Immunhistologie an der Kette Kontrollen!

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1 Immunhistologie an der Kette Kontrollen! Histologica Essen 18. Juni 2016 Till Braunschweig Insitut für Pathologie Uniklinikum Aachen

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3 Gliederung 1. allgemeine Grundlagen: - Was steht im Waschzettel? - Vorgaben der DAKKS 2. Umsetzung: - Übersicht verschiedene Systeme - Vorstellung des Systems in Aachen 3. Bespiele: - Probleme mit Kontrollen - Probleme mit Färbungen 4. Fragen von Teilnehmern:

4 Gliederung 1. allgemeine Grundlagen: - Was steht im Waschzettel? - Vorgaben der DAKKS 2. Umsetzung: - Übersicht verschiedene Systeme - Vorstellung des Systems in Aachen 3. Bespiele: - Probleme mit Kontrollen - Probleme mit Färbungen 4. Fragen von Teilnehmern:

5 Waschzettel Antikörper was ist wichtig?

6 Was ist drin? z.b. IgG1 ggf. lyophilisiert? Waschzettel Antikörper was ist wichtig? Aufbewahrung bei welcher Temperatur Probenvorbereitung Enzym? Puffer? Färbung Konzentration? Interpretation Wo? Kern/Zellleib/Membran Kontrollgewebe am besten Normalgewebe

7 Vergleich Forschungsantikörper klinisch eingesetzter Antikörper

8 Vergleich Forschungsantikörper klinisch eingesetzter Antikörper

9 Vergleich Forschungsantikörper klinisch eingesetzter Antikörper

10 Interessante Antikörper EMA = Muc1??

11 Woher kommt der Antikörper - Validierung: - Antikörperfirma mit klinischer Ausrichtung: z.b. Roche-Ventana, Leica-Novocastra, Thermo, DAKO, etc. in der Regel liegt eine CE-Kennzeichnung vor. - Firma mit Forschungs-Ausrichtung: z.b. Abcam, R&D, Santa Cruz, Cell Signalling etc. häufig ohne CE-Kennzeichnung

12 Begriffe klären Begrifflichkeiten: - Spezifität, Sensitivität - Validierung - Verifizierung - Intraassay Präzision - Interassay Präzision - Antikörper Klasse I - Antikörper Klasse II - CE Kennzeichnung - in House Verfahren - in-vitro-diagnostika aus eigener Herstellung - Forschungsantikörper - Testgewebe - Kontrollmaterial - Kontrollen: - positive und negative Kontrolle - interne Kontrolle - externe Kontrolle

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14 Spezifität und Sensitivität

15 Validierung und Verifizierung

16 Alle 3 Monate neues Kontrollgewebe : Verifizierung Routine mit Kontrollen in der Immunhistochemie

17 Routine mit Kontrollen in der Immunhistochemie Alle 4-5 Monate neues Kontrollgewebe suchen: Verifizierung

18 CE und in house Verfahren

19 Forschungsantikörper

20 [.] Testgewebe - Kontrollmaterial

21 Positivkontrolle Freigabe durch den Facharzt

22 Typen von Kontrollen Interne Kontrolle im selben Schnitt häufiger unzuverlässig externe Kontrolle: - separater Objektträger: bei vielen Ärzten nicht praktikabel, man verliert Plätze im Färbeautomaten - externe onslide-kontrolle am besten geeignet - Positivkontrolle aber auch Negativkontrolle wichtig externe Onslide-Kontrolle: Goldstandard Antikörper- Klasse I Sie dienen der qualitativen Differenzierung (z. B. Zellart und -differenzierung, Gewebezusammensetzung, Erregernachweis). prinzipiell ausreichend interne Kontrolle Antikörper- Klasse II direkte Therapierelevanz haben (z. B. Östrogenrezeptor, Mammakarzinom). externe Kontrolle erforederlich, auch mit Quantifizierung

23 Gliederung 1. allgemeine Grundlagen: - Was steht im Waschzettel? - Vorgaben der DAKKS 2. Umsetzung: - Übersicht verschiedene Systeme - Vorstellung des Systems in Aachen 3. Bespiele: - Probleme mit Kontrollen - Probleme mit Färbungen 4. Fragen von Teilnehmern:

