Strahlen- und chemoinduzierte multiple Medikamentenresistenz bei Kolonkarzinomzellen - differentielles Ansprechen verschiedener biologischer Parameter

Größe: px

Ab Seite anzeigen:

Download "Strahlen- und chemoinduzierte multiple Medikamentenresistenz bei Kolonkarzinomzellen - differentielles Ansprechen verschiedener biologischer Parameter"

Lena Beck
vor 8 Jahren
Abrufe

1 Strahlen- und chemoinduzierte multiple Medikamentenresistenz bei Kolonkarzinomzellen - differentielles Ansprechen verschiedener biologischer Parameter Detlef Bartkowiak, Michael Stempfhuber, Thomas Wiegel, Dirk Bottke P266 Abstract

verschiedener biologischer Parameter Detlef Bartkowiak,

2 Material und Methode Zellkultur: Kolorektalkarzinomlinie SW620 in RPMI-1640 Medium bei Dichten bis /cm². Bestrahlung: 1.8 Gy x 15 Fraktionen über 3 Wochen (70 kv; ~1 Gy/Minute). Chemoselektion: 6-15 Wochen Cisplatin (0.3 µg/ml = IC50) bzw. Doxorubicin (8 µg/ml = IC50). Efflux: Rhodamin-123 (1 µg/ml) bzw. CMFDA (40 ng/ml) 1h bei 4 C gefärbt Transfer in Farbstoff-freies Medium Efflux bis zu 60 Minuten bei 37 C Durchflußzytometrische Bestimmung des Farbstoffgehaltes nach 0-60 Minuten Gating auf morphologisch normale und Membran-intakte Zellen. Apoptose-Rate: 24h Cisplatin / Doxorubicin (jeweiis IC50). Transfer in reines RPMI-1640 Medium. Simultane durchflußzytometrische Darstellung der Morphologie (Streulicht), der metablischen Aktivität (FDA) und der Membranintegrität (PI). Gen-Expressionstest: RNA-Extraktion, reverse Transkription, Duplex-PCR-Amplifikation mit publizierten Primer-Sequenzen unter Verwendung des QIAGEN-Mulitplex-Kits. interner Referenz: GAPDH (328 bp) MDR-assoziierte Gene: MDR1 (206 bp) MRP1 (262 bp) MRP2 (202 bp) MRP3 (452 bp) LRP (237 bp, 431 bp*) GCLC (431 bp) GST (199 bp) Photometrische Auswertung nach Agar-Gelelektrophoretischer Trennung und EB-Färbung. * zur Validierung der Methode wurden zwei Primer-Paare für LRP verglichen. Die Expressionslevel stimmten überein. Klonales Wachstum: Konventioneller Koloniebildungs-Test; die Kulturdauer entsprechend minimal 8 Zellegenerationen bei unbehandelten Zellen.

CMFDA (40 ng/ml) 1h bei 4 C gefärbt Transfer in Farbstoff-freies Medium Efflux bis zu 60 Minuten bei 37 C Durchflußzytometrische Bestimmung des Farbstoffgehaltes nach 0-60 Minuten Gating auf

3 Ergebnisse I Duplex-RT-PCR bei 7 MDR-assoziierten Genen, jeweils mit GAPDH als interner Referenz und mit identischen PCR- Konditionen. Die Abbildung zeigt die Expression unbehandelter SW620- Kontrollzellen. Densitometrisch bestimmte Expression (RT-PCR, Dreifach-Experimente) MDRassoziierter Gene bei SW620 nach Chemoselektion bzw. 4 Tage / 3 Wochen nach fraktionierter Bestrahlung. Die Expressionsniveaus unbehandelter n wurden zur Normierung (=1.0) verwendet. Die Anstiege von MRP2 nach Cisplatin- Selektion bzw. LRP unmittlebar nach Bestrahlung sind statistisch signifikant (p<0.05). relative Genexpression DxR 27Gy+4d 27Gy+3W MDR1 MRP1 MRP2 MRP3 GST GCLC LRP

Densitometrisch bestimmte Expression (RT-PCR, Dreifach-Experimente) MDRassoziierter Gene bei SW620 nach Chemoselektion bzw.

