Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln. vorgelegt von Johannes Lenz aus Köln

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1 Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln Klinik und Poliklinik für Innere Medizin I Hämatologie und Onkologie Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Hallek Über die Bedeutung des -173 G/C Single- Nukleotid-Polymorphismus (SNP) im Promotor des Gens für Macrophage-Migration-Inhibitory- Factor (MIF) für die Pathogenese der Chronischen Myeloischen Leukämie (CML) Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Johannes Lenz aus Köln Promoviert am 20. Februar 2013

2 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg 1. Berichterstatterin/Berichterstatter: Privatdozent Dr. med. G. Fingerle-Rowson 2. Berichterstatterin/Berichterstatter: Frau Professor Dr. med. E. Wardelmann Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten: Herr Privatdozent Dr. med. G. Fingerle-Rowson und Herr Moritz Hahn. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, den

3 Alle laborexperimentellen Ergebnisse der in dieser Arbeit angegebenen Versuche wurden von mir selbst, nach entsprechender Anleitung durch Herrn Privatdozent Dr. med. G. Fingerle-Rowson, Herrn Zaidoun Hajali und Herrn Rao Kaleswarapu (Mitarbeiter der Forschungsgruppe von Herrn Privatdozent Dr. med. G. Fingerle- Rowson), durchgeführt und ausgewertet. Die statistischen Berechnungen und Auswertungen wurden von mir selbst am Institut für Medizinische Statistik, Informatik und Epidemiologie der Uniklinik Köln nach Anleitung von Herrn Moritz Hahn (Institut für Medizinische Statistik, Informatik und Epidemiologie der Uniklinik Köln) durchgeführt. Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Daten sowie DNA der CML-Patienten wurden von Herrn Dr. med. Sebastian Kreil von der III. Medizinischen Klinik für Hämatologie und Internistische Onkologie der Universitätsklinik Mannheim zur Verfügung gestellt. 3

4 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Einführung Allgemeine Prinzipien der Tumorentstehung Der Zellzyklus Regulation des Zellzyklus Der programmierte Zelltod (Apoptose) Der ERK/MAPK Signalweg Das Ubiquitin-Proteasom System Ubiquitinierung APC/C und SCF Komplex Proteasom MIF Das Macrophage-Migration-Inhibitory-Factor Gen Polymorphismen im mif-gen Das MIF Protein Die Funktionen von MIF Der Einfluss von MIF auf die Aktivität des Proteasoms Zellzykluskontrolle, proteasomale Degradation und Tumorentstehung MIF und die molekularen Mechanismen der Tumorentstehung Die Bedeutung von MIF in der Pathogenese von Krankheiten Assoziation von MIF mit der Entstehung von Krebserkrankungen beim Menschen Assoziationen von mif-promotor-polymorphismen mit Krankheiten des Menschen Fazit Die chronische myeloische Leukämie (CML) Pathogenese - Molekularbiologie: Verlauf der Erkrankung in Stadien Prognose Diagnostik Differentialdiagnose Therapie

5 1.3.7 Ausblick Ziele der Arbeit Material & Methoden Allgemeine Materialien Polymerasekettenreaktion (PCR) Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP)-Analyse von DNA Patienten-Kollektiv Statistische Auswertungen Ergebnisse Das Patientenkollektiv Korrelationen der Genotyp- und Allelfrequenzen mit dem Auftreten der CML Korrelationen der Genotyp- und Allelfrequenzen mit klinischen Parametern Alter bei Erstdiagnose (age_ed) Geschlecht Sokal-Score Hasford-Score Zeit bis zur Progression Zeit bis zum ersten krankheitsspezifischen Ereignis Gesamtüberleben Zusätzliche chromosomale Anomalität Philadelphia-Chromosom positive Zellen (Ph_pos) Blasten (blasts) Leukozyten (WBC - white blood cell count) Basophile Granulozyten (basophil) Thrombozyten (platelet) Hämoglobin (hb) Milzgröße (spleensi) Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis Lebenslauf

6 Abkürzungsverzeichnis Abl - Abelson tyrosine kinase ACTH - Adrenocorticotropic hormone AP - Activator protein Apaf-1 - Apoptotic-protease-activating factor-1 APC - Anaphase promoting complex ATP - Adenosine-triphosphate Bcr - Breakpoint cluster region CagA - Cytotoxin-associated gene A product CAK - Cyclin-activating kinase camp - Cyclic adenosine monophosphate Cand1 - Cullin associated neddylation dissociated protein 1 CDK - Cyclin-dependent kinase CKI - Cyclin-dependent kinase inhibitor CLL - Chronic lymphatic leukemia CML - Chronic myelogenous leukemia COX - Cyclooxygenase CRE - camp-responsive element CRH - Corticotropin releasing hormone CSN - Cop9 signalosome DNA - Deoxyribonucleic acid ERK - Extracellular signal regulated kinase FAK - Focal adhesion kinase GAP - GTPase activating protein GTP - Guanosine-triphosphate HCC - Hepatocellular carcinoma HLA - Human leucocyte antigen HRE - Hypoxia responsive element HIF - Hypoxia inducible factor IL - Interleukin ICD - Intracellular domain IFN - Interferon Jab1 - c-jun activating binding protein-1 6

7 JAK JIA JNK kb kda ko LPS MALT MAPK MHC MIF MLC mrna NF-κB NO NSCLC PCR PDGF - Janus kinase - Juvenile idiopathic arthritis - C-jun N-terminal kinase - Kilo base - Kilo Dalton - Knock out - Lipopolysaccharide - Mucosa-associated lymphoid tissue - Mitogen activated protein kinase - Major histocompatibility complex - Macrophage-Migration-Inhibitory-Factor - Myosin light-chain kinase - Messenger-ribonucleic acid - Nuclear factor kappa B - Nitric oxide - Non small cell lung cancer - Polymerase chain reaction - Platelet derived growth factor PGE 2 - Prostaglandin E 2 PI3K - Phosphatidylinositol-3-kinase PLA 2 - Phospholipase A2 PKB - Protein kinase B PKC - Protein kinase C RFLP - Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus RNA - Ribonucleic acid RT-PCR - Real time polymerase chain reaction SCF - Skp-Cullin-F-Box-containing complex SNP - Single nucleotid polymorphism STAT - Signal transducer and activator of transcription TLR - Toll-like receptor TNF - Tumor necrosis factor VEGF - Vascular endothelial growth factor wt - Wild type 7

8 1. Einführung 1.1 Allgemeine Prinzipien der Tumorentstehung Zellen müssen sich während ihres Lebens immer wieder mit Schäden an ihrer genetischen Information auseinandersetzen. Hierbei handelt es sich um Veränderungen in der Sequenz der Basen der Desoxyribonukleinsäure (DNA). Sie entstehen durch oxidativen Stress, hervorgerufen z.b. durch freie Sauerstoffradikale, welche freigesetzt werden, wenn die Zelle genotoxischen Substanzen, ultravioletter oder ionisierender Strahlung ausgesetzt ist. Auch chronische Entzündungsreaktionen können durch die Freisetzung von freien Sauerstoffradikalen aus aktivierten Phagozyten zur Entstehung von Krebs führen. Als Beispiele für krebsfördernde entzündliche Erkrankungen lassen sich hier der Darmkrebs auf der Basis einer Colitis ulcerosa, der Magenkrebs auf Grundlage einer chronischen Helicobacter pylori-infektion, das Adenokarzinom des Ösophagus auf Basis einer durch Refluxösophagitis hervorgerufenen Barrett-Metaplasie und das Harnblasenkarzinom, welches durch eine Infektion mit Schistosomen entsteht, nennen. Durch diese freien Sauerstoffradikale entstehen Mutationen im Genom, welche die Zelle über DNA-Reparaturmechanismen zu korrigieren versucht. Misslingt diese Reparatur, hat die Zelle die Möglichkeit, die Apoptose einzuleiten und sich selbst zu zerstören. Ein Tumor kann entstehen, wenn Genmutationen, durch welche die Kontrolle über das Wachstum der Zelle verloren geht, nicht adäquat repariert wurden. Da dadurch das Gleichgewicht zwischen Zellneubildung, Zellwachstum und Zelldifferenzierung, sowie programmiertem Zelltod verloren geht, teilt sich die Zelle nun unkontrolliert. Gene können durch relevante Mutationen entweder konstitutiv aktiviert oder inaktiviert werden. Kritisch sind solche Mutationen in Genen der Familie der Protoonkogene. Protoonkogene bilden Proteine, die das Wachstum von Zellen positiv beeinflussen. Sie sind zum Beispiel an der Transduktion von Signalen der Rezeptoren der Zelloberfläche (z.b. Wachstumsfaktorrezeptoren) beteiligt. Werden diese Protoonkogene durch Mutation konstitutiv aktiviert, entzieht sich die Zelle ihrer normalen Regulationsmechanismen, und es kann zu unkontrolliertem Wachstum der Zelle auch in Abwesenheit des Wachstumsfaktors kommen. Als Beispiel ist eine Mutation mit Auswirkung auf das Ras G-Protein zu nennen. Der Austausch einer Aminosäure durch Mutation verhindert dessen Inaktivierung, da das GAP-Protein, das für dessen Inaktivierung verantwortlich ist, nicht mehr an Ras binden kann. 8

9 Wenn es zusätzlich zu der Aktivierung von Protoonkogenen zu inaktivierenden Mutationen oder gar Deletionen in Genen der Familie der Tumorsuppressorgene kommt, geht ein zweiter wichtiger Kontrollmechanismus des Zellwachstums verloren. Tumorsuppressorgene wie p53, p21, p16, p27 und andere spielen eine ebenso wichtige Rolle wie die Protoonkogene, denn sie sind in der Lage, den Zellzyklus zu arretieren und das Apoptoseprogramm einzuleiten, wenn beispielsweise die Erbinformation einer Zelle geschädigt ist oder sie unter Nährstoffmangel leidet. Die Aktivierung von Protoonkogenen und die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen sind die zwei entscheidenden Schritte einer Zelle auf dem Weg zur neoplastischen Entartung. Die genomischen Mutationen und Alterationen können in den Zellen akkumulieren und werden an die folgenden Generationen von Krebszellen weitergegeben [53] Der Zellzyklus Die Zellen im Körper befinden sich zumeist in einer Phase, in der sie nicht teilungsaktiv sind. Dies bezeichnet man als die sogenannte G 0 -Phase (Gap-Phase) des Zellzyklus. Damit sich eine Zelle teilen kann und somit Wachstum oder Regeneration des Körpers möglich ist, muss die Zelle in den Zellzyklus eintreten. Dieser besteht aus unterschiedlichen Phasen. Als erstes tritt die Zelle in die G 1 -Phase ein, in welcher sie wächst und am G 1 -Checkpoint kontrolliert, ob eine Zellteilung möglich ist. In der S- Phase (Synthese-Phase) führt die Zelle die Replikation der DNA durch, wobei es zu einer Verdoppelung der genetischen Information kommt, welche am Ende, am so genannten S-Checkpoint, auf ihre Integrität überprüft wird. Die G 2 -Phase bereitet die Zelle auf die sich anschließende M-Phase (Mitose) vor, und sie synthetisiert die für die Zellteilung erforderliche RNA und Proteine. Die genetische Information wird in der Mitose-Phase in Form der Chromosomen auf die beiden entstehenden Tochterzellen aufgeteilt. Nach erfolgter Zellteilung hat die Zelle entweder die Möglichkeit, sich dem Zellzyklus durch den Eintritt in die G 0 -Phase zu entziehen oder sich weiter zu teilen, und der Zellzyklus beginnt von neuem. Durch den Einfluss von Wachstumsfaktoren können Zellen, die sich in der G 0 -Phase befinden, wieder in den Zellzyklus eintreten. G 1 -, S- und G 2 -Phase werden zusammengefasst auch als Interphase bezeichnet [68]. 9

10 Abb. 1.1: Der Zellzyklus, seine verschiedenen Phasen sowie die Kontrollpunkte. Modifiziert nach [68] Regulation des Zellzyklus Damit sich eine Zelle unter optimalen Bedingungen teilen kann und durch ihr Wachstum nicht den Gesamtorganismus gefährdet, ist es notwendig, dass der Zellzyklus streng kontrolliert wird. Kontrollpunkte zwischen G 1 - und S-Phase sowie G 2 - und M- Phase dienen dieser Kontrolle. Am G 1 S-Kontrollpunkt entscheidet sich, ob die Zelle aus der G 1 -Phase in die S-Phase eintreten kann. Voraussetzung hierfür sind eine ausreichende Zellgröße und das Fehlen von Schäden an der DNA. Der G 2 M- Kontrollpunkt liegt in der G 2 -Phase und kontrolliert die Zelle vor dem Eintritt in die M- Phase. Hier wird geprüft, ob die DNA fehlerfrei repliziert wurde und ob Schäden an der DNA vorhanden sind. Bei aufgetretenen Fehlern wird der Zellzyklus angehalten. Nun hat die Zelle Zeit, mit ihren Reparaturmechanismen diese Fehler zu beheben, die Replikation ganz abzubrechen oder die Apoptose einzuleiten. Eine letzte Kontrolle erfolgt am Ende der M-Phase und dient dazu zu überprüfen, ob die beiden Chromosomensätze in der Mitosespindel korrekt aufgeteilt sind. Das Fortschreiten des Zellzyklus bedingt eine kontinuierliche Stimulation durch Wachstumsfaktoren, welche die Aktivität der Cyklin-abhängigen-Kinasen (CDKs) und ihrer Partner, der Cykline, regulieren. Im Verlauf des Zellzyklus fluktuiert die Konzentration der Cykline von Phase zu Phase spezifisch, während sich die Konzentration der CDKs nur wenig ändert. Somit sind die Cykline die Hauptregulatoren des Zellzyklus. 10

11 Cykline binden an die CDKs und bilden mit ihnen Komplexe, so dass deren Aktivität stark ansteigt. Die einzelnen Cykline sind in der Lage, unterschiedliche CDKs zu binden. Durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung wird ihre Aktivität bestimmt. Damit die Zelle von der G 2 -Phase in die M-Phase übergehen kann, steigt zunächst die Bildung von Cyklin B in der späten S-Phase an, um in der G 2 -Phase eine ausreichende Konzentration zu erreichen. Vorrausetzung für die Aktivität von CDK1 und ihre darauffolgende Translokation in den Zellkern ist die Bindung von Cyklin B und die Phosphorylierung an Threonin 161 durch die CDK aktivierende Kinase (CAK), die sich aus Cyklin H, CDK7 und Mat1 zusammensetzt. Das aktive Zentrum der CDK1 ist durch die Kinasen wee1, mik1 und myt1 an Threonin 14 und an Tyrosin 15 phosphoryliert, wodurch die enzymatische Aktivität der CDK1 blockiert ist. Um diese Blockade aufzuheben, dephosphoryliert die Phosphatase cdc25c diese beiden inhibitorischen Phosphorylierungen. Nun ist der Cyklin B/CDK1 Komplex in der Lage, die Mitose einzuleiten. Andere Cyklin/CDK Komplexe wirken an anderen Stellen des Zellzyklus. Cyklin D wirkt im Komplex mit CDK4 oder CDK6 von der G 1 - bis in die S-Phase hinein. Der Cyklin D/CDK4/6 Komplex ist für den Übergang von der G 1 - in die S- Phase verantwortlich. Auch er wird durch die CAK phosphoryliert, transloziert dann in den Zellkern und induziert den Transkriptionsfaktor E2F und DP1. E2F und DP1 liegen, durch den Tumorsuppressor Rb (Rb105) gebunden, in inaktiver Form vor. Der Cyklin D/CDK4 Komplex ist für die Phosphorylierung von Rb verantwortlich. Durch die des weiteren erfolgende Hyperphosphorylierung von Rb durch Cyklin E/CDK2 und Cyklin A/CDK2 kommt es zur Freisetzung und damit Aktivierung von E2F und DP1. Durch E2F und DP1 werden die für die DNA-Synthese wichtigen Enzyme transkribiert. Cyklin E und CDK2 wirken etwas kürzer am Übergang zwischen G 1 - und S-Phase. Hier dephosphoryliert die Phosphatase cdc25a das aktive Zentrum von CDK2. Von der S- Phase bis in die G 2 -Phase wirkt der Komplex aus Cyklin A und CDK2. CDK-Inhibitoren (CKI) regulieren die Aktivität der CDKs. Dabei gibt es zwei Familien von Inhibitoren, zum einen p21 WAF1, p27 KIP1 und p57 KIP2 und zum anderen p15 INK4B, p18 INK4C und p19 INK4D. Ihre Konzentration wird durch das Ubiquitin-Proteasom System gesteuert. Durch die Inhibition der CDKs, z.b. durch p21 WAF1, kommt es auch zur Beeinflussung anderer, für den Zellzyklus wichtiger Proteine, so z.b. nicht zur aktivierenden Phosphorylierung von Rb. Die Aktivität der CDKs ist abhängig von ihrer subzellulären Lokalisation. CDKs und Ubiquitin-Ligasen regulieren sich gegenseitig. Der Tumorsuppressor und Transkriptionsfaktor p53 ist ein weiterer wichtiger Regulator 11

12 des Zellzyklus. Nachdem es zu Schäden an der DNA gekommen ist, wird p53 aktiviert und bindet nun an den Promotor des Gens von p21 WAF1, steigert dessen Expression und inhibiert somit die Aktivität der Cyklin E, D/CDK 2, 4 Komplexe. Die Folge ist der Stopp des Zellzyklus, so dass es nicht zum Übergang in die S-Phase kommt [53, 71, 26, 68] Der programmierte Zelltod (Apoptose) Die Apoptose wird auch als programmierter Zelltod bezeichnet. Sie dient u.a. der Regulation der Zellzahl in den verschiedenen Organen und erhält so ein Gleichgewicht zwischen Zellteilung und Eliminierung nicht mehr benötigter Zellen aufrecht. Zu Beginn der Apoptose kommt es zur Kondensation des Kernchromatins, und der Zellkern beginnt zu schrumpfen. Anschließend fragmentiert der Zellkern, und die Zelle zerfällt. Makrophagen phagozytieren die Reste der Zellen, und somit kommt es nicht zu einer Immun- und Entzündungsreaktion. Die Apoptose wird durch verschiedene Mechanismen aktiviert. Die Einleitung der Apoptose über den extrinsischen Weg benötigt den TNF-Rezeptor-1 (TNFR1) oder den Fas-Rezeptor (CD95). Der TNF-Rezeptor-1 bildet einen Komplex mit verschiedenen zytoplasmatischen Effektorproteinen (TRADD, FADD, RIP, RAIDD) und besitzt intrazellulär gelegene Todesdomänen, die für die Interaktion der Proteine untereinander zuständig sind. Kommt es durch Bindung des Liganden TNF zur Stimulation des Rezeptors, so werden die intrazellulär lokalisierten inaktiven Procaspasen 8 und 2 durch Proteolyse aktiviert. Nun wird eine Kaskade von Caspasen initiiert, wobei die aktive Caspase 8 die Procaspasen 3, 6 und 7 durch limitierte Proteolyse aktiviert. Diese Caspasen leiten den Zelltod ein. Dabei werden wichtige Strukturproteine (Kernmembran, Zytoskelett) der Zelle zerstört, das Enzym DNAse wird aktiviert und die DNA im Zellkern abgebaut. Die Reparaturmechanismen der DNA und der Zellzyklus werden inhibiert. Auch der zur TNF-Superfamilie gehörende Rezeptor Fas (CD95) leitet, nach Bindung seines Liganden FasL, die Apoptose ein. Dabei lagert sich zunächst FADD an den Rezeptor an, und die nun folgende Procaspase 8 wird wieder proteolytisch aktiviert, was wiederum die Aktivierung der Caspasen-Kaskade zur Folge hat. Eine andere Form der Aktivierung der Apoptose wird als mitochondrialer oder intrinsischer Weg bezeichnet. Initial wird aufgrund einer zellulären Schädigung Cytochrom-C aus den Mitochondrien freigesetzt. Proteine der Bcl-2-Familie werden in 12

