die austreibenden Stiele mehrmalig künstlich inokuliert. Im letzten Jahr trat ein sehr starker Blattbefall auf. Alle Pflanzen bildeten zu diesem Zeitpunkt einen dichten Gesamtbestand. Die Testung des Ernteguts erfolgte mittels qpcr und PTA-ELISA. Vier Herkünfte des Sortiments waren besonders stark infiziert. Die mit 46 % am stärksten befallene Variante war eine Berfena -Herkunft, dessen Ausgangssaatgut als sehr anfälliger Standard bei allen Testungen mitgeführt wurde. Die Diskussion über die Samenübertragbarkeit von M. anethi war immer sehr eng mit der Bodenübertragbarkeit des Erregers (infizierte Ernterückstände) verbunden. Die Bodenübertragung von M. anethi ist bedeutsam, weil Fenchel überwiegend mehrjährig angebaut wird. Nach der ersten Vegetationsperiode verbleiben nach dem Drusch große Mengen von befallenen Blatt- und Stängelresten auf dem Feld. Mit der entwickelten qpcr wurden Ernterückstände sowie zahlreiche Bodenproben von Feldern und Topfversuchen (mit eingearbeitetem Inokulationsmaterial) auf potenzielle Infektionsreservoirs von M. anethi untersucht. Bisher ergaben sich aber keine Hinweise auf die Bodenübertragbarkeit von M. anethi. Infiziertes Blattmaterial zersetzte sich innerhalb weniger Tage bei Auflage auf den Boden. Es erscheint daher unwahrscheinlich, dass M. anethi-mycel ohne den Schutz von pflanzlichem Gewebe überwintert und neue Pflanzen besiedeln kann. Viel wahrscheinlicher ist die Verbreitung von M. anethi über Konidien auf dem frischen Neuaustrieb der Wurzeln nach der Ernte im Oktober, von wo aus neue Infektionsherde gebildet werden. Einzelne, sporulierende, vitale Kondienlager wurden auf diesen Blättern über die gesamten Wintermonate bis ins Frühjahr gefunden. Auch 2015 werden erneut, zur Absicherung der bisherigen Ergebnisse, Bodenproben aus stark infizierten Produktionsbeständen in der qpcr getestet. Projektbezogene Veröffentlichungen Taubenrauch, K.; Gabler, J.; Pank, F.; Krüger, H.; Hau, B. Einfluss der Stärke des Mycosphaerella anethi-befalls auf den Ertrag und die qualitätsbestimmenden Merkmale der Arzneifenchelsorte Magnafena (Foeniculum vulgare Mill.) 18. Bernburger Winterseminar Arznei- und Gewürzpflanzen und 5. Fachtagung Arznei- und Gewürzpflanzen am in Bernburg, Tagungsband S

5 Taubenrauch, K.; Gabler, J.; Pank, F.; Krüger, H.; Hau, B. Auswirkungen des Mycosphaerella anethi-befalls auf Ertrag und qualitätsbestimmende Inhaltsstoffe von Arzneifenchelsorten (Foeniculum vulgare Mill.) 18. Bernburger Winterseminar Arznei- und Gewürzpflanzen und 5. Fachtagung Arznei- und Gewürzpflanzen am in Bernburg, Tagungsband S Samenübertragbarkeit von Mycosphaerella anethi 18. Bernburger Winterseminar Arznei- und Gewürzpflanzen und 5. Fachtagung Arznei- und Gewürzpflanzen am in Bernburg, Tagungsband S Mycosphaerella anethi-befall an Körnerfenchel: Möglichkeiten der Schadensverringerung. Teil 1 Gemüse (2008), Heft 3, S. 41 Mycosphaerella anethi-befall an Körnerfenchel: Möglichkeiten der Schadensverringerung. Teil 2 Gemüse (2008), Heft 4, S Mykologische Untersuchungen von Mycosphaerella anethi an Fenchel (Foeniculum vulgare Mill.) Mitt. Julius Kühn-Institut (2008), 417, Dualkulturen von Fenchel (Foeniculum vulgare Mill.) und Mycosphaerella anethi - Symptombildung und Ausbreitung Mitt. Julius Kühn-Institut (2008), 417, 388 Entwicklung einer PCR-Methode zum Nachweis von Mycosphaerella anethi an Fenchelsaatgut 18. Bernburger Winterseminar Arznei- und Gewürzpflanzen am in Bernburg, Tagungsband S. 44 Taubenrauch, K.; Hau, B.; Kühne, T. Mycosphaerella anethi - ein samenübertragbarer Schaderreger an Fenchel 57. Deutsche Pflanzenschutztagung, Humboldt-Universität zu Berlin am in Berlin, Julius Kühn-Archiv, S. 401 Taubenrauch, K.; Hau, B.; Kühne, T. Ermittlung des Befallsniveaus von Mycosphaerella anethi an Fenchelfrüchten 57. Deutsche Pflanzenschutztagung, Humboldt-Universität zu Berlin am in Berlin, Julius Kühn-Archiv, S. 402 Projektvorstellung: Entwicklung einer quantitativen Methode zum Nachweis von Mycosphaerella anethi an Fenchelfrüchten Tagung Arzneipflanzenanbau in Deutschland - mit koordinierter Forschung zum Erfolg am in Neustadt an der Weinstraße, Tagungsband S

6 Erste Ergebnisse zur quantitativen Ermittlung des Mycosphaerella anethi-befalls an Fenchelfrüchten Tagung Arzneipflanzenanbau in Deutschland - mit koordinierter Forschung zum Erfolg am in Neustadt an der Weinstraße, Tagungsband S. 194 Bewertung von Arzneifenchelchargen bezüglich des quantitativen Befalls von Mycosphae-rella anethi 6. Fachtagung Arznei- und Gewürzpflanzen, Deutscher Fachausschuss für Arznei-, Gewürzund Aromapflanzen, Humboldt Universität zu Berlin am in Berlin, Tagungsband S Totalverlust von Fenchelernte durch Mycosphaerella anethi - Befall 58. Deutsche Pflanzenschutztagung "Pflanzenschutz alternativlos" an der Technischen Universität Braunschweig, in Braunschweig, Tagungsband S. 411 Ermittlung der Direktwirkung von Fungiziden auf Mycosphaerella anethi im Agarplattentest 58. Deutsche Pflanzenschutztagung "Pflanzenschutz - alternativlos" an der Technischen Universität Braunschweig, in Braunschweig, Tagungsband S. 412 Bedeutung der Saatgutkontamination für die Befallsentwicklung und den Infektionsgrad des Ernteguts im Pathosystem Fenchel - M. anethi 23. Bernburger Winterseminar am in Bernburg, Tagungsband S Fenchelproduktion - wichtige Schaderreger und deren Bekämpfung 2. Tagung der FNR Arzneipflanzenanbau in Deutschland - mit koordinierter Forschung zum Erfolg am in Bad Blankenburg, Tagungsband S Taubenrauch, K., Kühne, T. Fenchelproduktion - wichtige Schaderreger und deren Bekämpfung 2. Tagung der FNR Arzneipflanzenanbau in Deutschland - mit koordinierter Forschung zum Erfolg am in Bad Blankenburg, Tagungsband S Nachweis von Mycosphaerella anethi an Arzneifenchel mittels quantitativer PCR (qpcr) 7. Tagung Arznei- und Gewürzpflanzenforschung, Deutscher Fachausschuss für Arznei-, Gewürz- und Aromapflanzen (DFA) gemeinsam mit der Veterinärmedizinischen Universität Wien (VetMed) am in Wien. Tagungsband S. 87 Eignung von Fungiziden und alternativen Bekämpfungsmitteln zur Reduzierung von Mycosphaerella anethi an Fenchel 25. Bernburger Winterseminar am in Bernburg, Tagungsband S Mycosphaerella anethi an Fenchel - Ergebnisse langjähriger Forschung DPG-Sitzung des Arbeitskreises Heil-, Duft- und Gewürzpflanzen am in Bernburg 6