4 Häufigkeit 0,03 0,02 0,01 0,00 t0 t60/4 C t60/37 C CMFDA / GS-MF Ergebnisse II Lebend-Zellfraktion 1,05 1,00 0,95 0,90 0,85 0,80 Dox 27Gy DoxR 27Gy Tage Cis Durchfluzytometrisch bestimmter CMFDA-Gehalt von SW620 Kontroll-Zellen; der enzymatische Efflux- Prozess wird bei 4 C inhibiert. Durchfluzytometrisch bestimmte Apoptose-Kinetik bei SW620-Sublinien nach 24h Pulsexposition gegen Doxorubicin bzw. Cisplatin (jeweils IC50). Farbstoff-Retention 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 27Gy +3d Rh123 GS-MF 27Gy +3W DoxR (6W) DoxR (>15W) (6W) (>15W) 27Gy +3d 27Gy +3W DoxR Farbstoff-Retention (60 Minuten Efflux bei 37 C) unterschiedlich selektierter SW620-Zellen. 1,000 0,100 0,010 0,001 0, D oxorubicin (ng/m l) Überlebensfraktion 27Gy DoxR A 1,000 0,100 0,010 0,001 27Gy B 0, C isplatin (µg/m l) Dosiswirkungsbeziehung vom Doxorubin (A) bzw. Cisplatin (B) bei chemo- / strahlenselektierten SW620.

Durchfluzytometrisch bestimmte Apoptose-Kinetik bei SW620-Sublinien nach 24h Pulsexposition gegen Doxorubicin bzw. Cisplatin (jeweils IC50).

5 Zusammenfassung Der regelmäßige Einsatz der kombinierten Radiochemotherapie macht ein Verständnis der Wechselwirkung zwischen beiden Behandlungsmodalitäten unverzichtbar. Auf Genexpressionsebene (RT-PCR) waren bei SW620-Zellen MRP2 vor allem nach Chemoselektion und LRP kurzfristig nach Bestrahlung aktiviert. Gegenüber dem MDR-Substrat Rhodamin123 war die Pumpaktivität bei SW620 nach kurzfristiger Chemoselektion und nach Bestrahlung erhöht. Nach langfristiger Chemoselektion war diese Steigerung wesentlich intensiver. Der Substrat-Farbstoff CMFDA wurde unter allen Selektionsbedingungen binnen 60 Minuten auf nahezu gleiche Restmengen extrudiert. Die Apoptose-Kinetik zeigt eine intermediäre radiogene MDR-Aktivierung an. Die klonale Wachstumsfähigkeit der SW620-Zellen in Anwesenheit von Doxorubicin ist nur nach längerfristiger Chemoselektion erhöht, während Cisplatin auch nach Selektion durch fraktionierte Bestrahlung besser toleriert wird. Die Multidrug-Resistenz (MDR) kann anhand verschiedener biologischer Endpunkte beschrieben werden. Die Beeinflußbarkeitssung der MDR durch Strahlen- oder Chemoselektion variiert bei Kolonkarzinomzellen der Linie SW620 mit der Auswahl dieser Endpunkte.

Gegenüber dem MDR-Substrat Rhodamin123 war die Pumpaktivität bei SW620 nach kurzfristiger Chemoselektion und nach Bestrahlung erhöht.

Ähnliche Dokumente

A. Sak, S. Grehl, M. Engelhard, A. Wierlemann, HP. Kaelberlah, P. Erichsen, C. Pöttgen, M. Groneberg, M. Stuschke

γ-h2ax Foci Induktion in Lymphocten des peripheren Bluts von Tumorpatienten: in vivo und in vitro Interaktion von Cisplatin mit Doppelstrangbruch-Signalen ionisierender Strahlen A. Sak, S. Grehl, M. Engelhard,