Vorlesung Biologie für Mediziner WS 2010/11 Teil 1 Zellbiologie (Prof. R. Lill) Themengebiet: Organellen und Proteintransport

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1 Vorlesung Biologie für Mediziner WS 2010/11 Teil 1 Zellbiologie (Prof. R. Lill) Themengebiet: Organellen und Proteintransport

2 Die Zelle, wie wir sie bisher kennen

3 Komplexität der eukaryotischen Zelle Humangenom enthält ca Protein-kodierende Gene (Hefe: 6.200, E. coli 4.600) Pro Zelle verschiedene Proteine Gewebe- und entwicklungsspezifische Proteine (Zelltypspezifität) Proteine sind kompartimentiert, d.h. in definierten Reaktionsräumen lokalisiert Organellen

4 Organellen in der eukaryotischen Zelle

5 Endomembranen in eukaryotischen Zellen Wie entstehen sie???

6 Rauhes endoplasmatisches Retikulum (RER) Netzwerk, flache platte Schläuche RER Membran geht in Außenmembran des Kerns über Besonders häufig in sekretorischen Zellen (Drüsen, Plasmazellen des Immunsystems) Fluor.-mikroskopie Besetzt mit zahlreichen Ribosomen Proteineinschleusung ins RER Elektronenmikroskopie

7 Glattes endoplasmatisches Retikulum (SER) Nur in einigen Zellen eindeutig zu erkennen tubuläres verzweigtes Netzwerk Kontinuum mit RER Induktion des SER durch viele Stimuli z.b. Phenobarbitale, Alkohol, Hormone, Zigarettenrauch, Medikamente...

8 Funktionen des glatten ER Leber Phospholipidsynthese Synthese von anderen Lipiden (Prostaglandine etc. (auch in Prostata, Uterus)) Lipoproteinpartikelsynthese (LDL) Glykogensynthese Detoxifizierungen (Cytochrome P 450 ) Muskel Speicherung von Ca 2+ (Sarkoplasmatisches Retikulum) Nebennierenrinde Steroidhormonsynthese (Cytochrome P 450 ) verschiedene Sexualhormone

9 Funktionen des RER Einschleusung von Proteinen für RER und SER Golgi-Apparat Lysosomen Endosomen Plasmamembran Sekretproteinen Secretory proteins NICHT: Mitochondrien Peroxisomen Zellkern

10 Funktionen des RER Einschleusung von Proteinen Signalhypothese (Blobel, 1975) Unterschied freie / ER-gebundene Ribosomen Signalsequenz

11 Mechanismus der Einschleusung von Proteinen ins RER Wie kommt ein hydrophiles Protein über eine hydrophobe Lipiddoppelschicht? Signalsequenz signal recognition particle (SRP) Synthese und Translokation eines Sekretproteins (z.b. Insulin, Immunglobulin)

12 Funktionen des RER Signal recognition particle (SRP) SRP9 SRP14 Elongationsarrest 1 RNA 6 Proteine SRP72 SRP54 als zentrale Komponente Signalsequenz + + hydrophob 5-20 As As As. SRP54 Signalsequenzerkennung GTP-Hydrolyse SRP68 SRP19 Fertiges Protein Signalpeptidase

13 Strukturelle Grundlage der SRP Bindung ans Ribosom Wie kann man Translationsarrest verstehen? Gekrümmte Konformation wird stabilisiert

14 Funktionen des RER Einschleusung von Membranproteinen ins RER Synthese und Translokation eines Plasmamembranproteins z.b. Cadherin, Glykophorin

15 Einschleusung von Proteinen ins RER Topogene Informationen bestimmen Lokalisation Signalsequenz Lumen Signals. + Stop-transfer Anker Sequenz Membran Typ I (N in ) Signal-Anker Sequenz Membran Typ II (N out ) 3D Rekonstruktion des RER-gebundenen Ribosoms (Größenverhältnisse!) Film ER-translocation

16 Molekulare Funktionsweise eines Translokons Wie sieht der Translokationskomplex aus? Cryo-EM Daten Sichtbarmachung der translozierenden Polypeptidkette Konserviert von Hefe bis Mensch

