Riedel Molekularbiologie, Biotechnologie, Gentechnik 02 WS2015/16. Methoden der Molekularbiologie. Nachweis von DNA - Agarose-Gelelektrophorese

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1 Seite 1 Methoden der Molekularbiologie Nachweis von DNA - Agarose-Gelelektrophorese

2 DNA-Analyse: Agarose-Gelelektrophorese Methode zur Trennung von DNA-Molekülen eines Gemisches anhand ihrer Größe Grundlage: DNA durch Phosphatreste negapv geladen DNA wandert daher in elektrischen Feldern zur Anode (+ Pol) Seite 2

3 Seite 3 DNA-Analyse: Agarose-Gelelektrophorese Prinzip: Trennung nach Größe durch RetenPon in einem Agarosegel (Netz aus Agarosefasern) in einem Elektrischen Feld Agarose: Polysaccharid aus Dimeren von D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose

4 Seite 4 DNA QuanPtät und Qualität Prinzip: Trennung nach Größe durch RetenPon in einem Agarosegel (Netz aus Agarosefasern) in einem Elektrischen Feld Durch das Gel werden dabei größere Fragmente stärker zurückgehalten als kleine

5 Seite 5 DNA QuanPtät und Qualität Prinzip: Trennung nach Größe durch RetenPon in einem Agarosegel (Netz aus Agarosefasern) in einem Elektrischen Feld Durch das Gel werden dabei größere Fragmente stärker zurückgehalten als kleine Zugabe von Farbstoffen ermöglichen es den Endpunkt der Elektrophorese zu bespmmen Dünne Gele = geringere Diffusion = schärfer Banden

6 Seite 6 DNA QuanPtät und Qualität Prinzip: Trennung nach Größe durch RetenPon in einem Agarosegel (Netz aus Agarosefasern) in einem Elektrischen Feld Durch das Gel werden dabei größere Fragmente stärker zurückgehalten als kleine Zugabe von Farbstoffen ermöglichen es den Endpunkt der Elektrophorese zu bespmmen Die AgarosekonzentraPon bespmmt die Porengröße und damit die Auflösung des Gels % Agarose Auflösung (Bp) 0, , , , % Agarose = 150 nm Poren 0,16 % Agarose = 500 nm Poren 1,

7 Seite 7 DNA QuanPtät und Qualität Nach erfolgter Aufrennung: Sichtbarmachung der Fragmente durch Färbung mit z.b. Ethidiumbromid und Betrachtung unter UV-Licht Ethidiumbromid

8 Seite 8 DNA QuanPtät und Qualität Anwendungen: Aufrennung komplexer Gemische Aufreinigung und Nachweis von bespmmten Sequenzabschniken RestrikPonsanalyse... Sowohl analypsch als auch präparapv Abschätzung von Größe und Menge der einzelnen Fragmente AnimaPon Agarose-Gelelektrophorese

9 Seite 9 Methoden der Molekularbiologie ModifikaPon von DNA: RestrikPonsenzyme

10 Seite 10 RestrikPonsendonukleasen Bisherige Methoden für Arbeiten mit DNA: IsolaPon Qualitätskontrolle und QuanPfikaPon VervielfälPgung (PCR) Agarose-Gelelektrophorese Weitere Arbeitsschrike, die für die Klonierung von DNA wichpg sind: Schneiden RestrikPonsenzyme = molekulare Scheren, die DNA schneiden

11 Seite 11 RestrikPonsendonukleasen EcoRI: eine RestrikPonsendonuklease aus aus E. coli Bei Bakterien und Archaeen Erkennen und schneiden spezifische DNAabschnike (DNA-MoPve)

12 Seite 12 R-M Systeme EcoRI: eine RestrikPonsendonuklease aus aus E. coli Teil der RestrikPons-ModifikaPons-Systeme (R-M Systeme) Dienen der Abwehr von Fremd-DNA (z.b. Phagen; RestrikPon = Abwehr/Hemmung von Viren) EssenPelle Teile von R-M Systemen: Methylase- RestrikPons- Sequenzerkennungsdomänen teilweise auf unterschiedlichen Proteinen bp 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000 Typ I R-M System bbif1095 bbif1094 hsdm hsds hsdr bbif1089 Typ II R-M System bp 1,000 2,000 3,000 4,000 integrase type II Mtase type II Rease bbif0712 XhoI Isoschizomer

13 Seite 13 R-M Systeme Nachweis eines XhoI-ähnlichen R-M Systems: Methylase (MTase) und (REase) RestrikPonsendonuklease eines Bekteriums erkennen die selben DNA- MoPve M MTase Methylierung des MoPvs REase schneidet nur wenn die erkannten DNA-MoPve NICHT methyliert sind Bei gleichzeipger Expression von MTase und Rease: eigene DNA geschützt, Fremd- DNA wird abgebaut M Größenmarker (1kb Leiter) 1 Plasmid X 2 Plasmid X + XhoI 3 Chromosomale DNA 4 Chromosomale DNA + Xho 5 Chromosomale DNA + EcoRI

