Der Wirkmechanismus des natürlichen Kofaktors Tetrahydrobiopterin als pharmakologisches Chaperon bei der Behandlung der Phenylketonurie

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1 Aus der Kinderklinik und Kinderpoliklinik im Doktor von Haunerschen Kinderspital Ludwig-Maximilians-Universität München Direktor: Prof. Dr. Dr. med. Christoph Klein Der Wirkmechanismus des natürlichen Kofaktors Tetrahydrobiopterin als pharmakologisches Chaperon bei der Behandlung der Phenylketonurie Dissertation zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München vorgelegt von Katharina Anna Schiergens, geb. Domdey aus Gräfelfing 2017

2 Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität München Berichterstatter: Prof. Dr. med. Ania C. Muntau Mitberichterstatter: Prof. Dr. med. Eberhard Standl Prof. Dr. med. Kai Bötzel Mitbetreuung durch den promovierten Mitarbeiter: Dr. med. Søren W. Gersting Dekan: Prof. Dr. med. dent. Reinhard Hickel Tag der mündlichen Prüfung:

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4 4 Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG Phenylketonurie Phenylalaninhydroxylase Phenylalaninarme Diät als Therapie der PKU BH 4 als pharmakologisches Chaperon Zielsetzung der Arbeit MATERIAL UND METHODEN Material Laborgeräte Allgemeine Verbrauchsmaterialien Chemikalien, Reagenzien Puffer und Lösungen Bakterienstämme Anzuchtmedien Antibiotika Kits zur Isolierung von Plasmiden aus Bakterienkulturen Enzyme Restriktionsendonukleasen Enzymatische Abspaltung des Fusionspartners Polymerase für die Polymerase-Kettenreaktion Vektoren und cdna Primer für Polymerase-Kettenreaktion Kit für DNA-Sequenzanalyse Puffer für Restriktionsspaltungen Reagenzien für die Gateway -Klonierung Software Methoden Molekularbiologische Methoden Anzucht von E. coli-kulturen Glycerin-Dauerkulturen für die langfristige Lagerung DNA-Transformation Isolierung von Plasmiden aus Bakterienkulturen Mini-Prep von Plasmid-DNA Midi- und Maxi-Prep von Plasmid-DNA Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration Klonierung eines Vektors für die prokaroyte Expression der humanen Wildtyp-PAH und Varianten der PAH Polymerase Kettenreaktion... 27

5 Site-Directed Mutagenesis Vektor pmalc2e Vektor pmalc2x Gateway Vektoren Restriktionsverdau mit Endonukleasen Agarose-Gelelektrophorese Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Sequenzierung der Plasmide nach Sanger Proteinexpression aus pmalc2e/pmalc2x und pmalc2e/x DEST-Vektoren zur Durchführung eines Expressionstests Isolierung der Proteine aus E.coli-Zellen Proteinexpression und -isolierung zur Proteinaufreinigung Aufreinigung der rekombinanten MBP-PAH Fusionsproteine durch Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie Bestimmung der Proteinkonzentration Photometrische Bestimmung bei A Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford Fluoreszenzspektrophotometrische Messungen Differential Scanning Fluorimetry Kinetische Analyse der Denaturierung Trübungsmessung Statistische Auswertung Auswertung der thermische Denaturierung Auswertung der kinetischen Denaturierung Auswertung der Right Angle Light Scattering Messungen ERGEBNISSE Etablierung spektrophotometrischer Methoden und Auswahl der Kofaktoren Abhängigkeit der Übergangstemperatur des murinen PAH Wildtyps von der Geschwindigkeit der Erwärmung während der thermischen Denaturierung Auswahl eines geeigneten PAH-Konstrukts für DSF-Messungen Etablierung des Assays zur kinetischen Proteindenaturierung Messung der Proteinaggregation Auswahl der zu untersuchenden PAH-Varianten Auswahl der Kofaktoren Auswahl der Kofaktor-Konzentrationen Analyse des Effekts des natürlichen Kofaktors Tetrahydrobiopterin auf die Denaturierung humaner Wildtyp-PAH Effekt von BH 4 auf das Entfaltungsmuster der Wildtyp-PAH im DSF-Assay Analyse der kinetischen Denaturierung des PAH-Wildtyps im Komplex mit BH Berechnung der Aktivierungsenergie... 49

6 6 3.3 Analyse des Effekts des natürlichen Kofaktors BH 4 auf die Denaturierung ausgewählter Varianten der humanen PAH Effekt von BH 4 auf das Entfaltungsmuster der PAH-Varianten im DSF-Assay Vergleich der Hydrophobizität der PAH-Varianten im nativen Zustand Analyse der kinetischen Denaturierung der PAH-Varianten im Komplex mit BH Berechnung der Aktivierungsenergien Analyse des Einflusses von BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 auf die Denaturierung des humanen PAH-Wildtyp-Proteins Analyse des Einflusses von BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 auf die thermische Stabilität des PAH-Wildtyps Vergleich der Aktivierungsenergien des PAH-Wildtyps im Komplex mit BH 4, BH 2, Sepiapterin und 6-MPH Analyse des Einflusses von BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 auf die thermische Denaturierung ausgewählter Varianten der PAH Analyse des Einflusses von BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 auf die thermische Stabilität der PAH-Varianten Vergleich der Aktivierungsenergien der PAH-Varianten im Komplex mit BH 2, Sepiapterin und 6-MPH Analyse des Effekts des natürlichen Kofaktors Tetrahydrobiopterin sowie des Substrats Phenylalanin auf die Denaturierung und Aggregation des murinen PAH-Wildtyps und seiner Variante V106A Analyse des murinen PAH-Wildtyps und seiner Variante V106A im DSF-Assay Hydrophobizität des murinen PAH-Wildtyps und seiner Variante V106A im nativen Zustand Analyse der thermischen Entfaltungskurven des murinen PAH-Wildtyp-Proteins und seiner Variante V106A durch Zugabe von BH 4 und Phenylalanin Analyse des Aggregationsverhaltens des murinen PAH-Wildtyp-Proteins und seiner Variante V106A durch Right Angle Light Scattering DISKUSSION ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS DANKSAGUNG

7 Einleitung 7 1. Einleitung 1.1 Phenylketonurie Die Phenylketonurie (PKU; OMIM #261600) wird durch einen autosomal-rezessiv vererbten Defekt der Phenylalaninhydroxylase (PAH) verursacht. Mit einer Inzidenz von 1:5.062 ist sie die häufigste genetisch bedingte Störung des Aminosäurestoffwechsels in europäischstämmigen Populationen (Zschocke 2003; Nennstiel-Ratzel et al. 2010). Bei der PKU führt eine verminderte Aktivität der PAH zu einer reduzierten bzw. fehlenden Hydroxylierung der über eiweißhaltige Nahrung aufgenommenen essentiellen Aminosäure Phenylalanin zu Tyrosin, was erhöhte Phenylalaninkonzentrationen im Blut zur Folge hat (Scriver et al. 1988). Gleichzeitig wird Tyrosin zur essentiellen Aminosäure, da es nicht, oder nur in sehr geringem Ausmaß, aus Phenylalanin gebildet wird (Jervis 1947). Hervorgerufen wird die PKU durch Mutationen im Phenylalaninhydroxylase (PAH)-Gen, das sich auf Chromosom 12q22-q24.2 befindet ( Bisher sind 957 verschiedene Mutationen bekannt ( März 2016), von denen über 60% missense Mutationen sind, gefolgt von Deletions- (13,40 %), Splice- (10,93 %), silenten (5,64%) und nonsense (4,94%) Mutationen. Andere Mutationen machen nur einen geringen Prozentsatz aus ( Ein Großteil der betroffenen Patienten ist compound heterozygot und trägt damit unterschiedliche Mutationen auf beiden für die PAH kodierenden Allele. Dies führt dazu, dass die PAH auf Proteinebene verschiedene durch die Mutationen verursachte Veränderungen zeigt, die sich gegenseitig beeinflussen können (Shen et al. 2016). Die genetische Heterogenität bei der PKU ist damit sehr hoch (Danecka et al. 2015). Da nicht jede Mutation auf DNA-Ebene zur gleichen Schwere der Erkrankung führt, ist das klinische Erscheinungsbild der Betroffenen sehr variabel. Neugeborene mit PKU zeigen keine klinischen Auffälligkeiten, da die mütterliche Enzymaktivität intrauterin für eine normale Phenylalaninhomöostase ausreichend ist, und in der Regel werden Eltern nach der Geburt zu ihrem gesunden Kind beglückwünscht. Die Zeichen der neurologischen und körperlichen Beeinträchtigung beginnen schleichend. Auffallend ist in den ersten Monaten lediglich bei Kindern mit stark erhöhten Phenylalaninwerten im Blut ein oft als pferdestallähnlich beschriebener Uringeruch (Følling 1934; Centerwall & Centerwall 2000); häufig zeigen diese Kinder auch stark juckende, ekzematöse Hautveränderungen. Aufgrund des Tyrosinmangels und des daraus folgenden Mangels an Melanin sind betroffene Kinder häufig hellhäutig, blauäugig und blond (Fitzpatrick & Miyamoto 1957; Al & Christodoulou 2015). Ab dem zweiten Lebenshalbjahr weisen die Patienten einen erhöhten Muskeltonus und gesteigerte Muskeleigenreflexe auf, was Zeichen für eine Schädigung sowohl des pyramidalen, als auch des extrapyramidal-motorischen Systems sind (MacLeod et al. 1983). Bleiben die Kinder weiterhin unbehandelt, entwickeln sie schwerste fortschreitende neurologische Defizite mit Intelligenzverlust, Autoaggressivität und psychomotorischer Retardierung (Corsellis 1953;

8 Einleitung 8 Poser & van Bogaert 1959; Belanger-Quintana et al. 2011). Häufig wird die Erkrankung von Autismus und Epilepsieneigung begleitet; auch psychiatrische Erkrankungen wie Depressionen und Angststörungen können mit zunehmendem Alter auftreten (Moore et al. 1964; Manti et al. 2016). Vor Einführung der diätetischen Therapie mussten die Kinder deshalb häufig in geschlossen Therapieeinrichtungen untergebracht werden. (Woolf & Vulliamy 1951; Blau et al. 2010; Mitchell et al. 2011). Die Phenylketonurie wurde erstmals von Asbjörn Følling beschrieben, dem bereits im Jahr 1934 der Nachweis von Phenylbrenztraubensäure (Phenylpyruvat) im Urin eines geistig retardierten Geschwisterpaares gelang. Phenylpyruvat und andere atypische Stoffwechselprodukte wie Phenyllaktat und Phenylacetat entstehen durch den fehlerhaften Abbau von Phenylalanin und werden im Urin in großen Mengen ausgeschieden. Wird einer solchen Urinprobe im Rahmen der Fölling-Probe Eisen-III-Chlorid zugegeben, entsteht durch dessen Reduktion zu Eisen-II-Chlorid eine charakteristische Grünfärbung als Nachweis von Phenylpyruvat. So bezeichnete Følling das Krankheitsbild als Imbecillitas phenylpyruvica, zu Deutsch Phenylbrenztraubensäure-Schwachsinn (Følling 1934). 13 Jahre nach Føllings Entdeckung gelang es G.A. Jervis, den der PKU zu Grunde liegenden Stoffwechseldefekt nachzuweisen, nämlich einen Defekt in der Verstoffwechslung von Phenylalanin zu Tyrosin (Jervis 1947) machte der deutsche Kinderarzt Horst Bickel die PKU zur behandelbaren genetischen Erkrankung: Er entwickelte die phenylalaninarme Diät, mit der er eine 17 Monate alte Patientin erfolgreich behandelte (Bickel et al. 1953). Von besonderer Bedeutung bei der PKU ist ihre frühzeitige Behandlung vor Eintreten irreversibler Hirnschädigungen. Robert Guthrie entwickelte 1963 einen mikrobiologischen Hemmtest, den sogenannten Guthrie-Test, der ab Ende der 1960er Jahre deutschlandweit zur Früherkennung betroffener Kinder eingesetzt wurde (Guthrie & Susi 1963). Mittlerweile wurde der Guthrie-Test durch das modernere Verfahren der Tandem-Massenspektrometrie abgelöst (Chace et al. 1999; Harms & Olgemöller 2011). Die Tandem-Massenspektrometrie erlaubt eine verlässliche Konzentrationsbestimmung von Aminosäuren und Acylcarnitinen aus kleinen Blutvolumina. So kann nicht nur die Relation von Phenylalanin zu Tyrosin bestimmt werden, sondern im gleichen Schritt auch auf andere angeborene Stoffwechseldefekte getestet werden (Sahai & Marsden 2009; Blau et al. 2011). Definitionsgemäß wird eine Phenylalaninkonzentration größer als 120 µmol/l im Blutplasma als Hyperphenylalaninämie (HPA) bezeichnet. Die Phänotypen der HPA, die durch Mutationen im PAH-Gen hervorgerufen werden, werden nach der prätherapeutischen Phenylalaninkonzentration im Blut klassifiziert: Die klassische PKU liegt bei Phenylalaninkonzentrationen über µmol/l vor, während die milde PKU durch Werte kleiner µmol/l und größer 600 µmol/l definiert ist.

9 Einleitung 9 Patienten mit klassischer bzw. milder PKU benötigen eine lebenslange Behandlung, um einer mentalen Retardierung vorzubeugen. Bei Betroffenen mit milder HPA (Phenyalaninkonzentration im Blut kleiner 600 µmol/l und größer 120 µmol/l) wird weltweit sehr kontrovers über die Notwendigkeit einer Therapie diskutiert (Weglage et al. 2001; Lagler et al. 2010; Camp et al. 2014; Jahja et al. 2014). Eine weitere Erkrankung, die eine HPA zur Folge hat, ist die atypische PKU. Diese wird nicht durch Mutationen im PAH-Gen hervorgerufen, sondern durch einen genetischen Mangel des natürlichen Kofaktors Tetrahydrobiopterin (BH 4 ) infolge verschiedener Gendefekte verursacht. Lediglich 2% aller Patienten mit PKU sind von dieser Variante betroffen. Klinische Phänotypen Prätherapeutische Phe-Konzentrationen im Blut Enzymaktivität Klassische PKU Typ I > μmol/l < 1% Milde PKU Typ II < μmol/l und > 600 μmol/l 1 3 % Milde HPA Typ III < 600 μmol/l und > 120 μmol/l 3 10 % Atypische PKU (BH 4 -Mangel) 150 > μmol/l Normal Tabelle 1: Klassifikation der genetisch bedingten HPA (Muntau et al. 2000). Von besonderer klinischer Bedeutung ist auch die maternale PKU, die den Zeitraum der Schwangerschaft einer HPA-Patientin beschreibt. Während bei Jugendlichen und Erwachsenen mit abgeschlossener Gehirnentwicklung die strenge Einhaltung der phenylalaninarmen Diät zur Kontrolle des Phenylalaninspiegels häufig gelockert wird (s.u.), muss diese während der Schwangerschaft wieder streng eingehalten werden. Erhöhte maternale Phenylalaninkonzentrationen führen zu teratogenen Effekten. So weisen etwa 90% der Kinder unbehandelter PKU-kranker Mütter mit maternalen Phenylalaninkonzentrationen über µmol/l eine mentale Retardierung auf, etwa 70% sind mikrozephal (Lenke & Levy 1980). Auch intrauterine Wachstumsretardierungen und angeborene Herzfehler treten mit etwa 40% bzw % deutlich häufiger auf als in der Normalbevölkerung (Lenke & Levy 1980; Levy 2012; Martino et al. 2013). Das Risiko für diese Behinderungen ist sowohl abhängig von der Phenylalaninkonzentration im mütterlichen Blut als auch vom Zeitpunkt und der Zeitdauer der Exposition gegenüber erhöhten Phenylalaninkonzentrationen (Prick et al. 2012; Martino et al. 2013). HPA-Patientinnen, die planen, schwanger zu werden und zu diesem Zeitpunkt keine Diät einhalten, sollten deshalb die phenylalaninarme Diät wieder aufnehmen, um schon einige Monate vor der gewünschten Konzeption stabile Phenylalaninwerte von 120 bis maximal 360 µmol/l zu erreichen und diese während der Schwangerschaft zu halten (American Academy of Pediatrics 2001; Mitchell et al. 2011; Camp et al. 2014; Vockley et al. 2014).

