Physiologie der Blutgerinnung und Fibrinolyse Biochemie

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1 Schattauer GmbH Physiologie der Blutgerinnung und Fibrinolyse Biochemie K. T. Preissner Institut für Biochemie, Fachbereich Medizin, Justus-Liebig-Universität, Gießen Schlüsselwörter Multi-Komponenten-Enzymkomplexe, Thrombin, Feedback-Regulation, Oberflächenreaktionen, Enzymkaskade, Inhibitoren, Gendefekte Zusammenfassung Die Prinzipien der Auslösemechanismen, Initiator- und Amplifikationsreaktionen der Blutgerinnung und Fibrinolyse werden dargestellt und in Zusammenhang mit Regulationskreisläufen der Hämostase diskutiert. Besonders der Charakter der zelloberflächenkontrollierten Aktivierungsund Inhibierungsreaktionen in Form der Multikomponenten-Enzymkomplexe erlaubt die endogene physiologische Kontrolle des Systems und ermöglicht bei Störungen der Hämostase eine therapeutische Intervention mit unterschiedlichen pro- und antikoagulatorischen Wirkstoffen. Das Hämostasesystem umfasst lösliche und zellständige Faktoren der Blutgerinnung und Fibrinolyse, zelluläre Komponenten des Blutes, die stationäre Gefäßwand und die Blutströmung. Zusammen sind diese Komponenten untrennbar mit der Aktivierung, Inhibierung und Regulation des Systems verknüpft. Die Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen haben Möglichkeiten eröffnet, Reaktionen zwischen Gefäßwand und Blut im Detail zu studieren. Neben den vor allem von der Leber in die Zirkulation entlassenen Plasmafaktoren werden an der Blutgerinnung und Fibrinolyse beteiligte Komponenten auch vom Endothel synthetisiert, gebunden, inaktiviert oder phagozytiert, so dass die Bedeutung der Interphase zwischen Blut und Gefäßwand für die Regulation der Hämostase verständlich wird. Der nicht thrombogene Charakter des ruhenden Endothels bezieht sich auf seine Keywords Multicomponent enzyme complexes, thrombin, feedback regulation, surface reactions, enzyme cascade, inhibitors, gene defects Summary The principles of initiator and amplifications reactions of blood coagulation and fibrinolysis will be presented and discussed in relation to various regulatory pathways of haemostasis. In particular, cell surface-dependent activation and inhibition reactions are characteristics of multicomponent enzyme complexes that also allow the endogenous control of the haemostasis system. The understanding of these relationships in complications of haemo stasis has lead to different strategies for the therapeutic intervention with pro- and anticoagulant substances. Physiology of blood coagulation and fibrinolysis Biochemistry Hämostaseologie 2008; 28: vasodilatorischen, entzündungs- und wachstumshemmenden Eigenschaften, die u. a. auf die endogene Synthese von NO, Prostazyklin, Heparansulfat-Proteoglykanen sowie t-pa (Gewebe-Plasminogenaktivator), Thrombomodulin, endothelialen Protein-C-Rezeptor (EPCR) und Protein S zurückzuführen sind. Im Gegensatz dazu stellt aktiviertes Endothel mit vasokonstringierenden und entzündungs- wie wachstumsfördernden Merkmalen auch das Repertoire seiner Syntheseprodukte um und zwar auf prokoagulatorisch wirkende Komponenten (1) wie Tissue-Faktor, Platelet-activating-Faktor, Faktor V, Faktor-IX- und -X-Rezeptoren sowie Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1. Ziel der Blutstillung bei verletzter oder defekter Gefäßwand ist die Minimierung des Blutverlustes, so dass das Hämostasesystem neben dem Immunsystem einen lebensnotwendigen Abwehrmechanismus darstellt. Die Regulation der Thrombinbildung und -wirkung steht im Mittelpunkt der natürlichen antikoagulativen Mechanismen (Thrombomodulin/Protein C und zirkulierende Proteaseinhibitoren) und erlaubt die Begrenzung des reparativen Thrombus auf den Ort der ursprünglichen Gefäßverletzung. Die verzögert einsetzende (und vom Blutstrom geschützte) Proliferation und Migration von Gefäßwandzellen an der Läsionsstelle wird vor allem von lokal in hoher Konzentration vorliegenden Wachstumsregulatoren gefördert, die während der initialen Phase der Hämostase durch Thrombozyten freigesetzt wurden. Nach Gefäßwandreparatur erfolgt durch die Aktivierung der Fibrinolyse die zeitlich verzögerte fibrinspezifische Auflösung des Blutgerinnsels (Thrombolyse). Aktivierung der Blutgerinnung Das vor mehr als 40 Jahren von Earl Davie und Oscar Ratnoff formulierte Kaskadensystem der Blutgerinnung hat im Prinzip weiter Bestand (2). Eine mechanistisch ähnliche Proteasekaskade stellt das Komplementsystem bei der natürlichen Immunabwehr dar. Auslösemechanismen Auslöser der Gerinnungskaskade ist eine Gefäßläsion, an der Basalmembranstruktu-

2 260 Preissner Funktion (Komplex) Faktor-IXa- Generierung Faktor-Xa- Generierung intrinsisch extrinsisch intrinsische Phase Enzym XIa VIIa IXa ren mit Kollagenen und polymerem von- Willebrand-Faktor freilegt werden, welche die zirkulierenden (ruhenden) Thrombozyten zur Adhärenz, zu Formänderungen, Sezernierungsreaktionen und letztendlich zur Aggregation an der Verletzungsstelle induzieren. Bei diesem für die initiale Gefäßabdichtung wichtigen, innerhalb von Minuten ablaufenden Prozess ist eine Mindestkonzentration der Plättchen (>30 000/µl) lebensnotwendig. Gleichzeitig sind intakte Liganden-Rezeptorsysteme für die Zell - adhäsion und -aggregation notwendig, wobei die Interaktionen von polymerem von- Willebrand-Faktor und Kollagen mit den Thrombozytenrezeptoren Glykoprotein-Ib- Komplex bzw. Glykoprotein VI sowie die Wechselwirkung von Thrombozyten- Integrin αiibβ3 (GP IIb/IIIa) mit Fibrinogen als Brückenmolekül besondere physiologische Bedeutung haben. Weitere strukturelle und funktionelle Änderungen an dieser Verletzungsstelle sind gegenüber dem intakten Gefäßbereich zu unterscheiden: Die Konjugatbildung zwischen aktivierten Thrombozyten und Leukozyten (neutrophile Granulozyten) führt zur Gerinnungsaktivierung mittels Tissue-Faktor, der in zirkulierender Form über Mikro - partikel mit