13 pro- und antiapoptotische Proteine eingeteilt. Zu den proapoptotischen zählen die als Heterodimer vorliegenden Proteine Bax und Bak, die nach heutigem Kenntnisstand durch Porenbildung das Cytochrom-C aus dem Mitochondrium entweichen lassen. Dabei werden Bax und Bak durch verschiedene Proteine reguliert. Bei Störungen des Zytoskelettes wird das Protein Bim freigesetzt und wirkt proapoptotisch auf Bax und Bak. Das Protein Bad wirkt auch proapoptotisch, wird aber durch die von Wachstumsfaktoren aktivierte Proteinkinase PKB/Akt phosphoryliert und damit inaktiviert. Bid ist ein weiteres proapoptotisches Protein, welches durch die Caspase 8 gespalten wird und das Bruchstück tbid, die Freisetzung von Cytochrom-C aus dem Mitochondrium, bewirkt. Das freigesetzte Cytochrom-C bindet an Apaf-1 (apoptoticprotease-activating-factor-1), welches die Caspase 9 aktiviert. Caspase 9 ist in der Lage über weitere Caspasen die Apoptose einzuleiten. Bei Bcl-2 handelt es sich um ein antiapoptotisches Protein. Es inaktiviert Bax, indem es mit ihm ein Heterodimer bildet. Nachdem es zu Schäden an der DNA gekommen ist, bewirkt der Tumorsuppressor p53 einen Stopp des Zellzyklus in der G 1 -Phase. Wenn die Schäden an der DNA zu groß sind, ist p53 in der Lage, die Expression von Bax zu induzieren, so dass die Apoptose beginnen kann [53] Der ERK/MAPK Signalweg Signale, die durch einen Rezeptor (z.b. Rezeptortyrosinkinasen, G-Protein gekoppelte Rezeptoren) auf der Zelloberfläche bei dessen Aktivierung ausgesendet werden, werden über Signaltransduktionswege zu Transkriptionsfaktoren weitergeleitet. Beim ERK/MAPK Signalweg handelt es sich um einen wichtigen zellulären Signalweg, der Signale von Wachstumsfaktoren und Zytokinen weiterleitet und in entsprechende Reaktionen der Zelle umsetzt. Dazu zählen die Aktivierung von Genen, die Proliferation der Zelle und ihre Differenzierung. Dafür verantwortlich ist überwiegend eine transiente Aktivierung des Signalweges. Die MAP-Kinasen lassen sich in drei Familien einteilen. Es gibt Kinasen, die bei wachstumsfördernden Prozessen aktiv sind. Dazu zählen die ERK1 und ERK2. Die p38-kinasen (p38α, β, γ, δ) und die JNK-Familie werden durch proinflammatorische Zytokine sowie extrazellulären Stress (UV-Licht, Hungersignale, oxidativen Stress, osmotische Veränderungen) aktiviert. Bei diesen MAP-Kinasen handelt es sich um ausführende Kinasen, denen eine Kinasen- Kaskade vorgeschaltet ist, welche die Signale vom Rezeptor weiterleitet. Die Kinasen- 13

14 Kaskade ist unterschiedlich aus verschiedenen Enzymen aufgebaut. Die erste Kinase ist eine MAP3K. Diese Serin/Threoninkinase aktiviert die nachfolgende MAP2K an spezifischen Threonyl- oder Serylresten durch Phosphorylierung. Bei der MAP2K handelt es sich sowohl um eine Serin/Threoninkinase als auch um eine Tyrosinkinase. Sie aktiviert die Serin/Threoninkinase MAPK durch Phosphorylierung. Damit diese Kinasen-Kaskade aktiviert werden kann, werden sie an ein Scaffold Protein gebunden, welches die räumliche Nähe der Kinasen untereinander sicherstellt. Betrachtet man die Kaskaden genauer, so gibt es viele verschiedene Proteine, die hier exemplarisch dargestellt werden sollen. Durch die Rezeptor Stimulation von Wachstumsfaktoren oder Zytokinen wird zunächst das G-Protein Ras durch Bindung von GTP aktiviert. Ras wiederum wird durch das GAP-Protein inaktiviert, indem es die GTPase Aktivität von Ras stimuliert, wodurch aus dem an Ras gebundenen GTP ein Phosphat-Atom abgespalten und GDP freigegeben wird. Ras aktiviert die MAP3K Raf, welche wiederum die MAP2K MKK1/2 (MEK1/2) aktiviert. Zuletzt wird die MAPK ERK1/2 aktiviert. Durch zellulären Stress oder proinflammatorische Zytokine wird entweder die Kaskade: G-Protein (Rho, Cdc42) MAP3K (MEKK, MLK) MAP2K (MKK4/7) MAPK (JNK1/2/3) oder die Kaskade: G-Protein (Rac, Cdc42) MAP3K (TAK1, ASK1) MAP2K (MKK3/6) MAPK (p38α, β, γ, δ) aktiviert. Nach Beendigung der Kaskade werden Transkriptionsfaktoren wie Elk-1, Ets-1 Ap-1, NF-AT n oder c-myc induziert. Die Aktivierung der MAP-Kinase Kaskade ist, bezogen auf den Zellzyklus, wichtig für die Progression in die S-Phase [53]. 14

15 Abb. 1.2: Darstellung des Map-Kinasen Signalweges. Der Rezeptor (R) wird durch Wachstumsfaktoren oder Zytokine stimuliert (Pfeil), zunächst ein G-Protein (z.b. Ras) durch Bindung von GTP aktiviert. Ras aktiviert die MAP3K (z.b. Raf), welche wiederum die MAP2K aktiviert. Zuletzt wird die MAPK (z.b. ERK1/2) aktiviert. Es kommt zur Induktion von Transkriptionsfaktoren (TF) Das Ubiquitin-Proteasom System Das Ubiquitin Proteasom System (UPS) dient dem Abbau von zelleigenen Proteinen. Im Durchschnitt enthält eine Zelle ca Proteasomen [71] Ubiquitinierung Damit Proteine abgebaut werden können, müssen sie zuvor mit Ubiquitin, einem 48 Aminosäuren-langen Peptid, markiert werden. Bestimmt wird dieser Prozess u.a. durch die Halbwertzeit der Aminosäure am N-terminalen Rest des Proteins. Auch bestimmte Aminosäure-Sequenzen, sogenannte Cyclinabbauboxen, und PEST-Sequenzen (Prolin- Glutaminsäure-Serin-Threonin) stellen wahrscheinlich weitere Signale für die Ubiquitinierung dar. Der Zelle stehen drei Enzymtypen zur Verfügung, die die Ubiquitinierung vollziehen. Das ubiquitinaktivierende Enzym (E1), das Ubiquitinkonjugierende Enzym (E2) und die Ubiquitin-Protein-Ligasen (E3). Im ersten Schritt bindet das ubiquitinaktivierende Enzym (E1) unter ATP Verbrauch Ubiquitin über dessen terminale Carboxylgruppe. Das Ubiquitin wird hiermit aktiviert. Im zweiten Schritt wird das aktivierte Ubiquitin auf die Sulfhydrylgruppe des ubiquitin- 15

16 konjugierenden Enzyms (E2) übertragen, um dann im dritten Schritt von einer Ubiquitin-Protein-Ligase (E3) mit einer ε-aminogruppe mehrerer Lysinreste des abzubauenden Proteins kovalent verbunden zu werden. Durch weitere Verknüpfung mehrerer Ubiquitin Moleküle über Isopeptidbindungen untereinander entsteht eine Kette mit vier (Tetra-Ubiquitin) oder mehr Ubiquitin Molekülen. Das Signal für den Abbau des Proteins wird damit besonders effektiv [9] APC/C und SCF Komplex Unter den E3-Ubiquitin-Ligasen wurden zwei Enzyme entdeckt, die eine Schlüsselposition in der Regulation des Zellzyklus einnehmen. Es handelt sich um den Anaphase-Promoting/Cyclosome (APC/C) und um den Skp1-Cullin1-F-Box Komplex (SCF). Beide weisen unterschiedliche Aktivitäten in den Phasen des Zellzyklus auf. APC/C ist von der Mitte der M-Phase bis zum Ende der G 1 -Phase, SCF von der späten G 1 -Phase bis in die frühe M-Phase hinein aktiv. Der SCF-Komplex zeigt in Krebszellen mehr genetische Veränderungen als der APC/C-Komplex. Eine Deregulierung des SCF- Komplexes fördert die Krebsentstehung. Dies ist wahrscheinlich durch seine Funktionen bezüglich des G 2 M-Checkpoints zu erklären. Der SCF-Komplex besteht aus vier Proteinen: Rbx1 und Cul1 (Scaffold Protein - Cullin) die den katalytischen Kern bilden, Skp1 (Adaptor Protein) und ein Protein aus der Familie der F-box Proteine, welches für die Substraterkennung zuständig ist. Die Aktivität des katalytischen Kerns wird durch die Anheftung eines Ubiquitin-ähnlichen Proteins mit dem Namen Nedd8 an Cullin durch Ubc12 (Ubiquitin-conjugating enzyme-12) reguliert. Dabei besitzt Nedd8 eine aktivierende Funktion. Dieser Schritt ist auch verantwortlich für die Rekrutierung von E2-Enzymen. Diese fünf Proteine bilden den aktiven SCF-Komplex. Reguliert wird der stimulierende Effekt von Nedd8 durch die Untereinheit 5 des CSN/COP9 Signalosoms. Es handelt sich dabei um Jab1/CSN5, welches in der Lage ist, Nedd8 direkt von Cullin abzuspalten. Diese Deneddylierung verringert wiederum die Rekrutierung der E2-Enzyme und die Aktivität des SCF- Komplexes. Die inaktive Form des SCF-Komplexes entsteht, wenn Cul1 deneddyliert wird und das inhibitorische Protein Cand1, Skp1 und das F-box Protein entfernt hat. Cand1 bindet an Cul1. CSN wiederum rekrutiert die Deubiquitinase Ubp12, die eine entgegengesetzte Wirkung bezüglich der E3-Ubiquitin-Ligasen wie z.b. SCF hat [26, 71]. 16

17 Abb. 1.3: Aktivierung / Inaktivierung des SCF-Komplexes - Skp = Skp1, F = F-Box Protein, ND = Nedd8. Modifiziert nach [71] Proteasom Das Proteasom ist eine ATP-abhängige Protease. Der 26S-Proteasom Komplex besteht aus zwei Untereinheiten. Die 20S-Untereinheit besitzt katalytische, die 19S- Untereinheit regulatorische Funktion. Zwei 20S-Einheiten mit jeweils 14 homologen Untereinheiten (α, β) bilden eine fassartige Struktur. Dabei bilden jeweils 7 Untereinheiten einen von vier Ringen aus. Die regulatorische 19S- Einheit reguliert den Zugang zum Inneren des Proteasoms. Dafür binden zwei 19S-Einheiten jeweils an eines der beiden Enden des 20S-Proteasomkerns. Die 19S-Einheit ist in der Lage spezifisch an Polyubiquitinketten zu binden, und somit wird gewährleistet, dass nur zuvor ubiquitinierte Proteine abgebaut werden. Durch Hydrolyse von ATP durch die ATPasen der 19S-Einheit gelangt das abzubauende Protein an den katalytischen 20S-Kern. Die Hydroxylgruppe eines N-terminalen Threonin wandelt sich in ein Nukleophil um, welches Carbonylgruppen der Peptidbindungen angreift. Übrig bleiben Peptide von sieben bis neun Aminosäuren Länge. Die Isopeptidase der 19S-Einheit spaltet nun 17

18 Ubiquitin von diesen Peptiden ab, so dass das Ubiquitin wiederverwertet werden kann. Zelluläre Proteasen bauen die Peptidketten weiter zu Aminosäuren ab [9]. 1.2 MIF Macrophage-Migration-Inhibitory-Factor (MIF) wurde 1966 ursprünglich von zwei Forschergruppen (Bloom & Bennett, David) als ein Mediator von T-Lymphozyten beschrieben, welcher die Migrationsbewegung von Makrophagen in vitro hemmt [14, 18]. In den darauf folgenden 30 Jahren wurde gezeigt, dass es sich bei MIF um ein ubiquitär exprimiertes proinflammatorisches Zytokin handelt, welches eine Schlüsselfunktion in der Regulation von Immun- und Entzündungsprozessen besitzt. Des Weiteren wurden hormonale und enzymatische Funktionen beschrieben. Zwischen dem Jahr 2000 und heute wurde zunehmend erkannt, dass MIF auch eine intrazelluläre Aktivität und wachstumsregulatorische Eigenschaften besitzt, die von Bedeutung für die Entstehung und Promotion von neoplastisch veränderten Zellen sind. MIF moduliert viele Signaltransduktionswege wie den NF-κB-, den Akt-, oder den MAPK-Weg. Ferner kann es als direkter Inhibitor von JAB1/CSN5 eine stabilisierende Rolle auf den SCF-Komplex ausüben, was die proteasomale Aktivität und damit die Halbwertszeit von vielen wichtigen regulatorischen Proteinen beeinflusst. Sowohl über seine extrazelluläre wie auch über seine intrazelluläre Aktivität kann MIF Zellvorgänge wie Aktivierung, Differenzierung, Proliferation, Migration und Apoptose beeinflussen. MIF hat auch einen positiven Einfluss auf die Bildung von Gefäßen (Angiogenese) [24] Das Macrophage-Migration-Inhibitory-Factor Gen Das mif-gen befindet sich beim Menschen auf Chromosom 22q11.2. Bei Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie (CML) wird es im Rahmen der Translokation t(9;22) auf das veränderte Chromosom der9 transloziert, wohingegen es bei Patienten mit Ewing Sarkom t(11;22) auf Chromosom der22 verbleibt. Das mif-gen liegt somit zwischen den beiden Bruchpunkten von CML und Ewing Sarkom [17]. Auch das Auftreten des DiGeorge-Syndroms ist mit einer Mikrodeletion in diesem Bereich des Chromosoms 22 vergesellschaftet. Bei dem mif-gen handelt sich um ein sehr kleines Gen (<1Kb), bestehend aus drei Exons mit jeweils 205, 173 und 183 bp, welche durch zwei Guanin- und Cytosin-reiche Introns mit 189 und 95 bp getrennt sind. Mensch und Maus besitzen nur ein funktionierendes mif-gen, auch wenn in Mäusen mehrere Pseudogene für MIF beschrieben sind. Die Sequenzhomologie zwischen menschlichem 18

19 und murinem mif-gen ist sehr hoch und liegt bei den drei Exons zwischen 67,5 und 86,4%. In Mäusen werden, im Gegensatz zum Menschen, mehrere intronlose mif Pseudogene prozessiert. Die Startstelle für die Transkription befindet sich 97 bp vor dem Start Methionin in einem TATA-losen Promotor, der reich an Guanin und Cytosin ist. Bei der Transkription des mif-gens entsteht als Transkript eine mrna mit einer Länge von ca. 800 Nukleotiden. Die Expression von MIF ist in den verschiedenen Geweben unterschiedlich, besonders in wachsenden und sich differenzierenden Zellen. Während z.b. Niere und Gehirn eine hohe Expression von MIF zeigen, finden sich in Muskel und Pankreas eine relativ niedrige Expression. In der 5 -flankierenden Region des mif-gens befinden sich mehrere regulatorische Bindedomänen und Enhancer Sequenzen, die für die Regulation der Transkription des mif-gens wichtig sind. Hierzu zählen jeweils eine Bindungsstelle für den Sp-1, AP-2, NF-κB Transkriptionsfaktor, ein camp-responsives Element (CRE), ein Glukokortikoid negativ regulierendes Element, eine Cytokin-1 (CK-1) Sequenz und eine Konsensussequenz, welche ursprünglich die basale Expression des Proto-Onkogens c-fos vermittelt [64, 74] Polymorphismen im mif-gen Insgesamt wurden vier Polymorphismen im humanen mif-gen entdeckt. Der CATT- tetra-nukleotid repeat wurde 1994 durch Paralkar und Wistow in der 5 -flankierenden Region des mif-gens beschrieben. Er besteht aus fünf bis acht Wiederholungen der Basenabfolge Cytosin-Adenin-Thymin-Thymin, wobei jedoch das (CATT) 8 -Allel relativ selten vorkommt. Der CATT-Repeat befindet sich in Position -794, d.h. 794 Basen-Paare vor dem Start-ATG des mif-gens [74]. Es finden sich jegliche Kombinationen der Allele (5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 6,6; 6,7; 6,8; 7,7); ein homozygoter 8,8 Genotyp wurde bisher jedoch noch nicht entdeckt [7]. In der 5 -flankierenden Promotorregion wurde auch ein single nucleotide polymorphism (SNP) entdeckt. An Position -173 befindet sich entweder ein Guanin oder Cytosin. Somit entstehen die drei Genotypen G/G, G/C und C/C. Wenn das Nukleotid Cytosin vorhanden ist, dann ergibt sich eine Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor Activator Protein-4 (AP-4) [25]. Des Weiteren wurden zwei Polymorphismen in den Introns beschrieben. An Position +254 befindet sich entweder ein Thymin oder ein Cytosin. An Position +656 befindet sich entweder ein Cytosin oder Guanin [22]. 19

20 1.2.3 Das MIF Protein Das MIF Protein besteht aus 115 Aminosäuren und hat eine molekulare Masse von 12.5 kda. Die Röntgenstrukturanalyse zeigt, dass es sich bei MIF um ein Trimer handelt. Dieses Trimer besteht aus insgesamt drei β-faltblättern, umgeben von sechs α-helices, die einen Kanal bilden. Dabei bilden je zwei antiparallel angeordnete α-helices und sechs β-stränge ein MIF-Monomer. Vier dieser β-stränge bilden ein gemischtes Faltblatt. Somit ergibt sich für die Struktur des MIF-Monomers die Abfolge der Sekundärstrukturen: β 1 α 1 β 2 β 3 β 4 α 2 β 5 β 6 [92, 93, 94]. Es wird angenommen, dass es sich bei der physiologisch aktiven Form von MIF um ein Dimer oder ein Trimer handelt [78] Die Funktionen von MIF Immunregulierende Funktionen Glukokortikoid-antagonistische Wirkung: MIF wurde in corticotrophen und thyreotrophen Zellen der Hypophyse gefunden, in den selben Vesikeln wie ACTH, und es wurde postuliert, dass es simultan, durch CRH stimuliert, mit ACTH ausgeschüttet wird. In Zell-Linien von Nagern zeigte sich, dass geringe Mengen von Dexamethason und Hydrocortison in der Lage waren, die MIF Produktion und Freisetzung aus Makrophagen zu induzieren. Die durch Glukokortikoide hervorgerufene Unterdrückung der Sekretion proinflammatorischer Zytokine konnte durch MIF aufgehoben werden. Diese Funktion dient wahrscheinlich als Rückkopplungsschleife, um die Entzündungsreaktion zu steuern. Dies konnte in Studien an Menschen jedoch bisher nicht ganz schlüssig nachgewiesen werden. Hohe Glukokortikoid-Konzentrationen unterdrücken die MIF Sekretion. [24] Stimulation der Sekretion von Zytokinen und Metalloproteinasen: In der Anwesenheit von MIF sind sowohl die Phagozytose-Aktivität der Makrophagen sowie ihre Sekretion von TNF-α gesteigert, als auch deren Möglichkeit, Pathogene intrazellulär abzutöten. Die Induktion von proinflammatorischen Zytokinen ist eine Hauptfunktion von MIF. Hierzu zählen neben dem schon oben genannten TNF-α die Interleukine IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, Interferon-γ. In Synoviozyten von Patienten mit rheumatoider Arthritis werden durch MIF Matrix-Metalloproteinasen und NO freigesetzt. Auch konnte gezeigt 20

21 werden, dass MIF dort die Expression der Phospholipase A2 und Cyclooxygenase 2 reguliert [7] Wachstumsregulierende Funktionen Die Einflüsse von MIF auf Wachstum und Apoptose werden im Folgenden genauer beschrieben Der Einfluss von MIF auf die Aktivität des Proteasoms Auf der Suche nach intrazellulären Bindungspartnern von MIF stießen Kleemann et al. auf Jab1/CSN5. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl exogen zugeführtes MIF über die endozytotische Aufnahme als auch endogen gebildetes MIF über seine Aminosäuren und Cys 60 an im Zytosol lokalisiertes Jab1 bindet. Jab1 steigert die Aktivität des Transkriptionsfaktors AP-1, und es zeigte sich, dass MIF diese Aktivitätssteigerung zu unterbinden vermag. Auch die durch TNF- und UV-Stress induzierte Transkriptionsaktivität von AP-1 wird durch MIF gehemmt. Ferner wird sowohl die Bindung von Jab1 an c-jun, als auch die Konzentration von endogenem Phospho-c-Jun durch MIF verringert und die durch Jab1 stimulierte Aktivität der JNKs konzentrationsabhängig durch MIF inhibiert. MIF ist in der Lage, die durch TNF induzierte JNK-Aktivität zu unterdrücken. Jab1 bindet an den Zellzyklus Inhibitor p27 KIP1 und ist in der Lage, dessen Konzentration zu verringern, indem es seinen Abbau initiiert. Auch hier führt MIF konzentrations- und von Jab1 abhängig zu einer entgegengesetzten Reaktion, indem es die Konzentration von p27 KIP1 stabilisiert [47]. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass MIF über die Metalloprotease (MPN)-Domäne an Jab1 bindet und somit dessen Interaktion mit anderen zellulären Proteinen verhindert. Auf diese Weise nimmt es auch Einfluss auf den SCF-Komplex, indem es Jab1 hindert, Cul1 zu deneddylieren und somit den SCF-Komplex aktiviert lässt [26, 71]. 21