17 Struktur der Translokationspore Wie sieht das Translokon (Sec61) aus? Bakterielles SecY als Modell: 10 α-helices Wie bleibt Membran Ionen-dicht?? Stopfen (Plug) Pdb.Sec61 translocon (+SecY.pse) T. Rapoport

18 Funktionen des RER Einschleusung von Proteinen ins RER N-Glykosylierung (Dolichol) Trimmen der Oligosaccharidreste Oligosaccharyltransferase

19 Funktionen des RER Proteinfaltung und Bildung von Komplexen (Chaperone, z.b. Hsp70 = BiP) Proteine haben Faltungsanleitung in Primärstruktur (Aminosäuresequenz) Viele Proteine falten sich spontan korrekt (trotz Mrd. Möglichkeiten der Strukturbildung), Anfinsen Nobelpreis Was passiert häufig ohne Chaperone? Faltung (kein aggregiertes Protein) Aggregation plus Chaperon minus Chaperon Huntington disease, Alzheimer, Parkinson, Creutzfeld-Jacob

20 Funktionen des RER Proteinfaltung und Bildung von Komplexen Mechanismus: =Hsp70 Ungefaltet Nativ gefaltet Bindung von Chaperonen an ungefaltete (hydrophobe) Proteinregionen Dadurch niedrige Konzentration an freien, ungefalteten Proteinen Geringere Aggregation entfalteter (klebriger) Proteine und mehr Zeit zur Faltung Disulfidbrückenbildung (-S-S-) (Proteindisulfidisomerase, Ero1) Stabilisierung der Proteine WICHTIG für Sekretproteine (z.b. Antikörper), Insulin

21 Funktionen des RER "Quality control (Kein Verlassen des ER ohne korrekte Faltung/Assemblierung) WICHTIG bei Mucoviscidose = Cystische Fibrose Faltung und Assemblierung von Haemagglutinin (Influenza-Virus) 1. Faltung BiP Calnexin Calreticulin 2. S-S Brücken 3. Assemblierung Prozesse wichtig bei biotechnologischer Produktion von Erythropoietin (Proliferation von Blutzellen; Doping) Plasminogen-Aktivator (Antigerinnungsfaktor bei Herzinfarkt) Insulin (Diabetes)

22 Die Idee des vesikulären Transports Ein über Vesikel verbundenes Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum Golgi Apparat Sekretorische Vesikel Plasmamembran Lysosomen Endosomen Konstitutive Sekretion (alle Zellen) Regulierte Sekretion (Drüsen) Anterograder und retrograder Transport NICHT verbunden: Mitochondrien Peroxisomen Zellkern Membrantransport von Proteinen

23 Pulse-chase Radiomarkierung + Elektronenmikroskopische Autoradiographie (G. Palade) Radiomarkierung mit 3 H Leucin für 3 min A Chase mit kaltem Leucin C A D B 7 min Inkubation B 37 min Inkubation C 117 min Inkubation D EM und Autoradiographie

24 Vesikulärer Transport - Wie funktioniert das? Prinzip des Vesikeltransports 1. Vesicle budding (Fission, Knospen) 2. Vesicle Transport (Zytoskelett Tubulin und Aktin) 3. Fusion mit Zielmembran 4. Membranorientierung (Asymmetrie, z.b Zuckerketten) 1. -Z -Z Z -Z

25 Vesikulärer Transport - Wie funktioniert das? Prinzip des Vesikeltransports 1. Vesicle budding (Fission, Knospen) 2. Vesicle Transport (Zytoskelett Tubulin und Aktin) 3. Fusion mit Zielmembran 4. Membranorientierung (Asymmetrie, z.b Zuckerketten) 1. -Z -Z Z -Z Plasmamembran (Zucker extrazellulär)

26 Vesikulärer Transport - Wie kann man das verfolgen? Live cell imaging mit Fluoreszenzmikroskopie v17-04-golgi_sorting_a.avi v17-04-golgi_sorting_b.avi

27 Film als Übersicht Secretion

28 Wie erfolgt das vesicle budding??? oder Vor dem Weggehen einen Mantel anziehen Verschiedene coats für verschiedene Membranen