Thrombozyten assoziiert ist (3, 4). Damit wird die Blutgerinnung über den intravaskulären Tissue-Faktor- Pathway auf der Seite der Blutzirkulation ausgelöst (5). Eine tiefe Gefäßläsion setzt Aktivatoren (z. B. Tissue-Faktor) frei, die im Regelfall nicht auf dem Endothel, sondern konstitutiv auf tieferen Zellschichten der Substrat IX X Kofaktor HMW- Kininogen Tissue-Faktor VIIIa extrinsische Phase VIIa Tissue-Faktor Thrombingenerierung Prothrombinase Xa Prothrombin Va Protein-C-Aktivierung Protein-C-ase Thrombin Protein C Thrombomodulin Faktor-Va/VIIIa-Aktivierung Protein Ca Va/VIIIa Protein S Plasmin-Generierung t-pa Plasminogen Fibrin Tab. 1 Multikomponenten- Enzymkomplexe der Hämostase Abb. 1 Prinzip der Bildung eines Multikomponenten- Enzymkomplexes: An die nach Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten während der primären Hämostase abgedichtete und durch die Exponierung von negativ geladenen Phospholipiden gekennzeichnete Verletzungsstelle (aktivierte Oberfläche) werden die Kalzium-bindenden Gerinnungsproteine und nicht enzymatischen Kofaktoren spezifisch gebunden. Ihre Konzentrierung und enge molekulare Nachbarschaft ermöglicht die Zusammenlagerung in die für die Amplifizierung und Propagierung der Blutgerinnungskaskade notwendigen Enzymkomplexe (Tab. 1). Über direkte Wechselwirkungen zwischen der jeweiligen Enzym- und Substratkomponente mit dem als molekularen Schalthebel fungierenden Kofaktor kommt es zur hohen katalytischen Effizienz der entsprechenden Aktivierungsreaktion. Die Lokalisierung dieser Prozesse auf den Ort der Gefäßreparatur ist die Voraussetzung für die explosionsartige Bildung des Thrombins und ermöglicht die positiven wie negativen Rückkopplungsreaktionen zur Balance des Gerinnungsgeschehens. Gefäßwand (glatte Muskelzellen, Fibroblasten) exprimiert sind. Die aktivierten, adhärenten und aggregierten Thrombozyten bewirken eine aktive, enzymgetriebene (Translokase, Floppase) Umverteilung der Lipide in der Membrandoppelschicht mit der Exponierung von negativ geladenen, kalziumbindenden Phospholipiden wie Phosphatidylserin oder -inositol (6, 7). Diese Lipide dienen am Ort einer Gefäßverletzung der Bindung von Vitamin-K-abhängigen Gerinnungsfaktoren, die über ihre kalziumbindenden Gla-Domänen (10 12 γ-carboxyglutaminsäurereste) mit diesen lokal begrenzten Oberflächen spezifisch assoziieren und dort konzentriert werden. Weitere Kalziumbindungsstellen liegen in Form einer anderen posttranslationalen Modifikation, der β-hydroxy-asparaginsäure, in einigen Gerinnungsfaktoren vor. Die Nachbarschaft dieser nur an der Verletzungsstelle konzentrierten Faktoren ist für die effektive Auslösung und Propagierung der Blutgerinnung notwendig und begrenzt den Funktionsradius des Systems auf den Wundheilungsbereich. Mithilfe der Intravitalfluoreszenz-Video- Mikroskopie lassen sich die Vorgänge der Hämostase nach Auslösen einer Gefäßläsion (z. B. durch Laser) im Tiermodell detailliert charakterisieren (8). Amplifikation und Propagierung der Gerinnungskaskade Die Initiierung der Blutgerinnung, ob in tiefen Gefäßbereichen oder lumenseits, wird über den Tissue-Faktor in Nachbarschaft zu den genannten gerinnungsaktiven Phospholipiden ausgelöst. Als nicht enzymatischer Kofaktor stellt Tissue-Faktor den hochaffinen Rezeptor für Faktor VII/VIIa dar. Faktor X als Substrat wird durch diesen Enzymkomplex (extrinsische Tenase) zu Faktor Xa aktiviert (Tab. 1). Allerdings muss Tissue- Faktor über eine durch Proteindisulfid-Isomerase katalysierte Reaktion erst in seine aktive Konfiguration überführt werden (9). Eine Hemmung dieses Schrittes (durch Inhibierung der Proteindisulfid-Isomerase) führt zur Blockade der extrinsischen Aktivierung der Blutgerinnung. In Folge bindet Faktor Xa in enger Nachbarschaft an seinen (membranassoziierten) Kofaktor Faktor Va, der auch von Thrombozyten und Endothel bereitgestellt wird. Nur in dieser Konstellation wird das Substrat Prothrombin durch diesen Enzymkomplex (Prothrombinase) aktiviert, es entstehen minimale Thrombin-

3 261 Blutgerinnung und Fibrinolyse Tab. 2 Protease Faktor VII/VIIa Faktor X Faktor Xa Thrombin Protein S Urokinase Protease-Rezeptoren im Gefäßsystem Rezeptor (Zelltyp) Tissue-Faktor (Monozyten, Plättchen) Mac-1 (Monozyten), HSV cg (Endothel) EPR-1 (vaskuläre und andere Zellen) Faktor Va/Phospholipide (vaskuläre Zellen) PAR-1, -3 (vaskuläre und andere Zellen) Thrombomodulin (vor allem Endothel) Tyro 3, Annexin II (vaskuläre Zellen) Urokinase-Rezeptor (vaskuläre und andere Zellen)? (glatte Muskelzellen) mengen. Sie aktivieren den intrinsischen Teil der Gerinnungskaskade und tragen damit zur explosionsartigen Amplifikation der Thrombinbildung bei (10). Die Prototypen dieser Multikomponenten-Enzymkomplexe bestehen daher aus dem Proteinsubstrat (Proenzym), der aktiven Serinprotease, die beide mit einem nicht enzymatischen Proteinkofaktor assoziiert und über Kalziumbindung auf der gerinnungsaktiven Lipidmembran lokalisiert sind, um einen maximalen Substratumsatz zu erzielen (Abb. 1). Der Mangel an einer Komponente oder deren Dysfunktion (z. B. Faktor-V-Mangel oder fehlende γ-carboxylierung) führt zur drastischen Reduzierung der Enzymreaktionen und damit zur Blockierung der extrinsischen Aktivierung. Die durch die extrinsische Aktivierung generierte minimale Thrombinmenge reicht nicht aus, um Fibrinogen in Fibrin zu überführen: Vielmehr kann der Throminfunke weitere Blutplättchen aktivieren mittels Protease-aktivierbarer Rezeptoren (PAR) (Tab. 2) (11). Dies wirkt selbstverstärkend auf die intrinsische Aktivierung der Blutgerinnung, größere Thrombinmengen werden gebildet, die ausreichen, die Fibrinbildung zu katalysieren. Durch diesen positiven Feedback, der zur programmierten Explosion der Kaskade führt, werden zunächst die nicht enzymatischen Protein - kofaktoren Faktor V, VIII und das Proenzym XI durch Thrombin aktiviert (12). Im Zusammenspiel mit hochmolekularem Kininogen