22 Abb. 1.4: Der indirekte, über Jab1 vermittelte Einfluss von MIF auf wichtige Elemente des Zellzyklus Zellzykluskontrolle, proteasomale Degradation und Tumorentstehung Schäden, die an der DNA entstehen, können eine maligne Transformation der Zelle verursachen. Um die Entstehung von Tumoren zu verhindern, besitzt die Zelle beim Durchlaufen des Zellzyklus Kontrollpunkte, die Signalwege zu aktivieren vermögen, welche ein Fortschreiten des Zellzyklus hinauszögern. In diesem Zeitraum hat die Zelle die Möglichkeit, Schäden an der DNA zu reparieren. Dieser Proliferationsblock wird entweder durch den Tumorsuppressor p53 oder aber auch unabhängig von diesem induziert. Bei dem Tumorsuppressor p53 handelt es sich um ein Protein, welches die Proliferation von Zellen zu verhindern vermag, die genomische Stabilität erhält und somit die Transformation einer Zelle zur Tumorzelle verhindert. Dieses wird erreicht durch einen Proliferationsblock und die Induktion von Apoptose. Durch Mutation von p53 oder aber auch durch Mutationen in Rb-abhängigen Signalwegen verliert der G 1 - Kontrollpunkt seine Funktion. Die Zelle reichert immer mehr genomische Schäden an und gelangt unkontrolliert in die S-Phase. Auch Mutationen, die den G 2 M- Kontrollpunkt kompromittieren, wirken positiv auf die Krebsentstehung. Denn auch die Krebszelle benötigt einen intakten G 2 M-Kontrollpunkt, um ihr Genom zu stabilisieren. Der G 2 M-Kontrollpunkt sendet im intakten Zustand Signale aus, die bei DNA-Schäden zum Wachstumstopp, zur Induktion von DNA-Reparaturprogrammen und zur Apoptose führen. Somit nimmt p53 eine wichtige Wächterfunktion bei der Entwicklung von Tumoren ein. 22

23 An den Kontrollpunkten werden die Schäden an der DNA registriert und Stresskinasen (ATM, ATR, Chk1, Chk2) aktiviert, welche CDKs phosphorylieren. Diese Phosphorylierung bewirkt, dass die Schlüsselproteine ubiquitiniert und durch das Ubiquitin-Proteasom-System der Zelle abgebaut werden. Folglich wird das normale Voranschreiten des Zellzyklus unterbunden. DNA Reparaturprozesse und eventuell die Apoptose werden eingeleitet. Kommt es zu Schäden an der DNA oder zu einem Replikationsblock, so werden durch die Checkpointkinasen 1 und 2 (Chk1, Chk2) die Kontrollpunkte aktiviert und die Proliferation der Zellen mit geschädigter DNA verhindert. Angriffspunkt der Checkpointkinasen sind die Proteinphosphatasen vom Typ Cdc25 (A-C), welche entscheidend für die Aktivierung der CDKs 1 und 2 sind. Dabei wird die Konzentration von Cdc25A durch das Ubiquitin-Proteasom-System bestimmt. Zwischen Ende der Mitose und während der G 1 -Phase übernimmt APC/C den Abbau von Cdc25A. SCF ist für dessen Abbau nach vorangegangener Schädigung der DNA verantwortlich und wird induziert. Aber auch andere Schlüsselproteine des Zellzyklus werden durch SCF abgebaut wie z.b. Cyklin E, c-jun, c-myc, p21, p27, β-catenin und Notch. Des Weiteren phosphoryliert Chk1 Cul1 und aktiviert somit den SCF-Komplex. Kommt es zu Störungen des Abbaus von Proteinen, die den Zellzyklus regulieren, so wird auch die Proliferation der Zelle gestört, und Tumorzellen können entstehen. In Zellen von malignen Tumoren konnte man Veränderungen der Ubiquitin-Ligasen, besonders von SCF, feststellen [26, 70, 71] MIF und die molekularen Mechanismen der Tumorentstehung Die Hypothese, wie MIF die Tumorentstehung beeinflusst, geht davon aus, dass MIF die zellulären Mechanismen, die die Reparatur von geschädigter DNA übernehmen und die Proliferation des Zellzyklus beeinflussen, indirekt zu regulieren vermag. Des Weiteren wird die Akkumulation von onkogenen Mutationen gefördert. Die verstärkte Bildung von MIF während chronischer Entzündungsreaktionen verringert möglicherweise die p53-abhängigen Effekte, die durch Schäden an der DNA verursacht sind, und fördert somit das Anhäufen von Mutationen. In MIF-defizienten Zellen fand man zudem Veränderungen von wichtigen Proteinen des Zellzyklus wie Rb, E2Fs, DP1, Cyklin A2, p16, p21 und p27 und deren ordnungsgemäßen Abbau [26, 71, 75]. 23

24 Erste molekulare Erkenntnisse auf Zellebene, wie MIF das Wachstum von Zellen beeinflusst, stammen aus Experimenten mit Fibroblasten. Die durch Wachstumsfaktoren stimulierte schnelle Ausschüttung von endogenem MIF sowie exogen zugeführtes MIF sind in der Lage, die Proliferation von ruhenden Fibroblasten dosisabhängig zu induzieren. Dabei initiiert MIF autokrin die Phosphorylierung und damit Aktivierung der p44/p42 ERK/MAP-Kinasen, die wiederum Elk-1 phosphorylieren und aktivieren. Diese MIF-induzierte Aktivierung der MAP-Kinasen ist länger andauernd (>24h). Des Weiteren zeigte sich, dass diese durch MIF hervorgerufenen Effekte von der Protein-Kinase A abhängig sind. Aus der Aktivierung der MAP-Kinase resultiert auch eine Steigerung der Enzymaktivität der cpla 2 (cytosolische Phospholipase A 2 ), einem Substrat der ERKs. Dies zeigt sich in einer Erhöhung der Produktion von Arachidonsäure. [66] Die Progression des Zellzyklus und die Synthese von DNA sind abhängig von Signalen, die von Integrinen und von Wachstumsfaktoren ausgehen. Die dadurch initiierte prolongierte Aktivierung der MAP-Kinase hat eine erhöhte Expression von Cyklin D1, eine verstärkte Phosphorylierung und damit Inaktivierung von Rb sowie Freisetzung von E2F und letztendlich eine Progression der G 1 /S-Phase zur Folge. In Experimenten zeigte sich, dass Fibroblasten, die Kontakt zu extrazellulärer Matrix bekommen, MIF freisetzen. Die autokrine Stimulation der Fibroblasten durch MIF trägt zur Integrin-vermittelten Phosphorylierung und damit Aktivierung der MAP-Kinase und enzymatischen Aktivität von ERK bei. Ein weiteres Enzym, die Protein-Kinase C (PKC), hat Einfluss auf die durch Zelladhäsion induzierte MIF-Sekretion und prolongierte Aktivierung der MAP-Kinase. Die PKC ist zumindest teilweise nötig, damit es zur Sekretion von MIF und zur Integrin-initiierten prolongierten Aktivierung der MAP-Kinase kommt. In MIFko-Zellen fand man verminderte Cyklin D1 Konzentrationen und eine verminderte Aktivität der CDK4. Es zeigte sich auch eine erhöhte Aktivität des Tumorsuppressors Rb, was sich in einer verringerten, E2Fabhängigen Transkription äußerte [51]. Auf der Suche nach einem Rezeptor, der die durch MIF initiierte Signaltransduktion vermittelt, stieß man auf CD74. CD74 ist der an der Zelloberfläche gelegene Anteil der invarianten (li) Kette des MHC Klasse II Komplexes. MIF bindet an die extrazelluläre Domäne von CD74 und vermittelt so die Phosphorylierung und Aktivierung des 24

25 ERK1/2 MAP-Kinase Signalweges, die Produktion von Prostaglandin E 2 und die Proliferation der Zelle [50]. Es konnte gezeigt werden, dass die Rho-GTPase (RhoA) durch Integrine und Wachstumsfaktoren aktiviert wird. Dieser Schritt ist wichtig für die Modulation der prolongierten Aktivierung der MAP-Kinase, der sich anschließenden Expression von Cyklin D1 und somit der Progression des Zellzyklus. Nachforschungen wurden durchgeführt, die den Einfluss der Rho-GTPase auf die MIF-induzierte Expression von Cyklin D1 offenlegen sollten. Es zeigte sich, dass MIF dosisabhängig in der Lage ist, die Cyklin D1 Produktion in Fibroblasten zu induzieren. MIF induziert die Akkumulation der Rho-GTPase, und dieses geht einher mit der Aktivierung von ERK/MAPK. Der Stimulierung der Rho-GTPase durch MIF folgt die Phosphorylierung der Myosin-Leichtketten-Kinase (MLC). Eine mögliche Kaskade bestehend aus RhoA Rho-Kinase MLC-abhängige Formierung von Aktin Stress-Fasern FAK (focal adhesion kinase)-aktivierung und MEK1 ist die Voraussetzung für die durch MIF induzierte Aktivität der MAPK und die darauf folgende Expression von Cyklin D1 [95]. Die weitere Untersuchung des Einflusses von MIF auf den ERK MAPK Signalweg offenbarte, dass die durch MIF in Verbindung mit CD74 herbeigeführte prolongierte Aktivierung von ERK1/2, dosisabhängig ist. Hohe Konzentrationen von MIF verhinderten die Aktivierung von ERK1/2. Dabei wirkt MIF autokrin und wird durch Endozytose in das Zytosol der Zelle aufgenommen. Die kurze Stimulation der Fibroblasten mit MIF führt zur transienten und schnellen Aktivierung des ERK1/2 MAPK Signalweges, was sich sowohl in der Phosphorylierung und Aktivierung der ERK als auch durch die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors Elk-1 und Aktivierung der vorgeschalteten Kinase MEK1/2 äußert. Diese transiente Aktivierung des ERK1/2 MAPK Signalweges ist jedoch nicht durch autokrine Sekretion von MIF bedingt. Entdeckt wurde auch, dass ein vorgeschalteter Regulationsmechanismus, eine Src-Tyrosin-Kinase, in den ERK1/2 MAPK Signalweg eingreift. Um den Einfluss von Jab1 auf den durch MIF stimulierten ERK1/2 MAPK Signalweg weiter zu erforschen, wurden Experimente mit Jab-1 überexprimierenden Zellen gemacht. Zuvor konnte gezeigt werden, dass auch Jab-1 extrazellulär induzierte Signaltransduktion, z.b. durch Integrine stimulierte Signale über den AP-1 Signalweg und auch die Aktivierung von AP-1, reguliert. Die Überexpression von Jab1 führte zu einer Hemmung der 25

26 prolongierten, nicht aber der transienten Aktivierung von ERK1/2. Bei der transienten Aktivierung zeigte sich, dass geringe Mengen von Jab1 für dessen Aktivierung notwendig sind [54]. Die Vermutung, dass neben CD74 ein weiteres Molekül an der Signaltransduktion von MIF beteiligt ist, offenbarte durch weitere Nachforschungen, dass CD44 hierbei eine wichtige Rolle spielt. Dabei bindet MIF nur an CD74, nicht aber an CD44. CD44 ist jedoch für die durch MIF induzierte Phosphorylierung der ERK1/2 erforderlich; somit ist die Interaktion von CD74 und CD44 essentiell. Die Bindung von MIF an CD74 erhöht die Phosphorylierungsrate an Serinresten von CD74 und verändert das Phosphorylierungsmuster von CD44. Diese Effekte werden durch die Proteinkinase A reguliert. Des Weiteren wird durch MIF in CD74 und CD44 exprimierenden Zellen eine Src Tyrosin-Kinase phosphoryliert. Diese Tyrosin-Kinase wurde mit der intrazellulären Domäne von CD44 assoziiert. CD44 ist in der Lage, Nonrezeptor-Tyrosin-Kinasen zu aktivieren. Die durch MIF vermittelte Hemmung der Apoptose geht einher mit einer Reduktion der Phosphorylierung des Serinrestes 15 von p53. Diese Hemmung der Apoptose durch MIF ist wiederum abhängig von CD74 und CD44 [89]. Helicobacter pylori ist ein Bakterium, das eine Gastritis und nachfolgend Magen- sowie Duodenalulcera verursachen kann. Auch ein Einfluss von H. pylori auf die Entstehung des Magenkarzinoms und von MALT-Lymphomen (MALT = mucosa-associated lymphoid tissue) ist bekannt. Dabei besitzt H. pylori als wesentlichen Virulenzfaktor das Protein CagA (cytotoxin-associated gene A product), welches in den epithelialen Zellen des Magens eine Tyrosinphosphatase aktiviert und wahrscheinlich auch ERK1/2 stimuliert. Als Resultat kommt es durch den Einfluss von CagA zu einem Ansteigen der Proliferation von epithelialen Zellen des Magens. Zuvor konnte gezeigt werden, dass H. pylori in der Lage ist, die MIF Produktion in verschiedenen Zellen zu induzieren. Weitere Nachforschungen zeigten, dass die von H. pylori zuvor beobachtete Induktion von MIF in epithelialen Magenzellen abhängig von der Anwesenheit von CagA ist. MIF bindet an seinen Rezeptor CD74, der bei Infektionen mit H. pylori auf epithelialen Zellen des Magens hochreguliert ist. Die durch H. pylori induzierte Ausschüttung von MIF führt, abhängig von CD74 und CagA, zu einem Ansteigen der Proliferation der epithelialen Magenzellen. Die Apoptose in diesen Zellen zeigte sich verringert, was unter anderem am Absinken von aktiver Caspase-3 zu erkennen war. Die durch MIF 26

27 schon zuvor beschriebene Verringerung der Expression und Phosphorylierung von p53 konnte auch an den epithelialen Magenzellen gezeigt werden, so dass man vermuten kann, dass diese Effekte durch H. pylori hervorgerufen wurden. Die Expression von Bcl-2 ist während einer Infektion mit H. pylori hochreguliert. Dies zeigt sich in einer Resistenz gegenüber der Apoptose. Auch hierauf scheint MIF durch Steigerung der Bcl- 2 Expression einen Einfluss zu haben [12]. Da viele Tumoren Mutationen im p53 Gen aufweisen und die Aggressivität eines Tumors mit dem Verlust von p53 korreliert, wurden weitere Proteine gesucht, die die Funktion von p53 beeinflussen können. Durch den Verlust von p53 proliferiert die Zelle trotz DNA-Schäden weiter, was die Akkumulation weiterer DNA-Schäden zur Folge hat. Zudem haben solche Zellen aufgrund einer gestörten Zellalterung eine höhere Lebenserwartung. Man fand heraus, dass MIF einen funktionellen Antagonisten zu p53 darstellt. MIF bindet zwar nicht direkt an p53, ist aber in der Lage seine Transkriptionsaktivität bezüglich Gen-Aktivierung zu verringern und der Zelle somit eine Resistenz gegenüber Apoptose zu verleihen. Die Ergebnisse zeigten, dass der normale Wachstumstopp durch p53 durch die Gabe von MIF aufgehoben werden konnte, so dass die Zellen weiter proliferierten. Die verringerte Transkriptionsaktivität von p53, die durch die Behandlung der Zellen mit MIF festgestellt wurde, äußerte sich in verringerten Konzentrationen der durch p53 beeinflussten Proteine p21, Cyklin G, und MDM2. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass durch die Behandlung der Zellen mit MIF sowie bei der Überexpression von MIF ebenso wie beim Verlust von p53 die Lebensdauer dieser Zellen erhöht ist [43]. Um die Funktion von intrazellulärem MIF zu erforschen und Antworten auf die Frage zu finden, warum Makrophagen eine so große Menge MIF konstitutiv exprimieren, wurden Experimente mit MIF-defizienten Makrophagen durchgeführt. Diese zeigten ein vermindertes Ansprechen auf Lipopolysaccharide (LPS), einen Bestandteil der äußeren Zellmembran Gram-negativer Bakterien, die, wenn sie massiv in die Blutbahn des Menschen gelangen, für die Auslösung des septischen Schocks verantwortlich sind. Das verminderte Ansprechen auf Lipopolysaccharide und Gram-negative Bakterien äußerte sich in einer Verringerung der Produktion von TNF-α und Interleukin-6. In den durch LPS stimulierten MIF-defizienten Makrophagen zeigte sich auch eine Verringerung der DNA-Bindungsaktivität von NF-κB (Nuclear factor-kappa B) und eine verringerte 27

28 Konzentration von TNF-α (Tumor necrosis factor-α) mrna. NF-κB wird durch den TLR4 (Toll-like receptor 4) aktiviert. TLR4 ist Teil eines Rezeptorkomplexes an der Oberfläche von Makrophagen, der aus CD14 und TLR4 besteht und für die Signaltransduktion nach Bindung des LPS an das LPS bindende Protein (LBP) verantwortlich ist. In den MIF-defizienten Makrophagen fand man verringerte Konzentrationen des TLR4-Proteins und der TLR4-mRNA sowie eine verringerte Aktivität des für das Tlr4-Gen verantwortlichen Transkriptionsfaktors PU.1. Diese Ergebnisse erklären die molekularen Grundlagen bezüglich der Unempfindlichkeit MIFdefizienter Mäuse gegenüber dem Endotoxin-Schock und zeigen, dass MIF die Produktion proinflammatorischer Zytokine wie z.b. TNF-α verstärkt und somit die Immunantwort des Wirtes fördert [85]. MIFko-Peritonealmakrophagen aus Mäusen, die Lipopolysacchariden (Endotoxin) ausgesetzt wurden, zeigten eine geringere Fähigkeit zu überleben, als Makrophagen die MIF exprimieren, was auf eine Steigerung der Nitric Oxide (NO)-induzierten Apoptose zurückgeführt wird. Proinflammatorische Zytokine wie TNF-α, IL-1β und PGE 2 wurden durch die MIFko-Makrophagen vermindert gebildet. Exogen zugeführtes MIF unterdrückte wiederum sowohl die durch NO induzierte Apoptose als auch eine Anreicherung von p53 in den Makrophagen. Hier zeigte sich, dass MIF in der Lage ist, die Cyclooxygenase-2 (COX-2) zu induzieren. Die schon zuvor beschriebene Induktion der zytoplasmatischen Phospholipase A 2 führt zur Produktion von Arachidonsäure, dem Substrat der COX-2. Die durch MIF induzierte Verminderung der Akkumulation von p53 wird assoziiert mit der Induktion der COX-2, genauer gesagt mit dem aus der Arachidonsäure gebildeten Prostaglandin E 2. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass MIF die durch Lipopolysaccharide ausgelöste Apoptose der Makrophagen durch Interaktion mit p53 verhindert. Da Kolon-Karzinome verstärkt COX-2 exprimieren und COX-2 durch MIF induziert werden kann, stellt sich die Frage, ob MIF zum Überleben der Kolonkarzinom-Zellen beiträgt. Erste Hinweise auf MIF als bedeutenden Faktor bezüglich Überleben und Proliferation von Kolonkarzinomzellen bestehen bereits [65]. Um den Einfluss von MIF auf die Lebensdauer und Transformationsfähigkeit zu erkunden, wurden Experimente mit MIFko murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs) durchgeführt. C-Myc oder adenovirales E1A in Kombination mit aktiviertem Ras wurden eingesetzt, um primäre Fibroblasten zu malignen Zellen transformieren zu 28