10 Einleitung Phenylalaninhydroxylase Die Phenylalaninhydroxylase wird beim Menschen in der Leber synthetisiert und ist im Zytosol der Zelle lokalisiert. Sie gehört neben der Tyrosin- und der Tryptophanhydroxylase zur Familie der aromatischen Aminosäurehydroxylasen. Diese zählen zu den Monooxygenasen, da sie während der Hydroxylierungsreaktion ein Sauerstoffatom eines Sauerstoffmoleküls auf ihr Substrat übertragen (Kaufman et al. 1962). Wie alle aromatischen Aminosäurehydroxylasen benötigt die PAH Eisen und ihren natürlichen Kofaktor BH 4, um eine Hydroxylgruppe in den aromatischen Ring ihres Substrats einzubauen. Das Eisen wird während dieser Hydroxylierungsreaktion von Fe 3+ zu Fe 2+ reduziert (Hegg & Que, Jr. 1997; Costas et al. 2004). BH 4 stellt die für die Reaktion benötigten Elektronen zur Verfügung und wird dadurch zu der quinoiden Form von Dihydrobiopterin (BH 2 ) oxidiert. Die Regeneration des Kofaktors erfolgt über die Dihydropteridinredukatase (DHPR) unter Anwesenheit von NADH/H + (s. Abb. 1). Ist DHPR nicht in ausreichendem Maß vorhanden, wird die quinoide Form von BH 4 nicht-enzymatisch in BH 2 umgewandelt, das wiederum durch eine Dihydrofolatreduktase unter Anwesenheit von NADPH/H + zu BH 4 reduziert werden kann (nicht abgebildet) (Werner et al. 2011). Abbildung 1: Für die Hydroxylierungsreaktion von Phenylalanin zu Tyrosin werden der natürliche Kofaktor Tetrahydrobiopterin (BH 4) und Sauerstoff benötigt. BH 4 wird dabei zu einem quinoiden Dihydrobiopterin (BH 2) hydroxyliert und mit Hilfe der Dihydropteridin-Reduktase in Anwesenheit von NADH/H+ wieder zu BH 4 reduziert (Nelson DL & Cox MN 2013). Die Hydroxylierungsreaktion der essentiellen Aminosäure Phenylalanin zu Tyrosin ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt des Phenylalaninstoffwechsels. Etwa 75% des über die Nahrung aufgenommenen Phenylalanins wird über diesen Weg abgebaut (Underhaug et al. 2012). Im weiteren Verlauf wird Tyrosin zum biogenen Amin Dopamin und dieses zu den Katecholaminen Noradrenalin und Adrenalin verstoffwechselt (Hufton et al. 1995; Schuck et al. 2015). Die PAH von Säugetieren ist ein homotetrameres Enzym, bestehend aus einem Dimer aus Dimeren, die durch eine Tetramerisierungsregion asymmetrisch miteinander zu einem Tetramer verbunden sind (Fusetti et al. 1998). Jedes Monomer besitzt eine Größe von 52

11 Einleitung 11 kda und besteht aus einer regulatorischen (Aminosäuren 1-142), einer katalytischen (Aminosäuren ) und einer Oligomerisierungsdomäne (Aminosäuren ) (Erlandsen & Stevens 1999). Die regulatorische Domäne ist am N-Terminus des Enzyms lokalisiert. Sie ist über eine Gelenkregion ( hinge-region, Arg111 Thr117) flexibel an die katalytische Domäne gebunden, tritt aber auch mit der katalytischen Domäne des zweiten Monomers im Dimer in Kontakt. Während innerhalb eines Dimers also jede regulatorische Domäne mit beiden katalytischen Domänen interagiert, kommt es hingegen zu keiner direkten Interaktion zwischen den beiden regulatorischen Domänen (Fitzpatrick 2012). In der katalytischen Domäne befinden sich die Bindungsstellen für Eisen, den Kofaktor BH 4 und das Substrat Phenylalanin (Carluccio et al. 2016). Die Oligomerisierungsdomäne enthält zu Beginn eine antiparallele β-faltblattstruktur (Aminosäuren und ), durch welche die Bildung des Dimers möglich wird, gefolgt von einer α-helix (Aminosäuren ), die durch Ausbildung eines antiparallelen coiled-coil-motivs mit der α-helix des angrenzenden Monomers zur Bildung des Tetramers führt (Flydal & Martinez 2013). Abbildung 2: A Monomer der PAH, bestehend aus drei funktionellen Domänen: N-terminale regulatorische Domäne (blau), katalytische Domäne (gelb) mit den Bindungsstellen für Eisen (rote Kugel) sowie Phenylalanin und BH 4 (nicht abgebildet) und Oligomerisierungsdomäne (grün). B Durch Zusammenschluss von vier einzelnen Monomeren über die jeweilige Oligomerisierungsdomäne entsteht die funktionelle, tetramere PAH (Erlandsen & Stevens 1999). Die Aktivität der PAH wird durch verschiedene Regulationsmechanismen gesteuert, wobei vor allem Phosphorylierungsreaktionen und die Bindung des natürlichen Kofaktors BH 4 sowie des Substrats Phenylalanin an die PAH eine wichtige Rolle spielen (Xia et al. 1994; Shiman et al. 1994a; Shiman et al. 1994b; Fitzpatrick 2012). Durch Phosphorylierung an Position Ser16 über eine camp-abhängige Proteinkinase kann die Enzymaktivität um das Dreifache gesteigert werden (Abita et al. 1976).

12 Einleitung 12 Auch das Substrat Phenylalanin bewirkt bei der humanen PAH eine drei- bis sechsfache Aktivitätssteigerung (Gersting et al. 2008). Es wird vermutet, dass dies einer der wichtigsten Regulationsmechanismen zur Aufrechterhaltung der Phenylalaninhomöostase ist. Im Gegensatz dazu führt die Bindung des Kofaktors BH 4 bei Abwesenheit des Substrats zur Bildung eines inaktiven PAH-BH 4 -Komplexes, wodurch es zur Inhibierung der Enzymaktivität kommt (Fitzpatrick 2012; Underhaug et al. 2012). Die Bindung von Phenylalanin an die PAH löst konformative Veränderungen vor allem im Bereich der regulatorischen und katalytischen Domänen des Enzyms aus, die wahrscheinlich zu einer offeneren, dynamischeren Struktur der PAH und zu einer geringeren Bindungsaffinität des Kofaktors führen. BH 4 bindet in Abwesenheit des Substrats unter anderem über die N-terminale regulatorische Domäne an die PAH. Durch konformationelle Veränderungen kommt es zur oben erwähnten Inhibierung des Enzyms, die wiederum durch Substratbindung aufgehoben werden kann (Andersen et al. 2003; Solstad et al. 2003; Fitzpatrick 2012). 1.3 Phenylalaninarme Diät als Therapie der PKU Die Einführung der phenylalaninarmen Diät durch Bickel, in Kombination mit der Früherkennung der Erkrankung durch das Neugeborenenscreening, machte die PKU zum Prototyp der behandelbaren angeborenen Stoffwechselerkrankung. Nach der Feststellung einer HPA im Neugeborenenscreening müssen weitere, methodisch unabhängige Tests zur Diagnosebestätigung folgen (Camp et al. 2014; Vockley et al. 2014). Eine transiente HPA kann verschiedene Ursachen haben, zum Beispiel extreme Unreife bei Frühgeborenen, Niereninsuffizienz oder einen hohen Aminosäuregehalt der Nahrung bei parenteraler Ernährung (Cunningham 1966; Mabry 1990). Ist die persistierende HPA gesichert, muss zunächst eine atypische PKU ausgeschlossen werden. Dies erfolgt heute durch die Bestimmung der Pterine, Biopterin und Neopterin im Trockenblut und durch die Aktivitätsbestimmung der DHPR in Erythrozyten (Opladen et al. 2011). Die Diagnose muss durch weitere Tests bestätigt werden (Muntau et al. 2000; Blau et al. 2010; Blau et al. 2011; Mitchell et al. 2011). Erhärtet sich hingegen der Verdacht des Defekts der PAH, muss umgehend mit der diätetischen Therapie begonnen werden. In den ersten Lebenstagen erfolgt in der Regel eine phenylalaninfreie Diät, um die meist stark erhöhten Plasmaphenylalaninkonzentrationen rasch zu senken. Da Phenylalanin jedoch zu den essentiellen Aminosäuren zählt, die nicht vom Körper synthetisiert werden können, muss sie langfristig in geringem Maß zugeführt werden. Deshalb muss im Anschluss an die phenylalaninfreie Diät die Umstellung auf eine phenylalaninarme Diät erfolgen (Flannery et al. 1983; Macdonald et al. 2006). Während sich bei Säuglingen die spezifische Diät noch verhältnismäßig einfach gestaltet je nach individueller Toleranz ist eine Ernährung mit bis zu 50% Muttermilch in Kombination mit phenylalaninfreier Nahrung möglich wird diese ab Einführung von Beikost bis zur

13 Einleitung 13 gänzlichen Umstellung auf feste Nahrung deutlich schwieriger. Tierische Eiweiße enthalten viel Phenylalanin, sodass diese größtenteils vermieden werden müssen. Mittlerweile stehen zahlreiche phenylalaninarme Produkte aus speziellem phenylalaninarmen Mehl, sowie eiweißarme Milch und sogar eiweißarme Süßigkeiten zur Verfügung (Macdonald et al. 2004; van Calcar & Ney 2012). Aufgrund der geringen Menge an erlaubtem Phenylalanin ist die durch die phenylalaninarme Nahrung aufgenommene Menge an Eiweiß zu gering, um den täglichen Bedarf eines Kindes zu decken. Um eine normale körperliche Entwicklung zu gewährleisten, müssen Betroffene zusätzlich speziell hergestellte eiweißreiche, aber phenylalaninfreie Nahrungsergänzungsmittel zu sich nehmen. Durch diese wird auch die nötige Zufuhr von Vitaminen und Spurenelementen sichergestellt (Macdonald et al. 2004; Evans et al. 2014). Es hat sich gezeigt, dass die Therapie der PKU durch diätetische Restriktion der Phenylalaninzufuhr eine weitestgehend normale geistige Entwicklung zur Folge hat (Smith & Wolff 1974). In den Anfangszeiten der diätetischen PKU-Therapie wurde die Behandlung zwischen dem 6. bis 8. Lebensjahr unter der Annahme beendet, dass zu diesem Zeitpunkt die Entwicklung des Gehirns größtenteils abgeschlossen ist und somit die toxischen Abbauprodukte des Phenylalanins keine bleibenden Beeinträchtigungen hervorrufen. Schon bald wurde jedoch festgestellt, dass nach Beendigung der diätetischen Therapie nicht nur Ekzeme der Haut gehäuft auftreten, sondern vor allem auch neurologische und psychiatrische Probleme (Potocnik & Widhalm 1994; Koch et al. 2002). Tiefergehende neurologische Untersuchungen von erwachsenen PKU-Patienten zeigten Konzentrationsschwächen, eine verlangsamte kognitive Aufnahme und Verarbeitung von Informationen, eine geringere Merkfähigkeit sowie Tremor und gesteigerte Muskeleigenreflexe, die nach Beendigung der Diät deutlich schwerwiegender ausfallen als unter Diät (Pietz et al. 1998; Gassio et al. 2003; Moyle et al. 2007a; Moyle et al. 2007b; Enns et al. 2010). Patienten mit PKU neigen außerdem zu Depressionen, Angststörungen, Phobien, sozialer Isolation sowie einem geringen Selbstbewusstsein (Smith & Knowles 2000; Enns et al. 2010; Manti et al. 2016). Es konnte gezeigt werden, dass es zu einer Verbesserung der Lebensqualität kommt, sobald die Patienten ihre phenylalaninarme Diät wieder aufnehmen (Gassio et al. 2003; Bik-Multanowski et al. 2008). Der IQ-Wert der Patienten, wie auch weitere Ergebnisse neurokognitiver Testungen korreliert negativ mit dem bis zum Zeitpunkt der Untersuchung erreichten kumulativen Lebenszeit- Phenylalaninkonzentration, was die Bedeutung der strengen Einhaltung der empfohlenen Phenylalaningrenzwerte betont (Azen et al. 1991; Brumm et al. 2004; Waisbren et al. 2007; Gonzalez et al. 2011). MRT-Untersuchungen des Gehirns von behandelten und unbehandelten PKU-Patienten zeigen Veränderungen sowohl der weißen, als auch der grauen Substanz des Gehirns (Pearsen et al. 1990; Bick et al. 1991; Cleary et al. 1994; Koch et al. 2002; Christ et al. 2016). In Zusammenschau zahlreicher Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass sich die Veränderungen der weißen Substanz, die bei

14 Einleitung 14 unbehandelten PKU-Patienten auftreten, deutlich von den Veränderungen behandelter Patienten unterscheiden. Bei unbehandelten Patienten werden die Auffälligkeiten im MRT durch eine periventrikuläre Demyelinisierung hervorgerufen, während sie bei behandelten Patienten durch intramyeline Ödeme verursacht und von der aktuellen Phenylalaninkonzentration abhängig sind (Anderson & Leuzzi 2010). So konnte auch gezeigt werden, dass letztere Veränderungen durch eine Rückkehr zur strikten phenylalaninarmen Diät reversibel sind (Thompson et al. 1993; Cleary et al. 1995; Anderson & Leuzzi 2010). Aufgrund dieser Ergebnisse wird heute eine lebenslange Einhaltung der phenylalaninarmen Ernährung dringend empfohlen (Vockley et al. 2014). Durch die diätetische Therapie der PKU konnte erreicht werden, dass die Patienten durchschnittliche Intelligenzquotienten erzielen und somit nicht geistig retardiert sind. Allerdings birgt die Therapie auch diverse Risiken. Obwohl sich die Qualität der spezifischen Nahrungsergänzungsmittel in den letzten Jahren deutlich verbessert hat, kann es durch die strenge Diät zu Mangelerscheinungen kommen. So werden bei Patienten immer wieder Mängel an wichtigen Spurenelementen wie Zink, Calcium, Eisen und den Vitaminen D und B12 festgestellt (Belanger-Quintana et al. 2011), die zu Wachstumsverzögerungen und frühzeitiger Osteoporose führen können (Barat et al. 2002; Modan-Moses et al. 2007; Porta et al. 2011; Thiele et al. 2015). Auch bei lebenslanger Durchführung der Diät kommt es zu den oben bereits erwähnten neurologischen, psychiatrischen und motorischen Beeinträchtigungen, wenn auch in deutlich geringerem Ausmaß (Enns et al. 2010; Bilder et al. 2013). Besonderen Einfluss hat die Erkrankung auf die Konzentrationsfähigkeit, die Geschwindigkeit der Informationsverarbeitung und die Feinmotorik, da auch diätetisch behandelte PKU-Patienten in Studien hier signifikant schlechter abschneiden als die gesunde Normalbevölkerung (Pietz et al. 1998; Gassio et al. 2005a; Gassio et al. 2005b; Anderson et al. 2007; Enns et al. 2010; de Sonneville et al. 2011). Darüber hinaus wurde ein direkter Zusammenhang zwischen erhöhten Blutphenylalaninkonzentrationen und negativer Stimmung beobachtet (Ten Hoedt et al. 2011; Sharman et al. 2012). Dennoch entstehen die psychiatrischen Symptome, die bei der PKU gehäuft auftreten, wahrscheinlich aus einem Zusammenspiel sowohl der metabolischen Störung als auch aus der enormen Belastung, die die PKU als chronische Erkrankung mit sich bringt (Brumm et al. 2010; Manti et al. 2016). Die strenge Diät, die mit hohen Kosten für die phenylalaninfreien Nahrungsergänzungsprodukte und phenylalaninarmen Nahrungsmittel verbunden ist, stellt außerdem eine große finanzielle Belastung für betroffene Familien dar (Guest et al. 2013; Eijgelshoven et al. 2013). Die bisher erhältlichen Aminosäuremischungen schmecken trotz großer Anstrengungen der industriellen Hersteller aufgrund des Vorliegens der einzelnen Aminosäuren in freier anstatt in gebundener Form sehr unangenehm und betroffene Kinder leiden darunter, täglich die benötigte Menge zu sich nehmen zu müssen (Walter et al. 2002). Gerade älteren Kindern

15 Einleitung 15 und Jugendlichen fällt es sehr schwer, sich an die strenge Diät zu halten, bedeutet diese eben auch, nicht das gleiche wie Familie und Freunde essen zu dürfen und ungewollt immer eine Sonderrolle einnehmen zu müssen. Vielen ist es unangenehm, andere Nahrungsmittel essen zu müssen als ihre Mitschüler und Freunde und ziehen es daher vor, alleine zu essen oder verzichten sogar auf ihre Nahrungsaufnahme (Gokmen et al. 2013a). Deshalb überrascht es nicht, dass gerade bei älteren Kindern und Jugendlichen die Adhärenz häufig niedrig ist (Walter & White 2004; Macdonald et al. 2010). Welch extreme emotionale Belastung die Diät für Betroffene darstellen muss, zeigt nicht zuletzt die erhöhte Rate an schweren Depressionen von jugendlichen PKU-Patienten im Vergleich zur Normalbevölkerung (Sullivan & Chang 1999; Brumm et al. 2010; Sharman et al. 2012). Dies generiert daher ein neues Problem: Wird die Therapie mit Erreichen des Jugendalters abgebrochen, haben die Patienten ein schlechteres neurologisches Outcome und zeigen psychiatrische Auffälligkeiten. Wird sie fortgeführt, tragen die Patienten die Bürde der chronischen Erkrankung, die Risiken der Mangelernährung und müssen eine strenge Diät einhalten, durch die sie sich häufig sozial isoliert fühlen. Nachdem vor allem der mentale Gesundheitszustand der behandelten Patienten nachweislich deutlich besser ist als der der unbehandelten, ist die Empfehlung der lebenslangen Therapie gerechtfertigt (Waisbren et al. 2007; Camp et al. 2014; Vockley et al. 2014). Eine Alternative zur lebenslangen Diät könnte die große Belastung der betroffenen Patienten mildern. 1.4 BH 4 als pharmakologisches Chaperon Um ihre volle Funktion zu erreichen, müssen Proteine von der linearen Primärstruktur ausgehend zur dreidimensionalen Tertiär- bzw. Quartärstruktur gefaltet werden. Obwohl die Information für die finale Struktur bereits in der Aminosäuresequenz kodiert ist, behindern die Bedingungen innerhalb einer Zelle häufig die korrekte und effektive Proteinfaltung. Deshalb steht den Zellen ein komplexes Netzwerk aus molekularen Chaperonen zur Verfügung, die eine korrekte Proteinfaltung unterstützen und eine fehlerhafte Faltung und Aggregation der Proteine verhindern (Hartl et al. 2011; Muntau et al. 2014). Gerade die Faltung von größeren Proteinen, die aus mehreren Domänen bestehen, ist sehr fehleranfällig. Molekulare Chaperone, bei denen es sich selbst um Proteine oder um sogenannte small molecules handelt, verhindern die Aggregation von Proteinketten während des Faltungsvorgangs, indem sie die Aminosäureketten, bis die Faltung abgeschlossen ist, nach außen hin abschirmen (Hartl & Hayer-Hartl 2002). Doch nicht nur die richtige Faltung vieler neu synthetisierter Proteine ist von Chaperonen abhängig. Chaperone können auch Entfaltungen von Proteinen verhindern, die durch Stresssituationen wie Veränderungen der Umweltbedingungen der Zelle durch Temperaturschwankungen oder Alterungsprozesse ausgelöst werden. So werden in Stresssituationen zum Beispiel durch sogenannte Hitzeschocktranskriptionsfaktoren nahezu

16 Einleitung 16 sofort Gene abgelesen, die für Chaperone bzw. Hitzeschockproteine kodieren, um die Zellhomöostase aufrecht zu erhalten (Leandro & Gomes 2008; Broadley & Hartl 2009). In den letzten Jahren haben Fortschritte auf dem Gebiet der funktionellen Genomik und Proteomik zu der Erkenntnis geführt, dass der molekulare Mechanismus der Proteinfehlfaltung für zahlreiche genetisch bedingte Erkrankungen verantwortlich ist. Bei diesen Erkrankungen kommt es durch eine Genmutation zu einer fehlerhaften Abfolge der Aminosäuresequenzen, so dass der Code für die spätere Tertiär- oder Quartärstruktur des Proteins nicht korrekt ist. Es resultiert ein Funktionsverlust der Proteine ( loss-of-function ) der durch zwei unterschiedliche Mechanismen ausgelöst werden kann: Eine Mutation führt zu einem frühen Stopcodon, sodass das Protein bereits primär nicht gebildet werden kann. Andererseits können missense Mutationen zu einer geringeren Stabilität der Tertiärstruktur der Proteine führen, so dass sich diese in Stresssituationen vermehrt entfalten und frühzeitig abgebaut werden (Waters 2001). In beiden Fällen können die Proteine ihre gewünschte Funktion nicht ausüben. In den letzten Jahren konnte für verschiedene Erkrankungen gezeigt werden, dass diese missense Mutationen zu Fehlfaltung der betroffenen Proteine führen (Long et al. 2015; Zhang et al. 2015; Sahni et al. 2015). Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass dies auch für die PKU gilt: missense Mutationen führen zu einer globalen Veränderung der Proteinstruktur, wodurch die Enzymfunktion maßgeblich beeinträchtigt ist (Gersting et al. 2008). Diese Proteinfaltungserkrankungen müssen pathophysiologisch von neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson abgegrenzt werden, bei denen die Proteinfehlfaltung zur Bildung toxischer Aggregate führt (Cortez & Sim 2014; Perri et al. 2015). Die Erkenntnisse zum molekularen Phänotyp von Proteinfaltungserkrankungen haben zu neuartigen Strategien der Therapieentwicklung geführt. Nachdem man sich schon seit geraumer Zeit über die Bedeutung von Chaperonen bei der Proteinfaltung bewusst ist, spielt der Einsatz pharmakologischer Chaperone eine zunehmende Rolle bei der Therapieentwicklung und letztendlich der Behandlung von Proteinfaltungserkrankungen. Die Besonderheit der pharmakologischen Chaperone liegt in ihrer Eigenschaft, spezifisch an ungefaltete Proteine binden und deren Faltung in die richtige Tertiärstruktur unterstützen zu können, wodurch es zu einer Stabilisierung des Zielproteins kommt. In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob auch BH 4, das bereits mit großem Erfolg bei einer solchen loss-of-function Proteinfaltungserkrankung eingesetzt wird, als pharmakologisches Chaperon wirkt. BH 4 ist ein essentieller Kofaktor verschiedener Enzyme, die im menschlichen Stoffwechsel eine große Rolle spielen. Dazu zählen beispielsweise die Acylglycerolmonooxygenasen, die NO-Synthasen und die aromatischen Aminosäureoxygenasen, zu denen auch die PAH gehört (Ichinose et al. 2008).

