INAUGURAL-DISSERTATION

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1 Aus dem Department für Zahn-, Mund-, und Kieferheilkunde Klinik für Zahnerhaltungskunde und Parodontologie des Universitätsklinikums Freiburg im Breisgau Die Wirkung von dentalen Kompositmaterialien unter Einfluss von Antioxidantien auf Verhaltensparameter von Gingivazellen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Zahnmedizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2020 von Kerstin Rosemarie Siemer geboren in Hilden

2 Dekan: Prof. Dr. Norbert Südkamp 1. Gutachterin: Prof. Dr. Olga Polydorou 2. Gutachter: PD Dr. Simon D. Schulz Jahr der Promotion: 2020

3 Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis... 4 Abkürzungsverzeichnis Einleitung Literaturübersicht Komposite Veränderung der Polymerisationsreaktion in Kompositmaterialien Entwicklung der Füllpartikelgröße in Kompositmaterialien Entwicklung der organischen Matrix in Kompositmaterialien Kompomere Silorane Bulk-fill-Komposite Biokompatibilität von Kompositmaterialien Substanzfreisetzung aus Kompositmaterialien Zusammenhang zwischen Konversionsrate und herausgelösten Substanzen Zusammensetzung der Kompositeluate Zellkontakt von Kompositeluaten in der Mundhöhle Bildung von Reaktiven Sauerstoffspezies Reduktion der intrazelluläre Konzentration von GSH Gestörte Immunantwort der Zellen Antioxidantien N-Acetylcystein: Therapeutisches Einsatzgebiet Interaktion zwischen NAC und freigesetzten Substanzen Antiinflammatorische Wirkung von NAC Einfluss von NAC auf Differenzierung von HGK Antimikrobielle Wirkung von NAC Nebenwirkungen von NAC Ziel der Studie Material und Methoden Material Zellkultur Komposite Filtek TM Supreme XTE (3M GmbH, Seefeld, Deutschland) ceram.x universal (Dentsply Sirona, Bensheim, Deutschland)

4 Admira Fusion (VOCO GmbH, Cuxhaven, Deutschland) Antioxidatien - N-Acetylcystein (NAC) Methoden Probenherstellung Eluatherstellung icelligence TM - Bestimmung der Messzeitpunkte Propidium-Iodid/Syto16-Färbung, Lebend/tot-Färbung Indirekte Immunfluoreszens (IIF)-Färbung Western Blot Herstellung von Proteingesamtextrakten/Lysaten Bestimmung der Proteinkonzentration Auftrennung der Proteine mittels Gel-Elektrophorese und Proteintransfer Proteindetektion und Auswertung Statistische Analyse der Western blot-ergebnisse Quantitative Real-Time PCR-Analyse Zellversuchsansatz RNA Aufreinigung cdna Umschreibung qpcr Statistische Analyse der qpcr-ergebnisse Ergebnisse icelligence TM Morphologie und Propidiumiodfärbung IIF - qualitative Analyse von Involucrin und Filaggrin Western Blot - semi-quantitative Analyse von Involucrin und Filaggrin Involucrin Filaggrin qpcr Analysis Genexpression nach Exposition gegenüber NAC-haltiger Mediumkontrolle Einfluss der Kompositeluate und NAC auf entzündungsassoziierte Gene Einfluss der Eluate des Komposits Admira Fusion auf die Genexpression Einfluss der Eluate des Komposits ceram.x universal auf die Genexpression Einfluss der Eluate des Komposites Filtek TM Supreme XTE auf die Genexpression Diskussion Diskussion der Materialien Diskussion der Methoden

5 5.3 Diskussion der Ergebnisse Morphology/ Life/dead staining IIF/Western blot qpcr Schlussfolgerung Zusammenfassung Literaturverzeichnis Publikationen Lebenslauf Eidesstattliche Versicherung Erklärung zum Eigenanteil Danksagung

6 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Molekulare Strukturen der gebräuchlichsten Monomere in Kompositen Abbildung 2: Chemische Strukturformel von N-Acetylcystein Abbildung 3: Darstellung der Impedanzkurven der Zell-Index-Messungen Abbildung 4: Lichtmikroskopische Bilder und IIF-Bilder der Lebend/tot-Färbung Abbildung 5: IFF-Bilder nach Exposition gegenüber 3mM NAC Abbildung 6: Graphische Darstellung der Proteinmenge und Chemiluminszenz-Bild eines Western Blots von Involucrin Abbildung 7: Graphische Darstellung der Proteinmenge Chemiluminszenz- Bild eines Western Blots von Filaggrin Abbildung 8: Genexpression der HGK nach Exposition gegenüber unbehandelter Mediumkontrolle und Mediumkontrolle in Kombination mit NAC Abbildung 9: Genexpression der Entzündungs-assoziierten Gene: TNFα, IL-1β, CXC Abbildung 10: Genexpression der HGK nach Inkubation mit Admira Fusion Abbildung 11: Genexpression der HGK nach Inkubation mit ceram.x universal Abbildung 12: Genexpression der HGK nach Inkubation mit Filtek TM Supreme Abkürzungsverzeichnis BisGMA BisEMA BPA DAPI DGZMK DMEM DTT EGDMA GSH GSSH HEMA HGK Bisphenol-A Diglycidylmethacrylat Ethoxiliertes Bisphenol-A Dimethacrylat Bisphenol A 4`,6-Diamidin-2-Phenylindol deutsche Gesellschaft für Zahn-, Mund-, und Kieferheilkunde Dulbecco s Modified Eagle MediumFCS Fetal Calf Serum Dithiolthreitol Ethylendimethacrylat Glutathion (reduziert) Gluthathion Disulfid Hydroxylethylmetacrylat Humane Gingivakeratinozyten 4

7 HNO Nitroxyl IIF Indirekte Immunfluoreszenz KGM2 Keratinocyte Growth Medium 2 LPS Liposaccaride Endotoxine MAPK Mitogen aktivierte Protein Kinase NAC N-Acetylcystein NF-κB Nukleärer Faktor 'kappa-leichtketten-enhancer' der aktivierten B-Zellen OH Hydroxylrest qpcr quantitative Polymerase-Kettenreaktion Primer (Siehe Tabelle 2) ROS Reaktive Sauerstoffspezies RT Raumtemperatur NO2 Stickstoffdioxid SDS-PAGE Sodium Sodecyl Sulfat Polyacrylamide Gel Electrophorese TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung TBST TBS+ 0,2%-Tween TEGDMA Triethylenglycoldimethacrylat UDMA Urethandimethacrylat 5

8 1 Einleitung Komposite sind heutzutage die Option der Wahl für eine invasive Behandlung von kariöse Läsionen (Frankenberger et al., 2014). Die Untersuchung der Bioverträglichkeit von Kompositmaterialien hat deshalb besondere Relevanz. Ein Hauptproblem bei der Verwendung von Kompositen ist die unvollständige Polymerisation, die zu einem Restmonomergehalt im Komposit führt. Die in der Füllung verbleibenden Monomere können unter verschiedenen Bedingungen in der Mundhöhle aus dem Komposit freigesetzt werden (Polydorou et al., 2009). In früheren Studien (Ferracane, 1994; Schmalz und Dorthe, 2008) wurde gezeigt, dass etwa 5-10% der Restmonomere in einer wässrigen Lösung herausgelöst werden können. Dies entspricht etwa 2% des Gesamtgewichts des Komposits. Spahl et al. (1998) zeigten, dass neben den Monomeren wie Bisphenol A-Glycidylmethacrylat (BisGMA), Urethandimethacrylat (UDMA) und Triethylenglycoldimethacrylat (TEGDMA) auch Bestandteile des Photoinitiatorsystems wie Kampferchinon oder Benzil und eine Vielzahl weiterer Additiva aus dem Komposit herausgelöst werden können. Für viele der einzelne Komponenten, die aus dem polymerisierten Material freigesetzt werden, wurde bereits gezeigt, dass sie den Zellzyklus verzögern und zytotoxisch, östrogen oder genotoxisch wirken können (Schmalz und Dorthe, 2008). Kompositeluate mit unterschiedlicher Zusammensetzung rufen dabei in verschiedene Zelltypen unterschiedliche Effekte hervor (Schulz et al., 2012; 2015). Vornehmlich treten die herausgelösten Substanzen mit Zellen der Pulpa, die durch Dentintubuli erreicht werden, und Zellen der Mundschleimhaut in Kontakt. In diesen Zellen können Monomere nachweislich genotoxisch wirken (Schweikl et al., 2006). Obwohl die genauen molekularen Mechanismen noch unklar sind, ist es sehr wahrscheinlich, dass Monomere entweder direkt an die DNA binden (Schweikl et al., 2006) oder indirekt über die Bildung von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu DNA-Läsionen führen (Krifka et al., 2013). Die ROS-Bildung wird unweigerlich von der Abnahme von Glutathion in seiner reduzierten Form (GSH) begleitet und führt zu dem so genannten oxidativen Stress in der Zelle. Die damit verbundene Oxidation von Proteinen, Lipiden und der DNA schadet der Zelle und kann bis zur Apoptose führen (Krifka et al., 2013). In diesem Zusammenhang helfen Antioxidantien wie N-Acetylcystein (NAC) den Zellen nach Monomerexposition oxidativem Stress entgegenzuwirken (Tsukimura et al., 2009, Nocca et al., 2010; Yamada et al., 2010). NAC, ein membranpermeables Antioxidans, zeigte zum Beispiel in Zellkulturexperimenten mit Gingivafibroblasten von Lottner et al. (2013), dass es monomerinduzierte Chromatin- und DNA-Schäden signifikant reduzieren kann. Andere Studien (Perez-Giraldo, 1997; Paranjpe et al., 2007) führen die Schutzwirkung von NAC auf 6

9 seine Fähigkeit zurück, die terminale Differenzierung in Zellen zu provozieren und sie damit widerstandsfähiger gegenüber äußeren Noxen werden zu lassen. Edlundh-Rose et al. (2005) zeigten in ihrer Studie eine 10-fach schnellere Differenzierung von primäre Keratinozyten nach Zugabe von 2mM NAC als in vergleichbaren Kontrollkulturen. Basierend auf Erkenntnissen wie diesen schlussfolgerten auch Pei et al. (2018), dass NAC großes Potential hat negative Auswirkungen von Kompositen auf Zellen zu mildern. Das Erlangen eines besseren Verständnisses der Reaktionen von Zellen auf den Kontakt mit Kompositmaterialien ist erstrebenswert, da es dabei hilft die Konsequenzen von dentalen Restaurationsmaterialien für die orale Mundgesundheit besser einschätzen zu können. Dieses Wissen kann außerdem genutzt werden, um bereits existierende Produkte zu optimieren oder neue Materialien zu entwickeln. Aus diesem Grund war es das Ziel der Studie, anhand von drei Kompositen mit unterschiedlicher Chemie den Einfluss von NAC auf die durch die Komposite ausgelösten Effekte auf humane Gingivakeratinozyten (HGK) zu untersuchen. Darüber hinaus sollte überprüft werden, ob die Ergebnisse aus früheren Studien (Pei et al.,2018) auf den von uns gewählten realitätsnäheren Versuchsaufbau übertragbar sind. Dabei sollten folgenden Hypothesen überprüft werden: (i) Das Antioxidans NAC erhöht die HGK-Differenzierung, (ii) NAC moduliert die von Komposit-Eluaten ausgelösten Effekte in HGK auf der Genexpressionsebene. 7

10 2 Literaturübersicht Im Folgenden wird die Entwicklung der dentalen Kompositmaterialien beschrieben und aufgezeigt, welche Veränderungen im Laufe der Zeit zu den heute gebräuchlichen Kompositen in der Zahnmedizin geführt haben. Im Anschluss werden Aspekte der Biokompatibilität der Kompositmaterialien erläutert und die aktuelle Studienlage bezüglich der Wirkung von Antioxidantien auf potentielle Nebenwirkungen von Kompositmaterialien für den Menschen dargelegt. 2.1 Komposite In den 50er Jahren begann die Entwicklung der Kompositmaterialien (Ferracane, 2011). Damals wurde der Markt der Frontzahnfüllungen noch von Silikatzemente dominiert, die im Mundmilieu eine hohe Löslichkeit der Matrix aufwiesen (Marxkors und Meiners, 2005). Der Schweizer Chemiker Oskar Hagger entwickelte in dieser Zeit Sevriton, einen kalt aushärtenden Kunststoff, der sich im Vergleich zu den Silikatzementen unter oralen Bedingungen wesentlich stabiler verhielt. Sevriton basierte auf Glycerophosphorsäure, was die Retention der Füllung auf dem Zahn verbesserte (Söderholm, 2008). Dieser erste dentale Kunststoff hatte jedoch noch erhebliche Mängel in Bezug auf Abrasionsfestigkeit, Verfärbungen, Schrumpfung und rezidivierende Karies. Als wegweisend stellte sich rückblickend eine andere Idee von Knock und Glenn heraus, einen Kunststoff auf Methylmethacrylat-Basis mit Al2O3-Späne zu kombinieren. Dieses Konzept wurde 1951 zum Patent angemeldet (Söderholm, 2008). Den eigentlichen Durchbruch mit dentalen methylmethacrylat-basierenden Materialien erzielte allerdings Dr. R. Bowen entwickelte er das erste bekannte Bis-GMA-Komposit, das auch als Bowen-Komposit bezeichnet wird (Söderholm, 2008). Die verbesserten Eigenschaften wurden zum einen durch das von Dr. Bowen neu synthetisierte aromatische BisGMA bewirkt und zu anderen durch die Beimengung anorganischen Füllpartikeln, die mit einer Schicht Silan überzogen wurden (Chen, 2010). Das Silan ist eine amphiphile Verbundschicht, welche die anorganischen Füllpartikel mit der organischen Matrix aus Monomeren, Initiatoren, Stabilisatoren und anderen Additiva verbindet (Chen, 2010) Veränderung der Polymerisationsreaktion in Kompositmaterialien Seit der Entwicklung des ersten dentalen Bowen-Komposits wurden dentale Kompositmaterialien vielfältig weiterentwickelt. Zu Beginn dieser Entwicklung wurden Komposite aus zwei Pasten manuell angemischt. Diese Materialien waren somit selbstvernetzend, beziehungsweise chemisch-härtend. Diese Art der Abbindereaktion ist jedoch stark 8