29 lassen. Maligne MIFko-Fibroblasten wuchsen langsamer und bildeten weniger maligne Kolonien, was bedeutet, dass sie stärker gegenüber der malignen Transformation resistent waren. Auf der Suche nach der Ursache des verminderten Zellwachstums und der verminderten Empfindlichkeit gegenüber Ras vermittelter Transformation in MIFko Fibroblasten stieß man auf den Transkriptionsfaktor E2F1, denn die Expression von E2F1 war in MIFko MEFs erhöht. E2F1 ist in der Lage, abhängig oder unabhängig von p53 bei Schäden an der DNA Apoptose zu induzieren. Die Induktion von E2F1 in MIFko-Fibroblasten mit funktionstüchtigem p53 induziert einen G 1 -Wachstumstop und Apoptose. Passend dazu konnten durch die Blockade der Bindung des E2F1- Transkriptionsfaktors an die DNA die Ras-vermittelten Effekte in MIFko-Fibroblasten überwunden werden und lies diese im gleichen Masse wie MIF-Wild Type (wt) MEFs transformieren [75]. Weitere biochemische Analysen wurden an MEFs von MIFwt- und MIFko-Mäusen durchgeführt. MIFwt-MEFs zeigten eine erhöhte Aktivität der ERK-1/2 und eine geringere Expression von Rb, p107 und p130. Diese Proteine wiederum sind in der Lage, E2F-Transkriptionsfaktoren zu regulieren. Der beobachtete Proliferationsblock in MIF-Knockout-Fibroblasten ließ sich auf erhöhte Konzentrationen von p16 und p21 zurückführen. Auch konnte bestätigt werden, dass MIF die Lebensspanne von Zellen durch Verhinderung der Apoptose steigert. In MIF-überexprimierenden Fibroblasten konnte die durch Überexpression von Myc induzierte Apoptose ebenso wie die NOinduzierte Apoptose in Makrophagen reduziert werden. Die MIFko-Zellen weisen eine erhöhte Aktivität von p53 und somit eine Resistenz gegenüber Ras-induzierter Transformation auf. Der Verlust des Tumorsuppressorgens p53 hebt die Effekte der MIF-Defizienz auf [26, 27, 71]. Um den Einfluss des Rb-E2F Signalweges auf MIF weiter zu erforschen, wurden Experimente mit p53ko- und MIF/p53-Doppel-Knockout-Mäusen durchgeführt. Es zeigte sich, dass MIFko-Zellen, abhängig von E2F-Transkriptionsfaktoren, weniger anfällig bezüglich maligner Transformation waren und vermindert Tumoren bildeten. Die Transformationsfähigkeit ist abhängig von der Funktion der C-terminalen Transaktivierungs-/Rb-Bindungsdomäne des E2F4-Transkriptionsfaktors. Aus weiteren Experimenten lässt sich schlussfolgern, dass MIF die durch Rb vermittelte Unterdrückung der DNA-Replikation aufhebt. Diese Effekte sind abhängig von E2F- 29

30 Transkriptionsfaktoren. Auch Veränderungen im DNA-Bindungsverhalten von E2F- Transkriptionsfaktoren an die DNA konnten in MIF-defizienten Zellen beobachtet werden. Insgesamt lässt sich aus Experimenten mittels embryonalen Fibroblasten zusammenfassen, dass MIF die Expression und Aktivität von E2F- Transkriptionsfaktoren reguliert [76]. Im Burkitt-Lymphom Maus-Modell (Eµ-Myc transgenen Mäusen) zeigt sich, dass ein MIF Verlust die Bildung von B-Zell-Lymphomen im Maus-Modell zu verzögern oder gar verhindern vermag. Der Verlust der MIF-Expression verringert die durch E2F-Transkriptionsfaktoren initiierte DNA-Replikation und es wird ein p53-abhängiger Proliferationsblock induziert. Die Progression der Zelle in die S-Phase wird verhindert. Die Mycinduzierten Lymphome, die in MIFko-Mäusen heranwachsen, zeigen im Vergleich zu Lymphomen aus MIFwt-Mäusen eine stärkere nukleäre Expression von p53 und auch eine höhere Apoptoserate. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen ist auch die Konzentrationserhöhung von p21 und den an der Apoptose beteiligten Faktoren Apaf-1 und Caspase-3, da diese durch p53 induziert werden [97]. Um den Einfluss von MIF auf p53 und die Tumorentstehung besser zu verstehen, wurden Experimente mit p53ko-mäusen, welche die Eigenschaft haben, spontan Tumoren zu bilden, und MIF/p53-Doppel-Knockout-Mäusen durchgeführt. In diesen MIF/p53-Doppel-Knockout-Mäusen zeigte sich, dass der G 2 M-Checkpoint defekt war und die Zellen trotz DNA-Schädigung nach der S-Phase weiter in die Mitose eintraten. Dementsprechend kam es nach der Mitose zu einer deutlich erhöhten Apoptoserate, da das Genom der Zellen nicht mehr mit dem Zellüberleben in Einklag stand. Die Inhibierung der MIF-Expression zeigt eine Verschiebung im Tumorspektrum in MIF/p53-Doppel-Knockout-Mäusen im Gegensatz zu den p53ko-mäusen. Dies äußert sich in einer Verringerung von Fibrosarkomen und T-Zell-Lymphomen und in einer Erhöhung der Rate von B-Zell-Lymphomen und Karzinomen. Die Überlebensrate der MIF/p53-Doppel-Knockout-Mäuse ist im Vergleich zu den p53ko-mäusen vermindert. Die B-Zell-Lymphome der Doppel-Knockout-Mäuse beherbergen klonale Gen- Amplifikationen und charakteristische chromosomale Myc-Translokationen, die als Ergebnis erhöhte Konzentrationen von c-myc und n-myc zeigen. 30

31 In MIF/p53-Doppel-Knockout-B-Lymphom-Zellen, die DNA-Schäden aufweisen, ist die proteasomale Degradation von Cdc25 gegenüber den Chk1/Chk2-Kontrollpunkten entkoppelt. Sie weisen im Vergleich zu p53ko-zellen eine höhere Konzentration und auch Aktivität von Cdc25A und somit auch Cdk2 auf. Diese Deregulierung ermöglicht es der Zelle trotz DNA-Schäden weiter zu proliferieren. Erhöhte Konzentrationen von Cdc25A und Cdk2 wurden bereits mit der Bildung menschlicher Tumoren assoziiert. Auch die Konzentration anderer wichtiger Proteine, die den Zellzyklus regulieren wie Cyklin A2, E2F1 und DP1, ist erhöht. Sie werden in der Zelle durch das Proteasom nicht mehr richtig abgebaut. Dies zeigte sich auch in der herabgesetzten Aktivität des Proteasoms. Die Effekte werden durch die fehlende Inhibierung von Jab1 in MIFdefizienten Zellen erklärt. Somit zeigt sich, dass ein großer Teil von Cullin1 des SCF-Komplexes deneddyliert und an Cand1 gebunden und folglich nicht mehr aktiv ist. Die aktivierende Phosphorylierung von Cullin1 durch Chk1 ist stark vermindert. Es deutet vieles darauf hin, dass die Regulierung von Jab1 durch MIF für die Interaktion von Chk1 mit SCF von entscheidender Bedeutung ist. MIF sorgt dafür, dass ein Pool von intaktem SCF vorhanden ist, der mit Chk1 nach einer DNA-Schädigung reagieren kann. Die MIF-defizienten Zellen weisen eine Hochregulation des Transkriptionsfaktors E2F1 auf. E2F1 bindet die DNA unter Mitwirkung des Proteins DP1. Wenn die Zelle von der G 1 -Phase in die S-Phase übergeht, bildet E2F1 normalerweise mit Cdk1-Cyclin A2 einen Komplex, welcher E2F1 gebundenes DP1 phosphoryliert und somit die DNA- Bindungsfähigkeit von E2F1 verringert und sowohl seine als auch die Degradation von DP1 durch SCF einleitet. Diese Degradation findet in den MIF-defizienten Doppel-Knockout-Lymphom-Zellen nicht statt. Es wird vermutet, dass die Persistenz von E2F1 durch seine Transkriptionsaktivität und stärkere Bindung an die DNA die Doppel-Knockout- Lymphom-Zellen trotz DNA-Schäden aufgrund wirkungsloser Checkpoint-Aktivierung weiter proliferieren lässt und sie empfindlicher gegenüber der Apoptose macht. Auch die Persistenz von Chk2 stabilisiert E2F1. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass der G 2 M-Kontrollpunkt und der SCF-Komplex eine funktionelle Einheit bilden, die ein Fortschreiten des Zellzyklus nach Schäden an der DNA verhindert. MIF wiederum spielt indirekt eine Schlüsselrolle in der Regulation von Cdc25A, CDK2/Cyklin A und E2F1/DP1, welche in der Lage sind, eine p53-abhängige antiproliferative Reaktion zu 31

32 induzieren. Der Verlust von MIF verleiht der Zelle genetische Instabilität, da die normale Funktion der DNA-Reparaturmechanismen ohne MIF gestört ist [26, 70, 71]. Abb. 1.5: Der über Jab1 vermittelte Einfluss von MIF auf die Kontrolle des G 2 M-Kontrollpunktes. Modifiziert nach [70]. Für die Interaktion von MIF mit der zentralen DNA-Bindungsdomäne von p53 sind Cystein-Reste verantwortlich (Cys 81, Cys 242, Cys 238 ). Die Bindung von MIF an p53 verhindert die Translokation von p53 aus dem Zytoplasma der Zelle in den Zellkern. MIF stabilisiert den Komplex bestehend aus dem p53 Inhibitor MDM2 und p53 [44]. Die Chronische-Lymphatische-Leukämie vom B-Zell-Typ (B-CLL) wird charakterisiert durch Akkumulation von kleinen reifzelligen Lymphozyten, die eine verminderte Apoptoserate aufzeigen. B-CLL-Lymphozyten zeigen eine deutliche Expression von CD74, dem extrazellulären Bindungspartner von MIF, und die Transkription von MIF ist in B-CLL-Zellen hochreguliert. Es konnte gezeigt werden, dass MIF durch Bindung an CD74 eine Signalkaskade induziert, die die Tumorprogression fördert. Nach Bindung von MIF an CD74 transloziert die intrazelluläre Domäne CD74-ICD in den 32

33 Zellkern und aktiviert dort den Transkriptionsfaktor NF-κB. Dieser ermöglicht der Zelle den Eintritt in die S-Phase mit konsekutiver Synthese der DNA und Zellteilung und führt auch zur verstärkten Bildung und Sekretion von Interleukin-8 (IL-8). Somit wirkt IL-8 vermutlich als Verstärker der von MIF und CD74 ausgelösten Kaskade. IL-8 verlängert das Überleben der B-CLL-Lymphozyten indem es die Transkription des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 initiiert [15]. In weiteren Experimenten mit B-Lymphozyten stellte sich heraus, dass bei einer Aktivierung der Signalkaskade durch MIF, CD74 und CD44 im Komplex wirken. Hierbei sind zwei weitere Kinasen (Syk und Akt) beteiligt [28]. Bei NM23-H1 handelt es sich um einen weiteren intrazellulären Bindungspartner von MIF. Es wurde ursprünglich als Protein beschrieben, das die Metastasierung und Differenzierung eines Tumors unterdrückt. NM23-H1 bindet über seinen Cystein-Rest Cys 145 an den Cystein-Rest Cys 60 von MIF und bildet einen Komplex. Durch die Bildung dieses Komplexes wird sowohl die durch MIF hervorgerufene Unterdrückung des durch p53 hervorgerufenen Stopps des Zellzyklus und der Apoptose als auch die durch MIF induzierte Proliferation von ruhenden Fibroblasten vermindert. NM23-H1 verringert die durch MIF herbeigeführte Stabilität des MDM2-p53-Komplexes. Die Hemmung der Proliferation der Fibroblasten wird durch eine Abnahme der Aktivität des Phosphatidylinositol-3-Kinase/ERK/MAP-Kinase-Signalwegs erreicht. Auch die durch Interaktion von Jab1 mit MIF verminderte Transkriptionsaktivität konnte durch NM23- H1 reduziert werden [45]. Viele Tumoren weisen hypoxische Areale auf. Viele Anzeichen deuten darauf hin, dass Tumorhypoxie mit einem bösartigeren und aggressiveren Tumorphänotyp einhergeht. In Zelllinien von Plattenepithel-Karzinomen, die hypoxischen Bedingungen ausgesetzt waren, fand man u.a. eine deutliche Steigerung der Transkription des mif-gens [48]. Die durch Hypoxie induzierte Steigerung der MIF-Expression ist abhängig von HIF-1α, einer Untereinheit des Hypoxie-induzierten Transkriptionsfaktors-1. Entscheidend ist hierbei die Bindung von HIF-1 an das HRE (hypoxia-responsive-element) in der 5 - flankierenden Region des mif-gens. Die Hypoxie-induzierte MIF-Transkription wird überdies durch den Transkriptionsfaktor CREB gehemmt [8]. In Brustkrebszelllinien (MCF-7) konnte gezeigt werden, dass MIF, abhängig von CD74 und dem CD74/MAPK-Signalweg, die Protein-Expression von HIF-1α und die HIF-1 33

34 abhängige Gen-Expression wie zum Beispiel von vascular-endothelial-growth-factor (VEGF) und Glukose-Transporter 1 (GLUT1) steigert. Dieser Effekt von MIF ist abhängig von p53. Es ist wahrscheinlich, dass MIF unter hypoxischen Bedingungen die Konzentration von HIF-1α erhält, indem es die durch p53 initiierte und durch Ubiquitin gesteuerte Degradation von HIF-1α verhindert [73] Die Bedeutung von MIF in der Pathogenese von Krankheiten Nachdem man bei zahlreichen vor allem entzündlichen Erkrankungen erhöhte Konzentrationen von MIF im Serum, im Plasma und im Gewebe festgestellt hat, lag der Schluss nahe, dass MIF in deren Pathogenese eine Rolle spielen könnte. Bei mehreren entzündlichen Erkrankungen wie Sepsis, rheumatoider Arthritis oder allergischer Dermatitis waren die Serumspiegel von MIF mit der Schwere der Entzündung korreliert. In-vivo-Experimente mit mif-knockout (MIFko)-Mäusen konnten zeigen, dass MIF in der Pathogenese von septischem Schock [10, 11, 16], autoimmuner Colitis [20, 29, 69, 72] und Arthritis [6, 7, 25] eine wichtige Rolle einnimmt [82]. Auch im Gewebe von Tumoren der Prostata [59, 60], des Dickdarms [49, 96], der Brustdrüse [5, 107], des Ovars [2], der Lunge [46, 99, 103], der Harnblase [61, 98], der Haut (Melanom) [63, 90] und in Glioblastomen [56] wurden im Vergleich zu normalem Gewebe höhere Konzentrationen von MIF-RNA und/oder Protein nachgewiesen. Anhand von MIFko-Mäusen konnte bisher gezeigt werden, dass MIF die Bildung von B-Zell-Lymphomen [97], Sarkomen [27, 30], Tumoren des Verdauungstraktes [105] und Harnblasenkarzinomen [98] fördert. Es wurde berichtet, dass MIF mit der Aggressivität und dem Metastasierungspotenzial korreliert [13] Assoziation von MIF mit der Entstehung von Krebserkrankungen beim Menschen Brustkrebs In Tumoren von Brustkrebspatienten fand man eine Überexpression von MIF. Diese Überexpression zeigt sich an den Tumorzellen selbst, an den Stromazellen des Tumors und an Gewebsmakrophagen. Die Höhe der MIF-Konzentrationen in Tumor und Serum der Patienten korrelierte invers mit dem Befall der Lymphknoten. Die Überexpression von MIF zeigte auch eine positive Korrelation mit der Dichte der Tumorgefäße [5]. 34

35 Eine weitere Untersuchung teilte Brustkrebspatienten in zwei Gruppen ein. Die Tumoren der einen Gruppe zeigten eine Überexpression von MIF im Vergleich zu Normalgewebe, die Tumoren der anderen Gruppe zeigten keine Überexpression. Hier zeigte sich, dass die Patienten mit der Überexpression von MIF ein vermindertes krankheitsfreies Überleben aufweisen. Diese Patienten zeigten erhöhte Serum- Konzentrationen von MIF, VEGF und IL-8. Die MIF-Expression korrelierte auch mit der Höhe von VEGF, IL-8 und der Dichte der Tumorgefäße im Tumorgewebe, was die Vermutung aufwirft, dass MIF einen fördernden Einfluss auf die Angiogenese in Tumoren ausübt. Durch Stimulation von Brustkrebszellen mit MIF in vitro konnte nachgewiesen werden, dass diese Zellen dosisabhängig vermehrt VEGF und IL-8 sezernieren [107] Tumoren der Lunge In verschiedenen Zellen der Lunge wird MIF exprimiert, u.a. im Bronchial- und Alveolarepithel, in glatten Gefäßmuskelzellen und in Alveolarmakrophagen. Der Gehalt an MIF-mRNA und MIF-Protein ist in Zellen des Adenokarzinoms der Lunge deutlich höher als im normalen Alveolarepithel. Dabei ist MIF sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern lokalisiert. Hier zeigte sich eine Korrelation bezüglich der MIF-Expression im Zellkern der Adenokarzinom-Zellen und der Überlebenszeit. Die Überlebenszeit war bei den Patienten, deren Krebszellen MIF im Zellkern exprimieren, signifikant länger, als bei Patienten, deren Krebszellen lediglich eine MIF-Expression im Zytoplasma zeigten [46]. Auch in Zellen des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms (NSCLC) konnte eine höhere Anzahl an MIF-mRNA-Kopien und MIF-Protein nachgewiesen werden als in normalem Lungengewebe. Klinisch konnte eine Korrelation zwischen männlichem Geschlecht, starkem Raucherstatus und einer höheren MIF-Expression nachgewiesen werden. In Plattenepithelkarzinomen korreliert eine höhere MIF-Expression mit einer verringerten Überlebenszeit [99]. Die Expression von MIF in Zellen des NSCLC führt zu einer verstärkten Expression von CXC-Chemokinen durch Monozyten, die die Gefäßbildung induzieren [104]. Die Korrelation der MIF-Expression mit der Konzentration der CXC-Chemokine konnte des weiteren mit der Dichte und Anzahl von Gefäßen in nicht kleinzelligen Bronchialkarzinomen in Verbindung gebracht werden. Dabei zeigen Tumoren mit 35

36 erhöhten Konzentrationen von MIF, CXC-Chemokinen und vascular-endothelialgrowth-factor (VEGF) eine stärkere Neigung zur Bildung von Rezidiven [103] Hepatozelluläres Karzinom (HCC) Bei Patienten mit Leberzirrhose und bei Patienten mit HCC konnte man im Vergleich zu einem Normalkollektiv erhöhte Konzentrationen von MIF im Serum nachweisen. An Leberbiopsien von Patienten mit Leberzirrhose konnte man schon vor der malignen Transformation zum HCC eine erhöhte Expression von MIF nachweisen. Diese erhöhte Expression zeigt sich auch bei Patienten mit nachgewiesenem HCC [3]. Weitere Untersuchungen bestätigten, dass sowohl die Expression von MIF-mRNA als auch von MIF-Protein in Zellen des HCC im Vergleich zu normalem Lebergewebe erhöht ist. Auch hier fand sich eine positive Korrelation von MIF und IL-8 im Serum von HCC-Patienten. In vitro sezernieren HCC-Zellen große Mengen von MIF, was die Invasion und Migration der Tumorzellen verstärkt. MIF induziert dosisabhängig die angiogenetischen Faktoren VEGF und IL-8 in HCC-Zelllinien. Die Ergebnisse sprechen für eine entscheidende Rolle von MIF für die Angiogenese und Metastasierung in der Pathogenese des HCC [81] Malignes Melanom Sowohl Melanozyten als auch Zellen des Malignen Melanoms exprimieren MIF. Dabei ist die Expression von MIF-mRNA und MIF-Protein in Melanomzellen deutlich ausgeprägter als in den Melanozyten. Die Untersuchungen zeigten, dass MIF für das Wachstum und für die Migration von Melanomzellen wichtig ist. Des weiteren wurden Versuche mit einem MIF neutralisierenden Antikörper durchgeführt. Durch die Applikation dieses Antikörpers in Tumoren von Mäusen konnte die tumorinduzierte Angiogenese unterdrückt werden [90]. Zellen des malignen Melanoms der Uvea produzieren MIF, und Zellen der Metastasen des Melanoms der Uvea zeigen eine etwa doppelt so hohe Produktion von MIF. Bei den Experimenten zeigte sich, dass MIF die durch Natürliche-Killer-Zellen vermittelte Lyse der Melanomzellen zu verhindern vermag, was einen spezifischen Escape- Mechanismus des Tumors darstellt [83]. An 126 Hautveränderungen bestehend aus benignen und atypischen Naevi, Malignem Melanom und Melanom-Metastasen wurde die Expression von MIF-mRNA gemessen. Hierbei zeigte sich, dass benigne Naevi signifikant weniger MIF exprimieren als 36

