1 Hämostasesystem. K. Madlener, B. Pötzsch. 1.1 Thrombozytäre Blutstillung Plasmatische Blutstillung 8

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1 Hämostasesystem K. Madlener, B. Pötzsch. Thrombozytäre Blutstillung 8.2 Plasmatische Blutstillung 8.3 Dynamische Regulation der Gerinnungsaktivierung 0.4 Fibrinolyse

2 8 Kapitel Hämostasesystem > Einleitung Die Blutgerinnung ermöglicht nach einer Verletzung den primären Wundverschluss und begrenzt dadurch den Blutverlust. Bei intakter Gefäßwand wird eine Gerinnselbildung verhindert und die Fließfähigkeit des Blutes aufrechterhalten. Alle daran beteiligten Reaktionspartner werden dem Hämostasesystem zugerechnet. Entsprechend den physiologischen Reaktionsabläufen, den beteiligten Reaktionspartnern und den biologischen Endpunkten werden die thrombozytäre und plasmatische Blutstillung, die Regulationsmechanismen der Gerinnungsaktivierung und die Fibrinolyse unterschieden. Diese Reaktionswege des Hämostasesystems sind durch vielfache Wechselwirkungen miteinander verbunden und beeinflussen sich gegenseitig in ihrer Aktivität.. Thrombozytäre Blutstillung Auslösender Trigger für die Hämostaseaktivierung ist die verletzungsbedingte Ruptur des Gefäßendothels. Dadurch werden Gewebszellen und subendotheliale Matrixproteine freigelegt, die als Reaktionspartner für die im Blut zirkulierenden Thrombozyten und plasmatischen Hämostasefaktoren fungieren. Der im Blut zirkulierende Von-Willebrand-Faktor (vwf), ein multimeres Adhäsivprotein, bindet an freigelegte Strukturproteine der Gefäßwand wie Kollagenfibrillen. Im Unterschied zu dem im Plasma zirkulierenden vwf verändert der an Kollagen gebundene vwf unter dem Einfluss hoher Scherkräfte seine molekulare Struktur. Dadurch kann eine Bindung von Thrombozyten an den kollagengebundenen vwf erfolgen. Vermittelt wird die Bindung der Thrombozyten an den vwf durch den thrombozytären Glykoprotein-Ib-IX-Komplex, der als primärer vwf-rezeptor in hoher Konzentration auf der Thrombozytenmembran exprimiert wird (. Abb..). Der Thrombozytenadhäsion folgt die Thrombozytenaktivierung. Dieser aktive Prozess beruht auf einer Kontraktion des thrombozytären Zytoskeletts. Er führt zu einer Änderung der Thrombozytenmorphologie, die als Shape Change bezeichnet wird, zur Freisetzung von thrombozytären Inhaltsstoffen und zu einer Änderung der Membranzusammensetzung mit einer Änderung der Membranpolarisation. Der Shape Change ist im Wesentlichen durch die Ausbildung von filamentösen Pseudopodien gekennzeichnet, über die eine Vernetzung der Thrombozyten untereinander erfolgt. Zu den aus speziellen thrombozytären Organellen während der Thrombozytenaggregation freigesetzten Inhaltsstoffen gehören Gerinnungsfaktoren, vasoaktive Substanzen und thrombozytenaktivierende Substanzen wie ATP. Durch diese freigesetzten Mediatoren werden weitere Thrombozyten aktiviert, sodass die Gerinnselbildung beschleunigt wird. Ein entscheidender Agonist der Thrombozytenaktivierung ist Thrombin, das über die pa-. Abb... Molekulare Mechanismen der Thrombozytenadhäsion. Durch eine Verletzung der Gefäßwand werden subendotheliale Strukturen freigelegt, wie z. B. Kollagenfibrillen, an die Thrombozyten (TZ) adhärieren können. Vermittelt wird diese Reaktion durch das Adhäsivprotein Von-Willebrand-Faktor, der im Plasma als globuläres Protein zirkuliert und sich unter hohen Shear-stress-Bedingungen (Pfeil) entfaltet. Dadurch werden Bindungsstellen für thrombozytäre Glykoproteine freigelegt rallel verlaufende plasmatische Gerinnungsaktivierung gebildet wird und über thrombozytäre Thrombinrezeptoren verschiedene Signaltransduktionswege aktiviert. Die thrombozytäre Blutstillung wird unmittelbar nach der Verletzung eingeleitet und wird deswegen häufig auch als primäre Blutstillung bezeichnet. Dieser Begriff ist jedoch irreführend, da die Aktivierung der plasmatischen Gerinnungskaskade zeitgleich mit der Thrombozytenadhäsion initiiert wird..2 Plasmatische Blutstillung Das plasmatische Gerinnungssystem ist ein selbstamplifizierendes und dynamisch reguliertes Multienzymsystem. Die Verknüpfung der einzelnen Enzymreaktionen erfolgt