11 von der manuellen Durchmischung abhängig und führt deshalb zu Qualitätsschwankungen (Söderholm, 2008). Eingeschlossene Luftblasen beeinträchtigten beispielsweise die mechanischen Eigenschaften (Miletic, 2018). Mitte der 1970 Jahre wurde die revolutionäre Entwicklung hin zu lichthärtenden Kompositmaterialien vollzogen. Die Lichthärtung führte im Vergleich zu chemisch härtenden Kompositen zu homogeneren Materialien und sie verschaffte dem Behandler mehr Kontrolle über die Aushärtung des Komposits um die Füllung zu modellieren (Söderholm, 2008). Die ersten lichthärtenden Komposite wurden mit ultravioletter Strahlung ausgehärtet, die jedoch ein hohes Gesundheitsrisiko für die Augen des Behandlers und die oralen Gewebe des Patienten mit sich brachte. Erst durch die Verwendung des auch heute noch gebräuchlichen Photoinitiatorsystems aus Kampferchinon in Kombination mit tertiären Aminen wurde es möglich, Licht des sichtbaren Spektrums für die Aushärtung zu verwenden (Miletic, 2018). Heute werden die lange Zeit gebräuchlichen Halogenlampen meistens durch leistungsstärkere LED-Lampen ersetzt Entwicklung der Füllpartikelgröße in Kompositmaterialien Anorganische Füller, auch disperse Phase genannt, werden dem Kompositmaterial zugesetzt, um physikalischen Eigenschaften wie zum Beispiel Druck- und Zugfestigkeit, Elastizitätsmodul, oder Verschleißfestigkeit zu erhöhen. Je höher der Füllstoffanteil im Komposit desto geringer ist die Polymerisationsschrupfung (Ernst, 2010). Füller können aus Quarz, Silikat oder Keramik bestehen. Die ersten konventionellen Kompositmaterialien enthielten sogenannte Makrofüller-Partikel, die eine Größe von 10-50µm aufwiesen und einen Füllstoffgehalt von bis zu 75% erreichten (Zhou et al., 2019). Diese sogenannten Makrofüller- Komposite weisen gute physikalische Eigenschaften aber schlechte Oberflächeneigenschaften auf. Große Füllkörper können bei der Politur an der Oberfläche herausgebrochen werden, was in einer verminderten Polierbarkeit und Verschleißfestigkeit resultiert, weshalb sie heute nicht mehr eingesetzt werden. Im Zuge der Entwicklung der Kompositmaterialien wurden daher die Füllkörper kleiner. Sogenannte Mikrofüller-Komposite enthalten Füller, die eine durchschnittliche Größe 40-50nm aufweisen (Zhou et al., 2019). Aus heutiger Sicht würde man diese Partikel eher als Nano-Partikel bezeichnen, die per Definition einen Größe von <100nm aufweisen (Ernst, 2010). In den 1970er Jahren war der Begriff Nano jedoch noch nicht etabliert, deshalb wurde die Bezeichnung Mikro gewählt. Um eine arbeitsfähige Viskosität zu erhalten kann, kann bei dieser Größe und bei homogener Verteilung, maximal ein Füllstoffanteil von 50% erreicht werden (Söderholm, 2008). Um den Füllstoffanteil zu erhöhen begonnen die Hersteller Vorpolymerisate dem Mikrofüller-Komposit zuzugeben. So lässt sich 9

12 ein Füllstoffgehalt von 70-80% erreichen, ohne dass die Viskosität des Kompositmaterials die Verarbeitungsfähigkeit beeinträchtigt. Trotzdem waren die mechanischen Eigenschaften der Mikrofüllerkomposite nicht ausreichend um allen klinischen Indikationen für Füllungen gerecht zu werden (Ernst, 2010). Einen neuen Meilenstein der Kompositentwicklung stellen die Hybridkomposite dar. Sie bestehen aus einer Kombination aus Makro- und Mikrofüllerkompositen, deren Füllkörpergehalt bis zu 85% betragen kann (85-90% Makrofüller, 10-15% Mikrofüller). Damit war es erstmals möglich auch den kaudruckbelasteten Seitenzahnbereich suffizient mit Kompositfüllungen zu versorgen. (Ernst, 2010). Hybridkomposite unterscheidet man in Midihybridkomposite/Feinpartikel- Hybridkomposite ( nm + 40nm), Minihybridkomposite/Feinstpartikel- Hybridkomposite ( nm + 40nm) und Mikrohybridkomposite/Submikrometer- Hybridkomposite (5-100nm) (Ferracane, 2011). Trotz immer kleiner werdenden Füllpartikeln blieb die Polierbarkeit der Hybridkomposite die am schwierigsten zu optimierende Materialeigenschaft, die immer noch Verbesserungspotenzial aufwies (Ernst, 2010). Zu Beginn des 21. Jahrhunderts prägte die Nanotechnologie die Entwicklung der Komposite. Es entstand das erste und bislang einzige reine Nanofüllerkomposite Filtek Supreme (3M GmbH, Seefeld, Deutschland). In diesem Material sind ausschließlich Siliziumdioxid und Zirkonoxid- Nanopartikel enthalten, die entweder in Form von Clustern oder frei und nicht-agglomeriert vorliegen (Chen, 2010). Das neue Sol-Gel-Herstellungsverfahren der Nano-Partikel ermöglichte dabei höhere Füllstoffanteile im Komposit als bei den traditionellen Mikrofüllerkompositen (Chen, 2010). Andere Hersteller integrierten Nanopartikel in konventionelle Hybridkomposite und entwickelten somit die Materialklasse der Nanohybridkomposite. Da Nano-Partikel selbst kleinere Dimensionen aufweisen als die Wellenlänge des sichtbaren Lichts können diese die Transluzenz des Komposits und damit seinen Ästhetik entscheiden verbessern (Zhou et al., 2019). Darüber hinaus führten Nanopartikel zu verbesserten Polierbarkeit (Ferracane, 2011). Bei den physikalischen Eigenschaften wie zum Beispiel die Druckfestigkeit, das Verschleißfestigkeit oder die Polymerisationsschrumpfung konnten die Nano- beziehungsweise Nanohybridkomposite jedoch die Mikrohybridkomposite nicht mehr übertreffen (Miletic, 2018) Entwicklung der organischen Matrix in Kompositmaterialien Trotz immenser Entwicklungen im Bereich der Kompositmaterialien blieb die organische Matrix der Komposite lange Zeit unverändert. Die meisten Kompositmaterialien enthalten bis heute mehrfunktionelle Methacrylate mit der Grundformel MA R MA. Die Größe und 10

13 Funktionalität der R-Gruppe bestimmt die Viskosität, die Schrumpfung, den Polymerisationsgrad und viele weitere Eigenschaften der Kompositmaterialien. Es ist anzunehmen, dass bis zu 90% aller handelsüblicher Komposite Bisphenol A-Glycidylmethacrylat (BisGMA) enthalten (Ernst, 2010). Andere häufig verwendete Monomere sind Urethandimethacrylat (UDMA) und Triethylenglycoldimethacrylat (TEGDMA) (siehe Abb.1) (Radolph et al., 2018). Während der Monomervernetzung verkürzen sich die intermolekularen Abstände im Vergleich zum unpolymerisierten Zustand und das Komposit schrumpft. Die Polymerisationschrumpfung konnte durch die Erhöhung des Fülleranteils und das Einbringen von Vorpolymerisaten, was gleichbedeutend mit einer Reduktion des Matrixanteils ist, in modernen metyacrylatbasierten Kompositen auf 1,5-2,5% verringert werden (Miletic, 2018). Allerdings ist für die, durch die Schrumpfung verursachten, Probleme, wie zum Beispiel Abrisse an der Kavitätenwand, primär die Polymerisationsschrumpfungskraft verantwortlich. Diese ist das Produkt aus Polymerisationsschrumpfung und Elastizitätsmodul. Mit abnehmendem Matrixanteil nimmt die Elastizität des Komposits ab und damit das E-Modul zu. Das Produkt aus Polymerisationsschrumpfung und E-Modul bleibt daher bei steigendem Füllstoffanteil nahezu gleich. Die Reduzierung der Schrumpfungskraft kann demzufolge nicht allein über die Steigerung des Füllstoffanteil erreicht werden (Ernst, 2010). Die Entwicklung neuer Matrixsysteme stellt daher einen weiteren Ansatz dar dieses Problem zu lösen. Andere Zielsetzungen der Matrixweiterentwicklung waren zum Beispiel die Implementierung einer Flouridabgabe in das Füllungsmaterial, Verbesserung der Technik-Sensitivität des Komposits und die Optimierung der Handling-Eigenschaften und der Ästhetik. Im Folgenden wird auf einige Komposite mit modifizierter organischer Matrix näher eingegangen. 11

14 Abbildung 1: Molekulare Strukturen der gebräuchlichsten Monomere in Kompositen- BisGMA, UDMA, TEGDMA Kompomere Eine Möglichkeit die Matrix von Kompositen zu verändern ist die die Kombination unterschiedlicher Materialklassen, wie sie bei den Kompomeren realisiert wurde. Kompomere sind lichthärtende Komposite, die durch die Zugabe von Glasionomerzementen modifiziert wurden. Diese polyacryl/polycarboxyl säuremodifiziertes Komposite enthalten Füller aus Fluoroaluminiumsilicate-Glass und oder disperse Siliziumdioxid-Partikeln von unterschiedlicher Größe (0,2µm bis 10µm) (Soncini et al., 2007). Damit sollten die nützlichen Eigenschaften der Komposite, wie zum Beispiel die gute Ästhetik und ihre Stabilität um die Vorteile der Glasionomerzemente wie die leichte Handhabung und die Fluoridabgabe ergänzt werden (Zimmerli et al., 2010) erschien unter dem Namen Dyract (Dentsply Sirona, Bensheim, Deutschland) das erste Kompomer auf dem Markt (Rekha et al., 2012). Die Hersteller von Kompomeren propagieren eine gewinnbringende Fluoridfreigabe, die in erster Linie auf die beigefügten Fluorosilicat-Füllkörper zurückzuführen ist, die durch klinische Studien nachgewiesen werden konnten (Cildir and Sandalli, 2005; Lennon et al., 2007). An Grenzflächen, die mit feuchten Medien in Kontakt kommen, kann zudem das Kompomer in geringer Schichtstärke aufgrund der Säure-Base Reaktion der Glasionomerkomponenten aushärten, was das Material weniger anfällig für Restfeuchtigkeit in der Kavität macht (Ernst, 2010) und damit eine vereinfachte Verarbeitung der Kompomer ermöglicht (Soncini et al., 2007). Die mechanischen Eigenschaften sind nach bisherigem Stand der Forschung jedoch gerade im Hinblick auf die Abrasionsstabilität nicht mit denen von Hybridkompositen 12

15 ebenbürtig (Correr et al., 2006). Kompomere haben daher aktuell ihr Indikationsgebiet im Bereich der Milchzahnrestauration, obwohl sie auch für den kaudruckbelasteten Seitenzahnbereich zugelassen sind (Ernst, 2010) Ormocere Eine Kompositkatergorie mit verändertem Matrixsystem, das durch die Zusammenarbeit der Dentalindustrie und des Fraunhoferinstitutes für Silikatforschung (Würzburg, Deutschland) entstand ist, sind die Ormocere ein Acronym für Organically Modified Ceramic. Die Grundidee dieser Kompositkategarie war, ein anorganisches Gerüst aus Polysiloxane mit Anhängern aus konventioneller, organischer und polymerisierbarer Chemie (Methylacrylatmolekülen) zu konstruieren und nicht wie bisher eine organische Matrix mit anorganischen Partikeln zu füllen. Für dentale Anwendungen ist aktuell nur das Produkt Admira Fusion (VOCO GmbH, Cuxhafen. Deutschland) als reines Ormocer-Material erhältlich. Bei einem 5 Jahres Vergleich zwischen Admira Fusion (Ormocer) und Tetric Ceram (Hybridkomposit) zeigten sich jedoch keine verbesserten physikalischen Eigenschaften der Ormocere gegenüber Hybridkompositen (Bottenberg et al., 2009). Das gleiche Ergebnis lieferte eine Studie mit Ceram X (Dentsply Sirona, Bensheim, Deutschland), ebenfalls ein Ormocer, die keine verbesserte Überlebensrate der Ormocere im Vergleich zu konventionellen Kompositen zeigte (Schirrmeister et al., 2006, 2009). Auch die erhoffte Reduktion der Polymersiationsschrumpfung konnte bei allen auf dem Markt erhältlichen Ormoceren nicht nachgewiesen werden (Ernst, 2010). Ormocere zeigten lediglich eine verbesserte Bioverträglichkeit im Vergleich zu konventionellen Hybridkompositen, aufgrund eines niedrigeren Restmonomergehalts (Polydorou et al., 2009; Schubert et al., 2019) Silorane Die Materialklasse der Silorane besteht im Unterschied zu klassischen methacrylatbasierenden linearen Monomersystemen aus den ringbildenden Bausteinen Siloxan und Oxiran. Bei diesem ringöffnenden Komposite kommt es bei der Polymerisation zur Öffnung eines Ring/Epoxidsystemen, was mit einer Volumenexpansion einhergeht (Boaro et al., 2010). Diese Expansion soll die immanente Kontraktion von sich annähernden Molekülen ausgleichen und so in der Summe zu einer geringeren Polymerisationsschrumpfung führen (Boaro et al., 2010). So entstand 2007 das methacrylatfreie Komposit Filtek TM Siloran (3M GmbH, Seefeld, Deutschland). Bei diesem Komposit konnte die Polymerisationsschrumpfung auf <1 % bei gleichbleibenden mechanischen Eigenschaften gesenkt werden (Weinmann et al., 2005). 13