24 Überlegungen zu den Geweben der Positivkontrollen: Es muss Gewebe sein, was zu viel ist und nicht mehr für die Diagnostik gebraucht wird. Sollte möglichst lange halten, da bei Wechsel erneut verifiziert werden muss, also ausreichend viel Restgewebe für eine große Anzahl von Kontrollblöcken Am besten Normalgewebe mit bekannter Proteinexpression Bei Tumorgewebe selektiert man den exprimierenden Tumor, dessen Expressionsmuster man so selber erfasst Bei seltenen Expressionen (z.b. HHV8 bei Kaposi-Sarkom) am besten kleine Probe für den Kontrollblock, z.b. TMA Bei gut verfügbarem Gewebe am besten so viele Antikörper wie möglich mit einem Kontrollblock abdecken

25 Anforderung eines neuen Antikörpers Anfrage neue Antikörper Anlage 15 zur Arbeitsanweisung Immunhistochemie Antikörper Klon Firma (zutreffende ankreuzen) o Dako o Thermo o Santa Cruz o Cell Marque o Novo Castra o Medac o Invitrogen o Sigma o Zytomed o Bio Care Medical o Dianova o BD Biosciences o Epitomics o Abcam o Progen o Sonstige Färbergebnis (zelluläre Lokalisation) Anwendung: (Zielgewebe, Erkrankung) Positivkontrolle (am besten Normalgewebe)

26 Auswahl Kontrollgewebe Am besten Normalgewebe nach Herstellerangaben oder Datenbanken Tumorgewebe kann unspezfische Färbungen liefern, nur in Ausnahmefällen (z.b. p16) Tumorgewebe bei Klasse II AKs gut (z.b. ER, PR, Her2/neu) Datenbanken: Für CD Antikörper: Allgemein: Noch allgemeiner:

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30 Design Positivkontrollen Was soll eine Positivkontrolle leisten? Aus Sicht der TA: - wenig Infrastruktur erfordern, wenig Administration, unkompliziertes Design - viel Platz für das Patientengewebe Aus Sicht des QMB: - gute Dokumentierbarkeit, gleichbleibende Qualität Aus Sicht des Arztes: - muss immer Verfügbar sein Onslide-Kontrolle - eindeutige Färbung (große Positiv-Dichte) - gute Erkennbarkeit (Ampel) - gleichbleibend über großen Zeitraum - nicht zu komplex - viel Platz für das Patientengewebe

31 Beispiel Gewebsauswahl WT1 Dako Leica Novoc. Thermo Ventana - CM. Zytomed

32 Beispiel Gewebsauswahl CD99 Ventana Leica Novoc. Dako Thermo Zytomed

33 Beispiel Gewebsauswahl Calretinin Leica Novoc. Thermo Ventana Dako Zytomed

34 Verschiedene Arten der Gewebeproben für Onslide-Kontrollen Multiblock Allgemein mit zugeschnittenen Gewebestücken aus nicht-zugeschn. Material, kurz vor Verwerfung nach Fallabschluss Singleblock Für spezielle Antikörper würfelförmig zugeschnittenes Gewebe Tissue Micro-Array.

35 Design Positivkontrollen Pro AK eine Kontrolle oder sehr kleine AK Gruppen pro Positivkontrolle Ein Design für alle AKs pro: -flexibel -sehr spezifisch -wenig Gewebe kontra: -aufwendige Organis. -unübersichtlich -eher vorschneiden pro: -übersichtlich -klare Organis. -kein vorschneiden kontra: -viel Gewebe -häufiges Herstellen

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41 Gewebeproben für Onslide-Kontrollen in Aachen Allgemein mit zugeschnittenen Gewebestücken aus nicht-zugeschn. Material, kurz vor Verwerfung nach Fallabschluss, zum Beispiel Appendix und Tonsille Für AK Klasse I Einfacherer TMA mit Gewebestanzen, aus Archivblöcken aus abgeschlossenen Fällen, ein bis zwei Jahre alt Gewebeblock mit Resttumor bleibt erhalten. Für AK Klasse II: Komplexer TMA mit Gewebestanzen, aus Archivblöcken aus abgeschlossenen Fällen, ein bis zwei Jahre alt Gewebeblock mit Resttumor bleibt erhalten.