aktiviert der bimolekulare Faktor XIa den Vitamin-K-abhängigen Gerinnungsfaktor IX. Eine Faktor-IXa-Generierung kann auch über den extrinsischen Schenkel durch hohe Konzentrationen von Tissue-Faktor/ Faktor VIIa erfolgen. Die Zusammenlagerung der so genannten intrinsischen Tenase (Faktor IXa = Enzym, Faktor VIIIa = Kofaktor, Faktor X = Substrat) führt zum gemeinsamen Produkt Faktor Xa, das im Prothrombinase-Komplex die für den Gerinnungsprozess ausreichenden Konzentrationen an Thrombin bildet (13). Neue Untersuchungen zur Initiierung des Gerinnungssystems zeigen, dass auch ohne eigentliche Gefäßläsion eine intravasale Aktivierung des Gerinnungssystems über den extrinsischen Weg mittels Tissue- Faktor erfolgt (Abb. 2): In seiner zirkulierenden Form kann mit Mikropartikeln assoziierter Tissue-Faktor unter Bildung von Thrombozyten-Granulozyten-Konjugaten eine effektive Blutgerinnung auslösen. Diese Vorstellungen erklären auch eine zu beobachtende Gerinnungsaktivierung ohne Gewebeverletzung, die nach klassischer Interpretation schwer vorstellbar war, da Diffusionswege plasmatischer Faktoren zum extrinsischen Initiator Tissue-Faktor (im Funktion Initiierung der Blutgerinnung, Angiogenese Tissue-Faktor-unabhängige Faktor-Xa-Bildung Faktor-Va-unabhängige Thrombinbildung Thrombinbildung zelluläre Aktivierung, Zellproliferation Protein-C-antikoagulatorischer Weg, Angiogenesehemmung Protein C/Ca EPCR (Endothel) anit-inflammatorischer Mediator Protein Ca Protein S/Phospholipide (vaskuläre Zellen) Inaktivierung der Faktoren VIIIa und Va Zellproliferation zelluläre Aktivierung Zellproliferation Gewebe) durch die primären Hämostaseprozesse wie Plättchenadhäsion und -aggregation abgeschnitten sind (5). Es ist bekannt, dass Patienten mit einem Mangel an einer Komponente des Kontaktphasesystems (Faktor XII, Präkallikrein, Kininogen) keine Blutungskomplikationen aufweisen, obwohl ihre appt-werte verlängert sind. Dies besagt, dass diese Gerinnungsfaktoren keine Bedeutung für die phy- Abb. 2 Drei Dimensionen des Blutgerinnungssystems: Prinzipien der Amplifikation und intrinsischen Kontrolle der Blutgerinnungskaskade (1) Bildung des Produkts Thrombin (IIa); (2) Verstärkung der Thrombinbildung durch Amplifikation der Kaskade über Thrombin-induzierte Aktivierung des Kofaktors V (linke Seite); negative Feedback-Regulation durch den Thrombin-Thrombomodulin-Komplex unter Bildung des aktivierten Protein C (rechte Seite) und Inaktivierung des Kofaktors Va; (3) Konzentrierung der molekularen Vorgänge auf die aktivierte Thrombozytenoberfläche als Voraussetzung der positiven wie negativen Regulationsmechanismen (TF: Tissue-Faktor; TM: Thrombomodulin).

4 264 Preissner siologische Aktivierung der Hämostase/ Blutgerinnung haben. Allerdings werden diese intrinsischen Gerinnungsfaktoren bei Kontakt von Blut/Plasma mit fremden Oberflächen (Glas, Kaolin) aktiviert und führen zur Thrombin- und Fibrinbildung (Prinzip der appt-messung). Neue Untersuchungen auch an Tiermodellen zeigen, dass bei massivem Gewebeschaden oder bei Gefäßverletzung das Kontaktphasesystem durch negative geladene Nukleinsäuren/ RNA (Zellschaden) (14) oder Polyphosphate (Thrombozyten) (15) autoaktiviert wird, um so zur pathologischen Thrombusbildung beizutragen. Dementsprechend kann experimentell (bislang in Tiermodellen) durch Faktor-XIIa-Inhibitoren (16) bzw. RNase (14) eine Hemmung der pathologischen Thrombusbildung erreicht werden, ohne dass die physiologische Hämostase beeinflusst wird. Während der Aktivierung des Prothrombins diffundiert der größte Teil des entstandenen Thrombins (im Gegensatz zu anderen Gerinnungsproteasen) vom Entstehungsort und wird mit dem Blut in der Nachbarschaft der Verletzungsstelle vor allem auf dem intakten Endothel verteilt, wo Thrombin an Thrombomodulin bindet. Etwa 5% des gebildeten Thrombins reichen aus, um die physiologische Thrombusbildung unter proteolytischer Aktivierung des Fibrinogens zu garantieren. Mehr als 90% des Thrombins werden für die Regulation seiner Bildung über das Thrombomodulin/Protein-C-System genutzt (17). Der Teil des aktiven Thrombins, der am Fibrinthrombus gebunden bleibt, greift selbstverstärkend in die Gerinnungskaskade durch Aktivierung der Thrombozyten und des Faktors XIII zur Gerinnselstabilisierung ein (13). Vor Protease- Inhibitoren wie Antithrombin ist er geschützt, nicht aber vor der Hemmung durch Hirudin. Die Konzentration der Aktivierungspeptide, die aus Proenzymen freigesetzt werden, ist ein Maß für den Substratumsatz im Gerinnungssystem und kann als Diagnosemarker dienen. Fibrinogen, Faktor XIII Das in der Leber gebildete Fibrinogen (Molmasse ca ) besteht aus drei Paaren von über Disulfidbrücken verknüpften Proteinketten (Aα, Bβ, γ). Es wird durch Spaltung von vier Fibrinopeptiden (2 A, 2 B) durch Thrombin in Fibrinmonomere überführt. Diese polymerisieren (nicht kovalent) zu langen Fibrinketten und bilden das gel - artige Fibringerinnsel, das den Endpunkt bei Bestimmung der appt oder der Thrombinzeit darstellt. Die biologische Halbwertszeit des Fibrinogens beträgt drei bis fünf Tage. Bei entzündlichen Reaktionen steigt es als Akute-Phase-Protein mit einer Verzögerung von ein bis zwei Tagen auf abnorm hohe Konzentrationen an. Ein ausgeprägter Fibrinogenmangel kann beim Leberparenchymschaden infolge von Biosynthesestörungen auftreten, meist beruht ein Fibrinogenmangel jedoch auf erhöhtem Verbrauch bedingt z. B. durch Verbrauchskoagulopathie oder Hyperfibrinolyse (18). Eine erhöhte Fibrinogen-Plasmakonzentration gilt als kardiovaskulärer Risikofaktor. Das Zymogen Faktor XIII wird aus Plättchen freigesetzt, durch Thrombin in seine aktive Form überführt und stabilisiert das Gerinnsel durch kovalente Quervernetzung der Fibrinpolymere. Für die Wundheilung ist dies essenziell. Faktor XIIIa katalysiert intermolekulare Isopeptidbindungen, wobei zunächst benachbarte γ-ketten im Bereich der D-Domänen von Fibrinmolekülen