16 Allerdings führte die verringerte Schrumpfung des Silorans zu keinen messbaren klinischen Vorteilen gegenüber konventionellen methacrylatbasierten Kompositen (Maghaireh et al., 2016). Als nachteilig erwies sich zudem, dass das Siloran extrem hydrophob ist und deshalb spezielle Zweischritt-Adhäsive benötigen, die nicht mit anderen Kompositen kompatibel sind. All dies führte dazu, dass aufgrund mangelnder Nachfrage Silorane heute nicht mehr auf dem Markt erhältlich sind (Miletic, 2018b) Bulk-fill-Komposite Das Einbringen von konventionellen Kompositen erfolgt in der inkrementellen Schichttechnik. Dabei werden Schichten mit einer maximalen Schichtstärke von 2mm appliziert. Jede Schicht muss dabei separat polymerisiert werden. Mit dem Ziel diese zeitaufwendige Mehrschichttechnik zu vereinfachen wurden Bulk-fill-Materialien entwickelt. Bulk-fill- Materialien sind aufgrund ihrer unterschiedlichen chemischen Zusammensetzungen keinen Werkstoffklasse sondern eine inhomogene Materialgruppe (Van Ende et al., 2017), deren gemeinsame Eigenschaft eine vergrößerte Durchhärttiefe ist (van Dijken und Pallesen, 2016). So können bei der Anwendung von Bulk-fill-Materialien Schichtstärken von 4-5mm im Gegensatz zu den herkömmlichen 2mm bei konventionellen Kompositen erreicht werden. Bei den meisten Produkten werden diese vergrößerten Durchhärttiefen durch eine erhöhte Transluzenz der Materialien erzeugt (Fronza et al., 2015). Es gibt jedoch Vertreter der Bulkfill-Komposite die eine modifizierte organische Matrix haben, welche zu einer verbesserten Polymerisationstiefe führt. Beispielsweise enthalten diese modifizierten Bulk-fill-Komposite Polymerisationsmodulatoren, welche die Polymersiationsgeschwindigkeit herabsetzen und so die Spannung während der Polymersiation reduzieren, oder sie enthalten neben dem herkömmlichen Campherchinon/Amin-Initiatorsystem einen zusätzlichen reaktiven Photoinitiator, der in der Lage ist, das Material in der Tiefe zu polymerisieren. Andere Bulkfill-Komposite beinhalten neuartige Monomere, die trotz langer Ketten relativ flexibel bleiben und sich so an Schrumpfungskräfte besser anpassen können (Van Ende et al., 2017). Diese Durchhärttiefe wird zum einen durch eine erhöhte Transluzenz der Materialien erzeugt und zum anderen durch die Anwendung von verbesserten Photoinitiatorsystemen (Manhart und Hickel, 2014). Grundsätzlich gibt es fließfähige Vertreter der Bulk-fill-Komposite, die jedoch eine 2mm dicke Deckschicht benötigen, um verminderte physikalische Eigenschaften auszugleichen, und stopfbare Varianten der Bulk-fill-Materialien (Van Ende et al., 2017). In Bezug auf den Polymerisationsschrumpfungstress (Schrumpfungskraft bezogen auf die Fläche der Kavitätenwände) zeigte Gruppe der Bulk-fill-Materialien inkonsistente Ergebnisse (Van 14

17 Ende et al., 2017). Dies ist vermutlich unterschiedlichen Versuchsaufbauten geschuldet, bei dem auch das Adhäsivsystem großen Einfluss hat (Van Ende et al., 2017). SDR (Dentsply Sirona, Bensheim, Deutschland) ist das am besten untersuchteste Bulk-fill-Material (Van Ende et al., 2017), welches vielversprechende Ergebnisse zeigte. Beispielsweise verzeichneten Ilie und Hickel (2011) in Bezug auf den Schrumpfungsstress, für SDR die geringsten Werte verglichen mit fließfähigen und stopfbaren konventionellen Kompositen und einem Siloran. Forschungsergebnisse von Van Dijken und Pallesen (2016) zeigten nach 5 Jahren Nachbeobachtung, dass bei Verwendung von stopfbaren Bulk-fill-Kompositen, sowie Bulkfill-Flowables in 4-mm-Schichten ähnlich gute klinische Ergebnisse erzielt werden wie bei Verwendung von klassischen Hybridkompositen in 2-mm-Schichten. 2.2 Biokompatibilität von Kompositmaterialien Komposite können durch den direkten Kontakt mit der Haut lokal oder durch Aufnahme in den Körper systemisch auf den Menschen wirken und bergen somit potentielle Risiken für die menschliche Gesundheit (Shahi et al., 2019). Pathophysiologische Reaktionen nach direktem Kontakt mit Kompositmaterialien wie zum Beispiel Kontakt-Dermatitis, occupational skin disease, oder allergische Reaktionen, wurden bei zahnmedizinischen Fachpersonal häufig beschrieben (Alanko et al., 2004). Die bei der Verarbeitung von Kompositen entstehende Stäube beziehungsweise Dämpfe können zudem Bronchialasthma verursachen indem sie inhaliert werden oder durch Speichel in den Verdauungstrakt gelangen, wo sie metaboliert werden (Piirilä et al., 2002). Kompositmaterialien haben darüber hinaus Einfluss auf das Bakterienwachstum. Es wurde herausgefunden, dass die vermehrt austretende Monomere TEGDMA und Ethylendimethacrylat (EGDMA) die Proliferation von Bakterien unterstützen, was genauso wie die Hydrophobizität der Komposite zu einer vermehrten Adhäsion von Bakterien auf der Kompositoberfläche im Vergleich zu natürlichem Schmelz oder Keramik führt (Benderli et al., 1997) Substanzfreisetzung aus Kompositmaterialien Unter den Bedingungen der Mundhöhle treten aus dem bereits polymerisierten Material Bestandteile aus (Polydorou et al., 2007, 2012). Beim Herauslösen von Bestandteilen aus Kompositen unterscheidet man zwischen einem kurzzeitigen Effekt, direkt nach der Polymerisation, und einen Langzeit-Effekt, der durch Erosion und Biodegradation durch Enzyme des Speichels einsetzt (Polydorou et al., 2009; Polydorou, 2018). Michelsen et al. (2012) untersuchten den Speichel von Patienten nach Insertion von Kompositrestaurationen auf 15

18 seinen Monomergehalt. Direkt nach der Füllungstherapie fanden Sie dabei Monomere im Speichel der Patienten, nicht jedoch nach 7d Verweildauer der Restaurationen in der Mundhöhle. Eine andere Studie zeigte, dass Monomere auch ein Jahr nach Polymerisation aus dem Komposit freigesetzt werden können (Polydorou et al., 2009). Die Hauptquelle für eluierbare Monomere sind die Restmonomere, die aufgrund unvollständiger Polymerisation im Kompositmaterial verbleiben (Polydorou et al., 2009; Polydorou, 2018) Zusammenhang zwischen Konversionsrate und herausgelösten Substanzen Der Zusammenhang zwischen der Konversionsrate im Kompositmaterial und der Menge an herausgelösten Substanzen ist Gegenstand vieler Studien zur Bioverträglichkeit von Kompositmaterialien (Ferracane, 1994; Sideridou and Achilias, 2005; Polydorou et al., 2009, 2011, 2012; Ilie et al., 2014). Der, durch die Polymerisation erreichte, Grad der Monomer- Polymer-Konversion, also der Prozentsatz an umgesetzter Kohlenstoff-Kohlenstoff (C-C)- Doppelbindungen in C-C-Einfachbindungen, liegt in konventionellen Hybridkompositen bei 50 75% (Tarle et al., 2006). Nach Ferracane et al. (1994) werden ca % der nicht umgesetzten C-C Doppelbindungen aus dem Komposit herausgelöst, beziehungsweise zwei Gewichtsprozent aller Kompositbestandteile. Allerdings ist die Anzahl an nicht umgesetzten C- C-Doppelbindungen nicht gleichzusetzen mit der Menge an freien, möglicherweise eluierbaren Monomeren (Tarle and Par, 2018). Ihre Menge ist zusätzlich abhängig von der durch die Aushärtebedingungen maßgeblich beeinflusste Polymerarchitektur, in der auch Monomere mit freien C-C Doppelbildungen fest im Netzwerk des Kompositmaterials gebunden sein können (Ilie et al., 2014). Dennoch gilt, je höher die Konversionsrate desto geringer die Menge an herausgelösten Monomeren (Sideridou und Achilias, 2005; Pongprueksa et al., 2015). Dabei ist die Konversionsrate von vielen Faktoren wie zum Beispiel der Zusammensetzung des Komposits, dem Füllergehalt, dem Photoinitiatorsystem, der Belichtungszeit, der Modulation der Belichtung, der Schichttiefe und Effekten wie dem pre-heating oder der post-curereaction abhängig (Tarle and Par, 2018) Zusammensetzung der Kompositeluate Welche Zusammensetzung Kompositeluate haben wurde in zahlreichen Studien bereits untersucht (Ferracane, 1994; Spahl et al., 1998; Al Hiyasat et al., 2004; Polydorou et al., 2009). In der Studie von Spahl et al. (1998) wurden 34 Einzelsubstanzen in den Eluaten von 4 verschiedene Kompositmaterialien nachgewiesen. Hauptbestandteile der Kompositeluate sind BisGMA, UDMA, TEGDMA sowie Ethoxiliertes Bisphenol-A Dimethacrylat (BisEMA) 16

19 (Ferracane, 1994; Polydorou et al., 2007; 2009). Die Zusammensetzung der Eluatebestandteile ist von den jeweiligen Kompositmaterialien abhängig. Ergebnisse der Arbeitsgruppe Polydorou et al. (2009) lassen vermuten, dass die Menge an austretendem Monomer stärker mit der Chemie des Materials, der Füllerverteilung und der Größe der Füllpartikel korreliert als mit dem Gesamtfüllergehalt. In diesem Zusammenhang zeigte Polydorou et al. (2011) ebenfalls, dass aus dem Ormocer-basierenden Material Ceram X die geringste Menge an Bestandteilen herausgelöst wurde und führte dies auf die Chemie der Ormocere zurück (Polydorou et al., 2012). Zudem ist die Zusammensetzung der Eluate von dem verwendeten Lösungsmittel abhängig (Polydorou et al., 2012). Das Molekülgewicht der verwendeten Monomere und ihre Lipophilie spielen ebenfalls eine Rolle. Durch Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie wurden in der Arbeitsgruppe Polydorou et al. (2009) Proben auf die gängigsten Monomere wie BisGMA, TEGDMA, UDMA und BisEMA getestet. Nach 24h Lagerung in 75% Ethanol wurden beispielsweise für das Komposit Filtek Supreme XTE ca. 9 mm BisGMA, ca. 5mM TEGDMA und ca. 10,5 mm UDMA im Eluat nachgewiesen. Andere Autoren (Schmalz und Dorthe, 2008) fanden das zusammengenommen ca. 2 Gewichtsprozent der organischen Matrix in wässriger Lösung heraus gelöst wird und dass Monomerer mit größerem Molekulargewicht, wie zum Beispiel BisGMA und UDMA in kleineren Mengen heraus gelöst werden als (Ko)-Monomere wie EGDMA, TEGDMA, GDMA oder Hydroxylethylmetacrylat (HEMA). Um Bedingungen zu simulieren, die vergleichbar sind mit denen die in der Mundhöhle herrschen, empfiehlt die Food and Drug Administration (FDA) in den Guidelines of USA (1976, 1988) die Verwendung von 75% Ethanol. Ein Lösungsmittel, das den Einfluss von sauren Getränken, Obst, Gemüse und Zucker widerspiegeln soll (Sideridou et al., 2007). Polydorou et al. (2011) zeigten, dass Ethanol signifikant mehr Bestandteile aus den Kompositen löste als natürlicher Speichel (Polydorou et al., 2012). Auch Bestandteile wie Bisphenol A (BPA) konnten in Kompositeluaten nachgewiesen werden, die jedoch nicht bei der konventionellen Herstellung von Kompositen verwendet werden (Al Hiyasat et al., 2004). Woher das detektierte BPA stammt ist noch nicht abschließend geklärt. Vermutungen erklären das Vorhandensein von Bisphenol A durch Verunreinigungen von BPA-haltigen Schläuchen bei der Herstellung von BisGMA. Dass das BPA als Abbauprodukt von BisGMA entsteht wurde in einer Studie von Schmalz et al. (1999) untersucht, konnte aber bis heute nicht festgestellt werden. BisGMA zeigte sich dabei unter verschiedenen hydrolytischen Bedingungen stets stabil (Schmalz et al., 1999). 17