17 Einleitung 17 Im Jahr 1974 wurde eine bis dato unbekannte Form der PKU beschrieben: die oben bereits erwähnte atypische PKU als Folge eines BH 4 -Mangels. Da BH 4 auch Kofaktor der Tryptophan- und Tyrosinhydroxylase ist, treten aufgrund des resultierenden Neurotransmittermangels bei dieser Form der PKU trotz phenylalaninarmer Diät neurologische Symptome auf. Um dies zu verhindern, werden seit den 1980er Jahren Tetrahydrobiopterin- Belastungstests durchgeführt, um Betroffene mit atypischer PKU zu identifizieren und rechtzeitig behandeln zu können. Hierbei ist eine signifikante Senkung der Phenylalaninkonzentration nach Gabe einer Einzeldosis BH 4 in einer Konzentration von 20 mg/kg Körpergewicht ein Indikator für das Vorliegen eines BH 4 -Mangels. Im Jahr 1999 machten Kure et al. eine Zufallsentdeckung: Bei vier Patienten mit Mutationen im PAH-Gen ohne BH 4 -Mangel senkten pharmakologische Dosen (20 mg/kg) des natürlichen Kofaktors BH 4 die Phenylalaninkonzentration im Blut (Kure et al. 1999). Muntau et al. konnten im Jahr 2002 zeigen, dass BH 4 bei der Mehrzahl von PKU-Patienten mit mildem Phänotyp die PAH-Enzymaktivität in vivo steigert. Als Folge dessen sinkt unter BH 4 -Therapie bei diesen Patienten die Phe-Konzentration im Blut bei erhöhter Eiweißtoleranz (Muntau et al. 2002). In den folgenden Jahren wurde bei etwa 40% der PKU- Patienten eine solche BH 4 -responsive PKU diagnostiziert (Underhaug et al. 2012). Dabei hat sich herausgestellt, dass Patienten mit milder PKU oder milder HPA häufiger eine BH 4 - Sensitivität zeigen als Patienten mit klassischer PKU (Fiege & Blau 2007). Nachdem in klinischen Studien sowohl Wirksamkeit als auch Sicherheit von BH 4 bestätigt wurden (Levy et al. 2007b; Trefz et al. 2009; Sanford & Keating 2009) wurde Sapropterindihydrochlorid (die synthetische Form des Kofaktors BH 4 ) im Jahr 2007 in den USA und 2008 in Europa zur Therapie der BH 4 -responsiven PKU zugelassen. Eine PKU gilt in der Regel dann als BH 4 -responsiv, wenn es zu einer Reduktion von mindestens 30% des Phenylalaninwerts im Blut kommt. Doch auch schon geringere Reduktionen der Phenylalaninkonzentration von 20-30% können von klinischer und therapeutischer Relevanz sein (Levy et al. 2007a; Belanger-Quintana et al. 2011). Da nicht alle PKU-Patienten von einer BH 4 -Therapie profitieren, müssen die Patienten sorgfältig auf ihre BH 4 -Sensitivität getestet werden, bevor mit der Therapie begonnen wird. Hierzu wird ein BH 4 -Belastungstest über Stunden durchgeführt (Blau et al. 2010). Der Patient erhält dazu mg/ kg Körpergewicht BH 4, im Anschluss werden die Phenylalaninkonzentrationen im Trockenblut in regelmäßigen Abständen kontrolliert. Bei positivem Ergebnis, also einem Abfall der Blutphenylalaninkonzentration von mehr als 30%, erfolgt ein mehrwöchiger Therapieversuch. Die klinischen Studien zur Zulassung von Sapropterindihydrochlorid in Europa schlossen PKU-Patienten unter vier Jahren zunächst aus. In den USA ist Kuvan für alle Altersgruppen durch die FDA zugelassen. Eine Studie von Burton et al. (Burton et al. 2011) in den USA zeigte, dass BH 4 auch bei Patienten unter vier Jahren sicher angewendet werden und die Phenylalanintoleranz deutlich steigern kann (Cunningham et al. 2012).

18 Einleitung 18 In Europa wird derzeit eine internationale europäische Zulassungsstudie (Safety Pediatric EfficAcy PhaRmacokinetic with Kuvan; SPARK-Studie) zum Nachweis der Wirksamkeit und Sicherheit von Sapropterindihydrochlorid bei Kindern von null bis vier Jahren durchgeführt ( Aufgrund der überzeugenden Daten dieser Studie erhielt Kuvan im Juli 2015 auch in Europa für Kinder unter 4 Jahren die Zulassung ( Eine weitere Patientengruppe, die ebenso von der Therapie mit BH 4 profitiert, sind schwangere PKU-Patientinnen, die schon länger keine Diät mehr durchgeführt haben oder, im Fall einer milden HPA, noch nie eine Diät durchführen mussten. Ausführliche Studien zur BH 4 -Therapie während der Schwangerschaft gibt es bisher nicht. Tierversuche an trächtigen Ratten und Hasen, die mit der drei- bis zehnfach erhöhten maximalen Tagesdosis (bezogen auf Körperoberfläche) mit Sapropterindihydrochlorid behandelt wurden, zeigten keine teratogenen Effekte. Bei den Hasen wurde allerdings eine leicht erhöhte Rate an Holoprosenzephalie festgestellt ( Die teratogenen Effekte, die durch einen erhöhten Phenylalaninspiegel während der Schwangerschaft ausgelöst werden, scheinen dieses Risiko jedoch deutlich zu übertreffen. In den USA und in Europa gab es bereits einige unkomplizierte Schwangerschaften unter phenylalaninarmer Diät und Kuvan -Therapie, aus denen gesunde Kinder hervorgegangen sind (Grange et al. 2014; Feillet et al. 2014; Trefz et al. 2015). Dennoch ist Sapropterindihydrochlorid bisher nur dann in der Schwangerschaft zugelassen, wenn durch eine Diät nicht die für die Schwangerschaft angestrebten therapeutischen Phenylalaninkonzentrationen erreicht werden können. Nachdem die Therapie mit Sapropterindihydrochlorid bei BH 4 -responsiven Patienten nicht nur die Phenylalaninkonzentration im Blut senkt und auf stabilem Niveau hält, sondern einige Patienten ihre phenylalaninarme Diät lockern oder sogar einstellen können (Ziesch et al. 2012; Keil et al. 2013), wurde eine deutliche Verbesserung der Lebensqualität durch BH 4 - Therapie postuliert. Studien (Ziesch et al. 2012; Keil et al. 2013), Fallberichte (Gokmen et al. 2013b), sowie persönliche Berichte von BH 4 -responsiven Patienten (z.b. unter bestätigen eine positive Auswirkung der neuen Behandlungsmöglichkeit auf die Lebensqualität der PKU- Patienten. Außerdem wurde festgestellt, dass sich die Diätadhärenz durch die Einführung der BH 4 -Therapie deutlich verbessert hat (Keil et al. 2013). Zwei Studien (Ziesch et al. 2012; Demirdas et al. 2013) konnten jedoch keine signifikante Verbesserung der Lebensqualität der Patienten nach Einführung der Therapie feststellen, was jedoch verschiedene Gründe haben kann: Einerseits fiel im Rahmen dieser Studien auf, dass die schon vor Beginn der Therapie durchgeführten Tests zur gesundheitsassoziierten Lebensqualität bei den Patienten im Durchschnitt eine bessere Lebensqualität zeigten als bei der Normalbevölkerung. Dies könnte am gesteigerten Bewusstsein für die eigene Gesundheit bei chronisch kranken Patienten liegen. Bei einer überdurchschnittlich guten Ausgangsqualität fallen weitere

19 Einleitung 19 Verbesserungen der Lebensumstände weniger ins Gewicht. Darüber hinaus wurde bei den Untersuchungen kein PKU-spezifischer Fragebogen zur Beurteilung der Lebensqualität verwendet, da ein solcher noch nicht verfügbar ist. Eventuelle Verbesserungen, die zum Beispiel eine Lockerung der Diät mit sich bringen, wurden so nicht (Demirdas et al. 2013) oder nur in Einzelfragen, die nicht in das Testergebnis eingingen (Ziesch et al. 2012), bewertet. 1.5 Zielsetzung der Arbeit Sapropterindichlorid, die synthetische Form des natürlichen Kofaktors BH 4, wird seit einigen Jahren in der Therapie der BH 4 -sensitiven PKU angewandt. Allerdings war bei Zulassung von Kuvan lediglich bekannt, dass BH 4 die Phenylalaninkonzentration von BH 4 -sensitiven PKU-Patienten senkt und die Oxidation von Phenylalanin in vivo steigert (Muntau et al. 2002); der genaue Wirkmechanismus des Medikaments war zu Beginn dieser Forschungsarbeit nicht verstanden. Das übergeordnete Ziel dieser Doktorarbeit bestand darin, das Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Wirkung des natürlichen Kofaktors Tetrahydrobiopterin als pharmakologisches Chaperon zugrunde liegen, weiter zu vertiefen. Hierzu sollten drei Teilziele verfolgt werden. 1. Die thermische Stabilität und die Bildung löslicher Proteinaggregate sind zentrale pathophysiologische Parameter bei missense-induziertem Funktionsverlust varianter PAH- Proteine. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten daher das Verfahren der ANS- Fluoreszenzspektroskopie und des right angle light scattering weiter entwickelt werden, um den Einfluss des natürlichen Kofaktors BH 4 auf die thermische und kinetische Proteindenaturierung sowie auf die Proteinaggregation am PAH-Wildtypprotein und an varianten Proteinen zu untersuchen. 2. Zum besseren Verständnis der Struktur-Wirkungs-Beziehung von BH 4 sollte der Effekt dreier Derivate des natürlichen Kofaktors auf das PAH-Wildtypprotein und auf drei variante PAH-Proteine eingehend untersucht werden. Hierzu kamen das oxidierte BH 4 - Analogon BH 2, die Vorstufe Sepiapterin und der synthetische Kofaktor 6-MPH 4 zum Einsatz. Da sich die Substanzen in Bezug auf das Pteridingerüst und auf die Seitenkette von BH 4 unterscheiden, sollten diese Experimente dazu beitragen, herauszuarbeiten, welche Molekülstruktur die stabilisierende Wirkung auf das PAH-Protein ausübt. Auf dieser Grundlage könnte ein verbessertes Molekül für die maßgeschneiderte Therapie von PKU- Patienten entwickelt werden. 3. In Zusammenarbeit mit anderen Mitgliedern der Arbeitsgruppe sollte der Nachweis erbracht werden, dass das mutagenisierte Mausmodell Pah enu1 mit milder Phenylketonurie zur Analyse der Wirkung des pharmakologischen Chaperons BH 4 auf die PAH geeignet ist und sich die Beobachtungen am murinen Protein auf das humane PAH-Protein übertragen lassen.

20 Material und Methoden Material und Methoden Alle experimentellen Arbeiten wurden im Forschungszentrum des Dr. von Haunerschen Kinderspitals der Ludwig-Maximilians-Universität in München durchgeführt. 2.1 Material Laborgeräte Gerät Markenname Hersteller Aufreinigungssystem ÄKTAxpress GE Healthcare (D) Chromatographiesäule Fluoreszenz-Mikroplatten- Lesegerät Fluoreszenz-Mikroplatten- Lesegerät Fluoreszenz- Spektrophotometer Küvettenhalter HiLoad 16/60 Superdex 200 column FLUOStar Optima LUMIStar Optima CARY Eclipse Peltier-Thermostatted Holder Multicell Küvettenschleuder KS 8 CE ITS (D) Laborschüttler Magnetrührer Vortex-Genie VF2 Variomag Monotherm Ikamag RCT GE Healthcare (D) BMG Labtech GmbH (D) BMG Labtech GmbH (D) Varian, Agilent Technologies (USA) Varian, Agilent Technologies (USA) Bender & Hobein AG (CH) IKA Labortechnik (D) Thermo Scientific (USA) IKA Labortechnik (D) ph-meter qph 70 VWR International (USA) Präzisionswaage Sartorius Extend Sartorius (D) Schüttelinkubator Sonifiziergerät Spektrophotometer Excella E24 Incubator Shaker System Branson Digital Cell Disruptor Ultrospec 1000 UV/ Visible Spectrophotometer Nano Drop ND 1000 New Brunswick Scientific, Eppendort (D) Branson, Emerson Industrial Automation (USA) Pharmacia Biotech (USA) Thermo Scientific (USA) Thermocycler Mastercycler personal Eppendorf (D) Allgemeine Verbrauchsmaterialien Name Eigenschaft Bezugsquelle Fluoreszenz-Küvetten F/Q/10/Z20 6 STARNA (D) Küvettenreiniger Hellmanex II Hellma Analytics (D) Petrischalen 92 x 16 mm ohne Nocken Sarstedt (D)

21 Material und Methoden 21 Pipettenspitzen Pipettierhilfen 5 µl, 10 µl, 100 µl, 1000 µl Biosphere Filter Tips Eppendorf research Gilson Pipetman Neo Gilson (USA) Eppendorf (D) Sarstedt (D) Eppendorf (D) Gilson (USA) Reaktionsgefäße Safe Seal Sarstedt (D) Zentrifugenröhrchen 15 ml 50 ml Corning CentriStar Sarstedt (D) Corning (USA) Chemikalien, Reagenzien Alle Lösungen wurden, sofern nicht anders angegeben, mit deionisiertem Wasser hergestellt und bei Bedarf autoklaviert oder steril filtriert. Name Bezugsquelle 1 kb DNA ladder Life Technologies GmbH Invitrogen (D) 6-Methyltetrahydropterin (6-MPH 4 ) 8-anilino-1-naphtalensulfonsäure (ANS) Aqua ad iniectabilia Coomassie Brilliant Blue Dihydrobiopterin (BH 2 ) Dithiothreitol (DTT) Eisenammoniumsulfat Ethanol in aqua dest. Ethidiumbromid Flüssiger Stickstoff Gel Loading Solution Isopropanol Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Kaliumchlorid LE Agarose Magnesiumchlorid Magnesiumsulfat Natriumchlorid Salzsäure Tetrahydrobiopterin (BH 4 ) Schircks Laboratories (CH) Sigma-Aldrich Co. LLC. (D) B. Braun Melsungen (D) SERVA Electrophoresis GmbH (D) Schircks Laboratories (CH) Fluka, Sigma-Aldrich Co. LLC. (D) Sigma-Aldrich Co. LLC. (D) Apotheke der Universität München (D) Carl Roth GmbH (D) Linde AG (D) Sigma-Aldrich Co. LLC. (D) Apotheke der Universität München (D) Thermo Scientific Inc. (USA), ehem. Fermentas Merck (D) Biozym Scientific GmbH (D) Merck (D) Merck (D) Merck (D) Merck (D) Schircks Laboratories (CH) Puffer und Lösungen Die allgemein gebräuchlichen Puffer wurden mit H 2 O bidest. aus der Apotheke Klinikum Innenstadt der LMU hergestellt und im Anschluss gefiltert und entgast.

