Labordiagnostik der Autoimmunneutropenie (AIN)
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- Cornelius Kästner
- vor 6 Jahren
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1 DRK-Blutspendedienst West Labordiagnostik der Autoimmunneutropenie (AIN) Angelika Reil DRK-Blutspendedienst West Hagen
2 Labor für Leukozyten -und Thrombozytenimmunologie Nachweis von Allo- und Autoantikörpern gg. Granulozyten und Thrombozyten Immunhämatologie Autoimmunzytopenien (AIN, ITP) Mutter-Kind-Unverträglichkeiten (NIN, NAIT) Transfusionsmedizin Refraktärzustände gg. Thrombozytentransfusion Vorbereitung zu Granulozytentransfusion Granulozytenantikörper-Screening zur TRALI-Prophylaxe
3 Primäre Autoimmunneutropenie Typische Erkrankung des Kleinkindesalters Häufigste Ursache für eine chronische Neutropenie im Kindesalter Kann schon intrauterin beginnen Inzidenz 1: , nach Erfahrungen aus unserem Labor deutlich häufiger 2015: 50 Kinder mit Autoantikörpernachweis Mädchen und Jungen etwa gleich häufig betroffen Klinisches Bild: häufig symptomlos typische bakterielle Infektionen: Otitis media, Tonsillitis, Hautabszesse Aphthen
4 Fallbericht, Teil 1 A 15-month-old girl presented with fever and a subcutaneous abscess of 1,5 cm diameter in the right axilla. Blood count showed haemoglobin 105 g/l, WBC 6, /l, platelets /l. Differential count revealed neutrophils 6%, eosinophils 5%, monocytes 19% and lymphocytes 79%; absolute neutrophil count (ANC) was 0, /l. C-reactive protein (CRP) was elevated to 98 mg/l. After surgical incision and antibiotic therapy the patient recovered quickly. The family history, past medical history and physical examination of the patient were unremarkable. During the following months the ANC remained low, between 0 and 0, /l; there were no severe infections.. BJH 2008;142:504
5 Präanalytik: Typisches Erkrankungsalter 160 Alter bei erstmaligem Nachweis von Autoantikörpern Kinder (n= 369) bis 6 Monate bis 1 Jahr bis 1 1/2 Jahre bis 2 Jahre bis 2 1/2 Jahre bis 3 Jahre 3-18 Jahre physiologisch niedrigere Immunglobulin-Spiegel erschweren evtl. Nachweis
6 Präanalytik: Absolute Neutrophilenzahl 120 ANC bei erfolgreichem Autoantikörper-Nachweis Kinder (n= 295) bis 200/µl bis 500/µl bis 750/µl bis 1000/µl über 1000/µl
7 Knochenmark Normal oder hyperzellulär Linksverschiebung Kein Reifungsstop Autoimmunneutropenie (AIN) Kostmann-Syndrom Reifungsstop! Abb. aus: Zeidler C. Z Rheumatol. 2013;72:663-8.
8 Fallbericht, Teil 2 Repeated testing for granulocyte antibodies (PR3, MPO, canca, panca) and antinuclear antibodies (ANA) was negative. After 5 months of persistent neutropenia, bone marrow aspiration and biopsy were performed, which shows a slightly hypercellular bone marrow with normal erythro- and megakaryopoiesis. Granulopoiesis was hyperplastic with a shift to the left, maturing up to the level of band forms.. The age of the patient and the benign course of the disease despite the profound neutropenia make the most likely diagnosis chronic benign neutropenia, which is usually autoimmune in origin, even if circulating neutrophil antibodies are not always detected.. BJH 2008;142:504
9 Granulozytenantigene Protein Alloantigen Alter Name Autoantigen CD16b Fcγ-Rezeptor IIIb HNA-1a, -1b, -1c, -1d NA1, NA2, SH, -- ja CD177 NB1-GP HNA-2 NB1 ja CTL2 Cholin-Transporter HNA-3a, -3b 5b, 5a --- CD11b MAC-1 (Integrin) HNA-4a, -4b Mart ja CD11a LFA-1 (Integrin) HNA-5a, -5bw Ond --- Die große Mehrheit der Autoantikörper reagiert mit HNA-1apositiven Granulozyten. canca, panca und ANA haben mit Autoimmunneutropenie nichts zu tun!