kovalent verknüpft werden (D-Dimer-Bildung), gefolgt von weiteren Transglutaminase- Reaktionen an anderen Stellen des Fibrins. Neben Fibrin werden andere (Matrix-)Proteine durch Faktor XIIIa quervernetzt, was zur gefäßstablisierenden Wirkung der Transglutaminase und ihren ödempräventiven Eigenschaften beiträgt (19). Die Kryopräzipitate bei gekühlten Plasmaproben enthalten ca. 50% des Faktors VIII und des von-willebrand-faktors, 20 40% des Fibrinogens sowie einen Anteil des Faktors XIII des Vollblutes. Bei der Kryofibrinogenämie handelt es sich um Präzipitate von Fibrinogen, Fibrin und Fibro nektin im Plasma, die im Serum nicht auftauchen. Die seltenen symptomatischen Kryofibrinogenämien finden sich bei Neoplasien, Autoimmun- sowie Stoffwechselerkrankungen. Mechanistische Zusammenhänge der Präzipitatentstehung, die sich nach Wärmen wieder zurückbildet, sind unbekannt. Kontrolle und Hemmung Die vor allem in der Leber produzierten plasmatischen Faktoren (Proenzyme, Kofaktoren) zirkulieren als inaktive Vorstufen und werden zum Zeitpunkt ihres Einsatzes in der Hämostase rekrutiert und lokal aktiviert. Dieses Prinzip kann auch zur Verstärkung der Gerinnungskaskade beitragen, da die Substrate in den Multikomponenten- Enzym komplexen selbst Proenzyme darstellen, die nach Aktivierung ihrerseits als Enzymkomponente im nachfolgenden Komplex wirksam werden (Abb. 3). Da die nicht enzymatischen Protein - kofaktoren wie Tissue-Faktor, Faktor Va, Faktor VIIIa oder Thrombomodulin für die Bindung von Enzym und Substrat im jeweiligen Enzymkomplex essenziell sind, kann die Effektivität der Enzymreaktion auch über diese Kofaktoren kontrolliert werden. Dies wirkt sich positiv auf die Gerinnungskaskade durch Thrombin-mediierte Aktivierung von Faktor V und VIII aus, und antikoagulatorisch durch den in Abhängigkeit der Thrombinmenge ausgelösten negativen Feedback-Mechanismus (Produkthemmung) über das Thrombomodulin/Protein- C-System (17). Thrombomodulin Die Menge an löslichem, gerinnungsaktivem Thrombin, die entscheidend für den Fortgang der Thrombusbildung ist, wird über die Verteilung des Enzyms zwischen Diffusionsphase (Plasma) und Festphase (Endothel der Gefäßwand) reguliert, wobei die Protease ihren Charakter von einem proin ein antikoagulatorisches Enzym wandelt. Der endothelständige Kofaktor und Thrombinrezeptor Thrombomodulin bindet hochaffin über zwei Interaktionsstellen des diffundierenden Thrombins und bewirkt folgende Änderungen (20): An Thrombomodulin gebundenes Thrombin ist nicht mehr gerinnungsaktiv, da es prokoagulatorische Substrate, wie die PAR auf Thrombozyten, Fibrinogen oder Faktor XIII bzw. V und VIII nicht mehr als Substrat erkennt und aktiviert (20,21).

5 265 Blutgerinnung und Fibrinolyse Der Thrombin-Thrombomodulin- Komplex löst die Aktivierung von Protein C aus, aktiviertes Protein C (APC) im Komplex mit Protein S inaktiviert proteolytisch die Kofaktoren Va und VIIIa im Bereich der Wundheilungsstelle, so dass der Gerinnungskaskade die essenziellen prokoagulatorischen Kofaktoren fehlen (Tab. 1). Kooperativ wirkt in dieser Beziehung der vor allem auf dem Endothel großer Gefäße konstitutiv und durch Thrombin hoch regulierbare EPCR: Dieser mit Trombomodulin vergesellschaftete Rezeptor erhöht durch Bindung von Protein C dessen Affinität zum Thrombin-Thrombomodulin Komplex (22) und verhindert durch reversible Bindung von APC, dass das APC-Substrat Faktor Va (noch) nicht effektiv degradiert wird. Erst am membranassoziierten Kofaktor Protein S gebundenes APC inaktiviert die Kofaktoren VIIIa und Va. In dieser Konstellation spaltet APC den Faktor Va an Arg506 und Arg306, während in der Abwesenheit von Protein S nur die Spaltung (und damit unvollständige Inaktivierung) an Position Arg506 erfolgt. Folglich sind angeborene Mutationen in diesen Faktoren gerade im Bereich der Spaltstelle für APC (Faktor-V-Leiden) mit klinischsymptomatischen thromboembolischen Komplikationen verknüpft (23, 24). Der Thrombin-Thrombomodulin-Komplex wird teilweise von den Endothelzellen aufgenommen, so dass ein Teil des Thrombins damit eliminiert wird. TFPI Abb. 3 Angriffspunkte von Inhibitoren der Hämostase an den Multikomponenten-Enzymkomplexen: Basierend auf dem Konzept der Multikomponenten-Enzymkomplexe sind die auf verschiedenen Ebenen wirksamen (natürlichen) Inhibitoren der Blutgerinnung mit unterschiedlichen Wirkprinzipien angegeben: Tissue factor pathway inhibitor kontrolliert die Initiierung der Tissue-Faktor-abhängigen Aktivierung und wirkt als direkter Inhibitor der Proteasen Faktor VIIa und Faktor Xa. Über den Thrombin-Thrombomodulin-Komplex generiertes aktiviertes Protein C fragmentiert und inaktiviert die prokoagulatorischen Kofaktoren Va und VIIIa und unterbindet damit weitere Thrombinbildung. Vitamin-K-Antagonisten beeinflussen die γ- Carboxylierung der Vitamin-K-abhängigen Gerinnungsproteine in der Leber und senken dadurch den funktionellen Status dieser Faktoren in der Zirkulation. Kalzium-bindende Proteine wie β2-glykoprotein oder Annexin V konkurrieren auf der Endothelzelloberfläche mit der Bindung von Kalzium-abhängigen Gerinnungsfaktoren und wirken in dieser Weise antikoagulatorisch. Plasma Serinprotease-Inhibitoren wie Antithrombin können (verstärkt durch Heparinoide) aktive, von der Wundheilungsstelle diffundierende Gerinnungsproteasen direkt inhibieren und ermöglichen die Eliminierung der entstandenen Komplexe aus der Zirkulation. Die Initiierung des Gerinnungsgeschehens über zirkulierenden und extravasalen Tissue- Faktor wird durch den Gefäßwandständigen TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) kontrolliert, der mit Faktor Xa einen binären und zusätzlich mit Tissue-Faktor und Faktor VIIa einen quaternären Komplex bildet (25). Physiologische Spiegel dieses Kunitz-Typ-Inhibitors verhindern, dass geringe Mengen an Tissue-Faktor einen Gerinnungsprozess auslösen. Erst ein Überschreiten der stöchiometrischen TFPI-Barriere