Umhüllte RNA-Viren mit segmentiertem Genom negativer und zweifacher Polarität

Transkript

1 Umhüllte RNA-Viren mit segmentiertem Genom negativer und zweifacher Polarität Jürgen Stech Quellen: Modrow Molekulare Virologie Fields Virology Flint Principles of Virology

2 Vorgestellte Virusfamilien Orthomyxoviridae Arenaviridae Bunyaviridae

3 Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels Rotavirus Tabakmosaikvirus (TMV) Herpesvirus Vesikuläres Stomatitisvirus (VSV)

4 Klassifikation RNA-Viren

5 Vorgestellte Virusfamilien Orthomyxoviridae 8/7/6 Gensegmente Arenaviridae 2 Gensegmente Bunyaviridae 3 Gensegmente

6 Orthomyxoviridae 8/7/6 Gensegmente Fünf Sechs Genera: Influenzavirus A 8 GS Influenzavirus B Influenzavirus C 7 GS Influenzavirus D 7 GS (neu) Thogotovirus 6 GS Isavirus 6 GS Abgrenzung durch unterschiedliche Antigenität der Nukleoproteine

7 NEUES Genus: Influenzavirus D

8 PB2 PB1-F2 PA HA NP NA M1 NS1 M2 NS2/NEP Influenza A/Pr/8/34 (H1N1) PB1 ORF +1 ORF +1 ORF +1 PB2 PB1 P3 HEF NP CM1 NS1 NS2/NEP CM2 UG A ORF +1 Influenza C 7 Segmente! PB2 PB1 PA HA NP NB NA M1 BM2 NS1 NS2/NEP ORF -1 Influenza B/Lee/40 ORF +2 ORF +1 Kodierungstrategien: - überlappende ORF - Spleißen

9 Reservoir of the Influenza A Virus

10

11 Neu entdeckte akzessorische Proteine I

12 Neu entdeckte akzessorische Proteine II

13 Namensgebung Influenza-Aund B-Viren: A / Spezies (wenn nicht Mensch) / Ort / Isolatnummer / Isolationsjahr (Serotyp HA und NA (HxNx)): A/Swine/Germany/2/81 (H1N1) A/Swan/Germany/R65/2006 (H5N1) A/Hong Kong/1/68 (H3N2) B / Ort / Isolatnummer / Isolationsjahr: B/Wisconsin/1/2007

14 Starke genetische Variabilität durch Punktmutationen sehr hohe Mutationsrate, da Polymerase ohne Fehlerkorrektur (10-5 Austausche/ Position/ Replikation) Antigene Drift Reassortment durch segmentiertes Genom nach Doppelinfektion Austausch ganzer Segmente Antigene Shift Einführung neuer Serotypen Kein Reassortment zwischen verschiedenen Genera! Rekombination (innerhalb eines Gen-Segmentes) seltener (polybasische HA-Spaltstelle)

15 The influenza virus is a master of camouflage! Antigenic Drift Antigenic Shift The next pandemic will come. But when??

16 Pandemics Due to Reassortment Pandemic viruses originate from avian reservoir with or without gene reassortment (antigenic shift).

17 Genesis of H1N1 Swine-Origin Influenza Viruses (SOIV) Synonyme: H1N1v H1N1pdm09 Neumann, Nature 2009

18 Fig. 1 Summary of the activities that occurred in 2009 from day 0 of the pandemic on 18 March 2009, when the first case of H1N1 virus was reported in Mexico, to November and December (months 8 and 9), when large quantities of the pandemic vaccine became available. R Rappuoli, P R Dormitzer Science 2012;336: Published by AAAS

19 Die pandemischen H1N1-Stämme von 2009 haben die damaligen saisonalen H1N1-Viren verdrängt. Sterben diese aus?

20 Epidemiologie der humanen Influenza Pandemien 1918, 1957, 1968, 1977 und 2009 Pandemien von 1957 und 1968 durch antigene Shift (Austausch des HA und NA durch Reassortment) Saisonale (jährliche, epidemische) Influenza regelmäßige Epidemien in den interpandemischen Intervallen in den gemäßigten Klimazonen der Nord- und Südhemisphere während der kalten Jahreszeit weltweite Mortalität ca Tote, weltweite Morbidität ca. 3 5 Millionen pro Jahr kein feststehendes Epizentrum antigene Drift durch Akkumulation von Punktmutationen in den Oberflächenantigenen seit dem Wiederauftreten von H1N1-Stämmen 1977 kozirkulieren H3-, H1- und Influenza-B-Stämme zwischen zwei schwereren Epidemien liegt typischerweise ein Intervall von zwei bis fünf Jahren