37 atypische Naevi oder Zellen des Primärtumors sowie Metastasen eines Malignen Melanoms [63] Adenokarzinom des Magens In normalem Mukosaepithel ist mit 12% der Anteil MIF exprimierender Zellen gering. Er steigt an bei Patienten mit Helicobacter pylori induzierter Gastritis, intestinaler Metaplasie und bis auf 96% bei Patienten mit einem Adenokarzinom des Magens. Die MIF-Serum-Konzentrationen verhalten sich entsprechend der MIF-Expression im Gewebe, und es zeigt sich eine positive Korrelation. Die Erhöhung der Expression von MIF-mRNA und MIF-Protein in Magenkarzinomzellen im Vergleich zu normalem Magenepithel konnte in vitro nachgewiesen werden [32] Neuroblastom Die Expression von MIF ist in Neuroblastomzellen hochreguliert. Die Expression korreliert mit dem Grad der Tumordifferenzierung. Es zeigte sich, dass MIF die Produktion angiogenetischer Faktoren wie VEGF und IL-8 hervorruft. Auch induziert MIF, abhängig von ERK, die Expression von n-myc mrna und Protein, und es kommt zur Translokation von n-myc aus dem Zytoplasma in den Zellkern. Hier zeigt sich, dass MIF die Progression des Neuroblastoms fördert [80]. In weiteren Untersuchungen an Neuroblastomzelllinien zeigte sich, dass bei einer antisense vermittelten Absenkung der MIF-Produktion das Tumorzellwachstum um ca. 80% verringert war. Diese Beobachtung korrelierte mit einer verminderten Expression von n-myc, Ras, TrkB, C-Met und IL-8 [79] Assoziationen von mif-promotor-polymorphismen mit Krankheiten des Menschen Rheumatoide Arthritis Donn et al. zeigten 2001, dass Patienten mit dem MIF -173*C-Allel ein erhöhtes Risiko besitzen, eine juvenile idiopathische Arthritis zu entwickeln [25]. In der Gegenwart des MIF -173*C-Allels ließen sich bei diesen Patienten sowie bei gesunden Menschen im Vergleich zum MIF -173 G/G-Genotyp erhöhte MIF-Serum-Konzentrationen nachweisen [22]. 37

38 Baugh et al. zeigten 2002, dass der (CATT) 5 -Repeat bei Patienten mit rheumatoider Arthritis mit einem nicht so schweren Krankheitsverlauf assoziiert ist. Das (CATT) 5 - Allel besaß in vitro die niedrigste Promotor-Aktivität, um die Genexpression zu treiben [7]. Patienten, die den MIF-Promotor-Haplotyp bestehend aus (CATT) 7 und MIF - 173*C besitzen, zeigen eine besondere Anfälligkeit, eine entzündliche Polyarthritis und später eine rheumatoide Arthritis zu entwickeln [6]. Derselbe Haplotyp zeigte auch eine Assoziation zu Patienten mit juveniler idiopathischer Polyarthritis (JIA). Hier wurde auch gezeigt, dass in Verbindung mit dem MIF-173*C-Allel bei einer Zunahme der (CATT)-Repeats die Aktivität im MIF-Promotor anstieg. In Verbindung mit dem MIF G/G-Genotyp sank dessen Aktivität [23]. De Benedetti und Meazza et al. zeigten 2002 und 2003, dass bei Patienten mit JIA und MIF -173*C-Allel die Konzentration von MIF in Serum und Synovialflüssigkeit erhöht ist. Es ließ sich bei diesen Patienten vorhersagen, wie lange sie auf die intraartikuläre Injektion mit Triamcinolon ansprechen. Es kam bei Patienten mit MIF -173*C-Allel deutlich schneller zu einem Rückfall als bei Patienten mit dem MIF -173*G-Allel [19] Erythema nodosum Patienten mit Erythema nodosum, die das MIF -173*C-Allel besitzen, haben ein vierfach (Odds Ratio 4.16) erhöhtes Risiko eine Sarkoidose zu entwickeln [4] Progressive systemische Sklerose (Sklerodermie) Erste Untersuchungen ergaben erhöhte Serum-Konzentrationen von MIF bei Patienten mit der diffusen Verlaufsform der Sklerodermie im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen [88]. Hier zeigte sich, dass das Auftreten des MIF -173*C-Allels oder des [C/(CATT) 7 ]- Haplotyps in der Gruppe der Patienten, die eine limitierte Verlaufsform (lssc) der Erkrankung zeigten, geringer war, als in der Gruppe Patienten mit der diffusen Verlaufsform (dssc) oder in einem gesunden Normalkollektiv. Der [C/(CATT) 7 ]- Haplotyp zeigte in Fibroblasten eine verstärkte Produktion von MIF [106] Periodisches hereditäres Fieber 2007 wurde in einer Untersuchung gezeigt, dass Patienten mit periodischem hereditärem Fieber im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe öfter das MIF - 38

39 173*C-Allel aufweisen. Bei allen Patienten, egal welchen MIF-Genotyps, ließen sich höhere MIF-Serum-Konzentrationen messen [84] Atopische Erkrankungen Betrachtet man Patienten mit Atopie, so lässt sich feststellen, dass Patienten mit dem MIF -173*C-Allel und (CATT) 7- Genotyp ein ca. dreieinhalbfach höheres Risiko besitzen, eine Atopie zu entwickeln, als Patienten mit dem MIF -173 G/G- und (CATT) 5 -Genotyp. Hinsichtlich der Polymorphismen zeigte sich keine Assoziation zu Asthma, wohl aber ließ sich eine erhöhte Konzentration von MIF in bronchoalveolärer Lavage, Serum und Sputum von Asthmatikern nachweisen [41] Systemischer Lupus erythematodes (SLE) Patienten, die an einem systemischen Lupus erythematodes leiden, weisen im Vergleich zu Gesunden höhere MIF-Serum-Spiegel auf [67]. Die Auftreten des MIF -173*C- Allels (OR 1.34) sowie des MIF -173C/C-Genotyps (OR 2.58) ist bei Patienten mit SLE häufiger als bei gesunden Kontrollpersonen. Der MIF [C/(CATT) 7 ]-Haplotyp weist ein zweifach erhöhtes Risiko auf, einen SLE zu entwickeln, als die anderen möglichen Haplotypen [86] Prostatakarzinom In Zellen von Gewebe eines metastasierten Adenokarzinoms der Prostata fand man eine erhöhte Expression des mif-gens und eine um 50fach höhere Konzentration von MIFmRNA im Vergleich zu normalem Prostatagewebe [59, 60]. Normale Drüsenzellen der Prostata exprimieren MIF ebenso wie Zellen von Patienten mit benigner Prostatahyperplasie und Zellen von Patienten mit einem fokalen Adenokarzinom der Prostata. Die Expression von MIF in Zellen eines metastasierten Adenokarzinoms der Prostata war um den Faktor drei erhöht [58]. Es fand sich auch eine Korrelation zwischen der Differenzierung der Krebszellen und der Expression von MIF. Dabei zeigten Zellen gut differenzierter Low-Grade-Adenokarzinome (Gleason Score 6) eine höhere Expression von MIF als schlecht differenzierte Zellen von High-Grade- Adenokarzinomen (Gleason Score 7) [21]. Patienten mit einem Prostatakarzinom weisen höhere MIF-Serum-Konzentrationen auf als gesunde Probanden [60]. Die MIF- Serum-Konzentrationen waren bei Patienten mit einem Gleason Score 5 im Vergleich zu Patienten mit einem geringeren Gleason Score erhöht [57]. Patienten mit einem 39

40 Prostatakarzinom besitzen im Vergleich zu einer Kontrollgruppe öfter das MIF -173*C- Allel (G/C oder C/C) sowie das (CATT) 7 -Allel. Beim Auftreten beider Allele in Kombination [C/(CATT) 7 ] zeigte sich das höchste Risiko (Odds Ratio 59), ein Prostatakarzinom zu entwickeln. Das MIF -173*C Allel zeigte auch eine Assoziation zu High-Grade-Tumoren (Gleason Score 7). Die Rezidivquote war bei Patienten mit dem (CATT) 7 -Allel nach 5 Jahren am höchsten [62] Fazit Diese Untersuchungen zeigen insgesamt, dass MIF eine wichtige Funktion im Überleben von Zellen und in der Bildung von Tumoren einnimmt. 1.3 Die chronische myeloische Leukämie (CML) Die chronische myeloische Leukämie (CML) gehört zu den chronischen myeloproliferativen Erkrankungen. Es handelt sich um eine Neoplasie, die ca. 20% aller Leukämiefälle ausmacht. In Deutschland erkranken jedes Jahr ca Personen an einer CML, somit liegt die Inzidenz bei 2/ Einwohner/Jahr. Alle Altersstufen sind bei der CML betroffen, einen Erkrankungsgipfel gibt es zwischen Jahren [77] Pathogenese - Molekularbiologie: Am Anfang der Erkrankung steht die maligne Transformation der pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle. Als Ursache werden neben spontan auftretenden Störungen bei der DNA-Replikation und Distribution im Rahmen der zellulären Mitose auch mutagene Chemikalien und ionisierende Strahlen vermutet. Zytogenetisch zeigt sich bei 90 % der Patienten mit CML das Philadelphia-Chromosom (22q-), ein in % der Knochenmarksmetaphasen verkürztes Chromosom 22, welches einen Teil des kurzen Arms (q) verloren hat. Man findet es überwiegend in Zellen des hämatopoetischen Systems und in den Endothelzellen der Gefäße. Dieses genomische Material ist aber nicht verloren gegangen, sondern hat sich in 95 % der Fälle im Rahmen der zellulären Reparaturvorgänge durch eine Translokation an den langen Arm des Chromosoms 9 angeheftet. Insgesamt entsteht somit eine reziproke Translokation der distalen Bereiche der langen Arme der Chromosomen 9 und 22, t(9;22) (q34.1;q11.21). Dabei lagern sich die Gene bcr (breakpoint cluster region) und abl (Abelson Kinase) zum pathogenetisch wichtigen chimären bcr-abl Fusionsgen auf 40

41 Chromosom 22 zusammen. Hierbei fusioniert die 3 Region des abl- Gens mit der 5 Region des bcr-gens. Zusätzlich entsteht ein verlängertes Chromosom 9 (9+), welches das reziproke abl-bcr Hybridgen enthält. In diesem Bereich sind bei 20 % der Patienten größere Deletionen nachzuweisen, die mit einer schlechteren Prognose im Krankheitsverlauf einhergehen. Bei 5 % der Patienten mit Philadelphia Chromosom vermutet man eine variante Translokation, bei der ein anderes Chromosom involviert ist. Des Weiteren geht man von anderen komplexen Translokationen aus, bei denen jedoch immer das Chromosom 9 (Bande q34 = abl-onkogen) mit der Bildung eines Fusionsgens beteiligt ist. Das bcr-gen befindet sich auf Chromosom 22. Hier liegt der Bruchpunkt bei den meisten Patienten mit CML in einer 5,8 kb (Kilo Basen) großen Region, der sogenannten major-breakpoint-cluster-region (M-bcr). Betroffen sind hierbei die Exons des bcr-gens. Weitere Bruchpunkte liegen zwischen den Exons 19 und 20, die sogenannte micro-breakpoint-cluster-region (µ-bcr), und im Intron zwischen den Exons e1 und e2, die sogenannte minor breakpoint cluster region (m-bcr 22q11). Das abl-protoonkogen ist ca. 230 kb groß und ursprünglich auf Chromosom 9 lokalisiert. Das p145 abl -Protein ist eine konstitutiv inaktive nukleäre Nonrezeptor- Tyrosinkinase. Sie besitzt verschiedene Domänen, zum einen eine Kinasedomäne, eine DNS-Bindungsdomäne, eine Aktinbindungsstelle, ein nukleäres Lokalisationssignal, sowie mehrere Protein-Protein-Interaktionsdomänen (SH2/SH3). Diese sind für die Regulation der Aktivität der Kinase sowie für dessen Substratspezifität verantwortlich. Der Bruchpunkt im abl-gen liegt zwischen den Exons Ib und Ia und zwischen den Exons Ia und a2. Der Promotor des bcr-gens bleibt intakt, und somit entsteht durch Transkription die 8,5 kb bcr-abl-mrna und dann nach Translation der mrna das Bcr-Abl Fusionsprotein. Je nach Bruchpunkt im bcr-gen entstehen verschieden große Fusionsproteine. Zu 98 % entsteht aus den Transkripten b2a2 oder b3a2 des M-bcr das Fusionsprotein p210 bcr-abl mit einem Molekulargewicht von 210 kda (Kilo Dalton). Aus dem Transkript e1a1 des m-bcr entsteht das p190 bcr-abl -Protein mit einem Molekulargewicht von 190 kda. Das Transkript e19a2 des µ-bcr ergibt das Protein p230 bcr-abl mit einem Molekulargewicht von 230kDa. Selten entstehen noch weitere Transkripte. Bei etwa 70 % der Patienten lässt sich aus dem abl-bcr-fusionsgen auch ein Transkript nachweisen, nicht jedoch ein Fusionsprotein. Bei Patienten mit einer Deletion am Chromosom 9 fehlt die Expression des abl-bcr-transkriptes. 41

42 Im Gegensatz zur Abelson-Kinase, die primär nukleär lokalisiert ist, befindet sich das Bcr-Abl-Protein überwiegend im Zytoplasma der Zelle. Es handelt sich auch hierbei um eine Tyrosinkinase. Ein großer Anteil des Bcr-Proteins, die F-Aktinbindungsdomäne und eine Serin-Threonin-Kinase-Domäne, sind an das N-terminale Ende des Abl- Proteins gebunden. Die konstitutive Aktivierung der Bcr-Abl-Tyrosinkinase ist wahrscheinlich auf die Interaktion des Bcr-Anteils mit der negativ regulatorischen SH3- Domäne des Abl-Proteins, zurückzuführen. Dabei weisen die verschiedenen Proteine eine unterschiedliche Tyrosinphosphokinaseaktivität auf. Die Proteine p190 bcr-abl und p210 bcr-abl besitzen eine höhere Tyrosinphosphokinaseaktivität als die ursprüngliche Abl-Kinase (p145 abl). Die Bcr-Abl-Tyrosinkinase bindet und phosphoryliert Adapterproteine (CRKL, CBL, GRB-2, SHC). Sie stellen das Bindeglied zwischen der Bcr-Abl-Tyrosinkinase und den intrazellulären Signalwegen dar. Es resultiert eine konstitutive Aktivierung von intrazellulären Signalübertragungswegen wie Ras, JAK-STAT, FAK und Phosphatidylinositol-3-Kinase-Signal-Übertragungsweg. Diese sind für die vermehrte Proliferation und Ausdifferenzierung der myeloischen (myeloische Hyperplasie), aber auch thrombozytären, erythrozytären und lymphatischen Zellreihe verantwortlich. Zusätzlich kommt es durch die Aktivierung der Signalkaskaden zur Resistenz gegenüber Apoptose-Stimuli und zu genetischer Instabilität mit konsekutiver Anhäufung genetischer Aberrationen und daraus resultierender klonaler Evolution. Durch weitere molekulare Aberrationen im Verlauf der Erkrankung kommt es zu verschiedenen Krankheitsstadien und letztendlich zur Transformation der CML in eine akute Leukämie. Die myeloischen Zellen besitzen während der chronischen Phase noch ihre normale Differenzierungskapazität. Diese geht während der Akzelerationsphase verloren, und in der Blastenkrise ähneln die Zellen morphologisch unreifen Blasten wie bei einer akuten Leukämie. Bei % der Patienten in der Akzelerationsphase und in der Blastenkrise sind zytogenetische und molekulare Alterationen nachweisbar. Sie führen zum Teil zur Aneuploidie. Wichtig hierbei sind die Trisomie 8, die Trisomie 19 und das Auftreten eines zweiten Philadelphia-Chromosoms. Während des Übergangs von der Akzelerationsphase zur Blastenkrise kommt es zu Aberrationen in Genen, die den Zellzyklus beeinflussen. Betroffen sind rb1, p16, p15. Die Mutation von ras ist selten % der Patienten weisen in der myeloischen Blastenkrise Mutationen, Deletionen und Rearrangements des Tumorsuppressorgens p53 sowie ein Isochromosom 17 auf. Bei Patienten mit lymphatischer Blastenkrise dominieren 42

43 Mutationen im rb1 Gen sowie homozygote Deletionen von p16. Das Ansteigen der Expression von bcr-abl-transkripten und die Methylierung des abl-promotors sind weitere wichtige Veränderungen im Progress der Erkrankung. Auch bei gesunden Menschen konnten bcr-abl positive Zellen nachgewiesen werden. Mit steigendem Alter nimmt die Zahl der bcr-abl positiven Zellen zu. Es konnte jedoch nicht gezeigt werden, dass bei diesen Menschen, die Wahrscheinlichkeit, an CML zu erkranken, erhöht ist [38, 39, 77, 87]. Der CDK Inhibitor p27 Kip1 reguliert den Zellzyklus am G 1 -Kontrollpunkt in dem er einen Wachstumsstopp induziert. Es zeigte sich, dass eine verminderte Konzentration von p27 Kip1 mit der Aggressivität und schlechterer Prognose eines Tumors korreliert. Diese Herabregulierung von p27 Kip1 ist das Resultat der durch Skp2 vermittelten (SCF- Ubiquitin-Ligase) proteasomalen Degradation. Bcr-Abl vermindert die Konzentration von p27 Kip1 und fördert somit das Wachstum der Tumorzellen. Bcr-Abl induziert den Ras/MAPK und den PI3K/Akt Signalweg und bewirkt somit die Bildung des kleinen (100kDa) Jab1/CSN-Komplexes. Jab1 wiederum fördert die Degradation, indem es p27 Kip1 aus dem Zellkern in das Zytoplasma transportiert [100]. Bcr-Abl verursacht auch eine Steigerung der Skp2-Expression. Bei Skp2 handelt es sich um ein F-box-Protein. Es ist Teil des SCF-Komplexes (E3-Ubiquitin-Ligase). SCF Skp2 ist für die Ubiquitinierung und proteasomale Degradation des CDK-Inhibitors p27 Kip1 verantwortlich. Dadurch kommt es zur Progression des Zellzyklus und somit fördert Bcr-Abl die Progression leukämischer Zellen [1] Verlauf der Erkrankung in Stadien Die Erkrankung verläuft in drei Stadien. 1) Chronische Phase Der chronischen Phase kann eine asymptomatische Phase vorangehen, bei der lediglich das Philadelphia-Chromosom nachweisbar ist. Die meisten Patienten werden jedoch in der chronischen Phase diagnostiziert. Sie verläuft relativ stabil, ist therapeutisch gut zu kontrollieren und ist oft symptomarm. Häufig klagen die Patienten über unspezifische Symptome wie Leistungsabfall, rasche Ermüdbarkeit, ein allgemeines Krankheitsgefühl und Nachtschweiß. Durch die bei den meisten Patienten auftretende Splenomegalie (75 %) sowie Hepatomegalie (50 %) kommt es zu Oberbauchbeschwerden mit Völlegefühl, evtl. Schmerzen, deren Ursache aber auch ein Milzinfarkt sein kann. Ein ungewollter 43

44 Gewichtsverlust ist oftmals die Folge. Bei 7 % besteht initial ein extramedullärer Befall mit Infiltration von Haut und Lymphknoten. Thromboembolische Komplikationen, eine Blutungsneigung sowie Thrombozyten-Funktionsstörungen sind selten. Im peripheren Blut findet sich eine mäßige bis starke Leukozytose. Das Differentialblutbild wird durch das Auftreten unreifer Vorstufen der Granulozytopoese als buntes Bild oder pathologische Linksverschiebung charakterisiert. Es finden sich alle Reifungsstufen der Granulozytopoese bis hin zum Myeloblasten, welche gemäß der Definition der chronischen Phase weniger als 10 % der Zellen im peripheren Blut ausmachen. Myelo- und Granulozyten dominieren das Bild. Grund hierfür ist die Proliferation der granulopoetischen Vorläuferzelle mit erhaltender kontinuierlicher Ausreifung. Charakteristisch sind zudem eine Basophilie und Eosinophilie und eine relative Monozytopenie. Initial besteht durch die Mitbeteiligung der Megakaryozytopoese bei ca % der Patienten eine Thrombozytose. Eine normochrome normozytäre Anämie ist häufig bei Patienten mit unbehandelter CML, sehr selten ist eine Erythrozytose. Der Alkalische-Leukozyten-Phosphatase-Index ist erniedrigt (<10), sofern keine zusätzliche Infektion oder Schwangerschaft vorliegt. Das Knochenmark zeigt sich hyperzellulär durch eine Steigerung der Myelo- und Megakaryozytopoese. Es können dysplastische Zellformen vorkommen. Charakteristisch in Knochenmark und Milz sind sogenannte Pseudo-Gaucher-Zellen, die Glykolipide speichern. Das Verhältnis der myeloischen zu erythrozytären Zellen ist auf 25:1 erhöht (normal 2:1 bis 5:1). Das Fettmark ist nahezu vollständig durch blutbildendes Knochenmark ersetzt worden. Zu Beginn der Erkrankung ist der Gehalt an retikulären Fasern im Knochenmark selten erhöht, in späteren Phasen der Erkrankung wird dies häufiger gefunden. Eine Fibrosierung des Knochenmarks ist prognostisch ungünstig. Abhängig von Philadelphia-Chromosom-Status, Prognoseprofil und Therapie beträgt die mediane Dauer der chronischen Phase 4-5 Jahre, teilweise auch bis zu 10 Jahre oder länger. Die chronische Phase geht durch zunehmende genetische Instabilität entweder in die Akzelerationsphase oder direkt in die Blastenkrise über. 2) Akzelerationsphase Durch zunehmende genetische Aberrationen (Trisomie 8 oder 19, Isochromosom 17, ein zweites Philadelphia-Chromosom), welche bei ca. 10 % der Patienten auch schon initial bestehen, kann es im Verlauf der Erkrankung zur Akzelerationsphase kommen. 44