20 2.2.4 Zellkontakt von Kompositeluaten in der Mundhöhle Herausgelöste Bestandteile des Komposits können entweder der Klebefläche zum Dentin über Dentintubuli auf Zellen der Pulpa treffen oder über den Speichel in Kontakt mit Zellen der Oralmukosa kommen (Van Landuyt et al., 2011). Durch die physiologische Schichtung der Oralmukosa bedingt treffen die Eluate dabei zuerst auf HGK in der Epidermis (Lee et al., 2014) Bildung von Reaktiven Sauerstoffspezies Es wurde bereits gezeigt, dass Zellen auf den Kontakt mit Monomeren mit der Bildung von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) reagieren (Schweikl et al., 2001; Krifka et al., 2012). Durch die zusätzlichen ROS verschiebt sich das intrinsische Redox-Gleichgewicht der Zellen in eine zellschädigende Lage, was konzentrationsabhängig zum Zelltod via Apoptose führen kann (Schweikl et al., 2006). Akgul et al. (2015) kamen zu dem Schluss, dass Komposite das Antioxidant-Redox-System des Körpers beeinflussen. ROS-Spezies, wie O 2-, OH - und H2O2 werden physiologisch bei einer unvollständigen Reduktions-Reaktion von molekularem Sauerstoff gebildet. Dies kann als Reaktion auf exogenen Stress auf die Zelle passieren, ist aber ebenfalls ein Produkt des normalen aeroben Stoffwechsels. ROS ist ein Paradoxon der Zelle, da es gleichzeitig zelltoxisch ist und als Signalbotenstoff in der Zell fungiert (Blanchetot und Boonstra, 2008). Es existieren verschiedene Hypothesen wie Monomere die Bildung von ROS beeinflussen. Engelmann et al. (2004) beschreiben, dass BPA-Derivate, wie zum Beispiel BisGMA, die Aktivität von Cytochrome P450 steigern. Das aktivierte Cytochrome P450 führt im mitochondriale Enzymkomplex zu einer vermehrten ROS-Bildung (Engelmann et al., 2004). Darüber hinaus wird vermutet, dass bei der Metabolisierung von Monomeren ROS entstehen. Die dritte Hypothese besagt, dass durch die Bildung von Komplexen mit GSH es zu einem Mangel an GSH in der Zelle kommt und so nachgeschaltet mehr ROS entstehen Reduktion der intrazelluläre Konzentration von GSH Gluthation ist ein in der Zelle allgegenwärtiges Tripeptid bestehend aus Glycin, Cystein und Glutamat (Noda et al., 2005). Es existiert intrazellulär in seiner reduzierten Form (GSH) und der oxidierte Form (GSSH). Unter physiologischen Bedingungen liegt Gluthathion in der Zelle hauptsächlich als GSH vor (>95%). GSH spielt eine entscheidende Rolle im Schutz und in der in der Entgiftung der Zelle, wobei es zu GSSG oxidiert wird (Noda et al., 2005). Seine antioxidative Funktion geht auf eine SH-Gruppe im Cystein-Teil zurück, die mit Radikalen reagieren kann. Gleichzeitig fungiert es als Substrat für die Gluthation Peroxidase, die H2O2 18

21 reduziert (Nocca et al., 2011). Das Gleichgewicht zwischen GSH und GSSG wird durch ihr Reduktions-Potential beschrieben. Schafer und Buettner (2001) beschreiben in einem Übersichtartikel die Relation in der Zelle zwischen dem Reduktions-Potential des Redox-Paars GSH/GSSG und ihrem biologischen Status. Sie fanden heraus, dass eine milde Redox- Verschiebung zu Proliferation (-240 mv) oder Differenzierung (ca mv) führt und ein weiterer Abfall des Reduktionspotentials auf > -170 mv zur Apoptose führt. Oxidativer Stress, beispielsweise ausgelöst durch Monomerer, führt zu einer Verschiebung des Gleichgewichts hin zu vermehrtem GSSG und erhöht somit das Reduktionspotential (Schafer and Buettner, 2001). Engelmann et al. (2002) zeigten in humanen Gingivafibroblasten nach Exposition gegenüber subtoxische Konzentrationen von TEGDMA (0,5-7mM) einen Abfall der GSH- Konzentration von 30-50% in den ersten 2-6h. Dabei zeigte sich in der Studie keine gleichzeitige Verminderung der Zell-Viabilität (Engelmann et al., 2002). Allerdings führt ein massivem Mangel an GSH zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber weiteren Noxen und trägt damit zum zytotoxischen Effekt der Komposite bei (Engelmann et al., 2002). Der durch die Monomere hervorgerufene Verbrauch von GSH ist jedoch nicht auf einen Verbrauch im Sinne einer Detoxifikation zu verstehen, da ein simultaner Anstieg der GSSH-Konzentration nicht festgestellt wurde (Engelmann et al., 2002; 2004). Engelmann et al. (2002, 2004) vermuteten stattdessen, dass eine direkte Reaktion zwischen GSH und Monomeren der Grund für den GSH- Verbrauch sei. Diese Bildung von Verbindungen zwischen GSH und Monomeren wurde in vitro von Nocca et al. (2011) in Untersuchungen mit Fibroblasten nachgewiesen Gestörte Immunantwort der Zellen Monomere beeinflussen in Zellen des angeborenen Immunsystems die Signalwege, die durch Liposaccaride Endotoxine (LPS) gesteuert werden. Wie genau ist bis dato ungeklärt. Krifka et al. (2010) wiesen in ihrer Arbeit auf die hohe Komplexität hin, die zwischen den Faktoren besteht, die die Mitogen Aktivierte Protein Kinase (MAPK) aktivieren, die Zytokineausschüttung inhibieren und den Zelltot durch Apoptose in Gegenwart von Monomeren herbeiführen. Sie führten den ersten experimentellen Beweis, der Monomerinduzierten Inhibition der LBS-induzierten Zytokine-Ausschüttung. LPS führen zu einer Aktivierung von CD14 und des TLR4-Komplexes, die nach einer Kaskade von Signalproteinen schlussendlich MAPK oder einen Transkriptionsfaktor, den genannt Nukleärer Faktor 'kappa- Leichtketten-Enhancer' der aktivierten B-Zellen (NF-κB) aktivieren. Diese wiederrum führen zu einer Ausschüttung pro- und antiinflammatorischen Entzündungsmarker wie unteranderem Tumornekrosefaktor α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1ß), Interleukin 6 (IL 6), Interleukin 8 (IL 19

22 8) und Interleukin 10 (IL 10). Es konnte gezeigt werden, das die Ausschüttung dieser Zytokine in Maus- Makrophagen nach Kontakt mit TEGDMA signifikant zurückgegangen ist und somit die Vermutung nahe liegt, dass eine angemessene Immunantwort durch Monomere gestört wird (Krifka et al., 2010). Eine andere Arbeitsgruppe zeigte hingegen eine Aktivierung von NF-kB nach Inkubation mit HEMA in Fibroblasten (Spagnuolo et al., 2004). 2.3 Antioxidantien Um den zuvor beschriebenen Effekten der Monomere auf die Zellen entgegen zu wirken wurde in der Vergangenheit massiver Forschungsaufwand betrieben. Neben Bestrebungen weniger Monomere in den dentalen Restaurationen einzusetzen, wird versucht mittels Antioxidantien die Nebenwirkungen von Monomeren zu reduzieren. Die namensgebende Funktion von Antioxidantien besteht im Abfangen von freien Radikalen oder anderen Oxidantien im menschlichen Organismus. Im Vergleich zu enzymatischen Komplexen haben diese meistens ein niedrigeres Molekulargewicht und werden entweder im Körper synthetisiert oder werden durch die Nahrung aufgenommen. Ein Beispiel für endogene Antioxidantien ist die Harnsäure, die für 85% der antioxidativen Funktion des menschlichen Speichels verantwortlich ist (Battino et al., 2002). Andere Beispiele sind das Coenzym Q oder die Liponsäure. Zu den mit der Nahrung aufgenommenen Antioxidantien gehören viele Vitamine wie zum Beispiel Vitamin C und E (Siems et al., 2005). Dem Körper können darüber hinaus auch künstliche Antioxidantien wie zum Beispiel NAC zugeführt werden N-Acetylcystein: Therapeutisches Einsatzgebiet NAC wird in der Medizin seit Jahrzehnten als Therapeutikum verwendet. Dabei macht sich die Medizin hauptsächlich zu Nutzen, dass nach oraler Gabe NAC in der Leber überwiegend zu L- Cystein deacetyliert wird, einer schwefelhaltigen Aminosäure, die als Baustein bei der GSH- Synthese im Körper gebraucht wird (Pei et al., 2018). Die bekannteste Anwendung von NAC ist die mukolytische Therapie, als ACC-Präparat oder als Antidot bei Vergiftung nach Paracetamol-Einnahme. Darüber hinaus bildet NAC mit Metal-Ionen wie Cu 2+, FE 3+ aber auch Schwermetalle wie Cd 2+ und Hg 2+ Chelatkomplexe. Durch Bildung der Komplexe wird die Ausschleusung dieser Giftstoffe aus dem Körper vereinfacht (Pei et al., 2018) Interaktion zwischen NAC und freigesetzten Substanzen NAC hat eine große Bandbreite therapeutisch nutzbarer Eigenschaften. Das Monomere durch das Verursachen von oxidativer Stress Zellen schädigen, wurde unteranderem daran gezeigt, 20

23 dass der Einsatz von Antioxidantien wie NAC die Zytotoxizität der Monomere signifikant verringert (Yamada et al., 2010). Im Mittelpunkt der Forschung zu NAC stand daher lange Zeit seine antioxidative Wirkung. Wenn Leukozyten in der Zelle zu viel ROS und/oder reaktive Stickstoffspezies produzieren und die zelleigene oxidative Kapazität nicht ausreicht, um diese zu neutralisieren, kommt es zu oxidativem Stress in der Zelle. Dieses Ungleichgewicht kann durch Oxidierung von Proteinen, Lipiden und der DNA zu Zellschäden beziehungsweise bis zum Zelltod führen (Krifka et al., 2013). NAC kann als direktes Antioxidans den oxidativen Stress durch Interaktion seiner freien Schwefel-Seitenkette (siehe Abb.2) mit den freien Elektronenpaaren der Radikale verringern (Tsukimura et al., 2009). Neben diesem direkten Weg der Neutralisierung der ROS, scheint der dominierende Mechanismus der antioxidativen Wirkung von NAC jedoch der indirekte Weg über die Wiederherstellung von GSH zu sein. GSH ist das Hauptantioxidans der humanen Zelle und liegt in deutlich höheren Konzentration in der Zelle vor als NAC (Krifka et al., 2010; 2013). Lottner et al. (2013) konnten zeigen, dass alle in ihrer Studie untersuchten Monomere DNA Doppelstrangbrüche in humanen Gingivafibroblasten induzierten, deren Vorkommen durch die Zugabe von 500µM NAC reduziert werden konnten. Sie schlussfolgerten aus ihren Ergebnissen, dass ROS und Epoxide hauptverantwortlich für die Gentoxizität der zahnärztlichen Monomere sind und nicht die direkte Wechselwirkung der Monomere mit der DNA. Als dritte Möglichkeit der Interaktion zwischen NAC und Monomeren wurde außerdem gezeigt, dass NAC über die Michaels-Reaktion direkt an die Methylgruppen der Monomere bindet (Spagnuolo et al., 2013). Spagnuolo et al. (2013) konnten das Addukt aus TEGDMA und NAC extrazellulär zu jedem Versuchszeitpunkt und intrazellulär in 3T3 Mausfibroblasten nach 4h, nicht aber nach 24h Inkubation nachweisen. Als Erklärung für das frühere Verschwinden des Adukkts aus der Zelle im Vergleich zu TEGDMA allein, vermuten sie, dass die an NAC gebundenen Monomere hydrophiler sind und somit leichter aus dem Zytosol ausgeschieden werden können (Spagnuolo et al., 2013). Abbildung 2: Chemische Strukturformel von N-Acetylcystein. 21

24 2.3.3 Antiinflammatorische Wirkung von NAC NAC kann, als Antioxidans, an mehreren Stellen in den Entzündungsprozess von Zellen eingreifen (Palacio et al., 2011). Der Einfluss den NAC auf biochemische Kaskade, welche zur Aktivierung von NF-κB führt, ausübt wird widersprüchlich in der Literatur beschrieben. NFκB ist ein Transkriptionsfaktor der wiederrum im Zellkern zur Expression von proinflammatorischen Zytokinen IL-1ß, IL 6, IL 8 sowie von TNFα führt (Pei et al., 2018). Normalerweise liegt NF-κB im Zytosol gebunden an das Inhibitormolekül I κb in seiner inaktiven Form vor. Bei oxidativem Stress, das heißt vermehrtem ROS-Vorkommen, wird I κb phosphoryliert und NF-κB kann in den Zellkern transportiert werden, wo es dann die Transkription zahlreicher Gene ermöglicht. Pei et al. (2018) vermuten, dass NAC diesen Prozess beeinflusst, indem es ROS abfängt und durch Inhibierung eines Enzyms die Translokalisation von NF-κB in den Zellkern blockiert (Pei et al., 2018). Spagnuolo et al. (2004) zeigten jedoch in ihrer Studie, dass die Hemmung des Abbaus von IκB und Hemmung der DNA-Bindung von NF-κB die HEMA-induzierte Apoptose in humanen Fibroblasten signifikant erhöhte. Paranjpe et al. (2007) konnten zeigen, dass zum einen Monomere wie HEMA die Aktivität von NF-κB inhibieren und zum anderen, dass durch die zusätzliche Zugabe von NAC die Aktivität von NF-κB teilweise wiederhergestellt werden kann. Daraus leiteten sie eine Erklärung für die schädigende Wirkung von HEMA ab und den Beweis für eine protektive Wirkung von NAC. Darüber hinaus zeigten Paranjpe et al. (2009) an NF-κB Knockdown HGK, dass bei 50% der Zellen, die gegenüber HEMA exponiert wurden, es ebenfalls zu einem protektiven Effekt durch NAC kam. Sie schlussfolgerten, dass NAC HGK vor den toxischen Effekten von HEMA durch einen NF-κB-unabhängigen und einen NF-κB-abhängigen Weg schützen kann (Paranjpe et al., 2009). NAC kann darüber hinaus schon extrazellulär toxische ROS abfangen, und so verhindern, dass eine inflammatorische Antwort ausgelöst wird. Zudem verhindert NAC intrazellulär LPSinduzierte Lipidperoxidation in der Membran (Palacio et al., 2011) Einfluss von NAC auf Differenzierung von HGK Aus einem Vergleich zwischen den Antioxidantien NAC, Vitamin C und E schlussfolgerte Paranjpe et al. (2007), dass NAC möglicherweise zusätzlich zu einer antioxidativen Wirkung zu einer verstärkten Differenzierung führt, da NAC eine von den Vitamin C und E unterschiedliche Wirkung zeigte. Zuerst konnten Paranjpe et al. (2007) zeigen, dass je weiter fortgeschritten die Differenzierung von dentalen pulpalen Stroma-Zellen ist, desto größer ist die Widerstandskraft der Zellen gegen Zell-Tod induzierende Signale. In einem zweiten Schritt 22