erlaubt die Initiierung der Gerinnungskaskade. Dies erklärt auch, warum Mikropartikelassoziierter zirkulierender Tissue-Faktor nicht spontan Gerinnung auslöst, während in der Gegenwart von leukozytärer Elastase über die Degradation des TFPI eine prothrombotische Situation hervorgerufen werden kann. Zur Thromboseprophylaxe können deshalb therapeutische Gaben von TFPI eine effektivere Kontrolle der Blutgerinnungsaktivierung vor allem in der Mikrozirkulation und bei Sepsis erzielen (18). SERPINe und Heparinoide Eine weitere Kontrolle des aus dem Gerinnungsbereich diffundierenden Thrombins und (anderer Serinproteasen) erfolgt über zirkulierende Serinprotease-Inhibitoren (SERPINe) wie Antithrombin, Protein- C-Inhibitor oder α1-proteinase-inhibitor. Diese SERPINe finden sich im Vergleich zu ihren Zielproteasen in viel höheren Konzentrationen in der Zirkulation, um zunächst über gering affine Wechselwirkungen die Enzyme durch kovalente Komplexbildung zu entschärfen und ihre nachfolgende Klärung zu induzieren. Dabei reagieren alle Thrombin-SERPIN-Komplexe zunächst mit plasmatischem Vitronektin zu ternären Assoziaten, die entweder in der Gefäßwand deponiert oder über die Leber mittels Klärrezeptoren aus dem Kreislauf eliminiert werden (26). Die Konzentration der Thrombin- Inhibitor-Komplexe im Plasma ist daher ein Maß des im Gerinnungsgeschehen entstandenen und inaktivierten Thrombins. Ein weiterer, vor allem auf die Faktoren Xa und XIa ausgerichteter Inhibitor ist das SERPIN Protein-Z-abhängiger Protease-Inhibitor (ZPI), der durch den Vitamin-K-abhängigen Faktor Protein Z eine Zelloberflächen-mediierte Gerinnungshemmung bewirkt (27). ZPI wird endogen durch limitierte Proteolyse reguliert, wobei ein ZPI-Mangel das Thromboserisiko von Patienten mit APC-Resistenz (Faktor-V-Leiden) deutlich steigert. Die Geschwindigkeit der Antithrombin- Inhibierung des Thrombins und anderer Gerinnungsproteasen wird therapeutisch durch Glykosaminoglykane wie Heparin massiv erhöht und führt so zu einer effektiven Hem-

6 266 Preissner Abb. 4 Reaktionen des Fibrinolysesystems: Auf dem Fibringerinnsel (1), das mit Sezernierungsprodukten der Thrombozyten, wie Vitronektin und PAI-1, angereichert ist, bilden t-pa (2) und Plasminogen aufgrund ihrer Affinität zum Fibrin mit diesem Kofaktor den zentralen Multikomponenten-Enzymkomplex. Das dabei entstehende Plasmin (3) kann nur in Fibringebundener Weise dieses Substrat effektiv unter Bildung von Fibrin-Degradationsprodukten (inklusive D-Dimer) proteo - lysieren (4), während es in der freien Form sofort durch α2-plasmin-inhibitor inaktiviert wird (5). Die Kontrolle der Plasminogen- Aktivierung übernimmt an Vitronektin und Fibrin gebundener PAI-1 (5). Urokinase (u-pa) übt keine fibrin - spezifische Plasminogen-Aktivierung in der Zirkulation aus, sondern findet sich extravaskulär als potenter Plasminbildner, notwendig für Zellmigration und -invasion. mung gerade des Thrombins. Physiologisch wird derselbe Mechanismus durch Gefäßwand-ständige Heparansulfat-Proteoglykane vermittelt und verleiht dem Endothel damit einen Teil seines nicht thrombogenen Charakters. Kompensiert wird diese natürliche antikoagulatorische Wechselwirkung mit Antithrombin durch basische Proteine wie Plättchenfaktor 4, Lipoproteinlipase oder TFPI, die am Endothel über Heparansulfat fixiert sind (28). Dies ist physiologisch sinnvoll, da es im Falle einer Demaskierung von endogenen Heparansulfaten nicht zur ausreichenden Generierung von Thrombin käme und damit Blutungskomplikationen aufträten. Diese Situation tritt bei Überdosierung von exogenem Heparin ein, das die Endothel-ständigen basischen Proteine kompetitiv verdrängt, selbst mit diesen Komplexe bildet und so einen immobilisierten, langlebigen Heparin-Pool am Endothel zurücklässt, der eine stark antikoagulatorische Wirkung zeigt. Aktivierung der Fibrinolyse Ähnlich wie bei der lokal begrenzten Aktivierung des Gerinnungsgeschehens muss die Thrombolyse auf die gezielte Auflösung des fibrinreichen Blutgerinnsels beschränkt bleiben und nicht zu einer systemischen Generierung des Schlüsselenzyms Plasmin führen. Letzteres wird allerdings in Kauf genommen, um bei einer Thrombolyse - therapie mit Urokinase oder Streptokinase akut möglichst hohe Konzentrationen von Plasmin systemisch zu generieren. Die Fibrinolyse ist nur ein kleiner Ausschnitt aus dem Wirkungsspektrum des Plasmins, das zusammen mit Matrix-Metalloproteinasen für Proteolyseprozesse im Rahmen des Gewebsumbaus und der Entzündung aber auch für zellinvasive Vorgänge bei der Tumorprogression und Metastasierung verantwortlich ist (29, 30). Diese extravasale Plasminbildung bewirkt vor allem Urokinase als Plasminogen-Aktivator, wobei eine erhöhte Expression dieser Protease mit einem hohen Invasionspotenzial der Zellen korreliert. Analog zum Gerinnungsgeschehen gibt es ineinander greifende Phasen der Initiierung, Amplifikation und Kontrolle der limitierten Proteolyse, die sich auch im Fibrinolysesystem bewähren. Direkte Querbeziehungen zwischen Blutgerinnung und Fibrinolyse unter Beteiligung des Thrombins ermöglichen eine phasengerechte Regulation der Hämostasekinetik (Abb. 4) (31). Initiierung der Fibrinolyse Parallel zur Bildung des Fibrins (das zusammen mit dem Plättchenthrombus die Wundheilungsreaktionen vor der Blutströmung schützt) wird die Auflösung des Fibrinnetzwerkes initiiert. Entscheidend für die Kinetik der Fibrinolyse ist der verzögerte Beginn (um die Stabilisierungsphase der Fibrinbildung nicht zu unterlaufen) mit der Steigerung der Thrombolyse. Da der in Endothelzellen konstitutiv gebildete und in seiner Freisetzung durch vasoaktive Substanzen wie Plättchen-aktivierender Faktor, Adrenalin, DDAVP oder Thrombin induzierbare t-pa (tissue-type Plasminogen-Aktivator) zusammen mit seinem Substrat Plasminogen ans Fibrin bindet, wird eine Fibrin-abhängige Proteolyse erreicht. Die selektive Bindung der Faktoren erfolgt über niedrig