10 Granulozytenimmunfluoreszenztest Frische, fixierte Granulozyten + Patientenplasma (freie Auto-Ak?) 30 min bei 37 C inkubieren + Rabbit-anti-human-IgG-FITC 30 min bei 37 C inkubieren am Fluoreszenzmikroskop auswerten transmembrane Moleküle (fixiert): CD11b, CTL-2, HLA Kl. I Fluoreszenzmuster gibt Hinweis auf die Spezifität GPI-verankerte Moleküle (mobil): Fcγ-Rezeptor IIIb, CD177
11 Granulozytenimmunfluoreszenztest transmembrane Moleküle (fixiert): CD11b, CTL-2, HLA Kl. I : K., S. * , ANC 134/µl GPI-verankerte Moleküle (mobil): Fcγ-Rezeptor IIIb, CD177
12 Granulozytenimmunfluoreszenztest Warum kein direkter Test mit Patientengranulozyten? Kurze Lebensdauer => apoptotisch bei Ankunft im Labor Niedrige Zellzahl, dafür maximal aktiviert => hohe Autofluoreszenz Viele Fcγ-Rezeptoren => binden Immunkomplexe => starkes Hintergrundsignal => Direkter Granulozytenimmunfluoreszenztest ist praktisch nicht sinnvoll durchführbar
13 Granulozytenagglutinationstest Frische, unfixierte Granulozyten + Patientenplasma (freie Auto-Ak?) 2 h bei 37 C inkubieren am Mikroskop auswerten Fcγ-Rezeptor IIIb CD11b CD177 Form der Aggregate gibt Hinweis auf die Spezifität CTL-2
14 Granulozytenagglutinationstest Fcγ-Rezeptor IIIb CD11b CD : K., S. * , ANC 134/µl CTL-2
15 Antigen-spezifischer Enzymimmunoassay (MAIGA) ΔE enzymmarkierter Antihuman- Antikörper (Ziege) * Humaner Ak, I z.b. Anti-HNA-1a Y K., S. * FcγRIIIb: 2,181 Pos.-K.: 2,612 CD177: 0,119 Neg.-K.: 0,076 CD11b: 0,083 capture -Ak.: Monoklonaler Ak gg. CD16b (Maus) FcγRIIIb HNA-1a Y Ziege-Anti-Maus Mikrotiterplatte HNA-1a HNA-1b HNA-1a HNA-1b Zeitbedarf: ca. 7 h (Bux et al., Transfus Med 1993)
16 Genetische Prädisposition Koinzidenz bei Zwillingen und unter Geschwistern Kandidatengene: Fc gamma-rezeptor IIIb (Autoantigen) ist polymorph Autoimmunerkrankung => HLA-Assoziation?
17 Phänotyp-Frequenzen der FCGR3B-Allele FCGR3B*01 => HNA-1a, FCGR3B*02 => HNA-1b 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% AIN-Kinder (n=352) Kontrollen (Lit.) 30% 20% 10% 0% *01 *02 *03 47% der AIN-Kinder sind homozygot für FCGR3B*01 (nur ca. 8 % unserer Blutspender)
18 Phänotyp-Frequenzen der DQB1-Allele 80% AIN-Kinder (n=190) Kontrollen (n=111) 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% *02 *03 *04 *05 *06 Wang et al., Primary autoimmune neutropenia in children in Taiwan, Transfusion 2009;49: AIN ist assoziiert mit HLA-DQB1*0503
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