25 zeigte sie dann, dass eine gesteigerte Differenzierung über NF-κB durch NAC eingeleitet werden kann (Paranjpe et al., 2007). Auch Edlundh-Rose et al. (2005) wiesen an primäre Keratinozyten nach Behandlung mit 2 mm NAC schon nach 48h terminale Differenzierung nach, die im Normalfall erst nach 30d beobachtet wird (Edlundh-Rose et al., 2005) Antimikrobielle Wirkung von NAC Seit 1997 ist zudem die antimikrobielle Wirkung von NAC bekannt (Perez-Giraldo, 1997). Der exakte Mechanismus weshalb es zu einer antimikrobiellen Wirkung kommt, ist jedoch noch nicht abschließend geklärt. Erklärungsansätze berufen sich auf eine mögliche Cysteinverarmung der Bakterien, eine chemischen Bildung zwischen der Thiolgruppe des NACs und den Zellproteinen, eine Modulation der extrazellulären Polymere auf der Zellmembran durch NAC oder eine Störung des intrazellulären Redox-Gleichgewichts. Sollten sich diese Vermutungen bestätigen, birgt NAC großes Potential zum Beispiel während der endodontologischen Behandlung als Wurzelkanalmedikament eingesetzt zu werden (Pei et al., 2018). Nachdem die therapeutische Bandbreite von NAC stetig erweitert werden konnte, wurde auch die Krebsforschung auf NAC aufmerksam. Die bisher beschriebenen Effekte von NAC und dessen Einfluss auf den Zellzyklus, die antiangiogenetische Wirkung und die Hemmung von Invasion und Metastasierung werden in Bezug auf einen möglichen kurativen Einfluss von NAC auf die Krebsentstehung untersucht (Pei et al., 2018) Nebenwirkungen von NAC NAC wurde erstmals als Medizinprodukt 1963 von der US Food and Drug Administration zugelassen. Im Zuge dessen wurden potentielle Nebenwirkungen von NAC untersucht. In einer klinischen Studie von Pendyala und Creaven (1995) wurden bei 26 Probanden nach 6 monatiger oraler Einnahme von 800mg/m 2 /d als Hauptnebenwirkung unangenehmer Geschmack und gastrointestinale Symptome beschrieben (Pendyala and Creaven, 1995). In der Studie von Rosa et al. (2000) wurden bei Patienten mit humanen Immundefizienzvirus bei oraler Einnahme von 8000mg/d keine signifikanten Nebenwirkungen nachgewiesen und auch einen Übersichtsarbeit von Atkuri et al. (2007) kam zu dem Schluss, dass NAC ein sicheres, gut verträgliches Medikament darstellt. Allerdings wurden nach intravenöser Gabe ernste anaphylaktische Symptome beobachtet, die nach Beendigung der NAC-Gabe schnell verschwanden (Atkuri et al., 2007). 23

26 2.4 Ziel der Studie Das Ziel der vorliegenden Studie war es, anhand von drei Kompositen mit unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung den Einfluss von NAC auf die durch die Komposite ausgelösten Effekte auf HGK zu untersuchen. Dabei sollten folgenden Hypothesen überprüft werden: (i) Das Antioxidans NAC erhöht die HGK-Differenzierung, (ii) NAC moduliert die von Kompositeluaten ausgelösten Effekte auf HGK. Als Testsystem wurde dazu die Monolayer- Zellkultur mit HGK ausgewählt, da diese Zellen im Mundraum die erste Schutzbarriere der Gingiva vor Monomereinflüssen darstellen. 24

27 3 Material und Methoden 3.1 Material Zellkultur In dieser Arbeit wurden für alle Versuche, die durch die Gene E6/E7 des humanen Papillomvirus HPV16 immortalisierte HGK der Passagen verwendet (Roesch-Ely et al., 2006). Für deren Entnahme und Verwendung liegt eine Genehmigung der Ethikkommission der Universitätsklinik Freiburg vor (Votum 423/17). Die Kultivierung richtet sich nach Tomakidi et al. (1998) in Keratinocyte Growth Medium 2 (KGM2) (PromoCell GmbH, Heidelberg, Deutschland). Das Medium wurde zusätzlich mit 100µg/ml Kanamycin (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland), 60µl 0,5M CaCl2- Solution (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) und 12,3ml SupplementMix (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) versetzt. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in Standart-Zellkulturflaschen bis zu der Größe 175ml (Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Österreich). Bebrütet wurden die Zellen in einem Inkubator bei 37 C und 5%CO2. Für die Passagierung wurde die Zellkulturflasche T175 mit 4ml Trypsin für 4min bei 37 C inkubiert. Im Fall, dass sich die Zellen nicht vollständig abgelöst zeigten wurde ein Zellschaber verwendet. Als Abstoppmedium wurde Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, USA) verwendet, das mit 10% Fetal Calf Serum (FCS), sowie mit Kanamycin (50mg/ml) und 2mM L-Alanyl-L-Glutamin Dipeptid (GlutaMAX TM, Gibco, Life Technologies) versetzt wurde. Die Passagierung der Zellen fand bei einer Zellrasendichte von 70-80% statt und die Zellzahl wurde mittels des Luna TM Automated Cell Counter Zellzählers (Logos Biosystems Inc., Dongan-gu Anyang-si, Südkorea) ermittelt Komposite In der vorliegenden Studie wurden drei verschiedene moderne Kompositmaterialien verwendet. In Tabelle 1 sind die Materialnamen, die Materialklasse, die Hauptmonomerbestandteile, die Füller, sowie die Hersteller und die Batch-Nummern der verwendeten Komposite aufgelistet. Für alle Komposite wurde die Farbe A3 ausgewählt. 25

28 Material name Klasse Hauptmonomere Füller Hersteller Batch- Nr. Filtek Nanohybrid- TEGDMA, Nicht agglomerierte/ 3M GmbH, 4911 Supreme komposit PEGDMA,UDMA, nicht aggregierte Seefeld, A3B XTE BisGMA, BisEMA 20nm Silizium-Füller Deutschland und 4-11nm Zirkonoxid Füller, aggregierte Zirkonoxid- ceram.x Nanokeramik Methacrylate SphereTEC-Füller: Dentsply 1606 universal modifizierte 0,1-3,0μm Barium- Sirona, Polysiloxane Aluminum- Bensheim, Dimethacrylate Borosilicat-Glas, Deutschland Bis(4-methyl- Ytterbium Fluoride phenyl) iodonium Hexafluorophosphat Admira Nanohybrid Ormocer-Matrix auf Nano und VOCO 1623 Fusion mit Siliziumdioxid Glaskeramik Partikel GmbH, 331 Ormoceranteil Basis Cuxhaven, Deutschland Tabelle 1: Übersicht der verwendeten Komposite mit Einordnung in jeweilige Materialklasse, Inhaltsstoffe, Herstellerangabe und Batch-Nummer Filtek TM Supreme XTE (3M GmbH, Seefeld, Deutschland) Filtek TM Supreme XTE (3M GmbH, Seefeld, Deutschland) ist ein lichthärtendes reines Nanofüllerkomposit (3M GmbH, 2011). Laut Herstellerangaben werden als Füller eine Kombination von nicht agglomerierten/ nicht aggregierten ca. 20nm großen Silizium-Füllern, nicht agglomerierten/ nicht aggregierten 4 bis 11nm großen Zirkonoxid-Füllern sowie aggregierten Zirkonoxid-/ Siliziumcluster-Füllern (bestehend aus ca. 20nm großen Siliziumund 4 bis 11nm großen Zirkonoxid-Partikeln) verwendet. Die hochverdichteten Nanoclusterwerden aus einzelnen Partikeln mittels Sol-Gel-Verfahren gesintert. Bei Filtek TM Supreme XTE werden die Partikel im Vergleich zum Vorgängerprodukt Filtek TM Supreme XT weniger stark gesintert, was zu einer größeren Bandbreite an Clustergrößen führt. Die Dentin-, Schmelz- und Body-Farben haben eine durchschnittliche Cluster-Partikelgröße von 0,6 bis 10μm. Der 26

29 anorganische Fülleranteil beträgt 78,5% des Gesamtgewichts und 63,3% des Volumens. Die Kunstharzmatrix des Filtek TM Supreme XTE enthält BisGMA-, UDMA-, TEGDMA- und BisEMA-Kunstharze. Um den Schrumpf zu begrenzen, wurde ein Teil des TEGDMA Kunstharzes durch PEGDMA ersetzt ceram.x universal (Dentsply Sirona, Bensheim, Deutschland) Ceram.x universal ist ein nanokeramisches, lichthärtendes, röntgenopakes Universalkomposit, das auf der neuartigen SphereTec Füllertechnologie von Dentsply Sirona (Bensheim, Deutschland) basiert (Dentsply Sirona, n.d.). Dabei werden laut Hersteller durch das Verfahren der Sprühgranulation sphärische Partikel im Mikrometerbereich ( μm) aus Barium- Aluminum-Borosilicat-Glas-Partikeln hergestellt. ceram.x universal enthält außerdem Ytterbium Fluoride. Die Kompositmatrix besteht aus Methacrylate modifizierten Polysiloxanen und Dimethacrylate Bis(4-methyl-phenyl)iodonium Hexafluorophosphat Admira Fusion (VOCO GmbH, Cuxhaven, Deutschland) Bei Admira Fusion handelt es sich um ein Nanohybrid-Ormocer mit einem Füllstoffgehalt von 84% des Gesamtgewichtes (VOCO GmbH, n.d.). Der Hersteller wirbt damit, dass es sich dabei um das weltweit erste, rein keramisch basierte, Füllungsmaterial handelt. VOCO GmbH (Cuxhaven, Deutschland) verwendet dabei die Pure Silicate Technology um Füllstoffe und Harzmatrix rein auf Siliziumoxid-Basis herzustellen. Dabei enthält das Komposit keine klassischen Monomere Antioxidatien - N-Acetylcystein (NAC) Zu Beginn der Untersuchung wurde eine 0,5M Stammlösung von NAC (cell culture tested, BioReagent, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) in Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline (PBS) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) hergestellt. Nach Verwendung eines Sterilfilters erfolgte die Lagerung der NAC-Stammlösung in Falcon TM konischen Zentrifugenröhrchen (Falcon, Fisher scientific GmbH, Schwerte, Deutschland) bei 5 C. Die entsprechenden Molaritäten von 0-10mM NAC wurden kurz vor Versuchsbeginn durch eine entsprechende Verdünnungsreihe in KGM2 hergestellt. 27

30 3.2 Methoden Probenherstellung Zunächst einmal wurden für jedes Komposit 50 Proben nach der ISO-Norm :2012 (Technical Committee ISO/TC 194, 2012) hergestellt. Die scheibenförmigen Proben hatten einen Durchmesser von 6mm und eine Höhe von 2mm. Zur Formgebung wurde eine Silikonform verwendet. Bei der Insertion des Komposits wurde das Material mit einem Kugelstopfer in die Form appliziert und vor der Polymerisation mit einer Klarsichtmatrize abgedeckt (Hawe Striproll, Kerr, Biberach, Deutschland). Die Polymerisation erfolgte mittels LED-Lampe (bluephase, Ivoclar Vivadent AG, Schaan, Lichtenstein) mit einer Leistung von 800mV/cm 2 Es folgte eine Politur mit roten Soflex-Scheiben ohne Wasserkühlung bei 2000U/min für 5s Eluatherstellung Die Eluate wurden nach der ISO :2012 (ISO/TC 194, 2012) hergestellt. Dafür wurden die Kompositproben 60s in Ethanol 70% (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) desinfiziert, an der Luft trocknen gelassen und anschließend zweimal mit sterilem Wasser gewaschen. Pro Well einer 24-Well-Platte (CELLSTAR, Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Österreich) wurde eine Kompositprobe und 800µl KGM2 gegeben und in einem Inkubator bei 37 C für 72h gelagert (Jerg et al., 2018). Nach 72h wurden die Kompositproben entnommen und die Flüssigkeit aus jeweils einem Well, im Folgenden als Eluat bezeichnet, bei -20 C gelagert, bis sie benötigt wurden. Zur Herstellung einer Mediumkontrolle für die folgenden Versuche wurde natives KGM2 auf gleiche Weise gelagert und eingefroren icelligence TM - Bestimmung der Messzeitpunkte Um geeignete Messzeitpunkte festzulegen wurde mit Hilfe des Real-Time Cell Analyzer (RTCA) icelligence TM Systems (ACEA Biosciences Inc., San Diego, USA) der Einfluss auf die Zell-Proliferation und Adhäsion der oben beschriebenen NAC-Konzentrationen mit und ohne Kompositeluate mittels Impedanzmessung untersucht. Zu Beginn des Versuchs wurde mit 100µl KGM2 pro Well eine Hintergrundmessung vorgenommen und im Anschluss 2x10 4 Zellen pro Well 3,125 x10 4 Zellen/cm 2 ausgesät. Nach 30min Adhäsionsphase in der Sterilbank wurde das Zellkulturmedium durch eine Mediumkontrolle, eine NAC-haltige Mediumkontrolle oder durch die Eluate mit und ohnen NAC ausgetauscht und der Versuch gestartet. Die Plates sind mit Mikroelektroden ausgestattet. Der biologische Status der Zellen beeinflusst die 28