22 Material und Methoden 22 Puffer Zusammensetzung Kommentar HEPES-Puffer Lysepuffer TE-Puffer TBS-Puffer TBE-Puffer 20 mm HEPES 200 mm NaCl 1 mm DTT 1 mm EDTA 20 mm TRIS 10 mm TRIS 1 mm EDTA 20 mm TRIS 140 mm NaCl 90 mm TRIS 90 mm Borsäure 2 mm EDTA ph 7,0 ph 8,0 ph 8,0 ph 7,5 ph 8, Bakterienstämme Name Bezugsquelle Kommentar DH5α Competent Cells Subcloning Efficiency One Shot ccdb Survival T1 Phage-Resistant Cells Life Technologies GmbH Invitrogen (D) Life Technologies GmbH Invitrogen (D) E.coli Ca 2+ kompetent E.coli ccdb-resistent für Gateway -Produkte Anzuchtmedien Die allgemein gebräuchlichen Medien wurden mit H 2 O bidest., das aus der Apotheke Klinikum Innenstadt der LMU bezogen wurde, hergestellt und im Anschluss bei 120 C 20 Minuten autoklaviert. Medium Zusammensetzung Kommentar LB-Medium LB Agar-Platten Selektive LB Agar-Platten SOC-Medium Hefeextrakt 0,5 % Trypton 1 % NaCl 0,5-1 % LB-Medium 2 % Agar LB-Medium 2 % Agar Antibiotikum (s ) Hefeextrakt 0,5 % Trypton 2 % 10 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 10mM MgCl, 10 mm MgSO 4 in H 2 O bidest. autoklavieren ph 7,4 20 Minuten Inkubation Zugabe von Antibiotikum nach abkühlen auf 50 C 20 Minuten Inkubation in H 2 O bidest. autoklavieren Zugabe von 20 mm Glukose

23 Material und Methoden Antibiotika Antibiotikum Ampicillin Chloramphenicol Bezugsquelle SERVA Electrophoresis GmbH (D) Sigma-Aldrich Co. LLC. (D) Kits zur Isolierung von Plasmiden aus Bakterienkulturen Kit QIAprepSpin Miniprep QIAfilter Plasmid Midi QIAfilter Plasmid Maxi Bezugsquelle Qiagen, Hilden (D) Qiagen, Hilden (D) Qiagen, Hilden (D) Enzyme Restriktionsendonukleasen Enzym Schneidesequenz Bezugsquelle EcoRI HindII/ HincII HpaI/ KspAI NdeI NotI 5'...G A A T T C...3' 3'...C T T A A G...5' 5'...G T Y R A C...3' 3'...C A R Y T G...5' 5'...G T T A A C...3' 3'...C A A T T G...5' 5'...C A T A T G...3' 3'...G T A T A C...5' 5'...G C G G C C G C...3' 3'...C G C C G G C G...5' Thermo Scientific Inc. (USA) ehem. Fermentas Thermo Scientific Inc. (USA) ehem. Fermentas Thermo Scientific Inc. (USA) ehem. Fermentas Thermo Scientific Inc. (USA) ehem. Fermentas Thermo Scientific Inc. (USA) ehem. Fermentas Enzymatische Abspaltung des Fusionspartners Um das zur Proteinaufreinigung benötigte maltosebindende Protein (MBP) von der PAH zu trennen, wurden vektorabhängig zwei unterschiedliche Enzyme verwendet. Enzym Vektor Schneidesequenz Bezugsquelle Enterokinase pmalc2e pmalc2e DEST Asp-Asp-Asp-Asp-Lys AG Muntau, LMU (D) Faktor Xa pmalc2x pmalc2x DEST Ile-(Glu/Asp)-Gly-Arg AG Muntau, LMU (D) Polymerase für die Polymerase-Kettenreaktion Zur Durchführung der PCR-Amplifikation von Genen wurde die Pfu-Polymerase von Thermo Scientific Inc., USA, ehem. Fermentas, verwendet, die eine hohe Hitzestabilität und

24 Material und Methoden 24 Replikationsgenauigkeit verspricht. Als Puffer wurde der Pfu-Puffer von Thermo Scientific Inc. verwendet Vektoren und cdna Name Codiertes Protein Bemerkung Bezugsquelle pcdna3.1/myc-his C Vektor pdonr TM 221 Gateway -Vektor pentr TM Gateway -Vektor pmalc2e Expressionsvektor pmalc2x Expressionsvektor cdna humane Wt-PAH Vektor mit Ampicillin- und Neomycin-Resistenzgen Donorvektor, beinhaltet attp-sites Expressionsvektor, beinhaltet attl-sites MBP Enterokinase-Schnittstelle MBP Faktor Xa Schnittstelle Humane Phenylalaninhydroxylase Life Technologies GmbH Invitrogen (D) Life Technologies GmbH Invitrogen (D) Life Technologies GmbH Invitrogen (D) New England Biolabs (USA) New England Biolabs (USA) imagenes (D) cdna murine Wt-PAH Murine Phenylalaninhydroxylase imagenes (D) Primer für Polymerase-Kettenreaktion Primer Konstrukt Sequenz PAH forward PAH in cdna GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTG CAT GTC CAC TGC GGT CC 3 PAH reverse PAH in cdna GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA CTT TAT TTT CTG GAG GGC AC 3 M13 u Entry Clone 5 GTA AAA CGA CGG CCA GTG 3 M13 r Entry Clone 5 GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3 pmal forward Expression Clone 5 CGT CAG ACT GTC GAT GAA GC 3 pmal reverse Expression Clone 5 - CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3

25 Material und Methoden Kit für DNA-Sequenzanalyse Für die DNA-Sequenzanalyse wurde das BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit von Life Technologies GmbH Invitrogen, Deutschland, verwendet Puffer für Restriktionsspaltungen Die Wahl des jeweiligen Puffers erfolgte in Abhängigkeit der gewählten Restriktionsendonukleasen nach Empfehlungen des Herstellers. Puffer Buffer EcoR I Buffer Orange Buffer Tango 2 x Bezugsquelle Thermo Scientific Inc. (USA) ehem. Fermentas Thermo Scientific Inc. (USA) ehem. Fermentas Thermo Scientific Inc. (USA) ehem. Fermentas Reagenzien für die Gateway -Klonierung Die für die Gateway-Klonierung verwendeten Vektoren und Bakterienstämme sind unter bzw aufgelistet. Enzym/ Puffer Reaktion Bezugsquelle BP Clonase II BP-Reaktion attb x attp -> attl x attr Life Technologies GmbH Invitrogen (D) LR Clonase II LR-Reaktion attl x attr -> attb x attp Life Technologies GmbH Invitrogen (D) TE Puffer BP- und LR-Reaktion Life Technologies GmbH Invitrogen (D) Software Software Bezugsquelle Adobe Reader X Optima Software, V2.20 Microsoft Office 2010 Prism Graph Pad, V 5.0 Reference Manager, V 11 Sequence Navigator Zoner Draw, V 4 Adobe Systems Software Ireland Ltd. (GB) BMG Labtech GmbH (D) Microsoft Deutschland GmbH (D) GraphPad Software, Inc. (USA) Thomson Reuters Corporation (USA) Applied Biosystems, Thermo Scientific Inc. (USA) Zoner Inc. (USA)

26 Material und Methoden Methoden Molekularbiologische Methoden Anzucht von E. coli-kulturen Die Anzucht von E. coli-kulturen erfolgte über Nacht bei 37 C in LB-Medium auf Agar-Platten bzw. in Falcon-Röhrchen oder Erlenmeyerkolben. Je nach Bedarf wurden zur Anzucht Antibiotika zugegeben Glycerin-Dauerkulturen für die langfristige Lagerung Um E. coli-kulturen längerfristig lagern zu können, wurden Glycerin-Stocks angelegt. Hierfür wurden von den gewünschten E. coli-kulturen je 0,2 ml in 0,8 ml einer sterilen Lösung aus 50% Glycerol und 50% LB-Medium gegeben und anschließend bei -80 C eingefroren DNA-Transformation DNA-Transformation bedeutet die Aufnahme freier DNA in Zellen. Für die Transformation wurden in der Regel chemisch kompetente E. coli DH5α Zellen verwendet. Zur Transformation wurden 50 µl der auf Eis aufgetauten Zellen mit 2 µl des gewünschten DNA-Plasmids versetzt. Dieser Ansatz wurde über 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der auf diesen Kältestress folgende Hitzeschock bei 42 C über 90 Sekunden ermöglicht die DNA- Aufnahme in die chemisch kompetenten Zellen. Anschließend wurden die Zellen für 90 Sekunden wieder auf Eis gekühlt. In diesem Zeitraum verschließen sich die Poren der Zellmembran, es kann keine weitere DNA aufgenommen werden. Zur Expression der Resistenzgene erfolgte nach Zugabe von 200 µl LB-Medium eine 90- minütige Inkubation bei 37 C im Schüttelinkubator. Daran anschließend wurden 150 µl des Transformationsansatzes zur Selektion der erfolgreich transformierten Zellen auf Ampicillinhaltigen Selektivagarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37 C inkubiert. Nur diejenigen Zellen, die das Plasmid mit dem Ampicillin-Resistenzgen aufgenommen hatten, bringen Kulturen hervor. Zur DNA-Transformation der Gateway -Leervektoren wurden One Shot ccdb Survival T1 Phage-Resistant Zellen benutzt. Diese sind gegenüber dem toxischen Effekt (Hemmung der Bakteriengyrase) des ccdb-gens resistent und deshalb besonders geeignet bei Vektoren, die dieses Gen enthalten, wie es bei den Gateway -Vektoren der Fall ist. Die Transformation erfolgte analog zu der in E. coli DH5 α Zellen, mit dem Unterschied, dass der Hitzeschock bei 42 C nur über 30 Sekunden durchgeführt wird. Nach Transformation wurden die Zellen auf ampicillin- und chloramphenicolhaltige Selektivagarplatten ausgestrichen.

27 Material und Methoden Isolierung von Plasmiden aus Bakterienkulturen Mini-Prep von Plasmid-DNA Das Prinzip der Plasmidgewinnung besteht darin, ein Pellet aus rekombinanten Bakterien zu resuspendieren und im Anschluss zu lysieren. Die Isolierung von Plasmiden aus Bakterienkulturen wurde mit Hilfe des QIAGEN QIAprepSpin Miniprep Kits nach Herstellerprotokoll durchgeführt. Durch Zugabe von speziellen, im Kit zur Verfügung gestellten Puffern kommt es zur Ausfällung von denaturierten Proteinen. Während Zellreste und denaturierte Proteine abzentrifugiert werden, bindet die DNA an eine mit einer positiv geladenen Silikat-Membran überzogenen Säule und kann so vom Überstand getrennt werden. Durch Zugabe von H 2 O bidest. wird die DNA von der Säule gewaschen und kann in einem Reaktionsgefäß aufgefangen werden. Durch Anwendung dieses Verfahrens können aus 5 ml Kulturen bis zu 20 µg DNA (Herstellerangabe) gewonnen werden Midi- und Maxi-Prep von Plasmid-DNA Für größere Mengen an DNA wurde zur Plasmidisolation der Qiagen Midi- bzw. Maxi-Prep Kit verwendet. Mit dem Midi-Prep System können aus 50 ml Bakterienkultur bis zu 250 µg Plasmid-DNA und mit dem Maxi-Prep System bis zu 1 mg Plasmid-DNA aus 250 ml Bakterienkultur gewonnen werden; zudem resultiert eine reinere DNA-Qualität. Die Verfahren wurden nach Herstellerprotokoll durchgeführt (Mengenangaben sind Herstellerangaben) Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration Mit Hilfe des NanoDrop-Spektrophotometers kann die DNA-Konzentration in einem Probenvolumen von nur 1 µl bestimmt werden. Hierzu wurde die Extinktion der Probe bei 260 nm gegen einen Tropfen H 2 O bidest (Leerwert) gemessen. Eine Extinktion von 1,0 entspricht hierbei einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml. Um eventuelle Probenverunreinigungen durch Proteine festzustellen, wird auch die Extinktion bei 280 nm gemessen und der Quotient aus 260/280 gebildet. Der Quotient reiner DNA liegt bei 1,8; ist der Quotient kleiner als 1,8, liegt eine Verunreinigung vor Klonierung eines Vektors für die prokaroyte Expression der humanen Wildtyp- PAH und Varianten der PAH Polymerase Kettenreaktion Die Vervielfältigung der gewünschten Gene sowie die Klonierung der Restriktionsschnittstellen in die DNA-Fragmente erfolgten mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion (PCR). Als Vorlage wurde die entsprechende cdna verwendet; die eingesetzten Primer sind unter Punkt aufgelistet.

28 Material und Methoden 28 PCR-Ansatz DNA-Matrize 1 µl Primer forward 1,5 µl Primer reverse 1,5 µl dntps 1 µl Pfu-Polymerase 0,75 µl Pfu-Puffer 5 µl Aqua bidest ad 20 µl Im Mastercycler wurde mit folgendem Programm die Amplifikation durchgeführt. Schritt Temperatur Dauer Wiederholungen Initiale Denaturierung 96 C 120 Sekunden Denaturierung 96 C 15 Sekunden Annealing 53 C 60 Sekunden 30 Elongation 60 C 60 Sekunden Hold 4 C Site-Directed Mutagenesis Ausgehend vom pentry-vektor der Wildtyp-PAH wurden über die Methode der Site- Directed Mutagenesis (SDM) Punktmutationen in die cdna der Wildtyp-PAH einbracht, um die gewünschten PAH-Varianten zu erhalten. Die SDM wurde von Dunja Reiß mit Hilfe des PCR-basierten QuikChange site-directed mutagenesis Kits von Stratagene durchgeführt; die Expressionsvektoren der varianten PAH-Varianten wurden mir von ihr zur Verfügung gestellt. Die SDM wurde nach Herstellerangaben durchgeführt Vektor pmalc2e Die cdnas der humanen PAH, der murinen PAH und ihrer Varianten wurden im Anschlussan die SDM in den pmalc2e Expressionsvektor kloniert, der für ein N-terminales Maltose-bindendes Protein kodiert und eine Schnittstelle für das Enzym Enterokinase aufweist. Die in den Vektor klonierte cdna der PAH wird als Fusionsprotein an das MBP gebunden exprimiert. Die Eigenschaft an Maltose zu binden, qualifiziert MBP als Trägerprotein zur Aufreinigung rekombinanter Fusionsproteine, denn erst dadurch wird die affinitätschromatographische Aufreinigung der Proteine ermöglicht. In einem späteren Schritt kann der MBP-Tag/Fusionspartner vom gewünschten Protein enzymatisch durch die Enterokinase abgespalten werden.

29 Material und Methoden Vektor pmalc2x Die cdna der humanen PAH und ihrer Varianten wurde auch in den pmalc2x Expressionsvektor kloniert, der eine Schnittstelle für die Restriktionsprotease Faktor Xa aufweist. Wie pmalc2e kodiert auch dieser Vektor für einen N-terminalen MBP-Affinitätstag, der im exprimierten Fusionsprotein enzymatisch durch Faktor Xa abgespalten werden kann Gateway Vektoren Die oben beschriebene Klonierung von cdnas in konventionelle pmalc2-vektoren ist zeitaufwändig und häufig wenig effizient. Invitrogen hat eine neuartige Klonierungsmethode entwickelt, die auf dem Rekombinations-Prinzip des Lambda-Bakteriophagen beruht. Der λ- Phage ist ein Virus, der mit Hilfe bestimmter Enzyme seine DNA in das Genom eines Bakteriums integriert; dieser Vorgang stellt die Basis der Gateway -Technologie dar. Die Klonierung findet in zwei aufeinander folgenden Rekombinationsreaktionen statt, die als BP- und LR-Reaktionen (Gateway -Nomenklatur) bezeichnet werden. Im ersten Schritt werden innerhalb der lysogenen BP-Reaktion die Entry Clones hergestellt, im zweiten Schritt erfolgt durch die lytische LR-Reaktion die Generierung von Expression Clones (s.u.). Die DNA-Rekombination erfolgt innerhalb des Gateway -Systems an spezifischen Verbindungsstellen, auch attachment (att)-sites genannt. Das gewünschte Gen wird von att-sites flankiert und kann gegen ebenfalls att-site-flankierte Genfragmente im Zielvektor reversibel ausgetauscht werden. Sofern nicht anders beschrieben, wurden für die Untersuchungen in dieser Doktorarbeit Plasmide verwendet, die über die Gateway -Klonierungsmethode hergestellt wurden. Generierung von Entry Clones über die BP-Reaktion Zur Herstellung von Entry clones wird innerhalb der lysogenen BP-Reaktion das gewünschte Gen (z. B. ein PCR-Produkt oder ein linearisierter Expression Clone) in einen Donorvektor integriert. Im Fall der vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich att-site-flankierte PCR- Produkte verwendet. Die Rekombination erfolgte an den spezifischen att-sites. BP-Reaktion PCR-Produkt 50 ng attb-flankiert pdonr ng attp-flankiert BP Clonase II 1 µl TE-Puffer ad 5 µl Die Inkubation erfolgte in einem PCR-Cycler bei 25 C über 17 Stunden. Im Anschluss wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 µl Proteinase K bei 37 C über 10 Minuten beendet. Je 1 µl des Reaktionsansatzes wurde für die Transformation von E. coli DH5α Zellen verwendet.

30 Material und Methoden 30 Mit Hilfe der Entry Clones kann in einem nächsten Schritt das gewünschte Gen mit geringem Aufwand in einen Expressionsvektor kloniert werden. Generierung von Expression Clones über die LR-Reaktion Expression Clones wurden durch eine im Rahmen der LR-Reaktion aus den unter erstellten Entry Clones und DEST-Vektoren erstellt. Auch bei dieser Rekombinationsreaktion spielen die att-sites eine wichtige Rolle. LR-Reaktion Entry Clone ng attl-flankiert pdest (pmalc2e/ pmalc2x) 150 ng attr-flankiert LR Clonase II 2 µl TE-Puffer ad 8 µl Die Inkubation erfolgte bei 25 C über 1 bis 18 Stunden, wobei im Rahmen dieser Arbeit in der Regel über Nacht inkubiert wurde. Im Anschluss wurde die LR-Clonase durch 1 μl Proteinase K (37 C, 10 min) inaktiviert. Es folgte die Transformation von E. coli DH5α Zellen mit 1 μl des Reaktionsansatzes Restriktionsverdau mit Endonukleasen Zur Kontrolle der richtigen Orientierung der cdna innerhalb des Vektors erfolgte ein Restriktionsverdau durch Restriktionsendonukleasen. Hierbei handelt es sich um Enzyme, die doppelsträngige DNA an spezifischen Erkennungssequenzen schneiden und somit zirkulär vorliegende DNA-Vektoren bzw. DNA- Plasmide linearisieren. Abhängig davon, an welcher Stelle der Vektor bzw. das Plasmid geschnitten werden soll, wird die jeweils spezifische Restriktionsendonuklease gewählt. Einzelrestriktionsverdau DNA-Matritze 2,0 µl Restriktionsendonuklease 0,3 µl Puffer 2,0 µl Aqua bidest. ad 10 µl Doppelrestriktionsverdau DNA-Matritze 2,0 µl Restriktionsendonuklease 1 0,3 µl Restriktionsendonuklease 2 0,3 µl Puffer 2,0 µl Aqua bidest. ad 10 µl

31 Material und Methoden 31 Die Restriktionsansätze wurden bei 37 C für 90 Minuten inkubiert. Im Anschluss kann die Länge der entstandenen linearen DNA-Fragmente durch eine Agarose-Gelelektrophorese bestimmt werden. Durch Verwendung von einer oder zwei Restriktionsendonukleasen in verschiedenen Ansätzen entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge. So kann schnell und effizient eine Kontrolle der generierten Vektoren und Plasmide durchgeführt werden Agarose-Gelelektrophorese Bei einer DNA-Gelelektrophorese werden DNA-Moleküle in einem Agarosegel gemäß ihrer Größe aufgetrennt. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde mit 0,9% Agarosegelen gearbeitet. Zur Herstellung der Gele wurden 0,9 g LE-Agarose in 100 ml TBE-Puffer gegeben und für 2 Minuten gekocht. Nach Abkühlen auf etwa 60 C wurden 0,5 mg des Farbstoffs Ethidiumbromid zugesetzt. Die Aushärtung und Auspolymerisierung des Gels erfolgte in einer horizontalen Wanne und dauerte bei Raumtemperatur etwa 30 Minuten. Die Wanne zur Gelaushärtung wurde an einem Ende mit einem Kamm versehen, so dass Aussparungen im Gel entstehen, in die später die Proben pipettiert werden konnten. Nach Aushärtung wurde das Gel in eine mit TBE-Puffer gefüllte Gelkammer gelegt. Von den zu untersuchenden DNA-Proben wurden je 10 µl mit jeweils 2 µl Ladepuffer (Gel Loading Solution) vermischt und in die Geltaschen aufgetragen. Die DNA-Fragmente wurden bei 100 V und etwa 100 ma für ca. 1 h im elektrischen Feld aufgetrennt. Ethidiumbromid interkaliert dabei in die DNA-Helix und fluoresziert bei Anregung durch UV-Licht, wodurch die DNA Fragmente visualisiert werden konnten. Ihre Länge ließ sich anhand eines Molekulargewichts-Standards abschätzen, der bei jeder Gelelektrophorese mitgeführt wird. Zur Dokumentation wurden die Agarosegele während der UV-Belichtung fotografiert Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Um DNA-Fragmente nach einer Agarose-Gelelektrophorese weiter verwenden zu können, mussten diese aus dem Gel aufgereinigt werden. Hierfür wurde das QIAquick Gel Extraction Kit nach Herstellerangaben verwendet. Bei dieser Methode werden die DNA-Fragmente zunächst aus dem Agarosegel gelöst, dann an eine Silikatmatrix auf einer Säule gebunden, mehrfach gewaschen und durch Zugabe von H 2 O bidest. eluiert Sequenzierung der Plasmide nach Sanger Um Fehler in der Basenabfolge der PAH auszuschließen, erfolgte die Sequenzierung des Plasmids mittels der Kettenabbruchmethode nach Sanger. Bei dieser Methode werden radioaktiv markierte Didesoxynukleodtide (ddntps) zu einem DNA-Polymerisationsansatz gegeben. Bei diesen ddntps fehlt am 3`-C-Atom die Hydroxyl (OH-)-Gruppe, die für die Verknüpfung mit der Phosphatgruppe des nächsten Nukleotids notwendig ist.