und hochaffine Lysin-Bindungsstellen, die in den homologen Kringle-Modulen von t-pa und Plasminogen liegen. Der lokal entstehende Multikomponenten-Enzymkomplex aus t-pa (Enzym), Plasminogen (Substrat) und Fibrin (Kofaktor) generiert das Plasmin als Schlüsselenzym der Fibrinolyse (Tab. 1). Die spezifische Bindung von Plasminogen und t-pa nimmt im Zuge der Fibrino - lyse zu, da durch die Proteolyse des Fibrins weitere Bindungsstellen für Enzym und Substrat entstehen. Über einen proteolytischen Nebenweg kann am Endothel generiertes Kallikrein auch zur intrinsischen Bildung von Plasmin beitragen. Neue Untersuchungen zeigen, dass der Kontakphasen- Kofaktor Kininogen unter physiologischen Bedingungen eine antikoagulatorische Wirkung entfaltet und damit ein weiteres Argument gegen die Beteiligung dieses Systems an der Gerinnungsaktivierung vorliegt (32). Amplifikation und Propagierung der Fibrinolyse Obwohl die Proenzyme Plasminogen und t-pa in ausreichenden Konzentrationen im Plasma sind, kommt es nicht zur systemischen Plasminbildung, da nur gebunden an Fibrin eine effektive Plasminogenaktivierung durch t-pa erreicht wird. Damit ist auch im fibrinolytischen System die Pro-

7 267 Blutgerinnung und Fibrinolyse tein-komplexbildung als Wirkprinzip einer lokal limitierten und steuerbaren Enzymreaktion ausgeprägt. Das Schlüsselenzym Plasmin spaltet den Kofaktor Fibrin effektiv an mehreren definierten Spaltstellen mit der Generierung von Fragmenten mit C-terminalen Lysinresten, die über zusätzliche Wechselwirkungen der Lysin-Bindungstellen von Plasminogen und t-pa eine Verstärkung der Interaktion des Enzymkomplexes mit dem Gerinnsel bewirken. Gleichzeitig wird aus der natürlichen Proform des Glu- Plasminogens ein kürzeres Lys-Plasminogen generiert, das mit höherer Affinität an Fibrin bindet. Ferner kommt es zur Generierung einer t-pa-zweikettenform, welche die Plasminogenaktivierung effektiver gestaltet als die Einkettenform. Schließlich aktiviert Plasmin die Proformen der Urokinase und der Matrix-Metalloproteinasen, so dass vor allem extravaskulär eine Amplifikation von perizellulärer Proteolyse (Zellinvasion) erzielt wird. Typische, auch im Plasma nachzuweisende, Fragmente sind Fibrin-Degradationsprodukte und im fortgeschrittenen Zustand einer Gerinnselauflösung auch quervernetzte D-Dimere, deren Konzentrationssteigerung im Plasma als Diagnosemarker für massive Thrombusbildung gilt. Diese Fragmente wirken profibrinolytisch, da sie die weitere Fibrinpolymerisation unterdrücken. Kontrolle der Fibrinolyse Den beschriebenen positiven Rückkopplungsreaktionen, die die Fibrin-spezifische lokalisierte Amplifikation des Fibrinolysesystems unterhalten, stehen regulatorische Mechanismen gegenüber, nicht nur um das verzögerte Anspringen des Systems zu ermöglichen, sondern auch um eine systemische Plasminolyse zu verhindern. Eine im Plasma zirkulierende Procarboxypeptidase B (TAFI, Thrombin-aktivierbarer Fibrinolyse-Inhibitor) wird durch Thrombin (vor allem im Komplex mit Thrombomodulin) aktiviert und eliminiert ihrerseits carboxyterminale Lysinreste an Bindungsproteinen (wie Fibrinfragmenten) für Plasminogen oder t-pa. Durch diese die Kinetik der Hämostase beeinflussende Eigenschaft des Thrombin-Thrombomodulin-Komplexes wird eine zu frühe Fibrinolyse verhindert und die initiale Stabilisierung des Fibringerinnsels gewährleistet (33). Während der Fibrinolyse trägt das sich strukturell wandelnde Fibringerinnsel als nicht enzymatischer Kofaktor zur Plasminregulation bei: Nachdem Plasmin eine maximale Spaltung des Fibringerinnsels erreicht hat, ist auch die Bindung von Plasminogen und t-pa nicht zu steigern. Vom Gerinnsel dissoziierende Fibrinfragmente verringern den Fibrinolyse-stimulierenden Effekt des Fibrins. Auch andere Plasmaproteine wie Lipoprotein(a) oder das Plättchenprodukt Tetranektin konkurrieren mit ihren Lysin-Bindungsstellen (auf Kringle-Modulen) um die Anheftung der Fibrinolysekomponenten ans Fibrin, so dass diese Komponenten die Fibrinolyse hemmen. Hemmung der Fibrinolyse Weiterhin treten die beiden wichtigsten Serin protease-inhibitoren des Fibrinolysesystems in Kraft: Der in Thrombozyten gespeicherte PAI-1 wird vor allem in plättchenreichen Thromben freigesetzt und im Thrombus über die direkte Bindung an Fibrin bzw. sein Stabilisierungsprotein Vitronektin fixiert. Damit wird eine direktionierte Fibrinolyse von außen nach innen erreicht, da an das Gerinnsel bindender t-pa mit fortschreitender Auflösung des Gerinnsels durch aktiven PAI-1 blockiert wird. Es kommt auch zu einer schnellen Dissoziierung von initialen t-pa/pai-1-komplexen und ihrer Klärung aus der Zirkulation. Dieser Zusammenhang erklärt auch die wesentlich effektivere Hemmung von t-pa in arteriellen thrombozytenreichen Thromben gegenüber thrombozytenarmen Gerinnseln im venösen System. Durch die Bindung von aktivem PAI-1 an Vitronektin im Thrombus oder der extrazellulären Matrix wird dieses SERPIN auch zu einem moderaten Thrombininhibitor: An Fibrin gebundenes Thrombin wird langsam unter dem Verbrauch stöchiometrischer Mengen von PAI-1 neutralisiert, so dass als Nettoeffekt die Wirkungsdauer des t-pa verlängert wird. Der zunächst auch über Faktor XIIIa kovalent an Fibrin gebundene α2-plasmin- Inhibitor trägt in einer frühen Phase der Thrombusbildung zur Stabilisierung des Gerinnsels bei, indem er über direkte Hemmung des freien Plasmins eine verfrühte Auflösung des reparativen Thrombus verhindert. Vom Thrombus diffundierende t-pa- und Plasminmoleküle werden durch die jeweiligen SERPINe effizient gehemmt, so dass proteolytische Reaktionen auf dem Gerinnsel konzentriert bleiben. Ebenso wie der D-Dimer-Anstieg als Maß für die Menge an vernetztem Fibrin gelten kann, wird die erhöhte Konzentration an Plasmin/ α2-plasmin-inhibitor-komplexen als Diagnoseparameter zum Nachweis einer Thrombose herangezogen (34). Während mit der Auflösung des Fibringerinnsels intravasal