31 elektrische Impedanz zwischen Medium und den Mikroelektroden-Sensoren auf dem Boden der Wells, die über die Zeit aufgezeichnet wurde. Dieser Zusammenhang erlaubte es, das Zellverhalten dynamisch zu interpretieren. Alle Datenspuren wurden mittels der RTCA 2.0 Software analysiert und auf einen Zeitpunkt kurz nach dem Versuchsstart normiert, um eventuelle anfänglich unterschiedliche Ausgangsbedingungen zu nivellieren. Die Daten aus jeweils zwei Wells wurden gemittelt und der Variationskoeffizient automatisch berechnet und dargestellt. Es wurde insgesamt über 160h gemessen, dabei wurde in den ersten 12h alle 2min und anschließend alle 15min eine Messung durchgeführt Propidium-Iodid/Syto16-Färbung, Lebend/tot-Färbung Um Nachzuweisen, dass NAC nicht direkt zum Tod der HGK führt, wurde einen Propidium iodide/ SYTO 16 Färbung durchgeführt. Dazu wurden die HGK mit einer Aussaatdichte von 1,58x10 4 Zellen/cm² in 24 Well-Platten kultiviert. Wenn eine Konfluenz von 70-80% erreicht war, erfolgte ein Mediumaustausch bei dem KGM2 entweder durch eine Mediumkontrolle oder durch KGM2 mit den jeweiligen NAC-Konzentrationen (1mM, 3mM, 5mM, 10mm) ersetzt wurde. Die Well-Patten wurden für 24h inkubiert und im Anschluss dreimal mit PBS gewaschen. Pro Vertiefung wurden 200µl des Färbeansatzes hinzu pipettiert. Der Färbeansatz bestand aus einem 1:1 Gemisch aus Syto 16 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA), das in einem Verhältnis von 1:200 in KGM2 gelöst zugesetzt wurde und Propidiumiodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), welches in einem Verhältnis 1:1000 in KGM2-Medium hergestellt wurde. Nach 30min bei 37 C unter 0,5% CO2 Bedampfung folgten zwei Waschschritte mit PBS und ein letzter Schritt bei dem entsalztes VE-Wasser zu den Zellen gegeben wurde. Es folgte direkt im Anschluss die qualitative Beurteilung unter dem Fluoreszenzmikroskop (BZ-9000, Keyence Corporation, Osaka, Japan). Syto 16 färbt die lebenden Zellen grün, während Propidiumiodid zu einer roten Fluoreszenz führt, indem es in den Zellkern von Zellen mit beschädigter Zellmembran eindringen kann und dort mit der DNA interkaliert Indirekte Immunfluoreszens (IIF)-Färbung Die Indirekte Immunfluoreszens (IIF)- Färbung wurde durchgeführt um einen Veränderung der Proteinmenge der terminalen Differenzierungsmarker Involukrin (IVL) und Filaggrin (FLG) nach NAC-Zugabe in HGK zu untersuchen. Damit sollten Rückschlüsse auf den Einfluss von NAC auf das Differenzierungsverhalten der HGK gezogen werden. HGK wurden mit einer Aussaatdichte von 1,32x10 4 Zellen/cm² in 12 beziehungsweise 24 Well-Platten (CELLSTAR, 29

32 Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Österreich) bis zu einer Konfluenz von 70-80% kultiviert. Dann erfolgte ein Mediumaustausch, bei dem KGM2 durch KGM2-Medium mit der jeweiligen NAC-Konzentration ersetzt wurde. Nach 48h wurde jeweils ein Waschschritt mit Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) durchgeführt und das Medium gewechselt. Nach 1d und 5d wurden die Zellen 5min in 100% eiskalten Methanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) fixiert und anschließend luftgetrocknet. Auf die trockenen Zellen wurde pro Well mittels Parafilm 20µl des primären Antikörper IVL (Anti-Involucrin antibody, mouse, monoconal, Ab14504, Abcam, Milton, England) beziehungsweise FLG (Anti-Filaggrin antibody, rabbit, polyclonal, Ab81468, Abcam, Milton, England) mit einer Verdünnung in PBS von 1:100 aufgetragen. Die Well-Platten wurden im Anschluss bei 4 C über Nacht inkubiert. Nach intensiver Waschung mit PBS (3x 5min auf dem Rüttler) wurde der sekundäre Antikörper Alexa Fluor 594 goat anti-mouse F(ab )2 (A-11020, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) mit einer Fluoreszenz bei 594nm beziehungsweise Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) (A , Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) mit einer Fluoreszenz bei 488nm bei Raumtemperatur (RT) 1h bei Dunkelheit inkubiert. Nach erneutem Waschschritt (3x 5min mit PBS auf dem Rüttler) wurden 65 µl/cm² 4`,6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) -Lösung in jedes Well gegeben und für 10 min im Dunkeln auf dem Rüttler inkubiert. Es folgten ein weiterer Waschschritt mit PBS und ein finaler Waschschritt mit entsalztem Wasser. In die trockenen Wells wurde Fluoromount G Eindeckmedium (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) und jeweils ein Deckglas gegeben. Die Auswertung wurde mittels Fluoreszenzmikroskop (BZ- 9000, Keyence Corporation, Osaka, Japan) durchgeführt. Als Kontrolle dienten zum einen Zellkulturen, die nur mit Mediumkontrolle behandelt wurden und analog gefärbt wurden, sowie eine Zweitantikörper-Färbekontrolle, die nur mit sekundärem Antikörper behandelt wurde, um eine unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers auszuschließen Western Blot Um eine Veränderung der Proteinmenge der terminalen Differenzierungsmarker Involukrin und Filaggrin nach NAC Zugabe abhängig von der Inkubationszeit quantitativ zu erfassen wurden für jede Konzentration und jeden Zeitpunkt drei unabhängige Western Blots durchgeführt Herstellung von Proteingesamtextrakten/Lysaten Zu Beginn des Versuchs wurden alle Proteinbestandteile in den HGK isoliert. Um genügend Gesamtproteinmenge für den Western Blot zu erhalten, wurden pro Konzentration und Zeitpunkt eine 6-Well-Platte (CELLSTAR, Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, 30

33 Österreich) mit einer Aussaatdichte von 1,3 x10 4 cells/cm² Zellen angesetzt. Nach 3d Vorkultivierung wurden die jeweiligen NAC-Konzentrationen und die Mediumkontrolle in die Wells gegeben und 1d beziehungsweise 5d bei 37 C und 5% CO2 inkubiert. Nach 48h wurde bei dem 5d-Ansatz ein Mediumwechsel durchgeführt. Nach den genannten Zeitpunkten wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 5min mit 150µl/Well Lysepuffer (1 complete, Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablette (F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Schweiz) und 1 Phosphatase Inhibitor PhosSTOP-Tablette (F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Schweiz) in 10ml Ripa-Puffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) auf dem Rüttler bei auf Eis inkubiert. Nach einer visuellen Kontrolle unter dem Mikroskop wurden mittels eines Zellschabers die Zellen abgelöst und der gesamte Wellinhalt in ein Reaktionsgefäß überführt. Die Reaktionsgefäße wurden bei 4 C 10min bei rpm zentrifugiert und der Überstand im Anschluss abgenommen. Die so gewonnenen Lysate wurden bei -80 C eingefroren Bestimmung der Proteinkonzentration Die Lysate wurden auf Eis aufgetaut und je 10µl in eine 96 Multiplate PCR Plates TM (Bio- Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA) pipettiert. Zusätzlich wurde eine Standartreihe (BioRad) pipettiert. Zu jeder Probe wurde 200 µl Working Reagent, das aus einer Mischung von BCA-Reagenz A mit BCA-Reagenz B im Verhältnis 50:1 besteht (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA), hinzugeben und die Well-Plate 30min bei 37 C inkubiert. Im Anschluss wurde mittels des Mikroplattenlesegerätes Infinete M200 (Tecan Trading AG, Männedorf, Schweiz) und der Software Magellan (Tecan Trading AG, Männedorf, Schweiz) die Absorption bei 562nm gemessen und so die Proteinkonzentration mittels Standartkurve bestimmt. Durch Berechnung wurden die benötigten Volumen für einheitliche Mengen an Protein und des benötigten Proben-Puffers für die Beladung des Gels bestimmt Auftrennung der Proteine mittels Gel-Elektrophorese und Proteintransfer Zu den berechneten Volumen des Proteins wurde im Verhältnis 1:3 der 4x Laemmli-Puffer (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, USA) und im Verhältnis 1:20 eine 1600mM wässrigen Lösung Dithiolthreitol (DTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei 95 C für 5min im Thermomixer (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) denaturiert. Im Anschluss wurden die Proben für 5min auf Eis abgekühlt und kurz abzentrifugiert. Die Trennung der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) in 4-15% Criterion TGX Stain-Free Precast Gels (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA). Zusätzlich wurde eine Bahn des Gels für den Standard Ladder (Precision Plus 31

34 Protein All Blue(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA) genutzt. Als SDS-Laufpuffer wurde 100ml 10xTRIS/Glycine/SDS-Puffer (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA) 1:10 mit 900ml VE-Wasser verwendet. Die Elektrophorese-Kammer (Transblot Cell, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA) wurde mit einer Spannung von 90V (0,04A, 4W) betrieben, die nach 30min auf 180V erhöht wurde. Nach dem Lauf wurden die Gele aktiviert, indem sie im ChemiDoc Touch Imager (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA) dem UV-Licht ausgesetzt wurden Proteindetektion und Auswertung Für das Immunblotting wurden die separierten Proteine mit dem Trans-Blot Turbo Transfer System (7min bei 25V und 2,5A, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA) auf niedrigfluoreszierende PVDF-Membranen (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA) übertragen. Nach Transferkontrolle schloss sich die Immundetektion an. Nachdem die Membranen in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA), die 0,2% Tween (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) und 5% Rinderserumalbumin (BSA, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) enthielt, für 2h bei RT geblockt wurden, wurden sie über Nacht mit Primärantikörper in 0,5% BSA in TBS, das mit 0,2%-Tween versetzt worden ist (TBST), bei 4 C auf dem Rüttler inkubiert. Jeder der folgenden primären Antikörper wurde verwendet: IVL (mouse monoclonal, abcam plc, Cambridge, UK) 1:2500), FLG (mouse monoklonal, abcam plc, Cambridge, UK 1:5000). Die Membranen wurden 3 x 10min mit TBST gewaschen und mit sekundärem Antikörper (1:5000 in 0,5% BSA in TBST Anti-mouse, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, USA) für 1h bei RT auf dem Rüttler inkubiert. Nach 2 weiteren Waschschritten mit TBST folgt ein Waschschritt mit TBS. Um den Blot auszulesen, wurde die Membran in eine Klarsichtfolie eingepackt und mit der Working Solution (Clarity Western ECL Blotting Substrate (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA) benetzt, auf das Färbewännchen überführt und 5min inkubiert. Zuletzt wurde der Blot mittels der Chemilumineszenzanwendung des ChemiDoc Touch Imagers ausgelesen. Mit der ImageLab Software (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA, Version 6.0) wurde die semiquantitative Auswertung der Pixeldichte durchgeführt und die Proteinbänder auf die jeweilige Mediumkontrolle normalisiert. Die Balkendiagramme wurden mit Microsoft Excel 2010 erstellt. 32

35 Statistische Analyse der Western blot-ergebnisse Für die statistische Auswertung wurde der unpaired t-test angewendet, der mittels graph-pad Quick calcs (GraphPad Software, San Diegp, USA) berechnet wurde. Signifikanz wurde bei p<0,05 angenommen Quantitative Real-Time PCR-Analyse Um eine Veränderung der Genexpression in HGK nach Inkubation mit den Kompositeluaten mit und ohne NAC in Gingivakeratinozyten zu sehen wurde eine Quantitative Real-Time PCR- Analyse durchgeführt. Dazu wurde nach der Inkubation gemäß des Versuchsansatzes die RNA der Zellen aufgereinigt und diese im Anschluss in cdna umgeschrieben. Die cdna wird während der eigentlichen PCR erst denaturiert, bevor die spezifischen Primer (Tabelle 2) an die Einzelstränge binden können. An die gebundenen Primer bindet eine hitzestabile Polymerase, die die DNA-Einzelstränge amplifiziert. Dabei wird ein zunächst inaktiver Fluoreszenzfarbstoff in die DNA eingelagert, der durch die DNA-Produktion aktiv wird. Durch die Detektion dieser Fluoreszenz beim Überschreiten eines gewissen Schwellenwertes kann man auf die Menge der amplifizierten DNA schließen Zellversuchsansatz Für die qpcr-analyse wurden 5,3 x10 4 Zellen/cm 2 in 24 Well-Platten (CELLSTAR, Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Österreich) ausgesät. Pro Probe und Zeitpunkt wurden so 12x10 5 Zellen angesetzt. Die Kulturgefäße wurden 24h vorinkubiert. Nach 24h begann die Exposition gegenüber der Mediumkontrolle, den Eluaten mit und ohne NAC und einer zusätzlichen mit 3mM NAC versetzten Mediumkontrolle (NAC-haltige Mediumkontrolle) für die Zeiträume 1d und 4d RNA Aufreinigung Nach 1d beziehungsweise 4d wurde die RNA extrahiert. Dazu wurden jeweils 4 Wells gepoolt, sodass 3 technische Replikate pro Probe entstehen. Die Zellen wurden mit vorgewärmten PBS gewaschen und je Well mit 78µl RLT-Puffer (Qiagen, Venlo, Niederlande) versehen. Der Puffer wurde zuvor aus Lyse-Puffer (Qiagen, Venlo, Niederlande) und DTT(Sigma-Aldrich) (auf 1,2ml Lyse-Puffer kommen 24µl DTT) hergestellt. Die Zellen wurden 2min auf dem Rüttler auf Eis inkubiert. Die Lysate wurden in Qia Shredder Säulen (Qiagen, Venlo, Niederlande) überführt (pro Säule 350µl) und in der Zentrifuge 5417R (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei 4 C 2min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Durchfluss 33