14 Seite 14 R-M Systeme Bislang 4 Unterklassen von R-M Systemen beschrieben: Typ I-IV Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No ±1812 DOI: /nar/gkg274 SURVEY AND SUMMARY A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes Richard J. Roberts*, Marlene Belfort 1, Timothy Bestor 2, Ashok S. Bhagwat 3, Thomas A. Bickle 4, Jurate Bitinaite, Robert M. Blumenthal 5, Sergey Kh. Degtyarev 6, David T. F. Dryden 7, Kevin Dybvig 8, Keith Firman 9, Elizaveta S. Gromova 10, Richard I. Gumport 11, Stephen E. Halford 12, Stanley Hattman 13, Joseph Heitman 14, David P. Hornby 15, Arvydas Janulaitis 16, Albert Jeltsch 17, Jytte Josephsen 18, Antal Kiss 19, Todd R. Klaenhammer 20, Ichizo Kobayashi 21, Huimin Kong, Detlev H. KruÈ ger 22, Sanford Lacks 23, Martin G. Marinus 24, Michiko Miyahara 25, Richard D. Morgan, Noreen E. Murray 26, Valakunja Nagaraja 27, Andrzej Piekarowicz 28, Alfred Pingoud 17, Elisabeth Raleigh, Desirazu N. Rao 27, Norbert Reich 29, Vladimir E. Repin 30, Eric U. Selker 31, Pang-Chui Shaw 32, Daniel C. Stein 33, Barry L. Stoddard 34, Waclaw Szybalski 35, Thomas A. Trautner 36, James L. Van Etten 37, Jorge M. B. Vitor 38, Geoffrey G. Wilson and Shuang-yong Xu

15 Seite 15 R-M Systeme Bislang 4 Unterklassen von R-M Systemen beschrieben: Typ I-IV Interessant für molekularbiologische Anwendungen Auuau Erkennungssequenz Spaltstelle Typ I Typ II Typ III Enzymkomplex aus HsdS, HsdM und HsdR typischerweise M 2 S 2 R 2-teilig asymmetrisch bis 1000 bp außerhalb der Erkennungssequenz Unspezifisch MTase und REase beide mit eigener Erkennungsdomäne 4-8 Basen (u.u. mehr) Meist palindromisch (OTTO) Innerhalb oder nahe der der Erkennungssequenz Mod und Res beide benöpgt für Schnik Mod alleine akpv 5-7 Basen asymmetrisch 5-20 Basen vor der Erkennungssequenz ATP-Bedarf Ja Nein ja Typ IV: schneidet nur methylierte SequenzmoPve

16 Seite 16 Typ II RestrikPonsendonukleasen Schneiden der DNA durch Durchtrennen des Zuckerphosphat-Rückgrates an beiden Strängen Erkennungssequenz 1. Schnik EcoRI : : : : : : : : : : : :

17 Seite 17 Typ II RestrikPonsendonukleasen Schneiden der DNA durch Durchtrennen des Zuckerphosphat-Rückgrates an beiden Strängen Auurechen der Wasserstozrücken zwischen den komplementären Basen (Schmelzen der Bindung) Erkennungssequenz 2. Auuruch der H-Brücken EcoRI : : : : : : : :

18 Seite 18 Typ II RestrikPonsendonukleasen Schneiden der DNA durch Durchtrennen des Zuckerphosphat-Rückgrates an beiden Strängen Auurechen der Wasserstozrücken zwischen den komplementären Basen (Schmelzen der Bindung) Trennen der Enden Erkennungssequenz 3. Trennung der Enden EcoRI : : : : : : : : : :

19 Seite 19 Typ II RestrikPonsendonukleasen Einfacher dargestellt: EcoRI : : : : : : : : : : : : Erkennungssequenz Schnikstelle 5 -GAATTC-3 3 -CTTAAG-5 ^ 5 -GAATTC-3 3 -CTTAAG-5 ^

20 Seite 20 Typ II RestrikPonsendonukleasen PstI Einige Beispiele für häufig verwendete (Typ II) RestrikPonsendonukleasen und ihre Schnikstellen und -muster KpnI Je nach Enzym: - oder - Überhänge von 2-4 Basen ( spcky ends ) Kein Überhang ( blunt ends ) SacII AccII AscI PvuI EcoRI NdeI SmaI XhoI ClaI HpaI