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50 Serie: Styrokay von Styro,

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53 Serie: Styrokay von Styro, Einlagen aus 50er Histokästen von Assistent

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57 Gliederung 1. allgemeine Grundlagen: - Was steht im Waschzettel? - Vorgaben der DAKKS 2. Umsetzung: - Übersicht verschiedene Systeme - Vorstellung des Systems in Aachen 3. Bespiele: - Probleme mit Kontrollen - Probleme mit Färbungen 4. Fragen von Teilnehmern:

58 Falldemonstration - Fall 1 Haltbarkeit von vorbereiteten Schnitten: MDM2 3 Wochen alt

59 Falldemonstration - Haltbarkeit von vorbereiteten Schnitten: ER 2 Wochen alt

60 Falldemonstration Sinn von Positivkontrolle PDL1 einzelne Ly und Ma weitgehend komplett negativ, kaum interne Kontrolle externe onslide-kontrolle nötig!

61 Falldemonstration Schlechter Antikörper unspezifische Färbung PDL , ph , ph6 PDL1 polyklonaler AK 1-200, ph6 Plazenta und Lymphknoten

62 Falldemonstration guter Antikörper spezifische Färbung PDL1 RTU RTU/2 RTU, SP263 Plazenta - Tonsille

63 Falldemonstration guter Antikörper spezifische Färbung PDL1 Vergleich SP243 und Cal10 Plazenta

64 Falldemonstration Auswahl Kontrollgewebe Normalgewebe bei CD99 Marker für Wilms-Tumoren Schwierigkeit bei Tumorgewebe: seltener Tumor, mittlerweile ohne Biopsie neoadj. Ther. Kein primäres Tumorgewebe verfügbar Normalgewebe: Inseln Pankreas

65 Falldemonstration Ausfall der Färbung Positivkontrolle wichtig! p63 primär sehr flaue Färbung, fraglich Kontrolle ging Wiederholung: positiv

66 Falldemonstration Ausfall der Färbung Positivkontrolle wichtig! Ki-67 bei Wiederholung gutes Ergebnis

67 Falldemonstration Qualität Färbung damals (ohne Kontrolle) heute.- ER Kontrollen onslide permanent seit 2010

68 fehlt: z.b. Plattenepithel? z.b. Colonepithel? Kontrolle der Kontrollblöcke AT alles drauf?

69 Gliederung 1. allgemeine Grundlagen: - Was steht im Waschzettel? - Vorgaben der DAKKS 2. Umsetzung: - Übersicht verschiedene Systeme - Vorstellung des Systems in Aachen 3. Bespiele: - Probleme mit Kontrollen - Probleme mit Färbungen 4. Fragen von Teilnehmern:

70 in unserem Institut geben die Herceptin-Kontrollen immer wieder Anlass zu Diskussionen. Vielleicht könnten sie diese Problematik in Ihrem Vortrag mit einflechten. leider keine eigene Erfahrung. Fragen zum Thema

71 Fragen zum Thema Welche anderen Moeglichkeiten gibt es, um schnell und mit einfachen Mitteln die Primaerantikoerper zu validieren? am besten Normalgewebe, wir versuchen immer primär Tonsille/Appendix bei neuronalen Markern evtl. Kleinhirnquerschnitt? Zelllinien mit Überexpression von Proteinen (manchmal als Positivkontrollen erhältlich) Eigenherstellung zu aufwendig Western-Blot an Zellextraktionen aus Frischgewebe / Kryogewebe

72 Fragen zum Thema wir hätten gern Informationen für den Einsatz von Kontrollen, die für die Zytologie geeignet sind. gleiche onslide-kontrollen, am besten Zytoblock

73 Fragen zum Thema Was für Kontrollgewebe ist für Somatostatin und Alk-Protein (CD246) geeignet? Somatostatinrezeptor? Inselorgane der Bauchspeicheldrüse ALK ALK positives Lymphom. Normalgewebe: Im Nervensystem markiert der Antikörper einige Gliazellen, einige wenige Endothelzellen, Perizyten und einige verstreute neuronalen Zellen. Es erfolgte keine Markierung von Zellen hämatopoetischer und lymphoider Gewebe noch von Geweben des Gastrointestinal- und des Urogenialtrakts (1).