3 .2 Plasmatische Blutstillung. Tab... Plasmatische Gerinnungsfaktoren Gerinnungsfaktor Ursprüngliche Bezeichnung Syntheseort Relative Molekularmasse (M r ) Plasmakonzentration Halbwertszeit Faktor I Fibrinogen Hepatozyten mg/dl 3 4 Tage Faktor II Prothrombin Hepatozyten µg/ml 72 h Faktor V Proakzelerin Hepatozyten/ Megakaryozyten µg/ml 5 h Faktor VII Prokonvertin Hepatozyten ,5 µg/ml 4 h Faktor VIII Antihämophiler Faktor Sinusoidale Endothelzellen , µg/ml 8 2 h Faktor IX Christmas-Faktor Hepatozyten µg/ml 2 24 h Faktor X Stuart-Prower-Faktor Hepatozyten µg/ml 50 h Faktor XI Rosenthal-Faktor Hepatozyten µg/ml 60 h Faktor XII Hageman-Faktor Hepatozyten µg/ml 50 h Faktor XIII Fibrinstabilisierender Faktor Hepatozyten µg/ml 50 h Hochmolekulares Kininogen Fitzgerald-Faktor Hepatozyten µg/ml Präkallikrein Fletcher-Faktor Hepatozyten µg/ml Tissue Factor Gewebethromboplastin Ubiquitär Von-Willebrand- Faktor FVIII-assoziiertes Antigen Endothelzellen/ Megakaryozyten µg/ml 24 h über die Gerinnungsfaktoren, die zunächst als inaktive Vorstufe vorliegen. Nach ihrer Aktivierung bilden sie in dem folgenden Enzymkomplex das aktive Enzym. Der Gerinnungsfaktor ist damit Substrat in dem ersten und Enzym in dem folgenden Reaktionsschritt. Eine erste Signalverstärkung wird dadurch erreicht, dass ein gebildetes Enzym bis zu seiner Inaktivierung mehrere Substrate umsetzen kann. Eine weitere Verstärkung wird durch Rückkopplungsmechanismen erzielt. Alle plasmatischen Gerinnungsfaktoren werden in der Reihenfolge ihrer Entdeckung mit römischen Ziffern benannt. Zur Unterscheidung zwischen der aktiven Form und der noch nicht aktivierten Form wird der Faktorenbezeichnung ein kleines»a«(aktiviert) angehängt. Mit dem Suffix»i«werden inaktivierte Gerinnungsfaktoren bezeichnet. In. Tab.. sind die plasmatischen Gerinnungsfaktoren mit der Angabe des Syntheseorts, der relativen Molekularmasse (M r ), der Plasmakonzentration und der Plasmahalbwertszeit aufgelistet. Aktiviert wird das plasmatische Gerinnungssystem durch das Enzym FVIIa und den Kofaktor Gewebethromboplastin, der auch als Tissue Factor (TF) bezeichnet wird (. Abb..2). Faktor VII (FVII) zirkuliert im Unterschied zu den übrigen Gerinnungsfaktoren zu einem geringen Teil von etwa % bereits in der aktiven Form. Dieser FVIIa kann an TF binden, der in hoher Konzentration im subendothelialen Gewebe vorkommt, das nach einer Verletzung mit Blut in Kontakt kommt. Auf diese extravasale Lokalisation des TF ist die ursprüngliche Bezeichnung extrinsischer Aktivierungskomplex für den FVIIa-TF-Komplex zurückzuführen. Inzwischen konnte aber auch ein im Blut zirkulierender»intravasaler«tf nachgewiesen werden, der in freier Form und als Bestandteil zellulärer Mikropartikel vorkommt. Dieser TF spielt für die Perpetuierung der Fibrinbildung eine entscheidende Rolle. Substrat des FVIIa-TF-Komplexes ist Faktor X (FX), der nach seiner Aktivierung die Enzymkomponente des nachfolgenden Prothrombinasekomplexes bildet, dessen Substrat das Prothrombin (FII) ist. Nach proteolytischer Spaltung wird aus dem Prothrombin das aktive Enzym Thrombin (FIIa) freigesetzt. Zu den Thrombinsubstraten gehören neben Fibrinogen die Faktoren XI und XIII, die Kofaktoren V und VIII, Protein C und die Rezeptorfamilie PAR (»proteolysis activatable receptors«). Diese zum Teil gegenläufigen Thrombinwirkungen erfordern eine Regulation der Thrombinwirkung, die durch unterschiedliche Reaktionsgeschwindigkeiten, durch Modulation der Enzymaktivität durch Kofaktoren und durch eine unter-