der Fibrinolyseprozess abgeschlossen ist und durch zelluläre Reparaturprozesse die Dichtigkeit des Gefäßes wiederhergestellt wird, dient das extravaskuläre Fibringerinnsel mit eingelagerten Adhäsivproteinen und Sezernierungsprodukten der Blutplättchen (wie Chemokinen und Wachstumsfaktoren) nicht nur als provisorische Wundmatrix, sondern auch als Depot zum Anlocken von Gefäßwandzellen oder Keratinozyten. Weitere Umbaureaktionen vor allem unter der Beteiligung der extra vasalen Urokinase, des Plasmins sowie aktiver Matrix-Metalloproteinasen garantieren die Wundheilung. Diese ist auch gekennzeichnet durch Angiogeneseprozesse, die unter anderem durch das Urokinase/ Plasminsystem reguliert werden (30, 35, 36). Der endogene, anti angiogene Faktor Angiostatin, ein aus mehreren Kringle-Modulen bestehendes Spaltprodukt des Plasmins, ist möglicherweise an der Begrenzung der Reparatur-Angiogenese in diesem Stadium beteiligt (37). Ähnliches könnte für bestimmte Formen des Antithrombins gelten, die ähnlich wie Angiostatin eine potente angiostatische Wirkung im Rahmen der Tumorangiogenese zeigen (38). Eliminierung von Enzym-Inhibitor-Komplexen Die im Gerinnungs- und Fibrinolysesystem nach Inaktivierung durch SERPINe gebil-

8 268 Preissner Mutationen und Thrombose neigung Abb. 5 Hereditäre Defekte in Inhibitoren der Hämostase und ihre Beziehungen zur Regulation der Thrombinbildung und -wirkung. Die Ziffern weisen auf bekannte Gendefekte der angegebenen Komponenten des Blutgerinnungs systems hin:. 1: Prothrombin-Mutationen; 2: Thrombomodulinmangel oder Mutationen; 3: Protein-C-Mangel oder -Mutationen; 4: Protein-S-Mangel oder -Mutationen, 5: Faktor-V-Mutationen, APC-Resistenz; 6: Antithrombinmangel. deten kovalenten Enzym-Inhibitor-Komplexe werden über spezifische Scavenger- Rezeptoren aus der Zirkulation eliminiert und intrazellulär (vor allem in der Leber) verstoffwechselt. Ein Scavenger-Rezeptor, der bei der Eliminierung der fibrinolytischen Enzym-Inhibitor-Komplexe aber auch bei der Endozytose von Lipoproteinen eine wichtige Rolle spielt, ist der mit dem LDL-Rezeptor verwandte α2-makroglobulin-rezeptor oder LRP (LDL-receptor related protein) (39). Weiterhin existieren gewebe spezifisch exprimierte Rezeptoren für t-pa (Annexin II) und Urokinase (Urokinase rezeptor), die eine Konzentrierung der Enzyme auf der Zelloberfläche ermöglichen, zelluläre Prozesse über Signaltransduktion induzieren helfen und an der Endozytose der Enzym-Inhibitor-Komplexe in verschiedenen Zelltypen beteiligt sind (30, 36). Einen besonderen Stellenwert nimmt der Glykolipid-verankerte Urokinaserezeptor ein, der nicht nur eine ursächliche Rolle bei der (Tumor-)Zellinvasion und Migration spielt, sondern auch unter bestimmten Bedingungen als Adhäsivrezeptor die Zelladhäsion leukozytärer Zellen an Vitronektin-reiche extrazelluläre Matrix vermittelt. In dieser Konstellation wirkt Urokinase adhäsiv, während PAI-1 die durch Urokinaserezeptor vermittelte Zelladhäsion an Vitronektin blockiert. Dabei unterbindet PAI-1 sterisch die Bindung von Vitronektin an bestimmte Adhäsivrezeptoren (αvβ3-integrin), so dass eine Integrin-vermittelte Zelladhäsion und -migration verhindert wird. Somit erfüllt das Plasminogen-Aktivierungssystem auf der Ebene der Urokinase und des PAI-1 eine duale Rolle mit proteolytischen/antiproteolytischen Eigenschaften und adhäsiven/antiadhäsiven Interaktionen, die Proteolyse-unabhängig sind. In Tiermodellen zur Angiogenese, Restenose oder Wundheilung hat sich die duale Rolle dieses enzymatischen Systems bestätigt und ist auch durch transgene Tiere belegt (40). Schließlich kann der Urokinaserezeptor mit bestimmten Integrinen interaktive Reaktionen eingehen, die für die Rekrutierung von Granulozyten bei akuten Entzündungsreaktionen oder der Abwehr bakterieller Infektionen wichtig sind (41). Störungen im Gerinnungsund Fibrinolysesystem Mit dem Verständnis der Aktivierung, Amplifikation und Kontrolle der Blutgerinnung und Fibrinolyse lassen sich die Bedingungen oder Voraussetzungen für die Neigung zur Thrombose bzw. Blutungskomplikationen sowie andere pathophysiologische Konsequenzen abschätzen (Abb. 5): Defekte in der γ-carboxylierung, fehlendes Vitamin K bzw. Synthesestörungen oder Mangelerscheinungen einzelner Gerinnungsfaktoren führen zu eingeschränkter Gerinnungsaktivierung. Dies wird um so ausgeprägter, je höher der entsprechende Faktor in der Hierarchie der Gerinnungskaskade steht und hängt von der individuellen Halbwertszeit des Gerinnungsfaktors ab. Ein markantes Beispiel stellt der Mangel an Faktor IX dar, der zu den bekannten Blutungskomplikationen der Hämophilie B führt (42). Umgekehrt wird bei Thrombophilie - patienten durch therapeutische Gabe von Vitamin-K-Antagonisten (Cumarin - derivate) zwar die γ-carboxylierung der entsprechenden Gerinnungsfaktoren in der Leber verhindert (über die Blockade der Vitamin-K-Epoxid-Reduktase), aber nicht ihre Biosynthese beeinträchtigt: Funktionell inaktive Proteine werden synthetisiert. Allerdings muss die Dosierung oraler Antikoagulanzien periodisch kontrolliert werden (INR-Ratio, Thromboplastinzeit), um fatale Blutungskomplikationen zu verhindern (43). Eine Mutation in der nicht kodierenden Region des Prothrombingens führt zu einem erhöhten Spiegel des Thrombin-Vorläufers und ist mit erhöhtem Thromboserisiko verknüpft. Dieser Zusammenhang beruht u. a. auf der Stabilisierung der ProthrombinmRNA. Ebenso kann ein Mangel an Plasminogen oder t-pa bzw. Mutationen dieser Komponenten (z. B. in den Lysinbindungsstellen) zur Hypo fibrinolyse und damit zur Thromboseneigung führen. Bestimmte Mutationen im Fibrinogen/Fibrin (mehr als 100 symptomatisch auffällige sind beschrieben) entziehen sich einer Vernetzung durch Faktor XIIIa (Wundheilungsstörung). Andere Mutationen (weniger Spaltstellen) zeigen Fibrinolyse-Resistenz gegenüber Plasmin oder enthalten weniger affine Bindungsstellen für t-pa und Plasminogen (44).