45 Erster Hinweis ist oft eine Steigerung des Medikamentenbedarfs. Die Patienten zeigen steigende Leukozytenzahlen mit einem Anteil von % Blasten und Promyelozyten im peripheren Blut und im Knochenmark, eine zunehmende Eosinophilie und Basophilie von mehr als 20 %, eine Thrombozytopenie oder Thrombozytose mit Werten von über 1Mio/µl und eine zunehmende Anämie mit Werten <9 g/dl Hb trotz Therapie (zunehmende Therapieresistenz). Es handelt sich um Anzeichen der langsamen Entwicklung einer Knochenmarksinsuffizienz. Zusätzlich können sich Allgemeinsymptome wie Fieber, Knochenschmerzen, Gewichtsverlust sowie eine progrediente Splenomegalie bemerkbar machen. Auch können extramedulläre leukämische Infiltrate auftreten. Das Knochenmark fibrosiert zunehmend, und es können sich Ansammlungen von Leukämiezellen außerhalb des Knochenmarks, sogenannte Chlorome, entwickeln. Die Akzelerationsphase geht über in die Blastenkrise. 3) Blastenkrise Als Folge eines noch stärkeren Differenzierungsblocks der Zellreihen kommt es in der Blastenkrise zu einem Ansteigen des Anteils von Blasten und Promyelozyten im peripheren Blut und Knochenmark auf über 30 %. In ungefähr 60 % der Fälle handelt es sich um einen myeloischen oder myelomonozytären Blastenschub. In circa 30 % der Fälle kommt es zum B-lymphatischen Blastenschub, wobei lymphozytäre Marker wie TdT (terminale Desoxynucleotidyl-Transferase) oder CD10 (Acute Lymphoblastic Leukemia Antigen) positiv sind. 10 % der Blastenschübe sind entweder megakaryozytär, erythrozytär oder biphasisch. Der Blastenschub imponiert wie eine sekundäre akute Leukämie. Zytologisch und histologisch lassen sich eventuell extramedulläre Infiltrate in Lymphknoten, Haut, Schleimhäuten, Knochen, Nervensystem, Gastrointestinaltrakt, Urogenitaltrakt sowie exo- und endokrinen Drüsen nachweisen. Ohne Therapie beträgt die mediane Überlebenszeit von myeloischen Blastenkrisen circa 3 Monate, die von lymphatischen Blastenkrisen 9 Monate [39, 77, 87] Prognose Die mediane Überlebenszeit von Patienten mit CML liegt bei 4 bis 10 Jahren, wobei auch vereinzelt von Patienten mit einer Überlebenszeit von bis zu 25 Jahren berichtet worden ist. 45

46 Für die Prognoseabschätzung von Patienten mit CML sind verschiedene Prognosescores erarbeitet worden. Die Prognosefaktoren dieser Scores haben Einfluss auf die Dauer der chronischen Phase. Der Sokal-Score berücksichtigt folgende klinische Parameter: - das Alter des Patienten bei Erstdiagnose, - die Größe der Milz, - die Anzahl der Thrombozyten und - die Zahl der Blasten im peripheren Blut. Dabei zeigte sich, dass die Milzgröße, ferner auch die Zahl der Blasten im peripheren Blut den größten Einfluss auf die Prognose haben. Die Patienten werden einer Gruppe hohen, mittleren und niedrigen Risikos zugeteilt. Berechnet wird der Sokal-Score nach folgender Formel: Sokal-Score: EXP( (Alter in Jahren ) (Milzgröße in cm unterhalb des Rippenbogens ) ( Thrombozyten x 109 /l 700 ) (Blasten % - 2.1)) [91] Der Hasford-Score berücksichtigt folgende Parameter: - das Alter des Patienten bei Erstdiagnose (Multiplikator 0 bei Patienten <50 Jahre, 1 bei Patienten >50 Jahre) - die Größe der Milz, - die Anzahl der Thrombozyten (Multiplikator 0 bei Thrombozyten < / µl, sonst 1) - den Anteil der Blasten sowie - die eosinophilen und - die basophilen Granulozyten im peripheren Blut. Hasford-Score: 0,6666 x Alter (Jahre) x Altersmultiplikator + 0,042 x Milzgröße (cm unterhalb des Rippenbogens) + 0,0584 x Blasten (Differentialblutbild %) + eosinophile Granulozyten (Differentialblutbild %) + 0,2039 x basophile Granulozyten (Differentialblutbild %) + 1,0956 x Thrombozyten (Differentialblutbild) x Multiplikator für Thrombozytenwert 46

47 Die Patienten werden danach in Gruppen eingeteilt, in eine Hochrisikogruppe mit einer medianen Überlebenszeit von 42 Monaten, in eine Intermediärrisikogruppe mit einer medianen Überlebenszeit von 65 Monaten und in eine Niedrigrisikogruppe mit einer medianen Überlebenszeit von 98 Monaten [31]. Gratwohl et al haben 1998 einen zusätzlichen Score für das Transplantationsrisiko bei Patienten mit allogener Stammzelltransplantation entwickelt, der hier aber im Detail nicht geschildert werden soll. Wichtig für die Prognose im Verlauf ist generell das Ansprechen auf die Therapie und das Erreichen einer vollständigen Remission. Von Bedeutung ist das hämatologische Ansprechen, welches sich in einer Normalisierung der Blutwerte, der Milzgröße und der durch die CML bedingten Symptome äußert. Das zytogenetische Ansprechen zeigt sich in einer Verringerung der Philadelphia-Chromosom-positiven Knochenmarksmetaphasen. Besonders Patienten mit zytogenetisch kompletter Remission unter Interferon-Therapie haben eine sehr gute Langzeitprognose. Von diesen Patienten leben nach 10 Jahren noch 77 %. Molekulares Ansprechen bedeutet eine Reduktion von bcr-abl m-rna-transkripten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Prognose umso besser ist, je frühzeitiger die Therapie begonnen und je schneller die Tumorlast reduziert wird. Die bcr-abl negative CML hat eine deutlich schlechtere Prognose mit einer medianen Überlebenszeit von 1,5 Jahren [38, 39, 77, 87] Diagnostik Die Diagnostik beinhaltet neben einer gründlichen Anamnese die klinische Untersuchung mit Bestimmung der Milzgröße in cm unterhalb des Rippenbogens sowie die Bestimmung der Lebergröße in cm in der rechten Medioklavikularlinie. Sie kann jedoch auch sonographisch erfolgen. Der Patient wird des Weiteren auf etwaige extramedulläre Manifestationen (Haut, Lymphknoten, Schleimhäute) und Blutungszeichen hin untersucht. Es werden ein komplettes Blutbild/Differentialblutbild mit Ausstrichen angefertigt, der Alkalische-Leukozytenphosphatase-Index ermittelt (heute nur noch von untergeordneter Bedeutung) sowie weitere Laborparameter bestimmt. Wichtig hierbei sind LDH (Lactat-Dehydrogenase) und Harnsäure. Eine Erhöhung dieser Parameter zeigt den gesteigerten Zellumsatz an. Eine Multiplex-PCR 47

48 (Polymerase-Chain-Reaction) auf bcr-abl RNA im peripheren Blut ergänzt die klinischchemischen und hämatologischen Untersuchungen. Anschließend wird eine Knochenmarksbiopsie mit Aspirationszytologie durchgeführt. Die Aspirationszytologie ermöglicht die Chromosomenanalyse mittels FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung), die die pathognomonische bcr-abl-fusion des Philadelphia-Chromosoms und auch andere chromosomale Aberrationen (z.b. Deletion 9q+) nachweist. Das bcr-abl-rearrangement ist aber auch mittels Southern-Blot oder der heute standardmäßig verwendeten Real-Time-PCR nachweisbar. Eine Multiplex- PCR dient dem Nachweis von verschiedenen bcr-abl-transkripten. Der Nachweis des Bcr-Abl-Proteins mittels Western-Blot ist möglich, aber in erster Linie speziellen Fragestellungen vorbehalten. In der Blastenkrise erfolgt die Typisierung der Blasten mittels Zytochemie oder immunzytologisch. Mit der Pappenheim-Färbung werden die Zellen der Aspirationszytologie beurteilt. Eventuell wird eine Eisenfärbung angefertigt. Die Beckenkammbiopsie ermöglicht die Darstellung der Knochenmarksarchitektur, Knochenmarkszellularität und Morphologie der Zellen in Giemsa-Färbung. In speziellen Färbetechniken (z.b. Versilberung nach Gomori) gelingt der Nachweis von retikulären Fasern. Wenn eine allogene Transplantation mit peripher gewonnenen Blutstammzellen erfolgen soll, wird vorher eine Gewebetypisierung durch die HLA-(Human-Leucocyte- Antigen) A-, B-, C-DR-Typisierung des Patienten und seiner Geschwister oder gegebenenfalls von Fremdspendern durchgeführt [39, 77, 87] Differentialdiagnose Grundsätzlich stellt die Diagnose der CML bei einem typischen Erscheinungsbild für den Facharzt keine Probleme. Differentialdiagnostisch kann es allerdings manchmal schwer sein, die CML von anderen myeloproliferativen Syndromen in deren Frühphase sowie von der chronischen myelomonozytären Leukämie (CMML) abzugrenzen. Insbesondere stellt dies ein Problem bei der Philadelphia-Chromosom-negativen atypischen CML dar. Die hyperplastische Frühphase der Osteomyelofibrose (OMF = idiopathische Myelofibrose) und der CML können sich in Symptomatik und Morphologie des Blutausstriches und des Knochenmarksbefundes ähneln. Die OMF zeigt im peripheren Blut jedoch eine deutlich geringere Leukozytose und öfters Normoblasten als 48

49 morphologisches Korrelat der extramedullären Blutbildung. In der Frühphase kann eine ausgeprägte Markfibrose fehlen. Auffallend ist die exzessive Milzvergrößerung im Gegensatz zur CML, welche jedoch auch in der Frühphase der OMF fehlen kann. Hierbei handelt es sich jedoch nicht um sichere Kriterien zur Abgrenzung der OMF von der CML. Der Index der alkalischen-leukozyten-phosphatase ist, im Gegensatz zur OMF, bei der CML erniedrigt. Der Nachweis des Philadelphia-Chromosoms oder der bcr-abl-rekombination beweist die CML. Die Unterschiede von CMML und CML sind noch geringer. Auch die CMML zeigt eine Leukozytose mit Linksverschiebung, jedoch zeigt sich meist eine ausgeprägtere Monozytose, die aber auch bei CML Patienten mit dem p190 bcr-abl -Fusionsprotein zu finden ist. Auch hier beweist der Nachweis des Philadelphia-Chromosoms oder der bcrabl Rekombination die CML. Es ist auch möglich, dass manche Fälle von Philadelphia- Chromosom-negativer CML eigentlich der CMML zuzuordnen wären. Klären lässt sich dies jedoch zumeist erst im Verlauf der Erkrankung. Bei schweren Infektionen oder anderen Tumorerkrankungen kann es zu einer reaktiven Linksverschiebung der Granulozytopoese kommen. Diese leukämoide Reaktion kann einer CML ähneln. Hier würde jedoch das Auftreten von Myeloblasten im peripheren Blutbild eher für das Vorliegen einer CML sprechen [39, 77, 87] Therapie Die Therapie der CML hat sich in den letzten Jahren mit der Einführung der Tyrosinkinase-Inhibitoren stark gewandelt. Nun ist es möglich, gezielt am Pathomechanismus der CML anzugreifen. Es wird möglichst früh nach Diagnosestellung mit der Therapie begonnen, da es Hinweise gibt, dass eine frühzeitige Therapie die Prognose des Patienten verbessert. Das Ansprechen der Therapie wird wie folgt klassifiziert: 1. Hämatologisches Ansprechen: Leukozyten <10/µl, Thrombozyten <450/µl, basophile Granulozyten <5 %, keine unreifen Vorstufen im peripheren Blut, keine tastbar vergrößerte Milz 2. Zytogenetisches Ansprechen: komplett = 0 % Philadelphia-Chromosom positive Zellen, partiell = 1-35 %, minor = %, minimum = % und kein Ansprechen bei mehr als 95 % Philadelphia-Chromosom positive Zellen. 3. Molekulares Ansprechen: komplett = keine bcr-abl Transkripte nachweisbar, major = bcr-abl/abl Quotient <0.1 49

50 Tyrosinkinase-Inhibitoren: Bei Imatinib handelt es sich um den ersten bei der CML zugelassenen Tyrosinkinase- Inhibitor. Er besetzt kompetitiv die ATP-Bindungsstelle von Tyrosinkinasen und hemmt somit die Signaltransduktion. Es handelt sich hierbei nicht nur um die Abl- Tyrosinkinase, sondern auch um die Arg-Kinase (Abelson-related gene), PDGF-R-α, PDGF-R-β und c-kit. Standard ist heutzutage die Therapie mit Imatinib. Initial werden Patienten in der chronischen Phase mit 400mg/d p.o. (per os) behandelt. Unter dieser Therapie erreichen 98 % der Patienten eine hämatologische und 87 % der Patienten eine zytogenetische Remission bei Primärtherapie. Lediglich 4 % zeigen eine frühe Progression unter der Therapie. Auch nach Erreichen der zytogenetischen Remission oder bei fehlendem Nachweis von bcr-abl-transkripten muss die Therapie mit der gleichen Dosis Imatinib fortgesetzt werden. Eine Unterdosierung kann zur Resistenzentwicklung führen. Bei als milde eingestuften Resistenzen gegenüber Imatinib (Mutationen M244V, M351T, F359) kann eine Steigerung der Dosis auf mg/d p.o. das Ansprechen verbessern. Bei Hoch-Resistenz-Mutanten (Mutationen Y253F/H, E255K/V, T315I, H396P/R 43,44 ) wird man die Therapie auf einen anderen Tyrosinkinase-Inhibitor umstellen müssen. Weiterhin schlecht ist das Ansprechen bei Patienten in der Blastenkrise. Ein Therapieversagen mit Imatinib liegt vor, wenn folgende Kriterien zutreffen: 1. keine hämatologische Remission in 3 Monaten 2. inkomplettes hämatologisches Ansprechen nach 6 Monaten 3. kein zytogenetisches Ansprechen nach 6 Monaten 4. nur partielles zytogenetisches Ansprechen nach 12 Monaten 5. kein komplettes zytogenetisches Ansprechen nach 18 Monaten 6. Verlust einer früher vorhandenen kompletten hämatologischen oder zytogenetischen Remission 7. Auftreten von hoch resistenten bcr-abl Mutationen Weitere Tyrosinkinase-Inhibitoren wie Dasatinib oder Nilotinib können auch bei Resistenzen eingesetzt werden. Dasatinib inhibiert nicht nur Abl-, sondern auch Src- Kinasen. Eine Ausnahme bildet die Resistenz T315I, für die es derzeit noch keinen effektiven Inhibitor gibt. 50

51 Interferon Alpha Bevor Imatinib in die Therapie der CML eingeführt wurde, war rekombinantes Interferon-α die Standard-Therapie. Es hat sich bewährt bei Patienten mit niedrigem Risiko und in der frühen chronischen Phase der Erkrankung. Es wird heute aber nur noch selten und nur an zweiter Stelle nach vorangegangener Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren eingesetzt. Im Gegensatz zu Hydroxyurea und Busulfan konnte Interferon-α das Überleben der Patienten verlängern. Es führte in % zu hämatologischen und in 5-15 % zu dauerhaften zytogenetischen Remissionen. Es lassen sich jedoch auch nach zytogenetisch komplettem Ansprechen unter IFN-α bcr-abl Transkripte mittels RT-PCR nachweisen, obwohl sie zuvor von einem höheren Niveau abgesunken sind. In Studien zeigte sich, dass eine Hochdosis-Therapie mit Interferon-α (5MIU/m 2 /d) nicht besser wirkt als eine niedrigere Dosis (15 MIU/Woche). Interferon-α lässt sich mit Cytarabin kombinieren. Es zeigt sich ein gutes zytogenetisches Ansprechen, die Überlebenszeit wird jedoch nicht verlängert. Auch eine Kombination mit Hydroxyurea ist möglich. In Studien zeigte nur pegyliertes Interferon-α 2a ein besseres Ansprechen gegenüber Interferon-α, nicht aber pegyliertes Interferon-α 2b. Die 10-Jahres-Überlebensrate liegt in Studien zwischen %. Hydroxyurea (Hydroxycarbamid) Hydroxycarbamid hemmt die Ribonukleotidreduktase. Die proliferierenden Zellen werden am Übergang der G 1 zur S-Phase des Zellzyklus arretiert. Es kann zur schnellen Reduktion der Leukozytenzahlen eingesetzt werden. Es hat sich gezeigt, dass weder Hydroxycarbamid noch Busulfan das Leben der Patienten verlängern. Beide Medikamente wirken nur symptomatisch. Somit wird es heute auch nur noch bei Therapieversagen der zuvor genannten Medikamente eingesetzt. Busulfan Bei Busulfan handelt es sich um ein Alkylsulfonat aus der Gruppe der Alkylantien. Es wirkt sehr selektiv antineoplastisch auf Zellen des Knochenmarks durch Alkylierung der DNA. Es kommt zu DNA-Cross-Links. Busulfan spielt heutzutage nur noch eine Rolle bei Versagen der Therapie mit Hydroxyurea. 51

52 Allogene Stammzelltransplantation Die allogene Stammzelltransplantation wird als Primärtherapie nur noch bei Hochrisiko-Patienten bei vertretbarem Transplantationsrisiko durchgeführt. Bei den Risikofaktoren für die Stammzelltransplantation handelt es sich um: 1. Alter des Patienten bei Erstdiagnose (niedrig: <20; mittel: 20-40; hoch: >40 Jahre) 2. Phase der Erkrankung (niedrig: chronische Phase; hoch: Blastenschub) 3. nichtverwandter Spender 4. weiblicher Spender 5. männlicher Empfänger 6. Zeit von der Diagnose zur Transplantation Aktuelle Daten nach den Richtlinien der Amerikanischen Gesellschaft für Hämatologie zeigen, dass 50 % der allogen transplantierten Patienten noch nach fünf Jahren leben. Daten aus zwei Datenbanken (International Bone Marrow Transplantation Registry, European Group For Blood And Marrow Transplantation), die zwischen 1978 und 1997 gesammelt wurden, zeigten ein Überleben von 50 % 18 Jahre nach Transplantation und von 41 % nach 20 Jahren. Die Rezidivquote nach 21 Jahren betrug 1 % pro Jahr. Das Erreichen einer zytogenetischen Remission mit Imatinib scheint, vor Beginn der Transplantation, die Prognose zu verbessern. Die Gabe von Interferon in einem Zeitraum von <90 Tagen vor der Transplantation verschlechtert hingegen die Prognose. Kommt es während oder nach der Transplantation zum Rezidiv der Erkrankung, so hat sich gezeigt, dass die Infusion von Spender-Lymphozyten einen Vorteil gegenüber der Therapie mit Imatinib oder Interferon hat. Als sekundäre Therapie kommt die allogene Stammzelltransplantation bei Patienten in Betracht, bei denen eine Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren versagt hat [35, 38, 39, 42, 77, 87]. Therapie Monitoring: Das hämatologische Ansprechen sollte alle zwei Wochen überprüft werden, solange noch kein komplettes Ansprechen erreicht wurde. Danach sollte das Ansprechen alle drei Monate überprüft werden. Das zytogenetische Ansprechen sollte, bis zum Erreichen einer kompletten zytogenetischen Remission alle sechs Monate mittels Knochenmarksaspiration überprüft werden, anschließend alle zwölf Monate. Nach dem Erreichen der zytogenetischen Remission sollte die molekulargenetische Remission alle 52