4 0 Kapitel Hämostasesystem. Abb..2a c. Die plasmatische Gerinnungskaskade. a Aktivierung des plasmatischen Gerinnungssystems. Im Plasma bereits in aktivierter Form zirkulierender Faktor VII (FVIIa) bildet mit Tissue Factor (TF) den sogenannten extrinsischen Aktivierungskomplex, der über die Aktivierung von Faktor X (FX) die initiale Thrombinbildung einleitet. b Verstärkung der initialen Gerinnungsaktivierung. Die mit blauen Pfeilen gekennzeichneten Reaktionswege haben gemein, dass sie durch die initiale Thrombinbildung aktiviert werden und zu einer massiven Verstärkung der Thrombinbildung führen. c Fibrinbildung. Ist eine kritische Menge an Thrombin erreicht, wird die Fibrinpolymerisation und anschließende Quervernetzung der Fibrinfibrillen durch aktivierten Faktor XIII (FXIIIa) eingeleitet (blaue Pfeile). EC Endothelzellen; F Faktor; a aktivierter Faktor; FMx quervernetztes Fibrin schiedliche räumliche Verteilung der Thrombinsubstrate realisiert wird. Thrombin ist der zentrale Verstärker der initialen Gerinnungsaktivierung, weil es die Kofaktoren V und VIII sowie den Faktor XI aktiviert. Aktivierter FV (FVa) ist geschwindigkeitsbestimmender Kofaktor im Prothrombinasekomplex. Dementsprechend führt eine Erhöhung der FVa-Konzentration unmittelbar zu einer Verstärkung der Thrombinbildung. Aktivierter FVIII (FVIIIa) ist geschwindigkeitsbestimmender Kofaktor für den Faktor IXa und bildet mit diesem den Tenasekomplex. Die FIXa-Bildung erfolgt initial durch den FVIIa-TF-Komplex und anschließend durch den thrombinaktivierten FXI. Im Vergleich zu der initialen FXa-Bildung durch den FVIIa-TF-Komplex beschleunigt die Bildung des Tenasekomplexes die FXa-Generierung um mehrere Zehnerpotenzen. Die Bedeutung dieser Amplifikationsmechanismen für die plasmatische Gerinnungsreaktion wird durch die Blutungsneigung von Patienten mit einem FVIII- oder FIX-Mangel verdeutlicht. Mit steigender Thrombinkonzentration kommt es zu einem zunehmenden Umsatz des Thrombinsubstrats Fibrinogen. Thrombin spaltet aus dem Fibrinogenmolekül die Fibrinopeptide A und B ab. Die dadurch ausgelöste intramolekulare Strukturänderung ermöglicht die Polymerisation der»aktivierten«fibrinogenmoleküle zu Fibrinmonomeren. Durch den ebenfalls durch Thrombin aktivierten FXIII werden diese Fibrinmonomere durch Ausbildung von kovalenten Bindungen untereinander quervernetzt. Dabei katalysiert FXIIIa nicht nur die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den Fibrinmolekülen, sondern auch zwischen Fibrinmolekülen und extrazellulären Proteinen und Strukturproteinen der Thrombozytenmembran. Auf diese Weise entsteht ein Fibrinnetz, das die aggregierten Thrombozyten stabilisiert und zusammen mit diesen ein biomechanisch stabiles Gerinnsel bildet. Zur Bildung der Multienzymkomplexe müssen die Reaktionspartner in räumliche Nähe gebracht werden. Dies erfolgt durch Bindung der Enzyme, Kofaktoren und Substrate an die Oberfläche von negativ geladenen Phospholipidmembranen, wie sie aktivierte Thrombozyten und verletzte Zellen aufweisen. Dies ist ein Mechanismus, der die Gerinnungsaktivierung auf das verletzte Gefäßareal begrenzt..3 Dynamische Regulation der Gerinnungsaktivierung Die plasmatische und thrombozytäre Gerinnungsaktivierung wird durch verschiedene Mechanismen reguliert. Dazu zählen der»tissue-factor-pathway-inhibitor«-mechanismus (TFPI-Mechanismus), das Antithrombin-Heparin-System, das Protein-C-System und das Prostazyklin-Thromboxan- System.