29 Vesikulärer Transport - Das Clathrin coat Coat -abhängiges budding, z.b. mit Clathrin Bindung dadurch Krümmung der Membran Clathrin Coated pit (Stachelsaumgrübchen) Coated vesicle (Stachelsaumvesikel) Dann rasches Uncoating (Coat-ablösung)

30 Starke Ähnlichkeiten zwischen Clathrin Coats und COP II Coats Verschiedene COP II Strukturen im EM Vergleich: COP II Clathrin coat

31 Vesikulärer Transport - Wie wird Sortierung erreicht? Proteine enthalten spezifische Signale für Wirkort Jedes Vesikel wird spezifisch mit Proteinen bestückt Unterschiedlich für anterograden und retrograden Transport Komplizierte Sorting machinery Bsp: KDEL-Rezeptor, Rückholmechanismen, SNAREs Prä Lösliches ER Protein KDEL KDEL: K = Lys D = Asp E = Glu L = Leu

32 Das V- und T-SNARE Konzept oder Wie wird der Vesikeltransport spezifisch? V-SNARE T-SNARE Vesikel Target

33 SNAREs als Ziele der Botulinum- and Tetanustoxine Toxine sind aus verschiedenen Bakterien (Clostridien) extrem giftig (<1 µg ist tödlich) hoch spezifische Metalloproteasen Neurologische Symptome bei Vergiftung (keine Acetylcholin-Ausschüttung, Doppelsehen, Atemstillstand) Botox als Faltenlöser Ohne Botox Mit Botox

34 1898 Camillo Golgi (Padua) Apparato reticolare interno (Metallfärbung - OsO 4 ) Der Golgi-Apparat Nobelpreis 1906 mit Ramon y Cajal Bis in 50 er Jahre Kontroverse: Golgi App.: Organell oder Artefakt?? 1950 EM Daten: Golgi Strukturen in allen Zellen vor allem in sekretorischen Zellen (Schleimbildende Zellen) Ausgeprägt in Pflanzen Zellen Dictyosomen

35 Der Golgi-Apparat zentral im sekretorischen Weg Golgi-Subkompartimente: CGN - cis - medial - trans - TGN

36 Der Golgi-Apparat - Morphologie EM-Techniken

37 Der Golgi-Apparat Golgi Kompartimente: CGN - cis - medial - trans - TGN Versch. Färbemethoden (z.b. Immuno-Gold EM, Histochemische Färbungen Trans (Nukleosid- Diphosphatase) Cis (OsO 4 ) Golgi! TGN (Saure Phosphatase)

38 Funktionen des Golgi-Apparates O-Glykosylierung (Ser, Thr, Hydroxylysin) Komplexe Modifikation der N-Glykosyl- Oligosaccharidreste

39 Funktionen des Golgi-Apparates O-Glykosylierung (Ser, Thr, Hyl) Komplexe Modifikation der N-Glykosyl-Oligosaccharidreste Sulfatierung der Zuckerreste (Aufbau Extrazelluläre Matrix, Schleimbildung) Glucosaminoglykane, Hyaluronsäure

40 Funktionen des Golgi-Apparates Synthese von Glykolipiden (Sphingolipide, Ganglioside) Bedeutung der Zucker für Blutgruppe (wirken als Antigene)

41 Funktionen des Golgi-Apparates Proteinspaltungen (im TGN und später in sekretorischen Vesikeln): Spezifische Proteasen spalten... Proinsulin Insulin (Hyperproinsulinämie) Neuropeptide virale Proteine Hormone Condensing vacuole Secretory granula α-proinsulin α-insulin In kondensierenden Vakuolen In sekretorischen Granula

42 Rolle des TGN bei der Sortierung von Proteinen Regulierte Sekretion (Pankreas, andere Drüsen, Neuronen) (Kondensierende Vakuolen, Zymogengranula, Sekretorische Granula) Aktivierung von Proteasen, Hormonen, Neuropeptiden SG CV = kondensierende SG = Vakuolen sekretorische Granula

43 Rolle des TGN bei der Proteinsortierung - 4 Wege Regulierte Sekretion (Exozytose) Konstitutive Sekretion (Exozytose, sekretorische Vesikel) Exozytose Lysosomen - Endosomen Retrograder Transport