21 Konventionelle jährliche Totvakzine zumeist HA/NA-Reassortanten Herstellung im Hühnerei und in Zellkultur drei Typen: Ganzvirusvakzine, Spaltvakzine, Subunitvakzine immunologisches Korrelat der Protektion ist ein Serum-IgG- Antikörper-Spiegel trivalente Vakzine: H1-, H3- und eine Influenza-B-Komponente quadrivalente Vakzine (2 Influenza-B-Stämme) Attenuierte Lebendvakzine etablierte kälteadaptierte Vakzine (Flumist ) HA/NA-Reassortante Impfung quadrivalente Vakzine in USA 2012 zugelassen (seit 2013/2014) Weiterentwicklungen etablierte Totvakzine in Kombination mit Adjuvantien (Öl/Wasser- Squalen-basierte Emulsionen (MF59 und AS03) rekombinante konservierte Antigene: M2e sowie HA2 (HA-Stiel)

22 Klinik der saisonalen Influenza typisch plötzlicher Beginn von sehr hohem Fieber und Schüttelfrost, Kopfschmerzen, Halsschmerzen, Gliederschmerzen, Abgeschlagenheit, Appetitlosigkeit und trockener Husten, aber ca. 30% asymptomatisch! Fieber C innerhalb von 24h, hält 1 bis 5 Tage an Virusausscheidung erreicht Maximum am 2. Tag und fällt danach deutlich bis zum 6. Tag ab pathologisch-anatomisches Korrelat der unkomplizierten Influenza ist eine Tracheobronchitis Komplikationen: primäre virale Pneumonie, sekundäre bakterielle Pneumonien oder Mittelohrentzündungen, Exazerbation einer chronischen Bronchitis, deutlich seltener Reye-Syndrom, Enzephalitis oder Guillian-Barré-Syndrom

23 Menschliche Freiwillige

24 Highly pathogenic H5N1 viruses cause severe multi-organ (i.e. systemic) disease both in chickens and humans. Severe systemic disease Pneumonia Encephalitis Lymphopenia, Thrombocytopenia, Hypoglycaemia Diarrhoea Lethality > 50% 05/02/04 10/02/04 Jeremy Farrar, Oxford (modified)

25 H5N1 HPAIV Transmissions to Humans: Cases Confirmed first in Hong-Kong / /2015: 907 cases Lethality > 50% Lai et al. Lancet Inf Dis 2016

26 Zoonotic Influenza Strains Serotypes Confirmed Human Airborne HA Subtype Cases / Deaths Transmission Established in in Mammals Humans H5 (N1) H PAIV 661 / 387 Y N H7 (N2/N3/N7/N9) L & H PAIV 240 / 46 Y N H9 (N2) L PAIV 5 / 0 Y N H6 (N1) L PAIV 1 / 0 ND N H10 (N7) L PAIV 2 / 0 ND N H3 Swine 348 / 0 Y Y H1(N1, N3) Swine 21 / 0 Y Y modified from Schrauwen & Fouchier, Emerg Microbes and Infections 2014 An ever-increasing roster of pre-pandemic precursors?

27 Replikation

28 vrna virale RNA Genom negativsträngige Polarität im Virion enthalten crna complementary RNA Antigenom positivsträngige Polarität kommt nur in der Zelle vor RNP Ribonukleoproteinkomplexe bestehen aus vrna, NP sowie dem aus drei Untereinheiten bestehenden Polymerasekomplex (PB2, PB1, PA)

29 Replikationszyklus Infektion der Zelle: Erreichen des Replikationsortes, des Zellkernes Transkription im Zellkern sowie (später) Genomreplikation im Zellkern plus Translation Virusreifung: posttranslationale Modifikationen der Oberflächenproteine, Transport zur Zellmembran, Knospung und Ablösung