32 Material und Methoden 32 Bei Einbau eines solchen ddntp anstelle eines Desoxyribonukleotides in den DNA-Strang kann keine weitere Elongation des Stranges erfolgen. Die Methode wird in vier verschiedenen Ansätzen durchgeführt, in denen jeweils ddntps eines bestimmten Nukleotid vorliegen so kann im Anschluss an die DNA-Polymerisation eine Gelelektrophorese durchgeführt werden, in der die markierten Abbruchprodukte aus jedem Ansatz der Länge nach aufgetrennt werden. Über einen Vergleich der entwickelten Gele kann auf die Sequenz der DNA-Matrize geschlossen werden (Sanger et al. 1977). Anstelle der radioaktiv markierten ddntps werden inzwischen Derivate des Fluoreszenzfarbstoffes Rhodamin aus dem BigDye -System von Applied Biosystems verwendet, so dass die Methode im Unterschied zur Ursprünglichen in einem Ansatz durchgeführt werden kann. Zur Probenvorbereitung wurde folgender Ansatz auf Eis pipettiert. Material Konzentration Menge DNA-Matrize 50 ng 1,0 2,0 µl Primer (forward/ reverse) 10 pmol/µl 1,0 µl BigDye -Mix 2,0 µl Aqua bidest ad 5 µl Im Mastercycler wurde mit folgendem Programm die Amplifikation durchgeführt. Schritt Temperatur Dauer Wiederholungen Denaturierung 96 C 15 Sekunden Annealing 53 C 15 Sekunden 30 Elongation 60 C 4 Minuten Hold 4 C Die weiteren Schritte der Sequenzierung wurden von der Firma Eurofins Medigenomix GmbH, Martinsried, durchgeführt. Die Auswertung der Sequenzen erfolgte mithilfe des Computerprogrammes Sequence Navigator Proteinexpression aus pmalc2e/pmalc2x und pmalc2e/x DEST-Vektoren zur Durchführung eines Expressionstests Die Kultur aus transformierten E.coli-Zellen wurde bei 37 C bis zu einem OD Wert von 0,5 0,6 inkubiert. Dann erfolgte die Induktion der Proteinexpression durch Zugabe von 150 µl einer 0,1 molaren IPTG-Lösung. Dieser Ansatz wurde im Anschluss für weitere Stunden bei 28 C (Gateway -Klonierung) resp. 37 C (konventionelle Klonierung) inkubiert.

33 Material und Methoden 33 Ansatz Vorkultur LB-Medium 5 ml 50 ml Ampicillin 50 µl Abschließend wurden jeweils 5 ml der Kultur in Falconröhrchen überführt, abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die erhaltenen Bakterienpellets wurden entweder sofort weiter verarbeitet oder bis zum weiteren Gebrauch eingefroren Isolierung der Proteine aus E.coli-Zellen Zur Isolierung der Proteine aus Bakterienkulturen wurden die nach der Proteinexpression erhaltenen Pellets in je 500 µl Lysepuffer auf Eis resuspendiert und in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt. Für den Zellaufschluss wurde jede Probe dreimal je 15 Sekunden lang sonifiziert und währenddessen auf Eis, das zur weiteren Absenkung der Temperatur mit Ethanol versetzt war, gekühlt. Einstellungen (Proteinexpression) Zeit 15 Sekunden Amplitude 10 % Puls Pause 0,8 Sekunden 0,2 Sekunden Im Anschluss wurden die sonifizierten Lösungen über 15 Minuten bei Umdrehungen/ Minute bei 4 C abzentrifugiert, um lösliche von unlöslichen Zellbestandteilen zu trennen. Die Proteine befanden sich im Überstand Proteinexpression und -isolierung zur Proteinaufreinigung Um größere Mengen an Proteinen zu erhalten, wurde eine Hauptkultur hergestellt. Ansatz Vorkultur LB-Medium Ampicillin 20 ml 1000 ml 1 ml Die Proteinexpression wurde wie unter beschrieben durchgeführt. Um ein gutes Wachstum der Bakterienkultur zu gewährleisten, wurde das LB-Medium mit 10 ml Glukose versetzt. Um die aus den Hauptkulturen resultierenden Pellets zu sonifizieren, wurden diese

34 Material und Methoden 34 zunächst in 20 ml HEPES-NaCl-Puffer gelöst. Zur Sonifizierung wurden folgende Einstellungen gewählt. Einstellungen Zeit 45 Sekunden Amplitude 10 % Puls Pause 0,8 Sekunden 0,2 Sekunden Für den Zellaufschluss wurde jede Probe in fünf Zyklen sonifiziert und in den Pausen in einem Eis-Ethanolgemisch gekühlt Aufreinigung der rekombinanten MBP-PAH Fusionsproteine durch Affinitätsund Größenausschlusschromatographie Um aus dem unter gewonnen Rohextrakt das gewünschte PAH-Fusionsprotein zu isolieren, erfolgte zunächst die affinitätschromatographische Proteinaufreinigung. Diese wurde bei 4 C an der ÄKTAxpress mit einer MBPTrap-Amyloseharzsäule durchgeführt. Mit dieser Amyloseharzsäule wird die hohe Bindungsaffinität des MBP an Amylose ausgenutzt: Das MBP-PAH Fusionsprotein bindet an die Amylose, während andere, überschüssige Zelllysatbestandteile von der Säule gewaschen werden. Die Elution des Fusionsproteins erfolgt durch einen maltosehaltigen Säulenpuffer. In einem zweiten Schritt werden die gewonnenen Fusionsproteine durch Größenausschlusschromatographie an der HiLoad 16/60 Superdex 200 Säule der Größe nach aufgetrennt. Diese Säule besteht aus einer porösen Matrix aus quervernetzter Agarose. Während kleinere Proteine in die Poren diffundieren können, durchlaufen größere Moleküle nur die Zwischenräume der Poren, haben demnach eine kürzere Wegstrecke zurückzulegen und werden schneller von der Säule eluiert als kleinere Moleküle. In Bezug auf die PAH wurden somit zunächst hochmolekulare Aggregate eluiert, gefolgt von MBP-PAH- Tetrameren (380 kda), MBP-PAH-Dimeren (190 kda) und MBP-PAH-Monomeren (95 kda) Die Fraktionen der Tetramere wurden gesammelt und aufkonzentriert. Abschließend erfolgte die photometrische Bestimmung der Proteinkonzentration. Die Reinheit der Proteine wurde durch eine abschließende SDS-Gelelektrophorese kontrolliert. Die beschriebene Aufreinigung der Enzyme wurde von Frau Dunja Reiß übernommen. Die Enzyme wurden mir freundlicherweise zur Verfügung gestellt Bestimmung der Proteinkonzentration Photometrische Bestimmung bei A 280 Die Absorption der Seitenketten aromatischer Aminosäuren bei einer Wellenlänge von 280 nm kann zur einfachen Bestimmung der Proteinkonzentration genutzt werden.

35 Material und Methoden 35 Hierzu wurde die Proteinlösung mit HEPES-Puffer verdünnt (i.d.r. 1:50 bzw. 1:100). Mindestens drei der verdünnten Lösungen wurden im Photometer mit Licht einer Wellenlänge von 280 nm angeregt und die Absorption bestimmt. Als Referenzwert diente HEPES-Puffer. Um die Konzentration zu berechnen, wurde der Mittelwert der gemessenen Absorptionen gemäß dem Lambert-Beerschen Gesetz durch den Absorptionskoeffizienten (ε 280 (1 mg/ml) = 1,63 beim Fusionsprotein und 1,0 bei der geschnittenen PAH) dividiert und mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford Der Bradfordtest dient der photometrischen Bestimmung der Proteinkonzentration mit Hilfe des Triphenylmethanfarbstoffs Coomassie-Brilliant-Blau, der an basische Seitenketten von Proteinen binden kann. In seiner ungebundenen (roten) Form liegt sein Absorptionsmaximum bei 470 nm. Bindet er jedoch an Proteine, kommt es zur Komplexbildung, die mit einer Blaufärbung und Verschiebung des Absorptionsmaximums auf 595 nm einhergeht. Um eine möglichst genaue Konzentration des Proteins zu erhalten, wurden unterschiedliche Proteinverdünnungen hergestellt und mit dem Coomassie-Farbstoff versetzt. In der Regel wurden Proben verwendet, in denen die Proteine in Konzentrationen von 1:20, 1:10, 1:5 oder unverdünnt vorlagen. Im FluoStarOPTIMA wurde die Proteinkonzentration gegen eine Standardproteinreihe spektrophotometrisch bestimmt. Als Standardprotein wurde bovines Serumalbumin (BSA) verwendet Fluoreszenzspektrophotometrische Messungen Die Fluoreszenzmessungen wurden an einem CaryEclipse Fluoreszenz-Spektrophotometer durchgeführt. Jeweils vier Küvetten konnten gleichzeitig in einem temperaturkontrollierten Peltier multicell holder (Varian) analysiert werden. Alle Experimente wurden, soweit nicht anders angegeben, mindestens als Triplikat durchgeführt. Alle Ergebnisse sind als Mittelwert mit Standardabweichung angegeben Differential Scanning Fluorimetry Mit der Methode der differential scanning fluorimetry (DSF) kann die thermische Denaturierung der PAH-Proteine analysiert werden. Um die Denaturierung über einen festgelegten Zeitpunkt zu beobachten wurde der Farbstoff 8-Anilino-1-naphthalensulfonsäure (ANS) eingesetzt. Dieser fluoresziert, sobald er an hydrophobe Seitenketten eines Proteins bindet. Diese hydrophoben Seitenketten befinden sich im nativen Zustand vorwiegend im Inneren eines Proteins; daher ist die durch gebundenen Farbstoff hervorgerufene Fluoreszenzintensität zunächst gering. Wird das Protein nun erhitzt, beginnt es, sich zu entfalten. Während der Entfaltung gelangen die hydrophoben Seitenketten zunehmend an die Oberfläche des Proteins, und ANS kann vermehrt daran binden. Dadurch steigt das

36 Material und Methoden 36 Fluoreszenzsignal. So kann über die Zunahme der Fluoreszenzintensität die Denaturierung des jeweiligen Proteins beobachtet werden. Die zu messenden Probenlösungen enthielten 6 µm PAH Protein in 20 mm Na-HEPES, 200 mm NaCl, 10 µm DTT und 10 µm Fe-Ammoniumsulfat sowie 1 mm ANS bei einem Probenendvolumen von 120 µl. BH 4, BH 2 und Sepiapterin wurden in finalen Konzentrationen von 43 µm, 75 µm und 200 µm eingesetzt. 6-MPH 4 wurde aufgrund einer niedrigeren Bindungsaffinität (Martinez et al. 1995) in höheren finalen Konzentrationen von 200 µm, 500 µm und 1000 µm zugegeben. Der Nullabgleich erfolgte vor jeder Messung mit Puffer (Na- HEPES, DTT, Fe-Ammoniumsulfat in den oben genannten Konzentrationen). Die Lösungen wurden vor Beginn der Messungen für zwei Minuten bei 25 C equibriliert. Die Analyse der thermisch induzierten Proteinentfaltung mittels ANS-Fluoreszenz erfolgte nach Zugabe von BH 4, BH 2 und 6-MPH 4 bei einer Emissionswellenlänge von 500 nm (Exzitationswellenlänge 395 nm, 5,0/10,0 nm Schlitzweite (Matulis et al. 2005; Hawe et al. 2008; Pey et al. 2008a)), während die Messungen nach Zugabe von Sepiapterin aufgrund der Eigenfluoreszenz von Sepiapterin bei einer Emissionswellenlänge von 480 nm und sonst gleichen Einstellungen durchgeführt wurden. Die Proteinentfaltung wurde im Temperaturbereich zwischen 25 und 60 C und einer Scan-Rate von 1,2 C pro Minute analysiert. Sofern nicht anders beschrieben, waren alle verwendeten Proteine mit Faktor Xa geschnitten und stammten aus unterschiedlichen Proteinaufreinigungen Kinetische Analyse der Denaturierung Die Untersuchung der zeitabhängigen Denaturierung erfolgte analog zu ANS-DSF bei einer Emissionswellenlänge von 500 nm bzw. 480 nm, einer Exzitationswellenlänge von 395 nm und Schlitzweite von 5,0/10,0 nm. Die Entfaltung wurde bei fest eingestellten Temperaturen von 41,5 C, 43 C, 44,5 C, 46 C und 47 C für den PAH-Wildtyp und die Variante R68S, sowie 38 C, 40 C, 42 C, 44 C und 46 C für die Varianten R261Q und Y417H der PAH durchgeführt. Die Messdauer variierte protein- und temperaturabhängig zwischen 35 und 100 Minuten. Die Zusammensetzung der untersuchten Proben erfolgte wie unter beschrieben Trübungsmessung Durch Trübungsmessungen kann eine temperaturabhängige Aggregation der Proteine und die damit einhergehende Bildung von löslichen Aggregaten beobachtet werden. Proteinaggregation entsteht dann, wenn hydrophobe Bereiche entfalteter Proteine miteinander in Wechselwirkung treten. Durch die entstehenden Proteinaggregate wird einfallendes Licht im rechten Winkel gestreut und kann gemessen werden. Deshalb wird diese Form der Untersuchung der Proteindenaturierung auch als Right Angle Light

37 Material und Methoden 37 Scattering bezeichnet. Als Exzitationswellenlänge wurden 330 nm verwendet, das gestreute Licht wurde bei einer Wellenlänge von 335 nm gemessen Statistische Auswertung Zur statistischen Auswertung wurde das Programm Prism 5.0 verwendet. Alle hier beschriebenen Gleichungen können in diesem Programm berechnet werden Auswertung der thermischen Proteindenaturierung Die Fraction unfolded (χ U ) der um die Eigenfluoreszenz des Puffers korrigierten Fluoreszenzspektren wurde durch folgende Gleichung berechnet (Pey et al. 2008b). χ U = [F (F N + m N T)]/[(F U + m U T) (F N + m N T)]. Hierbei entspricht F der experimentell bestimmten Fluoreszenzintensität, T der Temperatur in C, F N und F U sind die Fluoreszenzintensitäten des nativen und des entfalteten Zustands. Die Neigung der linearen Temperaturabhängigkeit wird über m N und m U eingebracht. Die Fraction unfolded (χ U ) wurde aus drei voneinander unabhängigen Experimenten berechnet. Um die temperaturabhängige Entfaltung der PAH nach Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen des Kofaktors BH 4 vergleichen zu können, wurden mit Hilfe der Boltzman- Sigmoidalgleichung die Temperaturübergänge (T m -Wert) berechnet. Der T m -Wert beschreibt den Wendepunkt, bei dem die Hälfte des Proteins bereits entfaltet vorliegt Auswertung der kinetischen Proteindenaturierung Zur Auswertung der zeitabhängigen Denaturierung wurden die Daten von jeweils drei voneinander unabhängigen Messungen analysiert und in die one-phase-association Gleichung eingesetzt, mit der sich eine einphasige, exponentielle Abhängigkeit beschreiben lässt. Y=Y 0 + (Plateau-Y 0 )*(1-exp (-K*x) ) Y 0 entspricht hierbei dem Y-Wert zum Zeitpunkt Null (x = 0), k entspricht der Konstante, die dem Kehrwert der x-achse entspricht, in diesem Fall also reziproke Minuten. Das Plateau ist erreicht, wenn sich der Y-Wert nicht mehr verändert. Mit Hilfe der Konstante K lässt sich über die Arrheniusgleichung die Aktivierungsenergie des Enzyms berechnen. ln (k) = - (E a /R) * 1/T + ln(a) E a ist dabei die Aktivierungsenergie, R entspricht der universellen Gaskonstante (8,314 J mol 1 K 1 ), T der Temperatur in Kelvin, k der oben berechneten Geschwindigkeitskonstante und A dem präexponentiellen Faktor (Arrheniusfaktor). Die Steigung m entspricht dabei dem

38 Material und Methoden 38 Ausdruck -(E a /R). Somit kann die Aktivierungsenergie aus der Geradensteigung m berechnet werden. E A = - m R Auswertung der Right Angle Light Scattering Messungen Aus den gewonnen Daten wurden mit Hilfe der Boltzman-Sigmoidalgleichung in Prism die Temperaturübergangspunkte (T m ) berechnet. Die Steigung der Geraden, die die Aggregation beschreibt, wurde über eine Exponentialgleichung erster Ordnung berechnet.