53 drei Monate mittels quantitativer RT-PCR überprüft werden. Mutationsanalysen werden bei nicht oder suboptimalem Ansprechen der Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren oder bei ansteigenden bcr-abl-transkripten durchgeführt [39, 77, 87] Ausblick Die Aufdeckung der molekularen Pathogenese der chronischen myeloischen Leukämie sowie die nachfolgende Entwicklung der Tyrosinkinase-Inhibitoren haben der modernen Krebsforschung einen bedeutsamen Impuls als Modell für zukünftige Krebstherapien gegeben. Es wurde damit exemplarisch klar, dass man bei einem guten Verständnis der die maligne Erkrankung auslösenden Mechanismen auch Möglichkeiten entwickeln kann, diese zu kontrollieren. Die CML-Forschung hat somit eine wichtige Vorreiterrolle in der modernen Krebstherapie eingenommen und vielen Tausenden von Ärzten, Forschern und auch Patienten Mut und Hoffnung gespendet. 1.4 Ziele der Arbeit MIF wurde ursprünglich als inflammatorisches Zytokin beschrieben, das die Migrationsbewegung von Makrophagen hemmt und somit die Makrophagen am Ort der Entzündung hält. In den letzten Jahren stellte sich zunehmend heraus, dass MIF interessante weitere Funktionen besitzt. Neben den immunmodulatorischen Funktionen besitzt MIF auch wachstumsregulierende Funktionen, die unter anderem auch das Wachstum von Tumoren beeinflussen. Ein wichtiger Aspekt ist hierbei, dass MIF die Wirkung von p53 abschwächen und somit die p53-induzierte Apoptose bremsen oder verhindern kann. Das Resultat einer Stimulation durch MIF kann sein, dass der Zellzyklus trotz Akkumulation von genetischen Schäden fortlaufen kann. Es konnte ferner gezeigt werden, dass MIF an der Bildung zahlreicher Krebserkrankungen des Menschen beteiligt ist. Von möglicher humanpathogener Bedeutung könnten dabei auch die Polymorphismen im MIF-Promotor sein, die die Expression von MIF mit beeinflussen. Betrachtet man den MIF -173 G/C-Single-Nukleotid-Promotor- Polymorphismus, so konnte gezeigt werden, dass das MIF -173*C-Allel, welches eine erhöhte MIF-Expression auslöst, sowohl bei entzündlichen Erkrankungen als auch beim Prostatakarzinom mit einem ungünstigerem Krankheitsverlauf einhergeht [6, 13, 24]. Die CML ist eine langsam verlaufende Erkrankung, bei welcher es nach der initial CML-initiierenden Läsion der t(9;22)-translokation im Lauf der Zeit über erhöhte genomische Instabilität zu weiteren genetischen Aberrationen und Schäden im Genom 53

54 kommt, die die charakteristische Abfolge der klinischen Stadien der CML bewirken [39, 77, 87]. Damit ist die CML eine sehr gut geeignete Krankheit, um Faktoren, die genomische Stabilität beeinflussen, zu untersuchen. Aufgrund der beschriebenen Erkenntnisse zur tumorfördenden Wirkung von MIF stelle ich in meiner Promotionsarbeit die Frage, ob das Auftreten der CML mit dem MIF G/C-Polymorphismus assoziiert ist und ob der MIF -173 G/C-Polymorphismus einen Einfluss auf den Krankheitsverlauf bei der CML hat. 54

55 2. Material & Methoden 2.1 Allgemeine Materialien Pipetten: Gilson Pipetman P2 0.2µl - 2µl AL55557 Gilson Pipetman P20 2µl - 20µl AL Gilson Pipetman P100 20µl - 100µl X68622M Gilson Pipetman P200 50µl - 200µl AM66899 Gilson Pipetman P µl µl AK65200 Geräte: Eppendorf PCR Mastercycler epgradient S Eppendorf Centrifuge 5415D VWR Mini-Vortexer Kern Waage Heidolph MR3001K Magnetrührer mit Heizung Siemens Mikrowelle Bio RAD Sub-Cell GT Cell Renner GmbH Elektrophoresis Power Supply LTF Labortechnik Photoprint Modell PP-IP-115SID Dokumentationssystem, FDD, CNTFX/TFX-35M 2.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) Die Polymerasekettenreaktion ermöglicht es, einen bestimmten Nukleinsäure-Bereich zu amplifizieren (vermehren). Ein spezielles Enzym, in diesem Fall die Polymerase von Thermus aquaticus (Taq), welche auch noch bei Temperaturen von ca. 100 C arbeitet, ist für die PCR essentiell. Zwei verschiedene Oligonukleotidprimer, welche den Startpunkt für die Polymerase markieren, binden in die beiden 3 Richtungen des zu amplifizierenden DNA-Fragmentes. Sie sind komplementär gegenüber dem Startpunkt der DNA-Zielsequenz. Dem Reaktionsansatz werden neben der zu amplifizierenden DNA, der Taq-Polymerase und den spezifischen Primern die vier Desoxynukleotidtriphosphate (dntp), (datp), Desoxycytidintriphosphat (dctp), Desoxyguanosintriphosphat (dgtp) und Desoxythymidintriphosphat (dttp) als Basen für den Aufbau des DNA-Stranges hinzugefügt. 55

56 Im ersten Schritt der PCR kommt es durch Erhitzung zur Denaturierung des DNA- Stranges. Der DNA-Doppelstrang, der durch Wasserstoffbrücken zusammen gehalten wird, teilt sich in seine beiden Einzelstränge auf. Die kovalenten Bindungen zwischen den Desoxyribosen und den Phosphatgruppen der Nukleotide der DNA bleiben dabei erhalten. Durch Abkühlung des Reaktionsansatzes können die Primer nun komplementär an ihre Zielsequenz binden (Annealing). Der nun folgende Schritt wird Extension (Verlängerung) genannt. Die DNA- Polymerase verlängert die Primer dabei jeweils in 5 3 Richtung, indem sie die komplementären Nukleotide an das 3 Ende des Primers anhängt. Aus den beiden Einzelsträngen sind nun zwei Doppelstränge entstanden. Durch erneutes Erhitzen werden die Reaktion gestoppt und die entstandenen DNA-Doppelstränge wieder getrennt. Dieser Synthesezyklus aus Denaturierung Annealing Extension wird nun Mal wiederholt, und die Menge identischer Doppelstrangmoleküle steigt exponentiell an, so dass sie letztlich in einem Agarose-Gel visualisiert werden kann [33]. Verwendeter PCR-Ansatz Materialien: - Hot Start Taq DNA Polymerase 5u/µl - Fermentas #EPO602 - Hot Start PCR Buffer (10X) 10mM - Fermentas #EPO602 - Magnesiumchlorid (MgCl 2 ) 25mM - Fermentas #EPO602 - MIF -173 F Primer (10µM): 5 -ACTAAGAAAGACCCGAGGC-3 - MIF -173 R Primer (10µM): 5 -GGGGCACGTTGGTGTTTAC-3 - dntp (10mM): 10µl datp + 10µl dgtp + 10µl dctp + 10µl dttp + 120µl Aqua dest. - Aqua dest. - DNA-Sample 1:5 verdünnt mit TE Puffer Ansatz für eine Probe - 16,5µl Aqua dest. - 1,5µl Magnesiumchlorid (MgCl 2 ) 25mM - 2,5µl Hot Start PCR Buffer (10mM) - 1µl MIF -173 F Primer (10µM)* (180µl Aqua dest. + 20µl Primer) 56

57 - 1µl MIF -173 R Primer (10µM)* (180µl Aqua dest. + 20µl Primer) - 1µl dntp (40mM)* - 0,5µl Hot Start Taq-DNA-Polymerase* - 1µl DNA-Sample *Die verwendeten Materialien werden in der Zeit des Ansatzes auf Eis gelagert. PCR Programm: C 9 min - Initiale Denaturierung/Enzym Aktivierung C 50sec - Denaturierung C 50sec - Annealing C 50sec - Extension C 9min - final Extension 6. 4 C - Ende der PCR Die Schritte 2-4 werden 37 Mal wiederholt. Zusätzlich zu den DNA-Samples läuft zum Ausschluss einer Kontamination eine Negativkontrolle mit. Sie enthält alle Reagenzien des Ansatzes mit Ausnahme der DNA. Die hier verwendete Hot Start Taq Polymerase trägt Hitze-labile Gruppen, die die Aktivität der Polymerase blockieren. Im ersten Schritt wird diese Blockierung aufgehoben und das Enzym aktiviert. Um den Erfolg der PCR zu überprüfen und um eine Kontamination auszuschließen, wird eine PCR-Produkt Gel-Elektrophorese angeschlossen. Dazu wird ein Agarose Gel 1 % angesetzt: 1g Agarose (Biozym, Hess. Oldendorf, Deutschland) 100ml 10X TBE Puffer (108g Tris Base + 55g Borsäure + 40 ml EDTA(0,5M, ph8) auf einen Liter mit Aqua dest. auffüllen). Die Agarose und der TBE-Puffer werden mit einem Magnetrührer vermischt und in der Mikrowelle solange erhitzt, bis die Agarose-Lösung kocht. Unter dem Abzug werden auf dem Magnetrührer vor der Erkaltung anschließend 5µl Ethidiumbromid untergerührt. Nach dem Ausgießen des Gels verfestigt sich das Agarosegel wieder. 10µl des PCR-Produktes werden mit 2µl 6X MassRuler DNA Loading Dye (Fermentas #SM0383) vermischt. 57

58 Die Elektrophoresekammer wird mit TBE-Puffer gefüllt. Das 1%ige Gel wird in einer entsprechenden Vorrichtung in die Elektrophoresekammer gebracht, und die Gel- Taschen werden mit jeweils 12µl des PCR-Produkt-Loading-Puffer-Gemisches beschickt. Als Referenz dienen 5µl MassRuler DNA Ladder Low Range ready-to-use (Fermentas #SM383). Bei einer Spannung von 80 mv läuft das Gel in der Elektrophoresekammer ca. 20 Minuten. Unter UV-Licht werden die Banden sichtbar gemacht und fotografiert. Das durch die PCR amplifizierte Genprodukt zeigt eine Größe von 366bp (base pairs). 2.3 Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP)-Analyse von DNA Bei den Restriktionsenzymen handelt es sich um Endonukleasen, die Prokaryonten zur Spaltung fremder DNA-Moleküle dienen. Sie schneiden bestimmte Basensequenzen von vier, sechs oder acht Nukleotiden Länge einer doppelsträngigen DNA, die sie spezifisch erkennen. Bei diesen spezifischen Basensequenzen handelt es sich oft um palindromische Sequenzen. Dabei entstehen entweder glatte oder kohäsive (überhängende) Enden. Die mittlere Schnittfrequenz einer Restriktionsendonuklease beim Schneiden von DNA ist definiert durch die Länge der geschnittenen Basensequenz (vier, sechs, acht). Beim Restriktionsverdau von DNA macht man sich die mittlere Schnittfrequenz und das spezifische Erkennungsmuster des Restriktionsenzyms zu Nutze. Die Anzahl der spezifischen Erkennungssequenzen einer DNA für das Restriktionsenzym ergibt nach dem Restriktionsverdau eine für die DNA spezifische Anzahl an DNA-Fragmenten. Nukleinsäuren liegen bei physiologischem ph-wert durch ihre negativ geladenen Phosphatgruppen als Anionen vor. Diese Eigenschaft macht man sich bei der Gel- Elektrophorese zu Nutze, indem sie im elektrischen Feld in einem porösen Agarosegel in Richtung Anode wandern. Kleine Fragmente wandern schneller und große Fragmente langsamer durch das Gel. Somit werden die Fragmente ihrer Größe nach getrennt. Um diese Auftrennung sichtbar zu machen, gibt man dem Agarosegel Ethidiumbromid hinzu. Es interkaliert (= schiebt sich ein) sich zwischen die Basenpaare der DNA- Fragmente, verändert diese in ihrer chemischen Struktur jedoch nicht. Unter ultraviolettem Licht fluoresziert Ethidiumbromid. Somit werden die DNA-Fragmente sichtbar gemacht. Im Vergleich mit einem Referenz-DNA-Marker lässt sich die Größe der DNA-Fragmente abschätzen [68]. 58

59 Bei dem hier verwendeten Restriktionsenzym handelt es sich um AluI. Es schneidet: 5 A G C T 3 3 T C G A 5 AluI stammt von Arthrobacter luteus. Verwendeter Restriktionsverdau Ansatz: Materialien: - AluI 10u/µl - Fermentas #ER Buffer Tango 10X - Fermentas #ER Aqua dest. - PCR-Produkt (DNA) Ansatz für eine Probe: - 7,7µl Aqua dest. - 2µl Buffer Tango 10X - 0,5µl AluI Enzym* - 10µl PCR-Produkt *Die verwendeten Materialien werden in der Zeit des Ansatzes auf Eis gelagert. Der verwendete Ansatz inkubiert für 24 Stunden bei 37 C im Wärmeschrank. Nun werden zu den 20µl AluI-Verdau 4µl 6X Orange Loading Dye Solution (Fermentas #SM0613) hinzugegeben. Es folgt anschließend die Auftrennung der DNA-Fragmente im elektrischen Feld. Dazu wird ein Agarose-Gel 3 % angesetzt: 3g Agarose (Biozym, Hess. Oldendorf, Deutschland) 100ml 10X TBE Puffer (108g Tris Base + 55g Borsäure + 40 ml EDTA(0,5M, ph8) auf einen Liter mit Aqua dest. auffüllen). Ein 3%iges Agarose-Gel wird in einer entsprechenden Vorrichtung in die Elektrophoresekammer gebracht, und die Gel-Taschen werden mit jeweils 20µl des AluI-Verdau-Loading-Puffer-Gemisches beschickt. Als Referenz dienen 5µl O RangeRuler 50bp DNA Ladder ready-to-use (Fermentas #SM0613). Bei einer 59

60 Spannung von 140mV läuft das Gel in der Elektrophoresekammer ca. 45 Minuten. Unter UV-Licht werden die Banden sichtbar gemacht und fotografiert. Abb. 2.1: Das zu erwartende Bandenmuster der drei MIF-173 SNP s nach Auftrennung im elektrischen Feld auf Agarose-Gel. 2.4 Patienten-Kollektiv Die Genomische DNA aus dem peripheren Blut von 316 Patienten mit neu diagnostizierter CML in chronischer Phase stammt von Erstlinien-Therapiestudien der Deutschen CML-Studiengruppe. Die Proben waren in TE-Puffer eingefroren und wurden während der Analyse vorübergehend bei +4 C im Kühlschrank gelagert. Die DNA wurde uns freundlicherweise durch Professor Dr. med. Andreas Hochhaus und Dr. med. Sebastian Kreil aus der III. Medizinischen Klinik für Hämatologie und Internistische Onkologie der Universitätsklinik Mannheim zur Verfügung gestellt. Patienten-DNA von folgenden Studien wurde analysiert: CML-I Studie Insgesamt wurde DNA von 12 Patienten der CML-I Studie analysiert. Die CML-I Studie wurde von 1983 bis 1991 durchgeführt. Sie sollte die Frage klären, ob Busulfan, Hydroxyurea oder Interferon-α einen Effekt auf die Dauer der chronischen Phase oder auf das Gesamtüberleben bei Patienten mit CML haben [37]. CML-II Studie DNA von 72 Patienten aus der CML-II Studie wurde analysiert. Die CML-II Studie rekrutierte von Februar 1991 bis Dezember Ausgewählt wurden Patienten in der chronischen Phase, bei denen die CML neu diagnostiziert wurde. Diese Studie sollte 60

61 vergleichen, welche Rolle Hydroxyurea in Kombination mit Interferon-α im Gegensatz zu einer Hydroxyurea-Monotherapie spielt [36]. CML-III Studie Von 227 Patienten der CML-III Studie wurde DNA analysiert. Die CML-III Studie dauerte von 1995 bis 2001 und hatte als primären Endpunkt die Gesamtüberlebenszeiten von Patienten, die in der frühen chronischen Phase eine allogene Knochenmarkstransplantation erhielten, mit der Gesamtüberlebenszeit von Patienten, die in der chronischen Phase nur eine medikamentöse Therapie erhielten, zu vergleichen. Als sekundäres Ziel sollte überprüft werden, ob Patienten mit Interferon-α und Hydroxyurea Therapie, gefolgt von einer Chemotherapie mit Idarubicin und Ara-C, gefolgt von einer Interferon-α Erhaltungstherapie, im Vergleich zur Standardtherapie mit Interferon-α und Hydroxyurea einen Überlebensvorteil haben [34]. Für die CML-Studien I, II und III und die Analyse der Patienten-DNA lag jeweils eine Genehmigung der zuständigen Ethikkomission vor. Kontrollkollektiv Als Kontrollkollektiv zur Bestimmung der -173 G/C SNP Frequenzen stand uns DNA aus einem altersgematchten Normalkollektiv von 154 gesunden Blutspendern zur Verfügung, welches uns von Herrn Privatdozent Dr. med. H. Nückel aus dem Universitäts-klinikum Essen, Zentrum für Innere Medizin, Abteilung für Hämatologie, bereit-gestellt wurde. 2.5 Statistische Auswertungen Die statistische Auswertung erfolgte mit SPSS 15. Chi 2 -Test: Der χ 2 -Test ist ein Signifikanztest und dient dem Vergleich von Häufigkeitsunterschieden zweier oder mehrerer Merkmale mit zwei oder mehreren Ausprägungen. Dabei wird die Unabhängigkeit der Merkmale untersucht. Zunächst wird eine Nullhypothese aufgestellt, die besagt, dass die Ereignisse unabhängig voneinander sind und dass kein Zusammenhang zwischen den Merkmalen besteht. Die Alternativhypothese geht im Umkehrschluss davon aus, dass zwischen den 61

62 Merkmalen eine Abhängigkeit besteht. Der χ 2 -Test vergleicht nun die beobachteten Häufigkeiten mit den nach der Nullhypothese zu erwartenden Häufigkeiten [102]. Log rank-test: Der Log rank-test vergleicht den Verlauf von Überlebenskurven verschiedener Gruppen. Auch hier wird wieder eine Nullhypothese (Zufall) gegen eine Alternativhypothese (Zusammenhang) geprüft. Die Differenz zwischen der beobachteten und der erwarteten Anzahl der Verstorbenen innerhalb einer Gruppe wird für jeden Todeszeitpunkt berechnet, mit Hilfe der Varianz standardisiert und über den gesamten Kurvenverlauf kumuliert [40]. Kaplan-Meier-Schätzer: Es handelt sich hierbei um eine Überlebenszeitanalyse, bei der die Überlebenswahrscheinlichkeit zu einem bestimmten Zeitpunkt geschätzt wird. Allgemein wird die Wahrscheinlichkeit geschätzt, bei der ein bestimmtes Ereignis zwischen einem Anfangs- und Endereignis in einem definierten Zeitraum auftritt [102]. One-way analysis of variance (One-way ANOVA): Bei der einfaktoriellen Varianzanalyse werden Gruppen bezüglich eines Merkmals (einer unabhängigen Variable) verglichen, indem man die Varianzen zwischen den Gruppen zu Varianzen innerhalb der Gruppen ins Verhältnis setzt. Sie gibt an, ob es einen signifikanten Unterschied zwischen den Mittelwerten gibt [101]. Bei allen statistischen Tests wurde ein p-wert < 0.05 als signifikant angesehen. 62

63 3. Ergebnisse 3.1 Das Patientenkollektiv In DNA von 316 Patienten mit neu diagnostizierter CML in der chronischen Phase wurde mittels PCR- und RFLP-Analyse mit AluI-Verdau der Genotyp des -173 MIF- Promotor-SNP s bestimmt. Abb. 3.1: Repräsentatives Ergebnis einer Agarose Gel-Elektrophorese der PCR-Produkte der mif- Promotorregion bei neu diagnostizierten CML-Patienten in der chronischen Phase. Das durch die PCR amplifizierte Genprodukt hat eine Größe von 366 bp. Eine Positivkontrolle (PK) bestätigt die Größe des Genproduktes. Die Negativkontrolle (NK) schließt eine Kontamination aus. Verschiedene Proben zeigen kein PCR-Produkt aufgrund einer noch nicht optimalen Verdünnung der DNA. 63

64 Abb. 3.2: Repräsentatives Ergebnis einer Bestimmung des AluI-Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus der PCR-Amplifikate bei Patienten mit neu diagnostizierter CML in der chronischen Phase. Das Vorliegen der unterschiedlichen Restriktionsbanden lässt den vorliegenden Genotyp des -173 G/C SNP s erkennen. Genotyp G/G zeigt 2 Banden (98 & 268 bp), z.b. Patient Nr und Patient Nr Genotyp C/C zeigt 3 Banden (62, 98 & 206 bp), z.b. Patient Nr und Patient Nr Der Genotyp G/C zeichnet sich durch das kombinierte Vorliegen der 4 Banden (62, 98, 206 & 268 bp) aus, z.b. Patient Nr und Patient Nr Die Negativkontrolle fällt negativ aus. 3.2 Korrelationen der Genotyp- und Allelfrequenzen mit dem Auftreten der CML Aus 310/316 DNA-Proben konnten die -173 MIF-SNP-Genotypen ermittelt werden. Bei 6 DNA-Proben konnte aufgrund mangelnden Materials oder insuffizienter DNA- Qualität kein PCR-Amplifikat erzielt werden. Die Genotypen der 310 Patienten unterteilen sich wie folgt in: 64

