Hämoglobinopathie- Diagnostik. Grundzüge und Tücken
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- Christel Friedrich
- vor 5 Jahren
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Transkript
1 Hämoglobinopathie- Diagnostik Grundzüge und Tücken Zentrallabor KA Rudolfstiftung
2 Dank an das Team Hämatologie Hämoglobinopathie-Diagnostik Molekularbiologie Befundung
3 Hämoglobin-Formen Hämoglobin- Formen Globinketten- Zusammensetzung Gower 1 ζ 2 ε 2 Gower 2 α 2 ε 2 Portland 1 ζ 2 γ 2 Hämoglobin F α 2 γ 2 Hämoglobin A α 2 β 2 Hämoglobin A 2 α 2 δ 2
4 Gen-Cluster α- und β- Globin-Gencluster modifiziert nach B.J. Bain ed. Variant haemoglobins. A guide to identification (Wiley-Blackwell, Chichester, 2010)
5 Thalassämien and Hämoglobin-Varianten Thalassämien Quantitativ gestörte Synthese der α- oder β- Globinkette Hämoglobin-Varianten Strukturvarianten mit qualitativ veränderter Globinkette -α 3.7 /-α 3.7 -α 4.2 /αα -- SEA /αα -- MED /αα Nonsense Splice Deletionen Insertionen Hb S: β Glu6Val Hb C: β Glu6Lys Hb D: β Glu121Gln Hb E: β Glu26Lys
6 Indikationen zur Diagnostik Anämie Mikrozytose, Hypochromasie bei normalem Eisenstatus Auffällige Erythrozyten-Morphologie Fetale und neonatale Anämie, rez. Aborte (Anamnese, Herkunft) Coombs-negative Hämolyse unklarer Genese Verdacht auf instables Hämoglobin Ethnische Herkunft (± Gefäßverschlusskrisen) Afrika Asien Auffälligkeiten bei der Bestimmung von HbA 1c Abnormale Peaks, Diskrepanz Glucose und HbA 1c Partner-Testung bei Kinderwunsch /Schwangerschaft
7 Stufendiagnostik (1) Anamnese Blutbild, Retikulozyten, Erythrozyten-Morphologie Eisenstatus, Ret-Hb, CRP HPLC / Kapillarzonenelektrophorese Alkalische Hämoglobin-Elektrophorese Hb H Färbung (Brillant Cresyl Blau-Färbung) Hb F-Färbung (Erythrosin B-Färbung) Stabilitätstests Retikulozyten erhöht, Hämolysezeichen, suspekter Peak in HPLC Hb S Löslichkeitstest Saure Hämoglobin-Elektrophorese
8 Stufendiagnostik (2) Molekularbiologische Untersuchungen Reverse Hybridisierung (häufige Hämoglobinopathien) Sequenzierung (seltene Hämoglobinopathien) Selektive PCR-Nachweise (z.b. Lepore) Massenspektrometrie Neugeborene Aufwendig und teuer
9 Indices Index Formel Ergebnis Cut-Off Korr Am J Clin Pathol Huber-Herklotz (MCHxRDW)/(10xRBC)+RDW 19,4 < 21 eher TT, > 23 IDA Mentzer MCV/RBC 11,1 < 13: eher BTT als IDA < 15.2 England & Fraser MCV-RBC-(5xHb)-k -7,3 < 0 BTT < 7.08 Green & King MCVxMCVxRDW/(Hbx100) 45,9 < 72 BTT < 62.8 Srivastava MCH/RBC 3,8 < 3.8 BTT / < 4.4 BTT < 4.2 Shine & Lal MCVxMCVxMCH/ ,5 < 1530 < 1204 New MCV-(10xRBC) 6,1 < 15 BTT Ricerca RDW/RBC 2,5 < 3.3 BTT < 6.0 RDW MCVxRDW/RBC 156,0 < 220 BTT RBC 5,72 > 5 BTT > 5.28 Hb g/dl 12,3 MCV 63,3 < 76 < 71.3 MCH 21,5 < 27 < 22.5 RDW 14,1 < 13.6 < 12.4 Hb A2 5,8 > 3.5
10 Globin Gene Server
11 HPLC: Screening Variant II System, Beta Thal Short Programm, Bio-Rad Laboratories Hb A 96 97% Glykiertes Hb A (HbA 1c ) Posttranslational mod. Hb A Hb A % %
12 HPLC: Screening Hb S - trait Hb S - disease heterozygot [beta 6 Glu Val] homozygot [beta 6 Glu Val]
13 Alkalische Elektrophorese A F S, D A 2, E, C Application Point Zellulose Acetat ph
14 Brillant Cresyl Blau-Färbung Retikulozyt Hb H ( Golfbälle )
15 Hb F-Färbung Erythrosin B Färbelösung
16 Reverse Hybridisierung (1) Multiplex Amplification Products A + B MANUAL PROCESSING AUTOMATED PROCESSING Robotic Equipment e.g. TECAN profiblot II Automated processing of up to 30 teststrips under permanent temperature control Alkaline denaturation hybridization to WT and MUTspecific probes on test strip HYBRIDIZATION Stringent wash (45 C, 3x) Enzymeconjugate incubation and wash (RT, 3x) Processed Test Strip Color development DETECTION