30 Infektion der Zelle Adsorption (Attachement) durch das HA an Sialinsäure- Rezeptoren der Zelle durch rezeptorvermittelte Endozytose Aufnahme ins Endosom nach Ansäuerung durch sauren ph im Endosom Exposition des HA2- Fragmentes (Fusionspeptid) Fusion der Virusmembran mit der Endosomen-Membran Freisetzung der Ribonukleoproteine (Uncoating) und Transport in den Zellkern

31 Transkription und Translation primerabhängige Transkription der negativsträngigen vrna in mrna, Primer durch Abspaltung Cap-tragender 5 -Enden der Wirt-mRNA sequestriert, Cap-stealing, trägt zum host-shutoff bei, Kernexport der mrna (bei M2 und NS2 zuvor Spleißen) Translation: M1, PB2, PB1, PA, NP, NS1, NS2 (NEP) im Zytoplasma und HA, M2, NA im rauen ER Rücktransport in den Zellkern: NP, PB2, PB1, PA, NS2 (NEP), M1

32 Genomreplikation primerunabhängige Replikation der vrna in positivsträngige crna (complementary RNA) und diese in vrna und Verpackung mit den Nukleoproteinen und den Polymerase-Proteinen zu Ribonukleoproteinen (RNP) Kernexport der RNP

33 Virusreifung posttranslationale Modifikationen der Oberflächenproteine im Golgi-Apparat: HA Glykosylierung, Palmityolierung, NA Glykosylierung, M2 Palmityolierung Transport der Oberflächenproteine und der RNP zur Zellmembran (spezifischer Verpackungsmechanismus?) Knospung (Budding, Release) Ablösung von der Zelloberfläche durch Neuraminidase

34 Replikationszyklus Infektion der Zelle: Erreichen des Replikationsortes, des Zellkernes Transkription im Zellkern sowie (später) Genomreplikation im Zellkern plus Translation Virusreifung: posttranslationale Modifikationen der Oberflächenproteine, Transport zur Zellmembran, Knospung und Ablösung

35 Replikation Proteolytische Aktivierung des Hämagglutinins

36 Infektion der Zelle Adsorption (Attachement) durch das HA an Sialinsäure- Rezeptoren der Zelle durch rezeptorvermittelte Endozytose Aufnahme ins Endosom Proteolytische Aktivierung des HA essentiell für Membranfusion nach Ansäuerung durch sauren ph im Endosom Exposition des HA2- Fragmentes (Fusionspeptid) Fusion der Virusmembran mit der Endosomen-Membran Freisetzung der Ribonukleoproteine (Uncoating) und Transport in den Zellkern

37 Banerjee et al, PLoS One 2013 The uncoating of the vrnps into the cytosol results from membrane fusion following an acid ph-triggered conformation change that requires prior HA cleavage absolutely.

38 Cross et al., Protein & Peptide Letters 2009

39 Cross et al., Protein & Peptide Letters 2009

40 HA-Spaltstelle R Chen et al., 1998

41 Hochpathogene aviäre Influenza-A-Viren Die hohe Virulenz ist vor allem durch eine polybasische Spaltstelle im Hämagglutinin bedingt, die eine proteolytische Aktivierung durch die ubiquitäre Protease Furin ermöglicht. Niedrigpathogene Vorläuferstämme erwerben eine solche polybasische HA- Spaltstelle als Insertionsmutation durch mutmaßliche Kopierfehler der viralen Polymerase (Stottern?) oder durch Rekombination mit Wirtszell- oder Virus- RNA. R E RR RK Chen et al., 1998 FL G K R

42

43 Replikation Transkription und Genomreplikation

44 Promotermodelle

45 Replikation Cap-Snatching

46

47

48 Replikation Transportvorgänge

49 Kernexport der vrnp Pohl, Lanz & Stertz J Gen Vir 2016

50 Apikaler Transport der Virusproteine und vrnp zur Zellmembran Pohl, Lanz & Stertz J Gen Vir 2016

51 Pohl, Lanz & Stertz J Gen Vir 2016 Knospung

52 Diagnostik

53 Variabilität verschiedener Influenzavirus-Gene M-Gen Polymerase-Gene (PB2, PB1, PA) Nukleoprotein (NP) Nichtstruktur-Gen (NS) Neuraminidase (NA) Hämagglutinin (HA) -vor allem HA1-Teil ( Kopf ) - auch innerhalb des selben HA- Subtyps hochvariabel!