39 Ergebnisse Ergebnisse Ziel der Arbeit war die Untersuchung des Einflusses des natürlichen Kofaktors BH 4 auf die thermische und kinetische Proteindenaturierung sowie auf die Proteinaggregation des PAH- Wildtyp-Proteins und varianter Proteine. Zum besseren Verständnis der Struktur-Wirkungs- Beziehung von BH 4 sollte die vergleichende Charakterisierung des Effekts von BH 4 und seinen Derivaten BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 auf den PAH-Wildtyp und seine Varianten R68S, R261Q und Y417H erfolgen. Um diese Ziele zu erreichen, mussten zunächst einige in der Arbeitsgruppe bereits etablierte Methoden wie die temperatur- und zeitabhängige Denaturierung der PAH sowie die Methode des right angle light scattering auf die neuen Fragestellungen angepasst werden. Die für diese Doktorarbeit erforderlichen Etablierungsexperimente werden in Kapitel 3.1 beschrieben; in den darauf folgenden Kapiteln schließen die daraus resultierenden Ergebnisse an. 3.1 Etablierung spektrophotometrischer Methoden und Auswahl der Kofaktoren Abhängigkeit der Übergangstemperatur des murinen PAH Wildtyps von der Geschwindigkeit der Erwärmung während der thermischen Denaturierung Zur Analyse der Entfaltung der PAH-Proteine wurde der Farbstoff 8-Anilino-1- naphthalensulfonsäure eingesetzt. Dieser Farbstoff emittiert ein Fluoreszenzsignal, sobald er an hydrophobe Seitenketten eines Proteins bindet, nicht aber, wenn er gelöst in Puffer vorliegt. Um den Mechanismus der thermischen Denaturierung zu analysieren, wurde die Zunahme des ANS-Fluoreszenzsignals in einem definierten Temperaturintervall gemessen. Die Erwärmung der Probe in Grad Celsius pro Minute wurde dabei über die Scan-Rate, also die Dauer der schrittweisen Erhöhung der Temperatur, geregelt. Je geringer die eingestellte Scan-Rate, desto weniger wird die Probe in einer Minute erhitzt und desto länger dauert die Untersuchung mit einem festgesetzten Endpunkt. Um herauszufinden, ob die Scan-Rate einen Einfluss auf die Messergebnisse hat, wurde die Abhängigkeit der Übergangstemperatur von der Scan-Rate untersucht. Für diese Messungen wurde die bisher in der Arbeitsgruppe verwendete Scan-Rate von 1,2 C/min als Ausgangswert verwendet; ihr gegenübergestellt wurden Scan-Raten von 0,2 C/min und 0,7 C/min, sowie 2,0 C/min, bei der der festgesetzte Endpunkt schneller erreicht wird. Abbildung 3 zeigt den Übergang des murinen PAH-Wildtyps vom nativen in den denaturierten Zustand in Abhängigkeit von der Temperatur. Die Messung wurde bei einer

40 Ergebnisse 40 Temperatur von 25 C begonnen und nach Erreichen der maximalen Fluoreszenzintensität beendet. Abbildung 3: Temperaturabhängige Entfaltung des murinen PAH-Wildtyp Proteins bei unterschiedlichen Scan-Raten. Mit zunehmender Temperatur steigt die Fluoreszenzintensität an, das heißt, dass zunächst frei vorliegendes ANS an hydrophobe Seitenketten des Proteins bindet und daraufhin eine stärkere Fluoreszenz detektierbar ist. Ab einer gewissen Temperatur erreicht die Fluoreszenzintensität ein Maximum: das Protein liegt in gänzlich entfaltetem Zustand vor, es werden keine weiteren ANS-Bindungsstellen frei. Bei einer weiteren Temperaturerhöhung wird die Stärke des Fluoreszenzsignals geringer, ANS kann entweder nicht mehr gebunden werden oder das Signal wird durch Störfaktoren im untersuchten Material nicht mehr detektiert. Dies spricht für eine zunehmende Aggregation der Proteine bei hohen Temperaturen. Während der Entfaltung weist die Wildtypform der murinen PAH vor und nach Zugabe des Kofaktors BH 4 zwei Temperaturübergänge (T m1/2 und T m2/3 ; Tabelle 2) auf. Dieses Entfaltungsmuster wurde bereits früher beschrieben und bildet die Grundlage für das Modell der dreiphasigen Entfaltung der murinen sowie humanen PAH (Thorolfsson et al. 2002). Der erste Temperaturübergang (T m1/2 ) entspricht der Entfaltung der vier N-terminalen regulatorischen Enzymdomänen. Der zweite Temperaturübergang (T m2/3 ) zeigt die Entfaltung der katalytischen Domänen. Das im Anschluss erreichte Fluoreszenzmaximum repräsentiert den Zustand der irreversiblen Proteindenaturierung (Thorolfsson et al. 2002; Gersting et al. 2008). Bei Vergleich der Denaturierungskurven fällt eine deutliche Rechtsverschiebung, also eine Entfaltung bei höheren Temperaturen, bei erhöhten Scan-Raten auf. Zur genauen Analyse erfolgte ein Vergleich der T m1/2 und T m2/3 -Werte.

41 Ergebnisse 41 Wt Mm PAH 0,2 C/min 0,7 C/min 1,2 C/min 2,0 C/min T m1/2 in C 38,29 41,72 47,90 47,76 T m2/3 in C 51,24 52,37 54,38 55,14 Tabelle 2: Vergleich der T m-werte nach Proteindenaturierung mit unterschiedlichen Scan-Raten. Die Ergebnisse zeigen, dass die Scan-Rate einen deutlichen Einfluss auf die Denaturierung der PAH-Proteine hat. Je mehr Zeit jedem Temperaturschritt gegeben wird, also je weniger Erwärmung in C pro Minute, desto früher entfalten die Domänen der PAH und desto niedriger ist die Temperatur, bei der eine vollständige Denaturierung des Proteins erreicht wird. Daher ist es notwendig, dass für alle vergleichenden Untersuchungen auch die gleiche Scan-Rate verwendet wird. Mit steigenden Scan-Raten fallen die Unterschiede in den T m - Werten geringer aus, es scheint zu einer Stabilisierung der Entfaltungsgeschwindigkeit bei höheren Scan-Raten zu kommen. Bei geringeren Scan-Raten besteht allerdings der Vorteil, dass aufgrund der langsameren Erhitzung mehr Datenpunkte zur Analyse vorliegen und die Entfaltung dadurch detaillierter abgebildet wird. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde deshalb für alle weiteren Untersuchungen die Scan-Rate von 1,2 C/min gewählt. Die resultierenden Übergangstemperaturen stimmen darüber hinaus gut mit den bereits bekannten Werten aus der Literatur überein Auswahl eines geeigneten PAH-Konstrukts für DSF-Messungen Zur Expression der PAH kann auf unterschiedliche Expressionsvektoren zurückgegriffen werden. Nachdem sich die Klonierung der Expressionsplasmide über das Gateway Cloning System der Firma Life Technologies GmbH, Invitrogen, durch einige Vorteile gegenüber der in unserer Arbeitsgruppe bereits etablierten konventionellen Klonierungsmethode auszeichnet, wurden Untersuchungen bezüglich der Vergleichbarkeit der aus pmalc2x DEST (Gateway Klonierung) und pmalc2x (konventionelle Klonierung) exprimierten Proteine durchgeführt. Beide Proteine enthalten zwischen Affinitätstag und PAH eine Schnittstelle für Faktor Xa. Für die in Abbildung 5 dargestellten DSF-Messungen wurden die von ihrem Fusionspartner abgetrennten PAH-Proteine verwendet.

42 Ergebnisse 42 Abbildung 4: Vergleich der temperaturabhängigen Denaturierung zweier humaner PAH-Wildtyp Proteine, die über unterschiedliche Klonierungssysteme hergestellt und aufgereinigt wurden. Das in grün abgebildete PAH-Wildtyp-Protein resultiert aus konventioneller Klonierung, das in orange abgebildete PAH-Wildtyp-Protein aus dem Gateway-Klonierungssystem. Der Vergleich der T m -Werte der über verschiedene Klonierungssysteme hergestellten und aufgereinigten PAH-Proteine zeigt keinen signifikanten Unterschied. Daher wurde bei allen weiteren DSF-Untersuchungen von humaner PAH das durch Anwendung der Gateway- Technologie hergestellte Plasmid zur Expression der PAH verwendet. T m1/2 ΔT m1/2 ( C) T m2/3 ΔT m2/3 ( C) Wt PAH pmalc2x Gateway -Klonierung Wt PAH pmalc2e konventionelle Klonierung 45,22-50,40-45,25 0,03 51,18 0,78 Tabelle 3: Vergleich der T m-werte der aus unterschiedlichen Klonierungssystemen aufgereinigten PAH- Wildtyp-Proteine. Das PAH-Protein kann sowohl basierend auf dem Vektor pmalc2e als auch auf dem Vektor pmalc2x exprimiert werden. Je nach Vektor liegt dann zwischen dem Affinitätstag MBP und der PAH entweder eine Schnittstelle für die Restriktionsprotease Enterokinase (pmalc2e) oder für Faktor Xa (pmalc2x) vor - unabhängig davon, ob das Plasmid konventionell oder durch Verwendung der Gateway-Technologie kloniert wurde. Im Gegensatz zur Enterokinase, die ausschließlich an der für sie vorgesehenen Schnittstelle schneidet, existiert bei Faktor Xa eine weitere Schnittstelle innerhalb der PAH. Diese zweite Schnittstelle befindet sich zwischen Arginin 13 und Lysin 14 der humanen PAH-Sequenz, so dass bei Inkubation mit Faktor Xa die 13 N-terminalen Aminosäuren des PAH-Proteins abgespalten werden. Aus Kostengründen wäre die Verwendung des mit Faktor Xa geschnittenen Proteins vorzuziehen. Um herauszufinden, ob sich der Verlust der 13 N-

43 Ergebnisse 43 terminalen Aminosäuren auf die Stabilität der PAH auswirkt, wurden die mit den beiden verschiedenen Proteasen inkubierten Proteine miteinander verglichen. Abbildung 5: Vergleich der temperaturabhängigen Denaturierung zweier humaner PAH-Wildtyp Proteine, beide aus Gateway-Vektoren aufgereinigt. Der in orange abgebildete PAH-Wildtyp wurde aus dem Vektor pmalc2x DEST exprimiert und aufgereinigt, das MBP-Tag wurde mittels Faktor Xa von der PAH abgespalten. Das in blau dargestellte PAH-Wildtyp-Protein wurde aus dem Vektor pmalc2e DEST exprimiert, aufgereinigt und im Anschluss mit Hilfe des Enzyms Enterokinase vom MBP-Tag getrennt. Für diese Untersuchungen wurde humanes Wildtyp-PAH Protein verwendet, dessen cdna unter Verwendung der Gateway -Technologie in die entsprechenden Vektoren kloniert worden war. T m1/2 ΔT m1/2 ( C) T m2/3 ΔT m2/3 ( C) Wt PAH pmalc2x 45,25-51,18 - Wt PAH pmalc2e 44,89-0,36 51,63 0,45 Tabelle 4: Vergleich der T m-werte der mit Faktor Xa bzw. Enterokinase geschnittenen PAH-Wildtyp Proteine. Der Vergleich der T m -Werte der unterschiedlich geschnittenen PAH-Proteine zeigt keinen signifikanten Unterschied. Daher können für die DSF-Messungen PAH-Proteine verwendet werden, deren Maltose bindendes Protein nach der Aufreinigung mittels Faktor Xa abgetrennt wurde und deren N-Terminus dadurch ggf. um 13 Aminosäuren verkürzt ist. Alle Messungen der DSF-Untersuchungen wurden in drei voneinander unabhängigen Experimenten durchgeführt. Die Proteine wurden aus Gateway -Plasmiden exprimiert, aufgereinigt und mit Faktor Xa geschnitten Etablierung des Assays zur kinetischen Proteindenaturierung Bei Messung der zeitabhängigen Denaturierung wird ein Protein bei einer voreingestellten Temperatur über ein bestimmtes Zeitintervall denaturiert und die sich verändernde Fluoreszenzintensität gemessen. Im Unterschied zur thermischen Denaturierung erfolgt also

44 Ergebnisse 44 kein gradueller Temperaturanstieg mit einer definierten Scan-Rate. Das Fluoreszenzsignal wird, wie bei der thermischen durch die an hydrophobe Seitenketten gebundenen ANS- Moleküle hervorgerufen. Die Auswahl der Temperaturen, bei denen die kinetischen Analysen durchgeführt wurden, erfolgte basierend auf den temperaturabhängigen Entfaltungskurven. Für den Wildtyp sowie für die Variante R68S wurden daraufhin fünf Temperaturstufen zwischen 41,5 C und 47,5 C für die Durchführung der kinetischen Denaturierung gewählt. Bei den Varianten R261Q und Y417H beginnt die Denaturierung schon bei deutlich geringeren Temperaturen. Deshalb wurden für diese Varianten fünf Temperaturstufen zwischen 38,0 C und 46,0 C zur weiteren Charakterisierung festgelegt. Abbildung 6: Auswahl der Temperaturen für die kinetische Proteindenaturierung am Bespiel der PAH- Varianten R68S und Y417H Messung der Proteinaggregation Über eine Trübungsmessung lässt sich die Aggregation von Proteinen in einer Lösung über die Zeit beobachten. Diese Methode des right angle light scattering, also die Detektion von Lichtstreuung im rechten Winkel zur Strahlungsquelle, hatten unter anderem auch Kleppe et al. bei ihrer Untersuchung der durch Harnstoff induzierten Proteinentfaltung verwendet (Kleppe & Haavik 2004). In diesen Untersuchungen war als Emissionswellenlänge 300 nm verwendet worden (Exzitiation 295 nm). Da es bei dieser Wellenlänge zu einer ausgeprägten Fluoreszenzlöschung durch BH 4 kommt, wurde für die Messungen im Rahmen der Doktorarbeit die Emissionswellenlänge von 335 nm (Exzitation 330 nm) verwendet Auswahl der zu untersuchenden PAH-Varianten Die Wahrscheinlichkeit einer BH 4 -Responsitivtät nimmt mit Zunahme des Schweregrades der PKU ab. So liegt die Häufigkeit eines BH 4 -responsiven Phänotyps bei den Patienten mit klassischer PKU bei lediglich 10% und steigt bei Patienten mit milder PKU auf über 80% an

45 Ergebnisse 45 (Muntau et al. 2002; Fiege & Blau 2007; Camp et al. 2014). Für die Untersuchungen in dieser Arbeit wurden demnach drei PAH-Varianten des PAH-Proteins gewählt, die bei Patienten aufgrund ihrer hohen Restaktivität (Staudigl et al. 2011) eine milde HPA zeigen. Die gewählten Varianten werden durch Mutationen verursacht, die in den drei verschiedenen Domänen der PAH liegen. Sie sind als BH 4 -sensitive Varianten bekannt, zeigen aber ein unterschiedliches Ansprechen auf eine Therapie mit dem Kofaktor (Erlandsen et al. 2004; Staudigl et al. 2011; Leuders et al. 2014). Die Mutation R68S führt in der regulatorischen Domäne der PAH zu einem Austausch der Aminosäure Arginin durch Serin an Position 68. Die Mutation R261Q liegt in der katalytischen Domäne der PAH, hier wurde Arginin an Position 261 durch Glutamin ersetzt. Diese Mutation führt zu einem Phänotyp am Übergang von der milden zur klassischen PKU. Bei der dritten untersuchten Variante Y417H kommt es zu einem Austausch der Aminosäure Tyrosin durch Histidin an Position 417 in der Oligomerisierungsdomäne (Erlandsen et al. 2004) Auswahl der Kofaktoren Sapropterindihydrochlorid (Kuvan ), die synthetische Form von BH 4 als natürlicher Kofaktor der PAH, wird bereits erfolgreich in der Therapie der PKU eingesetzt, es wirkt jedoch nicht bei allen Formen der Erkrankung. Um den Wirkmechanismus von BH 4 besser zu verstehen, bzw. um herauszufinden, welcher strukturelle Anteil des BH 4 -Moleküls für die Wirkung auf die PAH verantwortlich ist, wurde in dieser Arbeit sein Effekt mit dem seines oxidierten Analogons BH 2 und seiner Vorstufe Sepiapterin (SP) sowie des synthetischen Kofaktoranalogons 6-MPH 4 verglichen. Um diesen Vergleich anstellen zu können, wurden zunächst die Strukturformeln der verschiedenen Kofaktoren auf Ähnlichkeiten und Unterschiede hin analysiert. Hauptaugenmerk lag dabei auf den Unterschieden im Ringsystem bzw. der Dihydroxypropylseitenkette. (BH 4 ) (BH 2 ) (SP) (6-MPH 4 ) Abbildung 7: Strukturformeln des Kofaktors BH 4 und seiner Derivate BH 2, Sepiapterin (SP) und 6-MPH 4. Rot markiert sind die strukturelle Unterschiede im Vergleich zu BH 4. Der Kofaktor BH 4 wird während des durch die PAH katalysierten Abbaus von Phenylalanin zu Tyrosin zu BH 2 oxidiert. BH 2 weist somit im Vergleich zu BH 4 ein oxidiertes Ringsystem