74 Fragen zum Thema Es ist manchmal schwer geeignetes Gewebe für Kontrollen aus eigenen Probenmaterial zu gewinnen. Es gibt die Firma ProVitro in Berlin, bei der man Kontrollblöcke und Schnitte kaufen kann. (teuer) Gibt es noch andere Möglichkeiten an Gewebe zu kommen andere Anbieter z.b.? Gibt es schwach positive (Score 2) Kontrollen für ER und PR am Block zu kaufen? Wo kann man die kaufen? Paraffinblock für Schnitte: 200Euro

75 Fragen zum Thema Wir stellen uns Multiblöcke mit kleinen Stanzzylindern bereits selbst her. Manchmal haben wir Probleme beim Schneiden dieser Blöcke. In den Schnitten rollt sich das Gewebe auf. Anscheinend hat sich dann der Gewebestanzzylinder nicht richtig mit dem umliegenden Paraffin verbunden. Ist dieses Problem bekannt und gibt es eine Lösung? Mit zwei verschiedenen Stanzen arbeiten, die Gewebestanze muss sehr bündig in den leeren Paraffinblock passen. Den Block für ca. 3 Stunden bei Grad weich werden lassen, dann verbinden sich die zwei, wenn sie dicht beieinander sind. (Temperatur abhängig vom verwendeten Paraffin

76 1..Erfahrungen mit Spermaausstrichen und Färbung a. Baechi b. Shorr c. Christmas Tree d. oder?????? 2. Mastzellen :- Darstellung ( v. Paraffinblöcken) a. Toluidinfärbun oder b. Giemsa c. was ist besser oder?????? d. IHC CD Anti-D Asparaginsäure Ak. :- viele ausprobiert, leider keine Ergebnisse. (Fa. Abcam ; Fa. Chemicon) Hat jemand diese AK benutzt.?????? 4. Herzinfarkt AK.(C5b-9 Fa Abcam) Färbung mit Polymeren sehr schön. Frage:- Kontrolen :- Darf ich ein Lungeninfarkt als Kontrolle benutzen bei Herzinfarkt oder umgekehrt Herzinfarkt bei einem Lungeninfarkt. Wichtig für QM?????????? 5. Dityrosine :- AK v. Fa. Acris (Maus, Clon IC 3) AM PUS. v. 5 Jahren Verdünnung war 1:1200 Preis ca. 400, v.3 Jahren Verdünnung war 1:1000 Preis ca. 600, v.2 Jahre Verdünnung war 1 : 800 Preis ca.??? v.3 Monaten Verdünnung war 1 : 600 Preis 672, 6. Fibronectin AK v. Fa. Biomol DAK A Poly. Verdünnung 1:2000 AK. sehr stabil : Methode mit Polymeren. Färbung ist sehr schön. AK sind weiter zu EMPFEHLEN 7. AK Aktivität : wie lange darf man eine Kontrolle für IHC benutzen wenn man noch keine andere gefunden hat. Es handelt sich um besondere und seltene AK. Wichtig für QM. Literatur angaben???????? Danke 8. Puffer ph 6,0 : für Koch Methode ( Literaturrecherche ) ergaben :- a. Citrat-Puffer ph 6,0 : Tri-Na-citrat-dydydrat (10 mmol) oder 2,94 g/ l Aqua-dest, oder b. Citronensäure : C6H8O7 x H2O + Tri-Natriumcitrat 2-Hydrat C6H5Na3O7 x 2H2O oder c.na-citrat + NaoH Was ist richtig??????

77 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Danke an meine Mitarbeiter im Immunhistolabor: Angela Cassataro, Regina Bachmann, Anja Schütte, Patrick Kühl, Daniela Smeets Prof. Knüchel-Clarke

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80 Intraassay und Interassay Präzision

81 Intraassay und Interassay Präzision