5 .4 Fibrinolyse Der TFPI reguliert die Thrombinbildung in einem sehr frühen Stadium, in dem er den FVIIa-TF-Komplex blockiert. Zunächst ist hierzu die Bindung von TFPI an FXa erforderlich. Nachfolgend bindet der FXa-TFPI-Komplex an FVIIa-TF. Das Antithrombin-Heparin-System reguliert die Aktivität des Tenase- und Prothrombinasekomplexes. Antithrombin gehört zur Gruppe der Serinproteaseinhibitoren (Serpine) und inaktiviert die Faktoren Xa und IIa, in dem es deren aktives Zentrum durch kovalente Bindung blockiert. Die Interaktion zwischen Antithrombin und den Enzymsubstraten setzt eine bestimmte Konformation beider Reaktionspartner voraus, deren Entstehung durch endogene oder exogene Heparine begünstigt wird. Darauf beruht die antikoagulatorische Wirkung von Heparinen. Das Protein-C-System (PC-System) reguliert die Aktivität des Tenase- und Prothrombinasekomplexes durch Inaktivierung der Kofaktoren VIIIa und Va (. Abb..3). Aktiviert wird das PC-System an der Oberfläche von Endothelzellen durch Bindung von Thrombin an Thrombomodulin (TM). Dieser Komplex aktiviert Protein C (PC) zum aktivierten PC (APC). Zusammen mit dem Kofaktor Protein S inaktiviert APC die Kofaktoren Va und VIIIa. Dadurch wird die weitere Thrombinbildung in einem negativen Rückkopplungsmechanismus gehemmt, in dem Thrombin gleichzeitig Ziel- und Stellgröße ist. Neben dieser antikoagulatorischen Aktivität ist APC auch antiapoptotisch und antiinflammatorisch wirksam. Thrombin ist ein potenter Thrombozytenaktivator. Deswegen wird über die Regulation der Thrombinbildung auch indirekt die Thrombozytenaktivierung kontrolliert. Ein thrombozytenspezifischer Regulationsmechanismus existiert für die Thrombozytenagonisten ATP und ADP, die durch endothelzellständige Adeninnukleotidasen abgebaut werden. Darüber hinaus synthetisieren Endothelzellen mit Prostazyklin einen potenten Thrombozytenfunktionshemmer. Prostazyklin ist ein direkter Gegenspieler zu dem von Thrombozyten synthetisierten Thromboxan. Vergleichbar mit der Regulation der plasmatischen Gerinnungskaskade wird durch diese endothelassoziierten thrombozytenfunktionshemmenden Mechanismen die Thrombozytenaktivierung auf den verletzten Gefäßbereich begrenzt..4 Fibrinolyse Der biologische Endpunkt der Fibrinolyse ist der proteolytische Abbau des gebildeten Fibrins. In der biologischen Wirkung kann eine intravasale von einer extravasalen Fibrinolyse unterschieden werden. Die intravasale Fibrinolyse ist ein weiterer Regulationsmechanismus, über den die Fibrinbildung auf den verletzten Gefäßbereich begrenzt wird und der einem kompletten Verschluss des Gefäßlumens entgegenwirkt. Die extravasale Fibrinolyse katalysiert Umbauvorgänge der extrazellulären Matrix, die in der Zellproliferation und der Zellmigration eine Rolle spielen. Sie ist nicht unmittelbar an eine vorherige Aktivierung des Gerinnungssystems gekoppelt. In seiner Organisationsstruktur ist das fibrinolytische System dem plasmatischen