46 Ergebnisse 46 auf, während die Seitenkette mit der von BH 4 identisch ist. Auch Sepiapterin verfügt wie BH 2 über ein höher oxidiertes Ringsystem. Es unterscheidet sich von BH 2 durch eine höher oxidierte Seitenkette in der die Hydroxylgruppe (OH) durch eine Carbonylgruppe (C=O) ersetzt ist. Das Pteringrundgerüst von 6-MPH 4 ist mit dem von BH 4 identisch, allerdings ist in 6-MPH 4 die Dihydroxypropylseitenkette durch eine kurze Methylgruppe (CH 3 ) ersetzt Auswahl der Kofaktor-Konzentrationen Bei den im Rahmen dieser Promotionsarbeit durchgeführten Messungen der thermischen und kinetischen Denaturierung wurde der Effekt unterschiedlicher Konzentrationen des Kofaktors BH 4 und seiner Derivate untersucht, um zu analysieren, wie sich unterschiedliche Kofaktorkonzentrationen auf die Stabilität des Enzyms auswirken. Der Kofaktor BH 4 wurde in allen Assays in den finalen Konzentrationen von 43 µm, 75 µm und 200 µm eingesetzt. Die Konzentration von 43 µm wurde gewählt, nachdem bei in vitro- Untersuchungen an PAH-Wildtyp-Mäusen 30 Minuten nach Gabe von 10 mg/kg Körpergewicht Tetrahydrobiopterin es handelt sich hier um die übliche Initialdosis bei der Behandlung von Patienten eine BH 4 -Spitzenkonzentration von durchschnittlich 43 µm BH 4 in Leberzellen gemessen wurde (Gersting et al. 2010a). Um zu untersuchen, ob höhere Dosen eine andere Wirkung erzielen, wurde zusätzlich mit BH 4 -Konzentrationen von 75 µm sowie 200 µm gearbeitet. Diese Konzentrationen wurden in Studien anderer Arbeitsgruppen als Standardkonzentrationen für die Durchführung von PAH-Aktivitätsmessungen (Martinez et al. 1995) sowie PAH-Inhibierungsuntersuchungen (Solstad et al. 2003) verwendet. Die in den Assays eingesetzten finalen Konzentrationen der BH 4 -Derivate BH 2 und Sepiapterin entsprachen den für BH 4 definierten Konzentrationen. Das synthetische Kofaktoranalogon 6- MPH 4 hat einen deutlich höheren K m -Wert als BH 4 (Martinez et al. 1995), sodass bei Verwendung der gleichen Konzentrationen keine vergleichbare Substratsättigung vorliegen würde. Deshalb wurden für diese Untersuchungen 6-MPH 4 -Konzentrationen von 200 µm, 500 µm und 1000 µm gewählt. 3.2 Analyse des Effekts des natürlichen Kofaktors Tetrahydrobiopterin auf die Denaturierung humaner Wildtyp-PAH Sapropterindihydrochlorid wird seit einigen Jahren in der Behandlung der BH 4 -sensitiven PKU eingesetzt. Nach wie vor ist aber das Wissen um die Enzymfunktion und die Wirkungsweise des natürlichen Kofaktors in der Therapie nicht ausreichend geklärt. In den im Folgenden beschriebenen Untersuchungen wurde zunächst der Effekt von BH 4 auf die Denaturierung humaner Wildtyp-PAH analysiert. Alle Messungen wurden in drei voneinander

47 Ergebnisse 47 unabhängigen Experimenten durchgeführt. Die Proteine wurden aus Gateway -Plasmiden exprimiert, aufgereinigt und mit Faktor Xa geschnitten Effekt von BH 4 auf das Entfaltungsmuster der Wildtyp-PAH im DSF-Assay Um den Effekt von Tetrahydrobiopterin auf die Faltung des Enzyms im nativen Zustand sowie auf die Entfaltung ausgelöst durch thermischen Stress beurteilen zu können, wurde zunächst die Entfaltung des PAH-Wildtyps ohne und mit Zugabe des Kofaktors BH 4 im DSF- Assay analysiert. Abbildung 8: ANS-Fluoreszenzmessung des PAH-Wildtyps ohne BH 4 (schwarz) und unter Zugabe von BH 4 in unterschiedlichen Konzentrationen. Abbildung 8 zeigt den Übergang des PAH-Wildtyps vom nativen Zustand zu Beginn der Messung bei 25 C in den denaturierten Zustand bei 65 C in Abhängigkeit von der Temperatur. Bei etwa 60 C erreicht die Fluoreszenzintensität ein Maximum und der PAH- Wildtyp liegt in gänzlich entfaltetem Zustand vor. Steigt die Temperatur weiter an, nimmt das Fluoreszenzsignal wieder ab. Dies spricht für eine zunehmende Aggregation des PAH- Wildtyps bei hohen Temperaturen. Nach Zugabe von BH 4 in unterschiedlichen Konzentrationen kommt es zu einer leichten Rechtsverschiebung der Entfaltungskurve zu höheren Temperaturen. Die durchgeführten Messungen zeigen somit eine konzentrationsabhängige Stabilisierung der thermischen Entfaltung des PAH-Wildtyps durch Bindung des natürlichen Kofaktors BH 4. T m1/2 ΔT m1/2 ( C) T m2/3 ΔT m2/3 ( C) Wt PAH 47,74-54,99 - Wt PAH + 43 µm BH 4 49,23 1,49 56,47 1,48 Wt PAH + 75 µm BH 4 49,13 1,39 57,35 2,36 Wt PAH µm BH 4 50,16 2,42 58,10 3,11 Tabelle 5: Vergleich der T m1/2 und T m2/3 Werte unter Zugabe von BH 4 in verschiedenen Konzentrationen.

48 Ergebnisse Analyse der kinetischen Denaturierung des PAH-Wildtyps im Komplex mit BH 4 Um zu untersuchen, wie sich BH 4 auf die Aktivierungsenergie der Entfaltung auswirkt, wurde zusätzlich zur thermischen Denaturierung auch eine kinetische Denaturierung durchgeführt. Zunächst erfolgte die Denaturierung des PAH-Wildtyps ohne Kofaktoren. Als Temperaturstufen wurden in Abhängigkeit von der thermischen Entfaltungskurve 41,5 C, 43,0 C, 44,5 C, 46,0 C sowie 47,5 C gewählt. Die Messung wurde nach Eintreten einer Plateauphase beendet (Abbildung 9). Abbildung 9: Kinetische Denaturierung des PAH-Wildtyps bei steigenden Temperaturen. In einem nächsten Schritt wurde die Denaturierung des PAH-Wildtyps nach Zugabe von 43 µm BH 4 bei identischen Temperaturen analysiert (Abbildung 10). Abbildung 10: Kinetische Denaturierung des PAH-Wildtyps bei steigenden Temperaturen unter Zugabe von je 43 µm BH 4. Die fünf Temperaturkurven zeigen, dass bei steigender Temperatur die vollständige Denaturierung des Proteins schneller eintritt, was an der bei höheren Temperaturen deutlich früher eintretenden Plateauphase zu erkennen ist. Bei Vergleich der beiden Abbildungen

49 Ergebnisse 49 lässt sich erkennen, dass nach Zugabe von BH 4 die Entfaltungskurven insgesamt flacher verlaufen und das Plateau bei der jeweiligen Temperatur erst zu einem späteren Zeitpunkt erreicht wird. Im Anschluss wurde die zeitabhängige Entfaltung des PAH-Wildtyps unter Zugabe von BH 4 in höheren Konzentrationen untersucht. Abb. 11 zeigt, dass die Konzentration des zugegebenen Kofaktors keine Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Denaturierung hat, wie hier exemplarisch für die Temperatur von 43 C gezeigt. Während die Messung des PAH-Wildtyps ohne BH 4 bereits 32 Minuten nach Erreichen des Plateaus beendet werden konnte, verdreifachte BH 4 in allen eingesetzten Konzentrationen die Messzeit der kinetischen Denaturierung. Abbildung 11: Kinetische Denaturierung des PAH-Wildtyps ohne BH 4 und nach Zugabe von BH 4 in drei unterschiedlichen Konzentrationen bei einer festgelegten Temperatur von 43 C Berechnung der Aktivierungsenergie Mit Hilfe einer einphasigen Exponentialfunktion 1. Ordnung wurden die Geschwindigkeitskonstanten k aus den Kurven der zeitabhängigen Denaturierung für jede Temperatur nach folgender Formel berechnet und in Tabelle 6 aufgelistet. Y=Y 0 + (Plateau-Y 0 )*(1-exp (-K*x) ) Hierbei ist Y 0 ist der Schnittpunkt des Graphen mit der Y-Achse, x entspricht der Zeit. T [ C] T [K] k [Wt] k [Wt + 43 µm BH 4 ] k [Wt + 75 µm BH 4 ] k [Wt µm BH 4 ] 41,5 314,65 0,0349 0,0147 0,0243 0, ,0 316,15 0,0512 0,0309 0,0358 0, ,5 317,65 0,0892 0,0568 0,0611 0, ,0 319,15 0,1240 0,0753 0,0917 0, ,5 320,65 0,1447 0,1604 0,1291 0,1673 Tabelle 6: Berechnete Geschwindigkeitskonstante k aus den Kurven der kinetischen Denaturierung über die einphasigen Assoziationsgleichung.

50 Ergebnisse 50 Um die auf den Geschwindigkeitskonstanten basierende Aktivierungsenergie zu berechnen, die es zu überwinden gilt, wenn das Enzym vom gefalteten, nativen Zustand in den entfalteten Zustand übergeht, wurde die Arrheniusgleichung verwendet. Die Arrheniusgleichung lautet k = A e E A RT. Im Arrheniusplot wird dabei der natürliche Logarithmus der Geschwindigkeitskonstante gegen den Kehrwert der Temperatur in Kelvin aufgetragen. So können die temperaturabhängigen Werte der Geschwindigkeitskonstanten auf einer Gerade abgebildet werden. Abbildung 12: Der Arrheniusplot zeigt den linearen Zusammenhang zwischend dem natürlichen Logarithmus der Geschwindigkeitskonstante k und der reziproken Temperatur in Kelvin (1/K) für den PAH-Wildtyp ohne und mit BH 4. Über die Steigung m der Arrheniusgeraden ließ sich nun aus der Arrheniusgleichung die Aktivierungsenergie E A in kj/mol berechnen. E A = - m R, wobei R die allgemeine Gaskonstante ist. Abbildung 13: Die aus dem Arrheniusplot berechnete Aktivierungsenergie (E A) des PAH-Wildtyps vor und nach Gabe von BH 4 in unterschiedlichen Konzentrationen.

51 Ergebnisse 51 Während für den PAH-Wildtyp eine Aktivierungsenergie von 204,70 kj/mol berechnet wurde, kam es nach Zugabe von 43 µm BH 4 zu einem Anstieg der Aktivierungsenergie um etwa 50%. Mit steigenden BH 4 -Konzentrationen wurde dieser Effekt schwächer und bei einer BH 4 - Konzentration von 200 µm war die Aktivierungsenergie etwas niedriger als die des Wildtyps ohne BH 4 -Zugabe. Das lässt vermuten, dass nur eine therapeutische BH 4 -Konzentration von 43 µm dazu in der Lage ist, den energetischen Übergang vom nativen, gefalteten Zustand des PAH-Wildtyps in den entfalteten Zustand zu erhöhen und somit das Enzym in seiner nativen Konformation zu stabilisieren. Bei Vorliegen des Kofaktors in einer höheren Konzentration konnte der stabilisierende Effekt nicht im selben Maß gezeigt werden. E A [kj/mol] ΔE A [kj/mol] Wt 204,70 - Wt + 43 µm BH 4 308,55 103,85 Wt + 75 µm BH 4 234,22 29,52 Wt µm BH 4 186,49-18,21 Tabelle 7: Aktivierungsenergien des PAH-Wildtyp Proteins nach Gabe von BH 4 in steigenden Konzentrationen. 3.3 Analyse des Effekts des natürlichen Kofaktors BH 4 auf die Denaturierung ausgewählter Varianten der humanen PAH Um den Effekt von BH 4 nicht nur auf den Wildtyp der PAH zu untersuchen, wurden zur weiteren Charakterisierung die PAH-Varianten R68S, R261Q und Y417H ausgewählt, deren Mutationen zu einem Aminosäureaustausch in jeweils in einer der drei Domänen der PAH führen. Alle drei Varianten zeigen phänotypisch eine relativ hohe Restaktivität (Y417H 76%, R68S 68% und R261Q 44%; und lösen im Patienten eine BH 4 -responsive Hyperphenylalaninämie aus Effekt von BH 4 auf das Entfaltungsmuster der PAH-Varianten im DSF-Assay Auch bei den ausgewählten Varianten wurde eine durch Hitze induzierte Entfaltung der PAH ohne und mit Zugabe von BH 4 durchgeführt. Abbildung 14 zeigt die Denaturierung von R68S vor und nach Zugabe unterschiedlicher BH 4 - Konzentrationen im DSF-Assay.

52 Ergebnisse 52 Abbildung 14: Temperaturabhängige Entfaltung der PAH-Variante R68S ohne Zugabe von BH 4 (grau) und nach Gabe von BH 4 in drei unterschiedlichen Konzentrationen. Wie beim PAH-Wildtyp waren auch hier zwei Temperaturübergänge zu erkennen, am deutlichsten sichtbar in der Entfaltungskurve von R68S ohne Zugabe des Kofaktors. Die Variante R68S zeigte im nativen Zustand bei 25 C eine deutlich erhöhte Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Fluoreszenzintensität der Variante nach Zugabe von BH 4. Zudem war der Anstieg des Fluoreszenzsignals von R68S ohne Zugabe des Kofaktors bei steigender Temperatur deutlich weniger stark ausgeprägt als bei der Entfaltungskurve von R68S im Komplex mit BH 4. Die erhöhte Fluoreszenzintensität im nativen Zustand kann darauf hindeuten, dass die Variante R68S bereits im Grundzustand N-terminal partiell entfaltet vorliegt. Die Analyse der Daten zeigte eine im Vergleich zu den weiteren Varianten weniger stark ausgeprägte, aber dennoch signifikante Rechtsverschiebung der Übergangstemperaturen nach Zugabe des Kofaktors. T m1/2 ΔT m1/2 ( C) p-wert T m2/3 ΔT m2/3 ( C) p-wert R68S 40, , µm BH 4 43,06 2,17 < ,51 5,28 < µm BH 4 42,90 2,01 < ,06 3,83 < µm BH 4 42,84 1,95 < ,44 3,21 < Tabelle 8: Übergangstemperaturen des ersten (T m1/2) und zweiten (T m2/3) Übergangspunktes der Entfaltung von R68S vor und nach Zugabe von BH 4.

53 Ergebnisse 53 Abbildung 15 zeigt die Entfaltung von R261Q im DSF-Assay mit und ohne Gabe von BH 4. Abbildung 15: Temperaturabhängige Entfaltung der PAH-Variante R261Q ohne Zugabe von BH 4 (grau) und nach Gabe von BH 4 in drei unterschiedlichen Konzentrationen. Auch die Kurve von R261Q ohne Zugabe von BH 4 zeigte einen zweiphasigen Entfaltungsprozess. Bei dieser Variante führte die Zugabe von BH 4 in allen untersuchten Konzentrationen zu einer deutlichen Rechtsverschiebung der Entfaltungskurven, die zu einer statistisch signifikanten Erhöhung der Übergangstemperaturen T m1/2 sowie T m2/3 um jeweils mindestens 6,8 C führte. Dies entspricht einer Stabilisierung des Proteins gegenüber Hitzestress. T m1/2 ΔT m1/2 ( C) p-wert T m2/3 ΔT m2/3 ( C) p-wert R261Q 38, , µm BH 4 45,11 6,79 < ,89 6,76 < µm BH 4 46,13 7,81 < ,13 8,00 < µm BH 4 46,84 8,52 < ,78 8,65 < Tabelle 9: Übergangstemperaturen des ersten (T m1/2) und zweiten () Übergangspunktes der Entfaltung von R261Q vor und nach Zugabe von BH 4. Auch bei der Variante Y417H zeigten die Kurven nach Zugabe von BH 4 in allen untersuchten Konzentrationen eine statistisch signifikante Rechtsverschiebung.

54 Ergebnisse 54 Abbildung 16: Temperaturabhängige Entfaltung der PAH-Variante Y417H ohne Zugabe von BH 4 (grau) und nach Gabe von BH 4 in drei unterschiedlichen Konzentrationen. Die Rechtsverschiebung zeigte sich vor allem im ersten Temperaturübergang und ist mit einer Entfaltung der regulatorischen Domäne erst bei höheren Temperaturen gleichzusetzen. Somit führte BH 4 auch zu einer Stabilisierung der Variante Y417H gegenüber Hitzestress. Innerhalb der verschiedenen BH 4 -Konzentrationen gab es keine deutlichen Unterschiede der Übergangstemperaturen. T m1/2 ΔT m1/2 ( C) p-wert T m2/3 ΔT m2/3 ( C) p-wert Y417H 35, , µm BH 4 44,67 9,04 < ,47 6,08 0, µm BH 4 44,56 8,93 < ,36 5,97 0, µm BH 4 44,28 8,65 < ,70 5,31 0,0020 Tabelle 10: Übergangstemperaturen des ersten (T m1/2) und zweiten (T m2/3) Übergangspunktes der Entfaltung von Y417H mit und ohne Zugabe von BH Vergleich der Hydrophobizität der PAH-Varianten im nativen Zustand Um eine Aussage über die native Konformation des PAH-Wildtyps und seiner Varianten treffen zu können, wurden die Fluoreszenzintensitäten nach Zugabe von ANS im nativen Zustand, also bei einer Temperatur von 25 C analysiert. Hier fiel die deutlich erhöhte Fluoreszenzintensität der Varianten R68S auf, deren Mutation in der regulatorischen Domäne liegt.