65 SNP-Genotyp Anzahl Genotyp-Frequenz C/C 12 3,9% G/C 79 25,5% G/G ,6% Tab. 3.1: Frequenzen des -173 MIF-Promotor-SNP s bei 310 Patienten mit neu diagnostizierter CML in der chronischen Phase. Die Genotyp-Frequenzen wurden auf die erste Dezimalstelle gerundet. Die Allel-Frequenzen wurden wie folgt berechnet: C-Allel: 3,9% + 1/2 x 25,5% = 16,6% G-Allel: 70,6% + 1/2 x 25,5% = 83,4% Essener Kontrollkollektiv: Beim Essener Kontrollkollektiv handelt es sich um ein altersgematchtes Normalkollektiv von 154 gesunden Blutspendern. SNP-Genotyp Anzahl Genotyp-Frequenz C/C 3 1,9% G/C 41 26,6% G/G ,4% Tab. 3.2: Frequenzen des -173 MIF-Promotor-SNP s des Essener Normalkollektivs. Die Genotyp- Frequenzen wurden auf die erste Dezimalstelle gerundet. Die Allel-Frequenzen wurden wie folgt berechnet: C-Allel: 1,9% + 1/2 x 26,6% = 15,3% G-Allel: 71,4% + 1/2 x 26,6% = 84,7% 65

66 Patientenkollektiv Normalkollektiv C/C G/C G/G Abb. 3.3: Relative Häufigkeiten (%) der Genotypen C/C, G/C und G/G des -173 MIF-Promotor-SNP s Die Verteilung zeigt im Chi-Quadrat-Test keinen signifikanten in dem CML und dem Kontrollkollektiv. Unterschied (p = 0,539) Patientenkollektiv Normalkollektiv C-Allel G-Allel Abb. 3.4: Relative Häufigkeiten (%) des G- und des C-Allels des -173 G/C MIF-Promotor-SNP s in dem CML- und dem Kontrollkollektiv. Die Verteilung zeigt im Chi-Quadrat-Test keinen signifikanten Unterschied (p = 0,598). 66

67 CML-Kollektiv Normal-Kollektiv Anzahl 12 3 C/C Genotyp-Frequenz 3,9% 1,9% -173 Anzahl G/C SNP Genotyp-Frequenz 25,5% 26,6% Anzahl G/G Genotyp-Frequenz 70,6% 71,4% Gesamt Anzahl Chi-Quadrat nach Pearson / Asymptomatische Signifikanz 0,539 Tab. 3.3: Gegenübergestellt sind die absoluten und relativen Häufigkeiten der -173 MIF-Promotor-SNP- Genotypen C/C, G/C und G/G für das Patienten- und das Normal-Kollektiv. Der Chi-Quadrat Test zeigt keine signifikante unterschiedliche Verteilung der Genotypen des -173 MIF-Promotor-SNP zwischen dem CML- und dem Kontrollkollektiv an. Betrachtet man das Auftreten der verschiedenen Genotypen, so zeigt sich kein signifikanter Unterschied zwischen dem Kontrollkollektiv und dem CML- Patientenkollektiv. CML-Kollektiv Normal-Kollektiv Allel C- Anzahl Allel Allel-Frequenz 16,6% 15,3% G- Anzahl Allel Allel-Frequenz 83,4% 84,7% Gesamt Anzahl Chi-Quadrat nach Pearson / Asymptomatische Signifikanz 0,598 Tab. 3.4: Absolute und relative Häufigkeiten der G- und C-Allele des -173 MIF-Promotor-SNP s bei dem CML- und dem Kontrollkollektiv. Der Chi-Quadrat-Test zeigt keinen signifikanten Unterschied für die Verteilung der Allele zwischen beiden Kollektiven an. Betrachtet man die absolute und relative Häufigkeit des G- und C-Allels, so zeigt sich ebenfalls kein signifikanter Unterschied zwischen dem Normalkollektiv und dem CML- Patientenkollektiv. Auch wenn das Kontrollkollektiv aufgrund seines eher regionalen Charakters im Raum Essen nicht als optimal für den Vergleich mit dem nationalen Kollektiv der CML- 67

68 Kohorte anzusehen ist, so zeigen unsere Ergebnisse, dass der -173 MIF-Promotor-SNP höchstwahrscheinlich nicht mit dem Auftreten einer CML assoziiert ist. 3.3 Korrelationen der Genotyp- und Allelfrequenzen mit klinischen Parametern Alter bei Erstdiagnose (age_ed) Die Variable Alter bei Erstdiagnose behandelt die Frage, ob Patienten mit einem bestimmten -173 MIF-SNP-Genotyp aufgrund sich früher oder später entwickelnder genomischer Schäden früher oder später an einer CML erkranken. Für die Analyse wurden die Daten von 310 Patienten verwendet. Genotyp Verarbeitete Fälle (n) C/C 12 G/C 79 G/G 219 Gesamt 310 Tab. 3.5: Dargestellt sind die für die statistische Analyse der Variable Alter bei Erstdiagnose ausgewählten Fälle. Genotyp C/C G/C G/G Mittelwert [Jahre] % Konfidenzintervall [Jahre] Median [Jahre] Varianz Standardabweichung Minimum [Jahre] Maximum [Jahre] Interquartilbereich Tab. 3.6: Statistische Analyse der Variable Alter bei Erstdiagnose bezüglich der Genotypen. Die Werte wurden gerundet. 68

69 100,0 80,0 60,0 age_ed 40,0 20,0 23 0,0 C/C G/C SNP G/G Abb. 3.5: Alter bei Erstdiagnose (age_ed) der CML in der chronischen Phase in den Subgruppen des MIF-Promotor-SNP s. Dargestellt sind Median, oberes und unteres Quartil sowie das Maximum und Minimum in Form eines Boxplots. (I)SNP (J)SNP Mittlere Differenz (J-I) Standardfehler Signifikanz 95%-Konfidenzintervall Untergrenze Obergrenze C/C G/C 1,8 4,5 0,684-6,9 10,6 G/G 3,6 4,3 0,397-4,8 12,0 G/C C/C -1,8 4,5 0,684-10,6 6,9 G/G 1,8 1,9 0,341-1,9 5,5 G/G C/C -3,6 4,3 0,397-12,0 4,8 G/C -1,8 1,9 0,341-5,5 1,9 Tab. 3.7: Mehrfachvergleiche der einzelnen Genotypen des -173 MIF-Promotor-SNP s untereinander bezüglich der Variable Alter bei Erstdiagnose. Die Werte wurden gerundet. 69

70 In der One-Way-Varianzanalyse (One-Way ANOVA) zeigte sich kein signifikanter Unterschied bezüglich des Alters bei Erstdiagnose der CML in chronischer Phase und den unterschiedlichen -173 MIF-Promotor-SNP-Genotypen (p = 0,483) Geschlecht Die Variable Geschlecht untersucht, ob es einen Zusammenhang zwischen einem bestimmten -173 MIF-SNP-Genotyp und dem Auftreten der CML bei einem bestimmten Geschlecht gibt. Geschlecht Weiblich N % Männlich N % Gesamt N % SNP C/C Anzahl % von SNP 3 25% 9 75% % G/C Anzahl % von SNP 31 39% 48 61% % G/G Anzahl % von SNP 96 44% % % Gesamt Anzahl % von SNP % % % Chi-Quadrat nach Pearson / Asymptomatische Signifikanz 0,373 Tab. 3.8: Absolute und relative Häufigkeiten der Genotypen des -173 MIF-Promotor-SNP s bezüglich des Geschlechts. Die Prozentwerte wurden auf die erste Dezimalstelle gerundet. Der Chi-Quadrat-Test für die Variable Geschlecht zeigt keine signifikant unterschiedliche Verteilung der SNP-Genotypen an. Die Darstellung nach dem Geschlecht zeigt das bekannte leichte Überwiegen des männlichen Geschlechts in der Inzidenz der CML. Es konnte aber kein signifikanter Zusammenhang bezüglich des Auftretens der CML bei einem bestimmten Geschlecht und einem bestimmten -173 MIF-SNP-Genotypen hergestellt werden. 70

71 3.3.3 Sokal-Score Der Sokal-Score berücksichtigt das Alter des Patienten bei Erstdiagnose, die Größe der Milz, die Anzahl der Thrombozyten und die Zahl der Blasten im peripheren Blut. Die Patienten werden einer Gruppe hohen, mittleren oder niedrigen Risikos zugeteilt. Sokal-Score Niedriges Risiko N % Mittleres Risiko N % Hohes Risiko N % Gesamt N % SNP C/C Anzahl % von SNP 3 25% 6 50% 3 25% % G/C Anzahl % von SNP 30 38% 25 32% 24 30% % G/G Anzahl % von SNP 89 41% 72 33% 57 26% % Gesamt Anzahl % von SNP % % 84 27% % Chi-Quadrat nach Pearson / Asymptomatische Signifikanz 0,688 Tab. 3.9: Absolute und relative Häufigkeiten der Genotypen des -173 MIF-Promotor-SNP s nach dem Sokal-Score. Die Prozentwerte wurden gerundet. Der Chi-Quadrat-Test zeigt keine unterschiedliche Verteilung der -173 MIF-SNP-Genotypen für den Sokal-Score an. In der Analyse zeigt sich kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen einem spezifischen -173 G/C MIF-SNP-Genotyp und der Zuordnung eines Patienten zu einer Sokal-Score-Gruppe Hasford-Score Wegen der unbefriedigenden prognostischen Trennung IFN-behandelter Patienten durch den Sokal-Score wurde im Rahmen einer internationalen Kooperation auf der Basis von 1400 Patienten ein neuer, verbesserter Score entwickelt, der auch auf Patientengruppen anwendbar ist, die mit IFN behandelt wurden. Dieser sogenannte Hasford-Score ermöglicht eine Abschätzung der individuellen Prognose eines Patienten basierend auf 71

72 leicht zu bestimmenden klinischen Parametern (siehe Abschnitt 1.34). Die Hochrisikogruppe hat eine mediane Überlebenszeit von 42 Monaten, die Intermediärrisikogruppe von 65 Monaten und die Niedrigrisikogruppe von 98 Monaten. Bei einem Patienten aus dem CML-Kollektiv fehlte die Angabe des Hasford-Score, so dass die Grundgesamtheit für diese Analyse n = 309 betrug. Hasford-Score Niedrigrisiko N % Intermediärrisiko N % Hochrisiko N % Gesamt N % SNP C/C Anzahl % von SNP 1 8% 11 92% 0 0% % G/C Anzahl % von SNP 28 35% 42 53% 9 12% % G/G Anzahl % von SNP 90 41% % 27 13% % Gesamt Anzahl % von SNP % % 36 12% % Chi-Quadrat nach Pearson / Asymptomatische Signifikanz 0,042 Tab. 3.10: Absolute und relative Häufigkeiten der Genotypen des -173 MIF-Promotor-SNP s bezüglich des Hasford-Scores dar. Die Prozentwerte wurden gerundet. Der Chi-Quadrat-Test zeigt eine signifikante unterschiedliche Verteilung der Genotypen nach dem Hasford-Score an. Die Analyse zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied bezüglich des Hasford- Scores und dem -173 G/C MIF-SNP Genotyp Zeit bis zur Progression Bei der Variable Zeit bis zur Progression wurde zunächst der Zeitraum zwischen Erstdiagnose der CML in chronischer Phase und dem Progress der Erkrankung berechnet. Dabei stellt die Progression das Ende der chronischen Phase der CML dar, in der es zum Fortschreiten der Erkrankung trotz intensivierter Therapie kommt. Zugrunde 72

73 liegen die Kriterien der Akzelerationsphase oder der Blastenkrise [34]. Bei insgesamt 116 Patienten war die Zeit bis zur Progression aus den klinischen Daten ersichtlich. Genotyp Verarbeitete Fälle (n) C/C 3 G/C 29 G/G 84 Gesamt 116 Tab. 3.11: Dargestellt sind die für die statistische Analyse der Variable Zeit bis zur Progression verfügbaren Fälle. Mittelwert (Jahre) Median (Jahre) Standardfehler Schätzer SNP Untere Obere Grenze Grenze 95% - Standardfehler Konfidenzintervall 95% - Schätzer Konfidenzintervall Untere Obere Untere Obere Untere Obere Grenze Grenze Grenze Grenze Grenze Grenze C/C 5,2 1,1 3,1 7,3 6,2 2,5 1,2 11,2 G/C 4,1 0,6 3,0 5,2 3,2 0,7 1,9 4,5 G/G 3,8 0,3 3,2 4,3 3,5 0,4 2,6 4,3 Gesamt 3,9 0,2 3,4 4,4 3,2 0,3 2,6 3,9 One-Way ANOVA zwischen den Gruppen Signifikanz = 0,583 Tab. 3.12: Mittelwerte und Mediane in Jahren für die Zeit von der Erstdiagnose der CML bis zur Progression gemäß den Kriterien der Akzelerationsphase oder Blastenkrise. Die Werte wurden auf die erste Dezimalstelle gerundet. 73

74 Überlebensfunktionen 1,0 SNP C/C G/C G/G 0,8 Kum. Überleben 0,6 0,4 0,2 0,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 ttprogre Abb. 3.6: Ereigniszeitanalyse für die verschiedenen Genotypen des -173 MIF-Promotor-SNP bezüglich der Zeit von der Erstdiagnose bis zur Progression der CML gemäß den Kriterien der Akzelerationsphase oder der Blastenkrise. Das kumulative Überleben angegeben in %, die Zeit bis zur Progression angegeben in Jahren. Chi-Quadrat Signifikanz Log Rank (Mantel Cox) 0,819 0,664 Tab. 3.13: Gesamtvergleiche: Test auf Gleichheit der Überlebensverteilungen für die verschiedenen Stufen des SNP s. 74

75 (I)SNP (J)SNP Mittlere Differenz (J-I) Standardfehler Signifikanz 95%-Konfidenzintervall Untergrenze Obergrenze C/C G/C 1,1 4,5 0,684-6,9 10,6 G/G 3,6 4,3 0,397-4,8 12,0 G/C C/C -1,8 4,5 0,684-10,6 6,9 G/G 1,8 1,9 0,341-1,9 5,5 G/G C/C -3,6 4,3 0,397-12,0 4,8 G/C -1,8 1,9 0,341-5,5 1,9 Tab. 3.14: Mehrfachvergleiche der einzelnen Genotypen untereinander bezüglich der Variable Zeit bis zur Progression. Die Werte wurden gerundet. Nach der Auswertung der Ergebnisse zeigt sich kein signifikanter Unterschied der -173 G/C MIF-SNP-Genotypen bezüglich der Zeit bis zum Progress der Erkrankung. In einer zweiten explorativen Kaplan-Meier-Analyse schlossen wir auch die Patienten ein, bei denen kein Datum für die Progression, aber ein Todesdatum bei Blastenkrise und/oder ein Datum für eine allogene Transplantation bekannt war, da wir davon ausgingen, dass diese Patienten möglicherweise aufgrund eines Progresses transplantiert worden waren. Die Patienten, die an einer Blastenkrise verstorben waren, schlossen wir hier ebenfalls ein, da eine Blastenkrise eine klare Progression der CML darstellt. Ausgeschlossen wurden alle Patienten aus der CML-III Studie, da das Studienprotokoll die Transplantation als first-line -Therapie vorsieht. Auch ausgeschlossen wurden Patienten mit Myelodysplastischem Syndrom. Genotyp Verarbeitete Fälle (n) C/C 4 G/C 35 G/G 95 Gesamt 134 Tab. 3.15: Dargestellt sind die für die statistische Analyse der Variable Zeit bis zur Progression ausgewählten Fälle. 75

76 Mittelwert Median SNP Schätzer 95% - Konfidenzintervall Schätzer Standardfehler Standardfehler 95% - Konfidenzintervall Untere Obere Untere Obere Untere Obere Untere Obere Grenze Grenze Grenze Grenze Grenze Grenze Grenze Grenze C/C 5,0 0,8 3,4 6,5 4,4 1,6 1,3 7,4 G/C 3,9 0,5 2,9 4,8 2,5 0,4 1,6 3,3 G/G 3,7 0,3 3,2 4,2 3,4 0,3 2,7 4,1 Gesamt 3,8 0,2 3,3 4,2 3,2 0,3 2,7 3,7 Tab. 3.16: Mittelwerte und Mediane für die Zeit von der Erstdiagnose der CML in chronischer Phase bis zur Progression inklusive Tod in der Blastenkrise und allogene Knochenmarktransplantation. Die Werte wurden auf die erste Dezimalstelle gerundet. Überlebensfunktionen 1,0 SNP C/C G/C G/G 0,8 Kum. Überleben 0,6 0,4 0,2 0,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 ttprogre Abb. 3.7: Ereigniszeitanalyse für die verschiedenen Genotypen des -173 MIF-Promotor-SNP nach der Zeit bis zur Progression der CML inklusive der Patienten, die eine allogene Knochenmarktransplantation erhielten oder aufgrund einer Blastenkrise verstorben waren. Patienten aus der CML-III Studie wurden ausgeschlossen, da in diesem Protokoll eine allogene Knochenmarktransplantation bereits in chronischer Phase als fester Bestandteil des Therapiekonzeptes vorgesehen war. Das kumulative Überleben angegeben in %, die Zeit bis zur Progression (ttprogre) angegeben in Jahren. 76

77 Chi-Quadrat Signifikanz Log Rank (Mantel Cox) 0,594 0,743 Tab. 3.17: Gesamtvergleiche: Test auf Gleichheit der Überlebensverteilungen für die verschiedenen Stufen des SNP. (I)SNP (J) SNP Mittlere Differenz (J-I) Standardfehler Signifikanz 95%-Konfidenzintervall Untergrenze Obergrenze C/C G/C 1,1 1,4 0,420-1,6 3,8 G/G 1,3 1,3 0,327-1,3 3,9 G/C C/C -1,1 1,4 0,420-3,8 1,6 G/G 0,2 0,5 0,704-0,8 1,2 G/G C/C -1,3 1,3 0,327-3,9 1,3 G/C -0,2 0,5 0,704-1,2 0,8 Tab. 3.18: Mehrfachvergleiche der einzelnen Genotypen untereinander bezüglich der Variable Zeit bis zur Progression. Die Werte wurden gerundet. Auch hier konnten wir keinen signifikanten Unterschied in der Zeitdauer von der Erstdiagnose der CML in chronischer Phase bis zum Auftreten des Progresses zwischen den -173 MIF-SNP-Genotypen G/G, G/C und C/C nachweisen Zeit bis zum ersten krankheitsspezifischen Ereignis Die Variable time to first event beschreibt die Zeit von der Erstdiagnose der CML in chronischer Phase bis zum Auftreten eines krankheitsspezifischen Ereignisses. Dazu zählen der Beginn der Akzelerationsphase, der Eintritt in die Blastenkrise oder der Tod des Patienten. Dafür wurde eine Kaplan-Meier-Analyse durchgeführt. Zensiert wurden alle Patienten, die kein krankheitsspezifisches Ereignis aufwiesen. 77

78 SNP Gesamtzahl Anzahl der Zensiert Ereignisse N Prozent C/C ,0% G/C ,9% G/G ,0% Gesamt ,3% Tab. 3.19: Datengrundlage für die statistische Analyse der Variable Zeit bis zum ersten krankheitsspezifischen Ereignis. Mittelwert 95%-Konfidenzintervall SNP Schätzer Standardfehler Untere Grenze Obere Grenze [Jahre] [Jahre] [Jahre ] C/C 3,9 0,6 2,7 5,0 G/C 4,8 0,4 3,9 5,7 G/G 4,5 0,3 3,9 5,1 Gesamt 4,6 0,2 4,1 5,1 Tab. 3.20: Mittelwerte und Mediane [Jahre] für die Zeit bis zum ersten krankheitsspezifischen Ereignis in Abhängigkeit von den Subgruppen des -173 MIF-Promotor-SNP s. 78

79 Abb. 3.8: Ereigniszeitanalyse für die verschiedenen Genotypen des -173 MIF-Promotor-SNP s bezüglich der Zeit bis zum ersten krankheitsspezifischem Ereignis der CML (Akzeleration, Blastenschub, Tod)- Dargestellt ist auf der X-Achse die Zeit bis zum ersten krankheitsspezifischem Ereignis in Jahren und auf der Y-Achse der relative Anteil der Patienten in chronischer Phase. Chi-Quadrat Signifikanz Log Rank (Mantel Cox) 1,322 0,516 Tab. 3.21: Gesamtvergleiche: Test auf Gleichheit der Überlebensverteilungen für die verschiedenen Stufen des SNP s. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Zeitraum von der Erstdiagnose der CML in chronischer Phase bis zu Auftreten eines ersten krankheitsspezifischen Ereignisses bezüglich der verschiedenen Genotypen. 79