54 Influenza-Diagnostik Influenza-Schnelltest für Influenza-A- und B-Viren: basiert auf Direktnachweis der NP erkennt auch NP von Vogelgrippeviren Problem: nur bis ca. 48h nach Symptom-Ausbruch sinnvoll, Abstrich ist Erfahrungssache PCR zum Nachweis einer Influenzavirus-A-Infektion: meist mittels Detektion des stark konservierten M-Gens Subtyp-spezifische PCR: Amplifikation des Hämagglutinin-Gens und des Neuraminidase-Gens

55 Therapie

56 Neuraminidase-Hemmer Die Neuraminidase-Hemmer blockieren das aktive Zentrum der Neuraminidase und erschweren somit die Freisetzung des Virus. Die Anwendung sollte möglichst frühzeitig erfolgen! Zunehmend werden resistente Stämme beobachtet.

57 Influenza-A-Virus Systematik Genus der Orthomyxoviridae Genomaufbau 8 negativsträngige RNA-Segmente Virionstruktur 8 helikale Nukleokapside (vrna, NP, Polymerase (=RNP)) umhüllt von M1+ Lipidhülle, darin eingelagert Oberflächenproteine HA, NA, M2 Replikationsstrategie und Expression primerunabhängige Replikation der vrna zu crna zu vrna im Zellkern Transkription von vrna im Zellkern nach Cap-Stealing zu mrna im ZK Spleißen einzelner mrna (M2, NS2), alternative ORF (PB1-F2) Epidemiologie und Krankheitsbilder Pandemien, jährliche Epidemien Bronchiolitis, Bronchopneumonie sowie Sekundärkomplikationen Virusreservoir animale Stämme: vor allem Entenvögel, Hühnervögel, Schwein saisonale (epidemische) Stämme: Mensch

58 1 Genus: 2 Genera: Familie Arenaviridae Arenavirus Mammarenavirus Reptarenavirus

59 Familie Arenaviridae - Namensgebung Murphy & Whitfield Bull WHO 1975

60

61 Genomorganisation Radoshitzky et al.: Past, present, and future of arenavirus taxonomy Arch Virol (2015) 160: ; DOI /s y Kodierung ambisense!

62 Rezeptorwechsel und Entry Fusion ph-abhängig!

63

64 Mammarenavirus (Europa und Afrika)...

65 Mammarenavirus

66 LCMV (Lymphocytic Choriomeningitis Virus) Erste Infektionskrankheit, bei der ein chronisches Virusträgerstadium beschrieben wurde Theorie der Immunkomplexkrankheiten (M. Oldstone) MHC-Restriktion der CD8-Lymphozyten (Zinkernagel & Doherty) Virusreservoir sind Wildmäuse Infektion von Hausmäusen und anderen Wildmäusen weltweit 3 20% der Tiere haben eine persistente Infektion Übertragung auf den Fötus führt zur chronischen, monatelang asymptomatischen Infektion mit hoher Virusausscheidung lebenslang in Urin, Kot, Speichel, Milch und Samenflüssigkeit bei Infektion von erwachsenen Mäusen kommt es zur akuten lymphozytären Choriomeningitis

67 LCMV (Lymphocytic Choriomeningitis Virus) Menschliche Infektionen und Pathogenese Ansteckung über kontaminierten Staub Seroprävalenz 0,3% bei Personen jünger als 30 Jahre, 5,4% bei Personen älter als 30 Jahre meist asymptomatisch oder als leichte grippeähnliche Erkankung lymphyzytäre Choriomeningitis: Kopfschmerzen, Fieber, Schwäche, Brechreiz, Nackensteifigkeit (=Hauptsymptom der Meningitis) später auch in 2-3 Schüben sehr viel seltener Enzephalitiden, Lähmungen und andere neurologische Ausfälle

68 Virusreservoir persistierende Infektionen in bestimmten Nagetieren, wodurch die geografische Verbreitung der Viren bestimmt wird lebenslange Ausscheidung in Urin, Kot und Speichel Übertragung durch virushaltigen Staub oder direktem Kontakt mit den Nagetieren

69

70 Virales Hämorrhagisches Fieber Geisbert & Jahrling Nat Med: 10(12): S (2004)

71 Virales Hämorrhagisches Fieber Geisbert & Jahrling Nat Med: 10(12): S (2004)

72 Virales Hämorrhagisches Fieber Jahrling el al. Viral Hemorrhagic Fevers 2007

73 Hämorrhagische Fieber verschiedener Arenaviren: Symptome LASV - Lassa Virus, LUJV - Lujo Virus, JUNV - Junin Virus, MACV - Machupo Virus GTOV - Guanarito Virus, SABV - Sabia Virus, Chapare Virus CHPV McLay et al. JGV 2014