21 Seite 21 Typ II RestrikPonsendonukleasen Einige Beispiele für häufig verwendete (Typ II) RestrikPonsendonukleasen und ihre Schnikstellen und -muster Manche Enzyme: gleich Erkennungssequenz aber anderer Schnik Manche Enzyme unterschiedliche Erkennungssequenz, aber mit mit kompapblen Enden (Überhängen passen zueinander) Gleiche Erkennungssequenz anderer Schnik kompapble Enden KpnI XhoI Acc65I SalI WichPg für die Auswahl von RestrikPonsenzymen bei der Planung von Klonierungen

22 Seite 22 Typ II RestrikPonsendonukleasen M Einige Beispiele für häufig verwendete (Typ II) RestrikPonsendonukleasen und ihre Schnikstellen und -muster Neoschizomere Isoschizomere Gleiche Erkennungssequenz anderer Schnik Gleiche Erkennungssequenz gleicher Schnik Enzym aber aus anderem Organismus KpnI Acc65I XhoI BbiI M Größenmarker (1kb Leiter) 1 Plasmid X 2 Plasmid X + XhoI 3 Chromosomale DNA 4 Chromosomale DNA + Xho 5 Chromosomale DNA + EcoRI

23 Seite 23 RestrikPonsverdau in der Molekularbiologie In der Praxis: Ansatz für einen analypschen ResrikPonsverdau: 1 µl DNA-lösung (1 µg) 2 µl 10x Puffer 1 µl RestrikPonsendonuklease (2 U) 16 µl H 2 O InkubaPon für 1-2 h, in der Regel bei 37 C Typischer Puffer: mm Tris-HCl ph mm NaCl/KCl 10 mm MgCl2 1 mm DTE (Dithioerytriol) AkPvität (Menge) der Enzyme in Units (U) Standard-Enzym: 1 U = 1 µmol Substrat/min Pufferbedingungen, InkubaPonstemperatur und dauer können je nach Enzym variieren EnzymaPsche AkPvität der RestrikPonsenzyme hängt stark von den Pufferbedingungen ab Manche Enzyme sind bei falschen (nicht oppmalen) Pufferbedingungen inakpv oder habe unspezifische AkPvität (schneiden falsch) Star-AkPvität!!!

24 RestrikPonsverdau in der Molekularbiologie RestrikPonsendonukleasen werden in der Molekularbiologie vor Allem eingesetzt für: 1. AnalyPsche Verdaus (physikalische KarPerung), DNA Moleküle können anhand ihrer RestrikPonsmuster idenpfiziert bzw. karpert werden bp 5831 bp 4390 bp 3660 bp 1. XhoI 2. PstI 3. XhoI+PstI 730 bp Seite 24

25 Seite 25 RestrikPonsverdau in der Molekularbiologie

26 Seite 26 RestrikPonsverdau in der Molekularbiologie RestrikPonsendonukleasen werden in der Molekularbiologie vor Allem eingesetzt für: 2. Klonierungszwecke, dabei werden Fragmente zunächst in gewünschter Weise geschniken und anschließend wieder zusammengefügt ( rekombinante DNA) Of: AmplifikaPon der Ziel-sequenz durch PCR mit Primern, die die gewünschten Schnikstellen enthalten gena gena Polylinker) Resistenzgen) Replika.onsursprung) Promotor) PCR gena% gena

27 Seite 27 Methoden der Molekularbiologie ModifikaPon von DNA: LigaPon

28 Seite 28 RestrikPonsendonukleasen Bisherige Methoden für Arbeiten mit DNA: IsolaPon Qualitätskontrolle und QuanPfikaPon VervielfälPgung (PCR) Agarose-Gelelektrophorese Schneiden (RestrikPonsverdau Weitere Arbeitsschrike, die für die Klonierung von DNA wichpg sind: Verbinden von Fragmenten Ligase = molekularer Kleber für (kompapble) DNA-Enden

29 Seite 29 DNA-Ligase Auch hier bedienen wir uns bei den Enzymen, die für die DNA-ReplikaPon benöpgt werden: Brock Mikrobiologie, Abb Brock Mikrobiologie, Abb. 7.16

30 Seite 30 DNA-Ligase Für molekularbiologische Arbeiten meistens T4 Ligase (aus T4 Phagen) 1. Freie, kompapble DNA Enden finden sich und lagern sich lose aneinenader (H-Brücken) 3. Ligase knüpf 2. Esterbindung 2. Ligase knüpf 1. Esterbindung 4. (ehemals freie) DNA-Enden an beide Stränge kovalent bebunden (ligiert)

31 Seite 31 DNA-Ligase BenöPgt freie -OH- UND -Phosphat-Gruppen!!!! PO OH : : : : OH- -PO 4 - Ligase : : : : : : Zwischenprodukt vor LigaPon stabilisiert durch H-Brücken : : : : : :