36 wurde auf gdna Eliminator Spin Säulen (Qiagen, Venlo, Niederlande) transferiert und mit 350µl 70% Ethanol (hergestellt mit RNA-freiem Wasser) aufgefüllt und 30s bei 12000rpm zentrifugiert. Im nächsten Schritt wurde der Durchfluss auf RNeasy MiniSpin Column (Qiagen, Venlo, Niederlande) übertragen und 20s bei 12000rpm zentrifugiert. Der Durchfluss wird verworfen und es folgten ein Waschschritt mit 700µl RW1 Wash Buffer (Qiagen, Venlo, Niederlande) und zwei Waschschritte mit jeweils 500µl RPE Wash Buffer (Qiagen, Venlo, Niederlande). Die Zentrifugierzeit nach den ersten 2 Waschschritten betrug jeweils 20s und nach dem dritten Waschschritt 2min bei 12000rpm. Die Mini Spin Säule (Qiagen, Venlo, Niederlande) wurde in ein frisches Auffangröhrchen übertragen und 1min bei maximaler Geschwindigkeit trocken zentrifugiert. Zuletzt wurden die Säulen in 1,5ml Eppendorf-Tubes (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) gesteckt und 30µl RNA-freiem Wasser (Qiagen, Venlo, Niederlande) in die Säule gegeben. Nach 1min Inkubationszeit bei RT wurde zum letzten Mal für 1min bei 12000rpm zentrifugiert. Die Menge an RNA wurde im Anschluss mit QIAxpert-System (RNA-RNeasy (Qiagen, Venlo, Niederlande) im Doublet bestimmt cdna Umschreibung Für die Umschreibung in cdna wurde die benötigte Menge an RNA bei einer Zielkonzentration und einem Zielvolumen von 100ng/µl in 10µl wie folgt berechnet: c 1 V 1 = c 2 V 2 V 2 = V 2 = c 1 V 1 c ng µl 10µl Mittelwert RNA[ ng µl ] Das berechnete Volumen wurde mit RNA-freiem Wasser (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) auf 10µl verdünnt und mit 10µl Mastermix in ein 0,2ml Eppendorf-Tube (Eppendorf) gegeben. Der Mastermix besteht aus 4µl Reaktions Buffer, 2µl dntps, 1µl Oligo dt Primer, 1µl Random Hexamer Primer, 1µl RevertAid Reverse Transcriptase aus dem Reverse First Aid cdna Synthese Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA). Anschließend wurde der RNA-Ansatz im C1000 TM Thermal Cycler CFX96 Real-Time System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA) in cdna ungeschrieben und bei -20 C eingefroren. 34

37 qpcr Die qpcr wurde per Hand pipettiert. Zum Gesamtvolumen von 25µl pro Well eines Multiplate 96-Well PCR Plates (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA) wurden je 1µl cdna, 1µl Primer, 12,5µl RT 2 SYBR Green qpcr Mastermixes (Quiagen, Venlo, Niederlande) und 10,5µl RNAase-freies Wasser hinzugefügt. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Platte wurde mit einer Klebefolie verschlossen und ausreichend auf einem Rüttler gemischt. Nach 1min in einer Zentrifuge bei 2250rpm (PlateFuge Microplate Microcentrifuge, Benchmark Scientific, Edison, USA) wurde die Platte auf Luftblasen kontrolliert und das Plate in den C1000 TM Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA) überführt. Das Standard-Temperaturprofil beinhaltet eine erste Phase der Denaturierung von 10min bei 95 C, gefolgt von 40 Durchläufen von Denaturierung bei 95 C für jeweils 15s, Glühen bei 55 C für 30s und Ausdehnung bei 72 C für 30s. Die Auswertung erfolgte mit der -CT-Methode (Livak und Schmittgen, 2001; Vandesompele et al., 2002). Zelluläre Funktion Protein Gensymbol Produktnummer des Herstellers (Qiagen, Venlo, Niederlande) Interleukin-1β IL-1β PPH00171C-200 Entzündung Interleukin 8 CXC8 PPH00568A-200 Tumornekrosefaktor α TNFα PPH00341F-200 Annexin A5 AXA5 PPH00304F-200 Apoptose Matrix Degradation, Alveolar- Knochenverlust Caspase 3 Casp3 PPH00107C-200 Caspase 8 Casp8 PPH00359F-200 Matrix-Metalloprotease 1 MMP13 PPH00121B-200 ß-Östrogenrezeptor Βeta-Estrogen-Rezeptor ESR2 PPH00992C-200 Zell Adhäsion Integrin beta-1 ITGB1 PPH00650B-200 Terminale Differenzierung: Stratum granulosum in HGK Frühe Differenzierung Stratum spinosum in HGK Involucrin IVL PPH01911A-200 Filaggrin FLG PPH24283A-200 Keratin 1 KRT1 PPH06951E-200 Keratin 10 KRT10 PPH

38 Proliferation Housekeeping Proliferationsmarker Protein Ki-67 Glycerinaldehyd-3- phosphat-dehydrogenase Ki67 GAPDH PPH PPH00150F-200 Ubiquitin C UBC PPH00223F-200 Tabelle 2: Die verwendeten Primer für den Gennachweis mittels qpcr, sortiert nach zellulärer Funktion, mit entsprechendem Gensymbol und Produktnummer Statistische Analyse der qpcr-ergebnisse Die statistische Analyse wurde von Frau Dr. Vach und Herrn Hazard aus dem Institut für Medizinische Biometrie und Statistik durchgeführt. Für eine deskriptive Analyse wurden Median, Mittelwert und Standardabweichung berechnet. Lineare Regressionsmodelle wurden verwendet, um die Unterschiede zwischen den Gruppen für jede Variable (z. B. TNFα, IL1-β) zu überprüfen. Anschließend wurden paarweise Vergleiche durchgeführt und nach der Methode von Scheffe korrigiert (multiples Testproblem). Paarige t-tests wurden verwendet, um die Proben für jede Variable zum Zeitpunkt 1d und Zeitpunkt 1d innerhalb einer Gruppe zu vergleichen. Die statistischen Analysen wurde mit STATA 14.2 durchgeführt und eine Signifikanz ab einem p-wert von p<0,05 angenommen. 36

39 4 Ergebnisse 4.1 icelligence TM Um einen Überblick über die Effekte der Kompositeluate zu erlangen und die Beobachtungszeitpunkte für die Protein- und die Genanalyse zu optimieren, wurde mit dem icelligence TM -System eine Echtzeit-Zellüberwachung für mindestens 160h durchgeführt (siehe Abb.3). Die Messkurve von Admira Fusion (dunkel blau) zeigte die höchsten Zell-Index- Werte aller getesteten Kompositmaterialien und einen ähnlichen Kurvenverlauf im Vergleich zur Mediumkontrolle (rot). Die Kurve von Filtek TM Supreme XTE (dunkel grün) und ceram.x universal (orange) zeigte einen schwächeren Anstieg nach 1d Beobachtung. Die Zugabe von 5mM NAC führte bei allen getesteten Proben zu einer deutlich schwächeren anfänglichen Erhöhung des Zellindex-Werte im Vergleich zu der jeweiligen Probe ohne NAC und im Anschluss zu einer kontinuierlichen Abnahme des Zellindexes bis zum Ende der Messung. Da es bereits einen deutlichen Unterschied nach 1d Beobachtungszeit zwischen den Messkurven der Gruppe der Kompositeluate allein einschließlich der Kontrolle und der Gruppe Kompositeluate in Kombination mit NAC gab, wurde die erste Beobachtungszeit auf 1d festgelegt. Zwischen 40h und 96h hatten die Messkurven aller Proben ohne NAC ein relatives Plateau erreicht. Nach dieser Plateau-Phase stieg der Zellindex für die nur mit KGM2 behandelten Kontrollproben und die mit Eluaten des Komposits Admira Fusion behandelten Proben wieder an, während die Messkurven der verbleibenden Probe auf Plateau-Niveau blieben. Beim Übergang zu dieser zweiten Phase nach 4d wurde der zweite Beobachtungszeitpunkt gesetzt. Damit wurde zusätzlich ein längerer Beobachtungszeitraum ausgewählt, um gegebenenfalls auch später einsetzende Effekte der Komposite abbilden zu können (Abb.3). 37

40 Abbildung 3: Darstellung der Impedanzkurven der Zell-Index-Messungen mittels icelligence mit Standardabweichung, bei Zugabe der Proben zum Zeitpunkt t = 0h. Zeitlicher Verlauf über 160h nach Zugabe einer Mediumkontrolle, einer NAC-haltigen Mediumkontrolle und Kompositeluaten mit und ohne 5mM NAC. Normalisiert bei 2,5h. Vertikale gestrichelte Linien markieren die Zeitpunkte 1d und 4d. 4.2 Morphologie und Propidiumiodfärbung Um einen ersten Eindruck der Effekte von NAC allein auf die HGK zu gewinnen, wurden die Zellen wärend der Exposition gegenüber NAC unter dem Mikroskop untersucht. Nachdem die Zellen bis zu einer Konfluenz von 70-80% vorkultiviert wurden, wuchsen die Zellkulturen die einen weiteren Tag mit Mediumkontrolle kultiviert wurden, wie erwartet. Das heißt, die HGK bildeten eine homogene Monoschicht aus polygonalen Zellen (10-20µm Durchmesser), deren Erscheinungsbild auch als keratinozyten-typische Pflastersteinmorpholgie bezeichnet wird (Abb.4, A). Die Morphologie der HGK veränderte sich nach Zugabe von NAC-haltigen Medium bei allen untersuchten Konzentrationen (1mM, 3mM, 5mM, 10mm). Exemplarisch sind in Abbildung 4 lichtmikroskopische Aufnahmen, bei 60-fachen Vergrößerung, der Zellkulturen zu sehen, die mit 3mM NAC für die Expositionszeit 1d kultiviert wurden, sowie entsprechende Zellkulturen, die mit Mediumkontrolle kultiviert wurden. Es zeigte sich ein derangiertes Zellbild nach NAC-Zugabe (Abb.4, C). Die Zellen wurden deutlich unregelmäßiger in ihrer Größe und Form und erreichten einen Durchmesser bis zu 50 µm (Abb.4, C, rote Pfeile). Die Veränderung nach der Zugabe von NAC spiegelte sich auch in dem 38

41 Verlust der Integrität der Monoschicht wider. Es zeigten sich vermehrt gelöste und tote Zellen auf der Oberseite der Kultur (weiße Pfeile). Am stärksten war dieser Effekt bei der höchsten Konzentration 10mM zu sehen. Eine solche Veränderung wird normalerweise für senezente Zellen in Kultur beschrieben, die sich nach dem letzten Stadium der terminalen Differenzierung von dem Zellverband lösen. Um die Viabilität der Zellen nach der Exposition gegenüber NAC zu überprüfen, wurde in der Folge eine Lebend/tot-Färbung mit SYTO 16 und Propidiumiodid durchgeführt (Abb.4, B, D). Lebende Zellen zeigten eine leuchtend grüne Fluoreszenz, während Zellen mit beschädigter Kernmembran rot fluoreszierend imponieren würden. Im Vergleich zur Mediumkontrolle (Abb.4, B) zeigten die mit NAC behandelten Kulturen (Abb.4, D) keine erhöhte Propidiumiodid-Inkorporation. Abbildung 4: A,C: Lichtmikroskopische Bilder, Vergrößerung 60x, alle Kulturen wurden bis zu einer Konfluenz von 70-80% in KGM2 vorkultiviert A: Zellkultur mit Mediumkontrolle nach 1d Inkubationszeit, zeigt zellspezifische Monolayer-Organisation. C: Zellkultur nach 1d Exposition gegenüber 3mM NAC, zeigt gestörte Morphologie und ausgedünnten Zellrasen. Rote Pfeile weisen auf vergrößerte Zellen, weiße Pfeile deuten auf abgelöste, tote Zellen. B, D: IIF der Lebend/tot-Färbung mit SYTO16/ Propidiumiodid, Vergrößerung 60x, kein Unterschied zwischen der Mediumkontrolle (B) und der Zellkultur mit 3mM NAC (D) nach 1d Inkubation. 39

42 4.3 IIF - qualitative Analyse von Involucrin und Filaggrin Die qualitative Analyse der IIF zeigte nach 1d Exposition der HGK gegenüber 3mM NAC einen Anstieg der Proteinexpression des terminalen Differenzierungsmarkers IVL (Abb.5, A, C) im Vergleich zur Mediumkontrolle (Abb.5, A). In diesen Zellkulturen war vermehrt granuläre rote Fluoreszenz vornehmlich um den Nukleus vorzufinden (weißer Pfeil). Außerdem imponierten in den Proben nach NAC-Zugabe vergrößerte Abstände zwischen den Nuklei, die auf vergrößerte Zellkörper hindeuten. Die Proteinexpression des Proteins FLG (Abb.5, D) war in Zellkulturen, die 1d mit NAC inkubiert wurden, ebenfalls angestiegen im Vergleich zur Mediumkontrolle (Abb.5, B). In Abbildung 5, D zeigt der weiße Pfeil auf eine vergrößerte Zelle im späten Differenzierungsstadium. Die hell leuchtende grüne Fluoreszenz des FLG macht durch Anheftung an die Filamente des Keratin-Zytoskeletts, dessen verstärkte Struktur in Zellkulturen nach 1d NAC-Exposition sichtbar (Abb.5, D). Beide sekundäre Antikörper zeigten keine unspezifischen Bindungen in der Zweitantikörper-Färbekontrolle. Abbildung 5: IFF-Bilder von Zellkulturen nach 1d Exposition gegenüber Mediumkontrolle (A, B) und gegenüber 3mM NAC (C, D). In A und C ist das Protein IVL durch rote Fluoreszenz angefärbt. In C zeigt sich eine erhöhte Proteinexpression, insbesondere als granuläre Anhäufung um den Nukleus (weißer Pfeil). In B und D ist das Protein FLG durch grüne Fluoreszenz markiert. In D zeigt sich durch NAC-Zugabe eine vermehrte FLG-Expression im Vergleich zur Mediumkontrolle (B). 40