74 Familie Arenaviridae Namensgebung lat. arena Sand, sandartiges Bild in EM wg. eingelagerten Ribosomen im Virion Systematik 2 Genera: Mamm- und Reptarenavirus Genomaufbau 2 ambisense -Segmente Virionstruktur helikales Nukleokapsid (RNA, L-, N-Protein), umhüllt, GP1/GP2, Z- Protein, zelluläre Ribosomen Replikationsstrategie und Expression Transkription von vrna in mrna des L- und N-Proteins, Replikation von vrna zu crna zu vrna, von crna Transkription in mrna der Z- und GPC-Proteine (Replikation im Zytoplasma) Epidemiologie und Krankheitsbilder weltweit, hämorrhagisches Fieber, Lassa-Fieber, lymphozytäre Choriomeningitis Virusreservoir Nager oder auch früchtefressende Fledermäuse

75 Familie Bunyaviridae Fünf Genera: Orthobunyavirus Phlebovirus Nairovirus Hantavirus Tospovirus (Pflanzenvirus)

76

77

78

79

80 Bunyaviridae: Genomaufbau und Virionstruktur einzelsträngiges RNA-Genom negativer (oder ambisenser) Polarität 3 Segmente: large, medium und small, bei manchen Spezies auch crna-segmente im Virion umhüllte Virionen von nm Größe Nukleokapsid-Protein umhüllt vrna

81

82 Termini der Gen-Segmente Segment-Termini innerhalb des Genus konserviert

83 L-Segmente L-Segmente verschiedener Größe Ein ORF durch crna kodiert

84 M- und S-Segmente M S - Nichtstrukturproteine bei einigen Genera - auch ambisense - überlappender ORF -Nichtstrukturproteine (einige Genera) ambisense

85 Virusreplikation Primäre Transkription und Replikation im Zytoplasma Assembly und Knospung im Golgi-Apparat, alternativ an der Zytoplasmamembran (respirat. Hantaviren)

86 Namensgebung Familie Bunyaviridae nach Ort der Erstisolation: Bunyamvera (Uganda) Systematik 5 Genera: Orthobunyavirus, Phlebovirus Nairovirus, Hantavirus, Tospovirus Genomaufbau 3 Segmente L, M (Gn, Gc), S (N-Protein), bei manchen Bunyaviridae auch ambisense, auch crna-segmente im Virion, Reassortment Virionstruktur helikale Nukleokapside enthaltend L- und N-Protein, kein Matrixprotein, Lipidhülle, Hüllproteine Gn und Gc Replikation Genomreplikation und Transkription im Zytoplasma, Knospung in Golgi- Zisternen, Fusion von zytoplasmatischen Vesikeln, dann Freisetzung aus Zelle Epidemiologie und wichtige Krankheitsbilder weltweit, Zoonose, hämorrhagisches Fieber mit renalem Syndrom (HFRS), Hantavirus pulmonary syndrome (HPS) Virusreservoir Insekten, Vertebraten, Pflanzen (Tospovirus)

87 Vergleich der Virusfamilien Gemeinsamkeiten negativsträngiges RNA-Genom: Polymerase im Virion enthalten segmentiertes Genom: Reassortment Virion umhüllt: Knospungsvorgang analoge Schritte in der Replikation: Absorption durch rezeptorvermittelte Endozytose, proteolytische Aktivierung des rezeptorbindenden Proteins, ph-abhängige Membran-Fusion, Cap-Snatching Unterschiede Orientierung des Genoms Orthomyxoviridae: ausschließlich negativsträngig Arenaviridae: ausschließlich ambisense-orientiert Bunyaviridae: negativsträngig, aber auch ambisense-orientierte Segmente in einigen Genera Kodierungsstrategie verschiedene ORF und Spleißvorgänge Replikationsort Orthomyxoviridae: Zellkern Arenaviridae und Bunyaviridae: Zytoplasma Knospungsort Zellmembran (ZM) - aber Bunyaviridae: Golgi, respir. Hantaviren ZM