32 Seite 32 DNA-Ligase Ligase verbindet auch Enden ohne Überhang (Blunt) HpaI G T T : : : C A A OH PO 4 - PO 4 - A A C : : : T T G OH Ligase G T T A A C : : : : : : C A A T T G Allerdings ist die LigaPon von Blunt-Enden sehr viel ineffizienter Kein Zwischenprodukt, bei dem die Bindung durch H-Brücken stabilisiert wird, : : : : : :

33 Seite 33 Methoden der Molekularbiologie ModifikaPon von DNA: weitere

34 Seite 34 RestrikPonsendonukleasen Bisherige Methoden für Arbeiten mit DNA: IsolaPon Qualitätskontrolle und QuanPfikaPon VervielfälPgung (PCR) Agarose-Gelelektrophorese RestriPonsverdau LigaPon ModifikaPon freier Enden ModifikaPon freier Enden

35 Seite Dephosphorylierung Phosphatasen: Enzyme zur unspezifischen En ernung von endständigen Phosphatresten von biologischen Makromolekülen (DNA, RNA, Proteinen...) in der Molekularbiologie werden verschiedene Phosphatase eingesetzt, hauptsächlich zur Dephosphorylierung von freien DNA-Enden Calf intespnal phosphatase (CIP) Shrimp alkaline phosphatase (SAP) AntarkPc phosphatase PO OH : : : : OH- -PO 4 - CIP -OH : : : : OH-

36 Seite Dephosphorylierung Grund: Verhinderung der ReligaPon von z.b. Klonierungsvektoren nach Schnik mit einem RestrikPonsenzym PO OH : : : : OH- -PO 4 - Ligase : : : : : : gena% LigaPon ohne CIP mit

37 Seite Phosphorylierung (T4) PolynukleoPdkinase Überträgt einen Phosphatrest von ATP auf freie, unphosphorylierte -Enden von DNA Zweck: Vorbereitung von unphosphorylierten DNA-Fragmenten zur LigaPon -OH : : : : OH- T4 Kinase PO OH : : : : OH- -PO 4 -

38 Seite Phosphorylierung Warum braucht man das? PCR-Primer sind am -Ende meist nicht phosphoryliert und könnten sonst nicht direkt ohne Schnik ligiert werden z.b. Pfu-Polymerase produziert Blunt-Enden ohne freie PO 4- -Enden, nach Phosphorylierung können diese direkt mit dem (dephosphorylierten) Zielvektor ligiert werden können " " T" A" G" T" " Pfu" A" T" C" A" G" C" T" A" C" C" T" T" C" A" G" G" A" C" A" T" A" C" G" G" T" A" " Pfu-PCR " " T" A" G" T" C" G" A" T" G" G" A" A" G" T" C" C" T" G" T" A" T" G" C" C" A" T" A" T" C" A" G" C" T" A" C" C" T" T" C" A" G" G" A" C" A" T" A" C" G" G" T" A" " " Polynukleotidkinase # OH# G T T! : : :! C A A! # PO 4+ +" " T" A" G" T" C" G" A" T" G" G" A" A" G" T" C" C" T" G" T" A" T" G" C" C" A" T" A" T" C" A" G" C" T" A" C" C" T" T" C" A" G" G" A" C" A" T" A" C" G" G" T" A" " +PO 4+ " A A C! : : :! T T G! # OH# #

39 Seite Auffüllen von Überhängen Wird verwendet, wenn Vektor und zu klonierendes Fragment nicht-kompapble Enden haben EcoRI KpnI # OH# G T T! : : :! C A A! # " A" A" T" T" C" G" A" T" G" G" A" A" G" T" C" C" T" G" T" A" T" G" G" T" A" C" " G" C" T" A" C" C" T" T" C" A" G" G" A" C" A" T" A" C" " " A A C! : : :! T T G! # OH# #

40 Seite Auffüllen von Überhängen Wird verwendet, wenn Vektor und zu klonierendes Fragment nicht-kompapble Enden haben Enzym: Klenow-Fragment = das größere der beiden Proteinfragmente der DNA- Polymerase I aus E. coli nach enzymapscher Spaltung mit SubPlisin Besitzt 2 enzymapsche AkPvitäten: 1. 3' Polymerase-AkPvität 2. 5' Exonuklease-AkPvität (proof reading) Ursprüngliches Enzym zur AmplifikaPon von DNA durch PCR (vor Verwendung von Taq) 1. 3' Polymerase-AkPvität 2. 5' Exonuklease-AkPvität A A T T C G A T G G A A G T C C T G T A T G G T A C T T A A G C T A C C T T C A G G A C A T A C Phosphorylierung und LigaPon