43 4.4 Western Blot - semi-quantitative Analyse von Involucrin und Filaggrin Bei der Anfertigung der Western Blots wurde nach der Behandlung mit einer der fünf verschiedenen NAC-Konzentrationen (0,5mM, 1mM, 3mM, 5mM, 10mM) nach zwei Zeiträumen (1d und 4d) die Proteinkonzentration der terminalen Differenzierungsmarker FLG und IVL bestimmt. Nach der initialen Normalisierung der detektierten Bandintensitäten auf die Mediumkontrolle wurden jeweils drei unabhängige Western Blots ausgewertet Involucrin Bei der Detektion des Proteins IVL wurde nach 1d Exposition gegenüber NAC keine vermehrte Proteinexpression im Vergleich zur Mediumkontrolle nachgewiesen (Abb.6, A). Nach 4d Exposition der HGK gegenüber unterschiedlichen Konzentrationen von NAC war die Proteinexpression jedoch moduliert im Vergleich zur Mediumkontrolle (Abb.6, B). Die NAC- Konzentration 3mM führte dabei zu einer signifikant erhöhten Menge des Proteins IVL. Abbildung 6: Graphische Darstellung der Proteinmenge und Chemilumineszenz-Bild von exemplarischem Western Blot von IVL. Ordinate zeigt Proteinexpression in %, Abszisse bildet Konzentration von NAC (0-10mM) ab. Hell blaue Balken zeigen detektierte Bandintensitäten mit Standardabweichung nach Auswertung von drei unabhängig durchgeführten Western Blots, nach initialer Normalisierung auf Mediumkontrolle (dunkel blauer Balken). A: 1d Inkubation mit NAC führt zu keiner gesteigerten Proteinmenge im Vergleich zur Mediumkontrolle. B: 4d Inkubation mit 3mM NAC führt zu signifikant gesteigerten Proteinexpression von IVL, p< 0,05. 41

44 4.4.2 Filaggrin Die quantitative Analyse von FLG zeigte ebenfalls nach 1d Exposition gegenüber NAC keine signifikante Modulation im Vergleich zur Mediumkontrolle (Abb.7, A). Die 4d Exposition gegenüber 1mM NAC führte zu einem signifikanten Anstieg der Proteinmenge von FLG (Abb.7, B). Abbildung 7: Graphische Darstellung der Proteinmenge und Chemilumineszenz- Bild von exemplarischem Western Blot von FLG. Ordinate zeigt Proteinexpression in %, Abszisse bildet Konzentration von NAC (0-10mM) ab. Detektierte Bandintensitäten mit Standardabweichung nach Auswertung von drei unabhängig durchgeführten Western Blots, nach initialer Normalisierung auf Mediumkontrolle. A: 1d Inkubation mit NAC führt zu keiner signifikanten Modulation der Proteinmenge im Vergleich zur Mediumkontrolle. B: 4d Inkubation mit 1mM NAC führt zu signifikant gesteigerten Proteinexpression von FLG, p< 0,05. 42

45 4.5 qpcr Analysis Die resultierenden Expressionsprofile der CT-Werte nach dualer Normalisierung auf die nicht modulierten Haushaltsgene GAPDH und Ubiquitin und die Mediumkontrolle beziehungsweise die NAC-haltig Mediumkontrolle sind in den Abbildungen 8, 9, 10, 11 und 12 dargestellt. Die Genexpressionsprofile waren per se moduliert durch die Zugabe der Kompositeluate im Vergleich zur Mediumkontrolle und zeigten darüber hinaus unterschiedliche Modulationen bei zusätzlicher Zugabe von NAC im Vergleich zur NAChaltigen Mediumkontrolle. Standartabweichungen konnten in den Fällen, bei denen die Standartabweichung in der gleichen Größenordnung wie der Messwert selbst lag nicht vollständig angezeigt werden, da die logarithmische Skala Werte gegen null theoretisch unendlich groß anzeigt Genexpression nach Exposition gegenüber NAC-haltiger Mediumkontrolle Der Vergleich zwischen Zellkulturen, die mit Mediumkontrolle kultiviert wurden und Zellkulturen die mit NAC-haltiger Mediumkontrolle inkubiert wurden, zeigt nach 1d Expositionsdauer nur für die Gene der frühen Differenzierung (KRT1, KRT10) einen signifikanten Unterschied und somit eine valide Modulation durch NAC (p<0,05) (Abb.8, A, rote Asterisks). Nach 4d Expositionsdauer sind deutlich mehr signifikante Unterschiede zwischen den beiden Kulturen mit und ohne NAC zu erkennen (p<0,05) (Abb.8, B, rote Asterisks). Die Gene bei denen ein signifikanter Unterschied auftrat, waren TNFα, CXC8, MMP13, IVL und KRT1. 43

46 Abbildung 8: Genexpression der HGK nach Exposition gegenüber Mediumkontrolle und NAC-haltiger Mediumkontrolle nach 1d (A) und 4d (B). Abgebildet sind berechnete Werte nach der Ct-Methode, durch Normalisierung auf die Mediumkontrolle und auf nicht regulierte Haushaltsgene (GAPDH, UBC) Die Abszisse zeigt die Gene, die Ordinate zeigt die relative Genexpression im Verhältnis zu den Werten der Mediumkontrolle. Werte der Mediumkontrolle sind durch Normalisierung auf sich selbst auf 1 normiert. Rote Asterisks zeigen statistisch signifikante Unterschiede zwischen Zellkulturen, die mit Mediumkontrolle und Zellkulturen die mit NAC-haltiger Mediumkontrolle inkubiert wurden (p<0,05). Die Legende wird oben rechts abgebildet. 44

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48 4.5.2 Einfluss der Kompositeluate und NAC auf entzündungsassoziierte Gene Bei Betrachtung der Ergebnisse des Komposits Filtek Supreme XTE wird deutlich, dass in den untersuchten Zellkulturen nach 1d Exposition gegenüber dem Eluat die Expression der Gene TNFα und CXC8 (Abb.9, A, blau monchrome Balken) und nach 4d alle untersuchten entzündungsassoziierten Genen (IL-1ß, CXC8 und TNFα) signifikant hochreguliert wurden im Vergleich zur Mediumkontrolle (p<0,05) (Abb.9, B, blau monchrome Balken). Diese Hochregulation ist nach 1d Exposition gegenüber der Kombination aus Filtek Supreme XTE und NAC bei allen drei Genen: IL-1ß, CXC8 und TNFα signifikant weiter verstärkt worden im Vergleich zur NAC-haltigen Mediumkontrolle (p<0,05) (Abb.9, A, blau gemusterte Balken). Nach 4d Exposition ist keine signifikante weitere Hochregulation durch die NAC Zugabe mehr sichtbar. Im Gegenteil zeigte sich für das Gen IL-1ß eine signifikante schwächere Hochregulation der Expression nach NAC Zugabe im Vergleich zur Exposition gegenüber dem Eluat allein (p<0,05) (Abb.9, B, blau gemusterte Balken). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass es nach einer gewissen Zeitspanne zu einer Veränderung der Wirkung von NAC kommt. Für andere untersuchte Komposite konnte kein signifikanter Effekt durch die Eluate oder eine Kombination der Eluate mit NAC auf die entzündungsassoziierten Genen nachgewiesen werden. 46

49 Abbildung 9: Genexpression der entzündungsassoziierten Gene: TNFα, IL-1β, CXC8 in HGK nach Exposition der Zellen gegenüber Mediumkontrolle, NAC-haltiger Mediumkontrolle sowie Eluaten allein und in Kombination mit NAC für 1d (A) und 4d (B). Abgebildet sind berechnete Werte nach der Ct- Methode, normalisiert auf die Mediumkontrolle bzw. die NAC-haltige Mediumkontrolle und nicht regulierte Haushaltsgene (GAPDH, UBC). Die Abszisse zeigt die Gene, die Ordinate zeigt die Genexpression relativ zur entsprechenden Kontrolle, normiert auf 1. Schwarze Asterisks zeigen statistisch signifikante Veränderungen gegenüber der entsprechenden Kontrolle (p<0,05). Rote Asterisks zeigen statistisch signifikante Veränderungen zwischen Eluaten ohne und Eluaten mit NAC (p<0,05). Die Legende wird auf der rechten Seite abgebildet. 47

50 4.5.3 Einfluss der Eluate des Komposits Admira Fusion auf die Genexpression Im Fall des Komposits Admira Fusion war nur IVL nach 1d Inkubation mit dem Eluat des Komposits signifikant herunterreguliert im Vergleich zur Mediumkontrolle (p<0,05), während nach 4d Inkubation mit dem Eluaten von Admira Fusion eine Herunterregulierung der Genexpression von fünf Genen auftrat (p<0,05) (Casp3, MMP13, ITGB1, IVL, KRT1) (Abb.10, B, monochrome Balken, schwarze Asterisks). Ähnliches wurde für Admira Fusion in Kombination mit NAC beobachtet. Nach 1d Exposition gegenüber der Kombination von Admira Fusion und NAC war nur die Expression des Genes KRT10 im Vergleich zur NAChaltigen Mediumkontrolle signifikant hochreguliert (p<0,05), nach 4d waren es sechs Gene (Casp3, MMP13, ITGB1, IVL, KRT1 und Ki67) (p<0,05) (Abb.10, A, B, gemusterte Balken). Nach 4d Inkubationszeit war zu beobachten, dass sich die, durch Inkubation mit Admira Fusion allein, hauptsächlich herunterregulierte Genexpression bei allen Genen zu einer Hochregulierung nach Inkubation mit der Kombination aus Admira Fusion und NAC entwickelte (Abb.10, B). Der paarweise Vergleich zwischen der Genexpression der Zellkulturen, die mit dem Eluat von Admira Fusion allein inkubiert wurden und denen die mit Admira Fusion in Kombination mit NAC kultiviert wurden, war nach 1d Beobachtungszeit für kein Gen und nach 4d Beobachtungszeit für alle Gene signifikant unterschiedlich (p<0,05) (Abb.10, A, B, rote Asterisks). Nach 4d Inkubation, kann der Einfluss von NAC auf die Effekte, die durch Admira Fusion in den HGK hervorgerufen werden, für alle Gene mit Ausnahme von MMP13 und ESR2 positiv, im Sinne einer Verminderung der Effekte, interpretiert werden. Dies zeigt sich daran, dass die Werte der Genexpression nach Inkubation mit Admira Fusion in Kombination mit NAC schwächer moduliert sind im Vergleich zur der NAC-haltigen Mediumkontrolle als die Werte der Genexpression nach Inkubation mit Admira Fusion allein bezogen auf die Mediumkontrolle. 48

51 Abbildung 10: Genexpression der HGK nach Exposition gegenüber Eluaten des Komposits Admira Fusion und gegenüber Admira Fusion und NAC für 1d (A) und 4d (B). Untersuchte Gene: TNFα, IL-1ß, CXC8, AXA5, Casp8, Casp3, MMP13, ESR2, ITGB1, IVL, FLG, KRT1, KRT10, Ki67 (Abszisse, von links nach rechts). Die Ordinate zeigte die die relative Genexpression dargestellt durch berechnete Werte nach der Ct-Methode, normalisiert auf die Mediumkontrolle bzw. die NAC-haltige Mediumkontrolle und nicht regulierte Haushaltsgene (GAPDH, UBC). Schwarze Asterisks markieren statistisch signifikante Änderungen zur jeweiligen Kontrolle, rote Asterisks markieren statistisch signifikante Änderungen zwischen Probe mit und ohne NAC (p<0,05). Die Legende ist oben rechts (A) bzw. unten rechts (B) abgebildet. Die Werte der Genexpression der Probe Admira Fusion plus NAC für das Gen IL-1ß waren nicht auswertbar. 49

52 4.5.4 Einfluss der Eluate des Komposits ceram.x universal auf die Genexpression Die HGK zeigten nach 1d Exposition gegenüber ceram.x universal einen signifikanten Einfluss auf die Expression der Gene ITGB1, IVL, und KRT1, die alle durch das Eluat des Komposits herunterreguliert worden waren im Vergleich zur Mediumkontrolle (p<0,05) (Abb.11, B, schwarze Asterisks). Die Exposition gegenüber der Kombination von ceram.x universal und NAC führte im Fall von IVL und KRT1 zu einer ebenfalls signifikanten Herunterregulation der Genexpression im Vergleich zur NAC-haltigen Mediumkontrolle (p<0,05). Die Genen FLG und KRT1 wurde durch die Zugabe von NAC zum Eluat signifikant stärker herunterreguliert als durch die Einwirkung des Eluates von ceram.x universal allein (p<0,05; rote Asterisks). Nach 4d zeigte sich eine signifikante Herunterregulation der Gene MMP13 und ITGB1 nach Exposition gegenüber ceram.x universal im Vergleich zur Mediumkontrolle (p<0,05) und eine signifikante Herunterregulation der Gene Casp3, MMP13, ITGB1, KRT1 sowie Ki67 nach Exposition gegenüber der Kombination von ceram.x universal und NAC im Vergleich zur NAC-haltigen Mediumkontrolle (p<0,05) (Abb.11, B, schwarze Asterisks). 50

53 Abbildung 11: Genexpression der HGK nach Exposition gegenüber Eluaten des Komposits ceram.x universal und gegenüber ceram.x universal und NAC für 1d (A) und 4d (B). Untersuchten Gene: TNFα, IL-1ß, CXC8, AXA5, Casp8, Casp3, MMP13, ESR2, ITGB1, IVL, FLG, KRT1, Ki67 (Abszisse, von links nach rechts). Die Ordinate zeigte die die relative Genexpression dargestellt durch berechnete Werte nach der Ct-Methode, normalisiert auf die Mediumkontrolle bzw. die NAC-haltige Mediumkontrolle und nicht regulierte Haushaltsgene (GAPDH, UBC). Schwarze Asterisks markieren statistisch signifikante Änderungen zur jeweiligen Kontrolle (p<0,05), rote Asterisks markieren statistisch signifikante Änderungen zwischen Probe mit und ohne NAC (p<0,05). Die Legende ist oben rechts abgebildet. 51