17 Reverse Hybridisierung (2) Teststrip A Teststrip B red marker line control -a3.7 -a4.2 -a MED-1 --SEA --THAI --FIL cd 14 [G>A] cd 59 [G>A] cd 14 cd 59 PCR-control A green marker line red marker line control anti3.7 triple a initiation cd [T>C] cd 19 [-G] IVS1-5nt c95-99 del cd 59 [G>A] cd 125 [T>C] Hb Qong Sze cd 142 [TAA>CAA] Hb C.Spring cd 142 [TAA>AAA] Hb Icaria cd 142 [TAA>TAT] Hb Pakse cd 142 [TAA>TCA] Hb KoyaDora polya-1 [AATAA>AATAAG] polya-2 [AATAA>AATGAA] initiation cd cd 19 IVS1 cd 59 cd 125 cd 142 polya ViennaLab StripAssays PCR-control B blue marker line
18 Sequenzierung
19 Algorithmus der Diagnostik Anamnese, ethnische Abstammung, klinische Symptomatik, suspektes Blutbild/Morphologie HPLC Alkalische Elektrophorese Hb H-Färbung Abnormaler Peak Hb A 2, ev. HbF erhöht MCV < 75/80 fl, MCH <25/27 pg Genetik Hb A 2 > 4%: β-thalassämie-träger Fe, RET-Hb, RDW-CV Globin Gene Server Ev. β -Thalassämie-Genetik α-thalassämie-genetik Hb-Variante β -Thalassämie α-thalassämie Befund
20 Fall 1: Zeitpunkt der Diagnostik Hb A % WBC /µl RBC /µl HGB g/dl HCT % MCV fl MCH pg MCHC g/dl RET %% RDW-CV % RET HB pg Abklärung
21 Fall 2: Zusammenschau der Befunde (1) Pat. 1 Pat. 2 Pat. 3 WBC /µl RBC /µl HGB g/dl HCT % MCV fl MCH pg MCHC g/dl RET %% RDW-CV % RET HB pg α 3.7 /αα αα/αα
22 Fall 3: Zusammenschau der Befunde (2) Hb A WBC /µl RBC /µl HGB 11.1 g/dl HCT 34.6 % MCV 58.6 fl MCH 18.8 pg MCHC 32.1 g/dl RET 9.4 %% RDW-CV 17.0 % RET HB 20.4 pg β-genotypisierung: IVS 2.1 G>A heterozygot
23 Fall 4: Blutbild WBC /µl RBC /µl HGB 12.5 g/dl HCT 39.0 % MCV 91.0 fl MCH 29.1 pg MCHC 32.5 g/dl RET -- %% Glucose 160 mg/dl < 100 HbA 1c 4.7* / 8.1** % 6.0 HbA 1c korreliert nicht mit Plasmaglukose
24 Fall 4: HPLC
25 Fall 4: Sequenzierung Hb Ulm -βlys66asn (AAA>AAT)
26 Fall 5: Blutbild WBC /µl RBC /µl HGB 13.3 g/dl HCT 43.7 % MCV 91.6 fl MCH 27.9 pg MCHC 30.4 g/dl RET 10.8 %% Atypischer Peak bei der HbA 1c -Bestimmung
27 Fall 5: HPLC
28 Fall 5: Alkalische Elektrophorese A F S, D A 2, E, C Application Point Erythrosin B-Färbung: Hb F <1%
29 Fall 5: Sequenzierung Hb Hijiyama - β Lys120Glu (AAA>GAA)
30 Fall 6: Blutbild WBC /µl RBC /µl HGB 15.5 g/dl HCT 47.7 % MCV 91.7 fl MCH 29.8 pg MCHC 32.5 g/dl RET 13.0 %% Atypischer Peak bei der HbA 1c -Bestimmung
31 Fall 6: HPLC und Elektrophorese A F S, D A 2, E, C Application Point Eluiert wie Hb C, wandert wie Hb C...
32 Fall 6: Reverse Hybridisierung ist aber kein Hb C
33 Fall 6: Sequenzierung Hb O Arab -βglu121lys (GAA>AAA)
34 Fall 7 (1) Patientin mit bekannter Hb SC- Erkrankung, ihre drei Kinder werden zur Genotypisierung überwiesen Alle Kinder zeigen nur Hb S, erscheinen also homozygot in der Genotypisierung
35 Fall 7 (2) Vater wird genotypisiert, trägt aber kein Hb S Kuckuckseier?
36 Auf den 2. Blick Vater zeigt eine Hb F- Erhöhung auf 29.4% Hinweis auf eine Delta- Beta-Deletion Delta-Beta-Deletion in CH nachgewiesen Alle Kinder zeigen erhöhte Hb F-Fraktionen von etwa 30%, haben also die Delta-Beta- Deletion geerbt β S β C β S β β S - βδdel β - βδdel β C β β C - βδdel S A S F C A C F Kinder erscheinen in der Reversen Hybridisierung oder Sequenzierung homozygot für Hb S, da kein wt codon 6 vorhanden
37 Take Home Message Der Eisenmangel erschwert die Hb-Diagnostik beträchtlich Die Auswahl der diagnostischen Methoden ist ausschlaggebend für eine exakte Diagnose Motto: Zweimal testen, zweimal denken Diagnose nur in Zusammenschau aller Testergebnisse und hämatologischen Details Bevor wir den Glauben an das Gute im Menschen verlieren, werfen wir einen Blick auf das Hb F
38 Dank für Ihre Aufmerksamkeit
39 Saure Elektrophorese Früher Citrat Agar, jetzt Agarosegele mit saurem ph
Hämoglobinopathie-Diagnostik. oder wie man durch den Blick auf HbF den Glauben an das Gute im Menschen bewahrt
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