Gerinnungssystem vergleichbar. Zentrales Enzym ist Plasmin, das im Blut als inaktives Proenzym Plasminogen zirkuliert. Die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin erfolgt durch die Plasminogenaktivatoren (PA) u-pa (»urokinase-type«pa) und t-pa (»tissue-type«pa) (. Abb..4). U-PA und t-pa sind Serinproteasen, die von Endothelzellen und anderen Zellen synthetisiert und. Abb..3. Das Protein-C-System. Auf der Oberfläche von Endothelzellen wird Protein C durch den Thrombin-Thrombomodulin-Komplex proteolytisch aktiviert. Das aktivierte Protein C bildet zusammen mit dem Kofaktor Protein S einen katalytischen Komplex, der die Thrombinbildung durch Inaktivierung der geschwindigkeitsbestimmenden Kofaktoren V und VIII reguliert (blaue Pfeile). APC aktiviertes Protein C; EPCR endothelialer-protein-c-rezeptor; TM Thrombomodulin; PC Protein C; PS Protein S. Abb..4. Das Fibrinolysesystem. Die Plasminogenaktivatoren t-pa und u-pa katalysieren die Bildung von aktivem Plasmin, das quervernetztes Fibrin proteolytisch abbauen kann. Reguliert wird die Fibrinolyseaktivität durch spezifische Inhibitoren auf der Ebene der Plasminogenaktivatoren und des Plasmins. Grau aktive Enzyme; Blau Inhibitoren; t-pa»tissue-type plasminogen activator«; u-pa»urokinase-type plasminogen activator«; PAI Plasminogenaktivatorinhibitor; PAP Plasmin-α 2 -Plasmininhibitor-Komplex; FDP Fibrindegradationsprodukte

6 2 Kapitel Hämostasesystem reguliert freigesetzt werden. In der t-pa-katalysierten Plasminogenaktivierung wirkt Fibrin als geschwindigkeitsbestimmender Kofaktor. Dies erklärt die hohe Fibrinspezifität von t-pa und lässt vermuten, dass t-pa eine dominante Rolle in der Aktivierung der intravasalen Fibrinolyse spielt. Die nicht durch einen Kofaktor regulierte u-pa-abhängige Plasminogenaktivierung ist dagegen für die extravasale Fibrinolyse entscheidend. Die Fibrinolyseaktivität wird durch verschiedene Mechanismen reguliert. α 2 -Antiplasmin ist ein direkter Plasmininhibitor, der die Enzymaktivität von Plasmin durch kovalente Komplexbildung irreversibel blockiert. Damit ist es in seinem Wirkmechanismus dem Antithrombin vergleichbar. Die Plasminbildung selbst wird durch die Plasminogenaktivatorinhibitoren (PAI) reguliert. Durch den»thrombin activated fibrinolysis inhibitor«(tafi) wird die Fibrinolyseaktivität in Abhängigkeit von der Thrombinkonzentration reguliert. TAFI ist eine Carboxypeptidase, die terminale Lysinreste aus dem Fibrinmolekül abspaltet und dadurch dessen Kofaktorfunktion in der t-pa-vermittelten Plasmingenerierung reduziert. Literatur Monroe DM, Hoffman M (2006) What does it take to make the perfect clot? Arterioscler Thromb Vasc Biol 26: 4 48 Mann KG, Brummel-Ziedins K, Orfeo T et al. (2006) Models of blood coagulation. Blood Cells Mol Dis 36: 08 7 Esmon CT (2006) Inflammation and the activated protein C anticoagulant pathway. Semin Thromb Hemost 32: 49 60

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