9 269 Blutgerinnung und Fibrinolyse Nicht enzymatische Kofaktoren Deutlich wird das Prinzip des nicht enzymatischen Kofaktors als essenzieller Schalter der Enzymkomplexe bei Faktor-VIII-Mangel als Ursache für Hämophilie A: Während unter physiologischen Bedingungen der Protein-C-Loop lokal begrenzt zur Kontrolle der Gerinnungsaktivierung über Inaktivierung der Faktoren Va und VIIIa genutzt wird, führt angeborener Faktor-VIII-Mangel zu massiven Blutungskomplikationen. Die paradoxe Situation, dass trotz intaktem (extrinsischen) Gerinnungssystem bei Hämophilie-A-Patienten eine Blutungsneigung besteht, liegt u. a. an der blockierenden Wirkung des TFPI, der die weitere Aktivierung der Gerinnungskaskade unterbindet (25). Protein-C-System und intrinsische Antikoagulation Gendefekte oder Mangel an Protein C und Protein S sind ebenfalls mit einem erhöhten Thromboserisiko verbunden, da die endogene Kontrolle der Thrombinbildung teilweise oder ganz unterbleibt (24). In ähnlicher Weise ist dieser intrinsische Kontrollmechanismus deutlich herabgesetzt, wenn ein an der Spaltstelle Arg506 mutierter Faktor Va nicht durch APC inaktiviert werden kann: Dieser Gendefekt im Faktor V/Va wird als APC-Resistenz bezeichnet und macht den größten Anteil (ca. 35%) der angeborenen Defekte bei Patienten mit Thromboserisiko aus (23, 45, 46). Ein mit APC-Resistenz kombinierter Protein-S-Mangel hat eine schlechtere Prognose, da APC den Faktor Va an der zweiten Proteolysestelle Arg306 nur unzureichend inaktivert. Eine analoge Resistenz der Faktor-VIIIa-Inaktivierung würde kein Thromboserisiko nach sich ziehen, da eine enzymatische Spaltung und Inaktivierung von Faktor Va erfolgen könnte. Dem hereditären Protein -C-, -S- und Anti thrombinmangel kommt eine Prävalenz von je 2 3% zu, so dass neben anderen erblichen Thrombophilien etwa die Hälfte der beobachteten Thrombosefälle unbekannter Genese sind. Mutationen oder das Fehlen von Thrombomodulin sollte auch mit erhöhtem Thromboserisiko verbunden sein. Bislang sind nur wenige Patienten mit kardiovaskulären Komplikationen und Mutationen im Thrombomodulin aufgefallen (47). Ein Fehlen der Thrombinrezeptoren PAR-1 und PAR-4 im Tiermodell führt zu intrauteriner Letalität des Embryos zum Zeitpunkt der Gefäßanlage und ist offenbar nicht mit dem Leben vereinbar (48). Untersuchungen dazu könnten Aufschluss über die Rolle des EPCR in der Protektion gegenüber Entzündungen oder septischem Schock bringen, denn eine APC-Infusion führt im Tiermodell zur deutlichen Verbesserung der ansonsten letal verlaufenden Sepsis (49, 50). Protease-Inhibitoren Prinzipiell verursacht ein Mangel an antikoagulatorischem Antithrombin eine verlängerte Amplifikation und Fortführung von Reaktionen der Gerinnungsenzyme, vor allem des Thrombins: Da die normale Plasmakonzentration des Antithrombins im Bereich seiner Affinität zum Thrombin liegt (um eine progressive, aber nicht überschießende Kontrolle des Thrombins zu erreichen), sind Inhibitorspiegel von etwa 50% der Norm bei heterozygotem Antithrombinmangel mit dem Risiko thrombotischer Komplikationen verknüpft. Umgekehrt ist bei einem α2-plasmin-inhibitormangel mit Hyperfibrinolyse und damit assoziierten Blutungskomplikationen zu rechnen. Durch Studien ist belegt, dass ein erhöhter PAI-1-Spiegel mit einer schlechten Prognose bezüglich einer Restenose verknüpft ist. Da gerade PAI-1 einer komplexen transkriptionellen Kontrolle und Expressionssteigerung (vor allem in Adipozyten) durch verschiedene Zytokine unterliegt, kann es bei einer lokalen Entzündungsreaktion zur deutlichen Schwächung der Fibrinolyse oder perizellulären Proteolyse kommen (51). Zirkulierender (diagnostisch erfassbarer) PAI-1 stellt nur einen Bruchteil des in der Gefäßwand an Vitronektin gebundenen oder in Thrombozyten gespeicherten aktiven Inhibitors dar, und Antigenbestimmungen geben keinen direkten Anhaltspunkt für den absoluten Spiegel des Inhibitors und seiner Aktivität. Gen-Knockout-Modelle Nach tierexperimentellen Untersuchungen mit Knockout-Mäusen sollte man die funktionelle Rolle mehrerer Gerinnungsfaktoren (zumindest während der Embryonalphase) in einem neuen Licht sehen: Eine Deletion von PAR-1/PAR-4, Thrombomodulin, Tissue- Faktor, Faktor V, Prothrombin oder TFPI ist (ähnlich wie beim knock-out von Endothelzell-Wachstumsfaktor, VEGF) mit dem Überleben nicht vereinbar (11, 29, 35, 48). Diese Embryonen zeigen eine retardierte Entwicklung im Anfangsstadium und verenden intrauterin zum Zeitpunkt der Anlage des Gefäßsystems. Es bleibt zu untersuchen, ob Aktivitäten dieser Komponenten jenseits der Hämostase auch im adulten Organismus zu beobachten sind und welchen Stellenwert die Faktoren in anderen zellulären Systemen haben (52). Perspektiven Aktivierung und Inaktivierung des Hämo - stasesystems lassen sich diagnostisch über bestimmte Parameter nachweisen, ohne dass makroskopisch eine Gerinnselbildung erkennbar ist. Die Basalwerte von Aktivierungsmarkern wie F1/F2-Fragment, Fibrinopeptide, D-Dimere oder den Komplexen Thrombin-Antithrombin und Plasminα2-Plasmin-Inhibitor belegen, dass kontinuierlich und latent eine Aktivierung und Inaktivierung von Hämostasekomponenten erfolgt, das System sich unter Ruhebedingungen in einem Gleichgewicht (steady state) befindet. Im Vordergrund der Diagnostik und Therapie thromboembolischer Erkrankungen und hämorrhagischer Diathesen steht die Erfassung humoraler Komponenten und zellulärer Bestandteile, wie Thrombozyten, die von diesem Gleichgewicht abweichen. Die Vorhersage eines hyperkoagulabilen Zustandes ist ein Ziel der Diagnoseforschung. Nur indirekt (z. B. durch Bestimmung löslicher Endothelzellmembran-Komponenten wie zirkulierendes Thrombomodulin) lassen sich Aussagen treffen über den Aktivie-

10 270 Preissner rungs- oder Verletzungszustand der Gefäßwand als wichtigen Mitspieler der Hämostase. Verlässliche Bestimmungsmethoden und Parameter sind gefragt, denn aus der Bestimmung zirkulierender Komponenten kann auf den tatsächlichen Gerinnungsstatus nur begrenzt geschlossen werden. Die Identifizierung von spezifischen Bindungsproteinen oder Rezeptoren für klassische Gerinnungsfaktoren (z. B. Faktor VIIa, Thrombin, Faktor X/Xa, Protein C/Ca, Protein S) auf vaskulären und zirkulierenden Blutzellen hat zu einem neuen Konzept ihrer Rolle als zelluläre Mediatoren unabhängig von der Hämostase geführt. So initiiert Thrombin einen Großteil seiner zellulären Funktionen (Chemotaxis, Proliferation, Thrombozyten- und Endothelaktivierung) durch proteolytisch limitierte Spaltung von PAR-1, -3 und -4. Faktor Xa und Protein S induzieren direkt oder indirekt über zellständige Rezeptoren die Proliferation glatter Muskelzellen, während APC über seinen Rezeptor EPCR anti-inflammatorisch wirkt (Tab. 2), was seine Schutzwirkung bei septischem Schock erklärt (50). Durch Komplexbildung mit Komplement-C4b-Bindungsprotein wird die Konzentration von freiem Protein S limitiert. Diese Beziehungen zum humoralen Immunsystem können eine Verlängerung der lokalen Gerinnungsphase bewirken. Die Existenz dieser zellulären Kontaktstellen von Gerinnungsfaktoren verdeutlicht die Verbindung zwischen Hämostase, Entzündungs- und Wundheilungsreaktionen (53). Sie könnte ein Ausgangspunkt für neue Ansätze zur Therapie von Gefäßerkrankungen sein. Blutgerinnung und Fibrinolyse stellen daher nur einen begrenzten Teil der lebenswichtigen Aktivitäten im System der zellulären Hämostase dar. Literatur 1. Cines DB, Pollak ES, Buck CA et al. 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