55 Ergebnisse 55 Abbildung 17: Vergleich der Hydrophobizität von WT und den Varianten R68S, R261Q und Y417H im nativen Zustand. Um dieser interessanten Beobachtung weiter nachzugehen, wurde die Hydrophobizität von elf weiteren Varianten der PAH im Vergleich zum PAH-Wildtyp mittels ANS-Fluoreszenz analysiert. Beim Vergleich der Hydrophobizität im nativen Zustand von insgesamt fünf Varianten mit Mutation in der regulatorischen Domäne (F39L, F55L, I65S, I65T und R68S), vier Varianten mit Mutation in der katalytischen Domäne (R158Q, H170Q, R261Q und P314S) und zwei Varianten, deren Mutation in der Oligomerisierungsdomäne liegt (Y417C und Y414H), zeigte sich, dass es bei allen Varianten mit Mutation in der regulatorischen Domäne zu einer signifikanten Erhöhung der Hydrophobizität im nativen Zustand kommt. Variante Median (Fluoreszenz) p-wert (vs Wt) Δ (vs WT) Wt PAH 70,47 F39L 159,10 < *** 88,63 F55L 96,72 0,0140 * 26,25 I65S 104,6 0,0040 ** 34,13 I65T 102,7 0,0048 ** 32,23 R68S 153,9 < *** 83,43 R158Q 69,39 0,9068-1,08 H170Q 68,65 0,8434-1,82 R261Q 61,57 0,3051-8,9 P314S 65,21 0,5737-5,26 Y417C 78,17 0,4363 7,7 Y417H 69,63 0,9171-0,84 Tabelle 11: Vergleich der Fluoreszenzintensität verschiedener PAH Varianten und des PAH-Wildtyps im Nativzustand. Die Veränderung der Fluoreszenzintensität der Varianten, deren Mutation in der regulatorischen Dömane liegt, wird im Folgenden exemplarisch an der Varianten R68S

56 Ergebnisse 56 dargestellt. Die Erhöhung der Fluoreszenzintensität im Nativzustand war für die Variante R68S bereits in der Analyse der DSF-Daten aufgefallen. Nach Zugabe des Kofaktors BH 4 zur Variante R68S kam es zu einem Absinken der Fluoreszenzintensität im Nativzustand. Abbildung 18: Vergleich der Fluoreszenzintensitäten von R68S im nativen Zustand vor und nach Zugabe von BH 4 in drei unterschiedlichen Konzentrationen. Die erhöhte Fluoreszenzintensität von R68S ohne gebundenen Kofaktor deutet darauf hin, dass das Protein bereits in seinem nativen Zustand partiell entfaltet vorliegt, da mehr hydrophobe Seitenketten für die Bindung des Fluoreszenzfarbstoffs ANS zur Verfügung stehen. Nach Zugabe des Kofaktors BH 4 in steigenden Konzentrationen kommt es zu einer statistisch signifikanten Abnahme der Fluoreszenzintensität und damit der Hydrophobizität der Varianten im Nativzustand. Dies spricht für eine kompaktere Konformation und somit höhere Stabilität des varianten Enzyms im Komplex mit dem Kofaktor. Median (Fluoreszenz a.u.) p-wert (vs R68S) Δ (vs R68S) R68S 153,9 - - R68S + 43 µm BH 4 71,38 0, ,53 R68S + 75 µm BH 4 73,41 0, ,49 R68S µm BH 4 80,05 0, ,85 Tabelle 12: Fluoreszenzintensitäten von R68S im nativen Zustand Analyse der kinetischen Denaturierung der PAH-Varianten im Komplex mit BH 4 Auch bei den ausgewählten Varianten wurde die zeitabhängige Entfaltung, also die Denaturierung bei einer festgelegten Temperatur über einen definierten Zeitraum, untersucht. Alle Messungen wurden je dreimal bei fünf unterschiedlichen Temperaturen von 38,0 C bis 46,0 C (R261Q und Y417H) resp. 41,5 C bis 47,5 C (R68S) durchgeführt. Diese

57 Ergebnisse 57 Temperaturen wurden nach Berechnung der T m -Werte aus der thermischen Proteindenaturierung gewählt. Abbildung 19 zeigt die kinetische Denaturierung der Varianten R68S. Abbildung 19: Zeitabhängige Denaturierung der PAH-Variante R68S vor und nach Zugabe von 43 µm BH 4 über den Zeitraum von maximal 40 Minuten. Mit Anzeichen für eine Aggregation des Proteins in der Denaturierungskurve wurde die Messung beendet. Der Zeitpunkt der vollständigen Proteindenaturierung kann mit Eintreten der Plateauphase in der Entfaltungskurve festgelegt werden. Dieses Plateau wird wie erwartet bei R68S ohne und nach Zugabe des Kofaktors BH 4 mit ansteigenden Temperaturen schneller erreicht. Nach Zugabe von BH 4 veränderte sich der Kurvenverlauf allerdings nur unwesentlich, was darauf hindeutet, dass BH 4 kaum Einfluss auf die zeitabhängige Entfaltung der Variante R68S hat. Um dies zu verdeutlichen, wurde die Denaturierung von R68S ohne und mit 43 µm BH 4 bei einer beispielhaft ausgewählten Temperatur von 43 C direkt verglichen. Hier ist ein ähnlicher Kurvenverlauf mit einer etwas stärkeren Fluoreszenzintensität von R68S im Komplex mit BH 4 zu erkennen. Die Plateauphase tritt sowohl ohne als auch mit Gabe von BH 4 nach etwa 21 Minuten ein. Abbildung 20: Zeitabhängige Denaturierung der Variante R68S vor und nach Zugabe von 43 µm BH 4 bei einer Temperatur von 43 C. Für die kinetische Denaturierung der Variante R261Q wurden Temperaturstufen zwischen 38,0 und 46 C gewählt.

58 Ergebnisse 58 Abbildung 21: Zeitabhängige Denaturierung der PAH-Variante R261Q vor und nach Zugabe von 43 µm BH 4 über den Zeitraum von maximal 70 Minuten. Sowohl bei der Untersuchung von R261Q ohne Kofaktor als auch bei der Untersuchung nach Zugabe des Kofaktors trat die vollständige Entfaltung erwartungsgemäß bei höheren Temperaturen schneller ein, erkennbar am Zeitpunkt des Erreichens der Plateauphase. Das Plateau wurde bei Erwärmung auf 46 C schon nach wenigen Minuten erreicht, bei der Temperatur von 38 C hingegen nach etwa einer Stunde. Nach Zugabe des Kofaktos BH 4 war der Kurvenverlauf vor allem bei niedrigeren Temperaturen sichtbar flacher, gezeigt durch den direkten Vergleich von R261Q vor und nach Zugabe von 43 µm BH 4 bei einer beispielhaft gewählten Temperatur von 42 C. Abbildung 22: Zeitabhängige Denaturierung der Variante R261Q vor und nach Zugabe von 43 µm BH 4 bei einer Temperatur von 42 C. Die kinetische Denaturierung der Variante Y417H wurde ohne und nach Zugabe des Kofaktors BH 4 ebenfalls in Temperaturstufen zwischen 38,0 C und 46,0 C durchgeführt. Der Vergleich der Denaturierungskurven zeigt, dass die Kurve nach Zugabe von BH 4 flacher verläuft und das Plateau erst zu einem deutlich späteren Zeitpunkt erreicht.

59 Ergebnisse 59 Abbildung 23: Zeitabhängige Denaturierung der PAH-Variante Y417H vor und nach Zugabe von 43 µm BH 4 über den Zeitraum von maximal 60 Minuten. Auch bei der Varianten Y417H wurde das Plateau ohne Zugabe des Kofaktors BH 4 nach deutlich kürzerer Zeit erreicht. Abbildung 24: Kinetische Denaturierung der PAH-Variante Y417H vor und nach Zugabe von 43 µm BH 4 bei einer Temperatur von 42 C Berechnung der Aktivierungsenergien Zunächst wurden über die einphasige Assoziationsgleichung die Geschwindigkeitskonstanten k berechnet. Diese Geschwindigkeitskonstanten k wurden als Arrheniusplot ln(k) gegen 1/K aufgetragen. So konnten über die Arrheniusgleichung anhand der Steigungen der Geraden die Aktivierungsenergien (E A ) der Varianten vor und nach Zugabe des Kofaktors berechnet werden. Temperatur (K) k 314,65 0, ,15 0,0580 R68S 317,65 0, ,15 0, ,65 0,0621

60 Ergebnisse 60 R68S + 43 µm BH 4 R261Q R261Q + 43 µm BH 4 Y417H Y417H + 43 µm BH 4 314,65 0, ,15 0, ,65 0, ,15 0, ,65 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0, ,15 0,3037 Tabelle 13: Berechnete Geschwindigkeitskonstante k aus den Kurven der kinetischen Denaturierung über die einphasigen Assoziationsgleichung. Es konnte gezeigt werden, dass die Bindung des Kofaktors BH 4 zu einem Anstieg der Aktivierungsenergie der Varianten führt. Für R68S erfolgte eine Zunahme um Faktor 1,5, für Y417H um Faktor 1,3 und für R261Q war die Zunahme am geringsten ausgeprägt (Faktor 1,1).

61 Ergebnisse 61 Abbildung 25: Vergleich der Aktivierungsenergien (E A) des PAH-Wildtyps und der PAH-Varianten R68S, R261Q und Y417H vor und nach Gabe des Kofaktors BH 4. E A (kj/mol) Wt 204,70 - ΔE A (kj/mol) Wt + 43 µm BH 4 308,55 103,85 R261Q 259,33 - R261Q + 43 µm BH 4 285,60 26,27 R68S 79,94 - R68S + 43 µm BH 4 115,99 36,05 Y417H 153,82 - Y417H + 43 µm BH 4 192,15 38,33 Tabelle 14: Aktivierungsenergien (E A) des PAH-Wildtyps und der PAH-Varianten R68S, R261Q und Y417H vor und nach Gabe des Kofaktors BH 4. Die ΔE A ist immer in Bezug auf die jeweilige PAH-Variante vor Gabe des Kofaktors angegeben. 3.4 Analyse des Einflusses von BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 auf die Denaturierung des humanen PAH-Wildtyp-Proteins In den bisher beschriebenen Untersuchungen wurden die Auswirkungen des natürlichen Kofaktors Tetrahydrobiopterin auf den PAH-Wildtyp sowie auf ausgewählte Varianten der PAH untersucht. In den folgenden Experimenten wurde unter Anwendung derselben Methoden der Effekt der BH 4 -Derivate BH 2 und Sepiapterin sowie des synthetischen Kofaktoanalogons 6-MPH 4 auf den PAH-Wildtyp analysiert. Ziel war zu analysieren, welchen Einfluss das Pteringrundgerüst und die Seitenkette des natürlichen Kofaktors BH 4 auf dessen stabilisierenden Effekt haben.

62 Ergebnisse Analyse des Einflusses von BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 auf die thermische Stabilität des PAH-Wildtyps Zunächst wurde die Denaturierung des PAH-Wildtyps nach Zugabe von BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 untersucht und die Entfaltungskurven mit der nach Bindung von BH 4 verglichen. Die Analyse der thermischen Proteindenaturierung nach Zugabe von BH 2, Sepiapterin und 6- MPH 4 zeigte einen temperaturabhängigen Anstieg der Fluoreszenzintensität. Abbildung 26: Thermische Denaturierung des PAH-Wildtyps vor (schwarz) und nach Zugabe der Kofaktoren BH 4 (rot), BH 2 (blau), Sepiapterin (orange) und 6-MPH 4 (grün) in unterschiedlichen Konzentrationen. Nach Zugabe von BH 4 kam es bei allen untersuchten Konzentrationen zu einer gering ausgeprägten Rechtsverschiebung der Entfaltungskurve, die mit einer leichten Stabilisierung des Proteins gegen Hitzestress zu erklären ist. Ein ähnlicher, aber etwas geringer ausgeprägter Effekt war nach Zugabe des oxidierten Kofaktors BH 2 zu erkennen. Die Zugabe von geringen Sepiapterinkonzentrationen zum PAH-Wildtyp zeigte nahezu keinen Effekt auf die Proteindenaturierung, die T m -Werte variierten minimal im Vergleich zu denen des PAH-Wildtyp-Proteins ohne Zugabe des Kofaktos. Erst eine höhere Dosis von 200 µm führte zur Stabilisierung des Proteins gegen Hitzestress. Nach Zugabe von 6-MPH 4 kam es

63 Ergebnisse 63 zu einer konzentrationsabhängigen Reduktion der T m1/2 -Werte, die mit einer Destabilisierung der regulatorischen Domäne des PAH-Wildtyps im Komplex mit 6-MPH 4 einhergehen. Der 2. Umschlagpunkt konnte hingegen mit niedrigen 6-MPH 4 -Konzentrationen stabilisiert werden. T m1/2 ( C) ΔT m1/2 ( C) T m2/3 ( C) ΔT m2/3 ( C) Wt 47,74-54,99 - Wt + 43 µm BH 4 49,23 1,49 56,47 1,48 Wt + 75 µm BH 4 49,13 1,39 57,37 2,38 Wt µm BH 4 50,16 2,42 58,10 3,11 Wt + 43 µm BH 2 48,77 1,03 56,41 1,42 Wt + 75 µm BH 2 48,49 0,75 56,74 1,75 Wt µm BH 2 49,88 2,14 56,74 1,75 Wt + 43 µm SP 48,06 0,32 54,65-0,34 Wt + 75 µm SP 47,88 0,14 54,26-0,73 Wt µm SP 48,71 0,97 56,11 1,12 Wt µm 6-MPH 4 47,5-0,56 56,09 1,10 Wt µm 6-MPH 4 46,38-1,36 55,35 0,36 Wt µm 6-MPH 4 39,45-8,29 n.b. n.b. Tabelle 15: Übergangstemperaturen T m1/2 sowie T m2/3 für den Wildtyp unter Zugabe von BH 4, BH 2, Sepiapterin (SP) und 6-MPH 4. ΔT m1/2 und ΔT m2/3 zeigen den Temperaturunterschied im Vergleich zum Wildtyp ohne Zugabe eines Kofaktors Vergleich der Aktivierungsenergien des PAH-Wildtyps im Komplex mit BH 4, BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 Für die Kofaktoren BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 wurden ebenfalls zeitabhängige Denaturierungen durchgeführt. Im Anschluss wurden die Daten der kinetischen Denaturierung im Arrheniusplot aufgetragen. Aus den Steigungen der Geraden wurden die Aktivierungsenergien berechnet und mit der des PAH-Wildtyps mit und ohne Zugabe von BH 4 verglichen. Die Zugabe des Kofaktors BH 4 führte nur in der Konzentration von 43 µm, also in der therapeutischen Dosis, zu einem deutlich steileren Verlauf der Geraden. Daher wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit auch nur die therapeutischen Konzentrationen von BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 untersucht und mit BH 4 verglichen.

64 Ergebnisse 64 Abbildung 27: Arrheniusplot des PAH-Wildtyps ohne Kofaktor und im Komplex mit BH 4, BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4. Einen ähnlichen Effekt wie nach der Zugabe von 43 µm BH 4 zeigten von den weiteren untersuchten Kofaktoren nur BH 2 und Sepiapterin, denn die Steigung dieser Geraden ist nur geringfügig flacher als die der Geraden nach Zugabe von 43 µm BH 4. Im Gegensatz dazu ist die Steigung der Geraden nach Zugabe von 6-MPH 4 vergleichbar mit der des PAH-Wildtyps ohne BH 4. Aus den Geradensteigungen wurden über die Arrheniusgleichung die Aktivierungsenergien für den PAH-Wildtyp im Komplex mit dem jeweiligen Kofaktor berechnet. Die Aktivierungsenergie nach Zugabe von 43 µm BH 4 war mit 308,55 kj/mol die höchste. Auch die Zugabe von Sepiapterin steigerte die Aktivierungsenergie des PAH-Wildtyps von 204,70 kj/mol auf 282,76 kj/mol um 38%. BH 2 führte dagegen nur zu einer leichten Erhöhung der Aktivierungsenergie, während die Zugabe von 6-MPH 4 zu einer deutlichen Erniedrigung der Aktivierungsenergie um 34% führte. E A (kj/mol) Wt PAH 204,70 ΔE A (kj/mol) Wt + 43 µm BH 4 308,55 103,85 Wt + 75 µm BH 4 234,22 29,52 Wt µm BH 4 186,49-18,21 Wt + 43 µm BH 2 240,51 35,81 Wt + 43 µm SP 282,76 78,06 Wt µm 6-MPH 4 134,09-70,61 Tabelle 16: Aktivierungsenergien nach Zugabe der verschiedenen Kofaktoren im Vergleich zum PAH- Wildtyp ohne Zugabe eines Kofaktors.

65 Ergebnisse 65 Abbildung 28: Aktivierungsenergien des PAH-Wildtyps ohne Kofaktor sowie nach Zugabe von BH 4, BH 2, Sepiapterin und 6-MPH Analyse des Einflusses von BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 auf die thermische Denaturierung ausgewählter Varianten der PAH Der Einfluss der BH 4 -Derivate BH 2 und Sepiapterin sowie des synthetischen Kofaktoranalogons 6-MPH 4 wurde auch für die Varianten R68S, R261Q und Y417H untersucht Analyse des Einflusses von BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 auf die thermische Stabilität der PAH-Varianten Die thermische Denaturierung der Varianten R68S, R261Q und Y417H nach Zugabe der alternativen Kofaktoren wurde mit den Entfaltungskurven nach Zugabe von BH 4 verglichen. Abbildung 29 zeigt die Entfaltungskurven der thermischen Denaturierung der gewählten Varianten nach Zugabe von BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 im Vergleich.

66 Ergebnisse 66 Abbildung 29: Thermische Denaturierung der PAH-Varianten R68S, R261Q und Y417H vor (Graustufen) und nach Zugabe der Kofaktoren BH 4, BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 in unterschiedlichen Konzentrationen. Der Effekt des Kofaktors BH 4 auf die thermische Entfaltung der Variante R68S wurde bereits dargestellt. Die Stabilisierung der Entfaltung der regulatorischen Domäne (T m1/2 ) und der katalytische Domäne (T m2/3 ) nach Zugabe des Kofaktors BH 4 war für alle untersuchten Konzentrationen statistisch signifikant. Der Effekt der BH 4 -Derivate BH 2, Sepiapterin und 6- MPH 4 auf die PAH-Variante R68S zeigte insgesamt eine deutlich geringer ausgeprägte Rechtsverschiebung bzw. Stabilisierung der Denaturierungskurven. Lediglich die Zugabe von 200 µm BH 2 konnte im ersten Temperaturübergang eine signifikante Rechtsverschiebung um

67 Ergebnisse 67 1,53 C im Vergleich zu R68S ohne Zugabe eines Kofaktors bewirken und sich somit stabilisierend auf die Entfaltung der regulatorischen Domäne auswirken. Während nach Zugabe von Sepiapterin im ersten Temperaturübergang mit keiner der eingesetzten Konzentrationen ein Effekt zu beobachten war, erfolgte eine signifikante Stabilisierung aller T m2/3 -Werte von R68S im Komplex mit Sepiapterin. 6-MPH 4 führte in allen untersuchten Konzentrationen zu einer konzentrationsabhängigen Linksverschiebung der Entfaltungskurven und damit zu einer Destabilisierung der Variante bei Hitzestress. T m1/2 ΔT m1/2 ( C) p-wert T m2/3 ΔT m2/3 ( C) R68S 40, , p-wert R68S + 43 µm BH 4 43,06 2,17 < ,51 5,28 < R68S + 75 µm BH 4 42,90 2,01 < ,06 3,83 < R68S µm BH 4 42,84 1,95 < ,44 3,21 < R68S + 43 µm BH 2 41,33 0,44 0, ,26 2,03 0,0009 R68S + 75 µm BH 2 41,58 0,69 0, ,41 1,18 0,0063 R68S µm BH 2 42,42 1,53 < ,80 1,57 0,0042 R68S + 43 µm SP 40,89 0,01 0, ,38 4,15 < R68S + 75 µm SP 41,25 0,36 0, ,13 3,90 < R68S µm SP 40,98 0,09 0, ,02 3,79 < R68S µm 6-MPH 4 40,35-0,54 0, ,50 0,27 0,5253 R68S µm 6-MPH 4 39,53-1,36 0, ,50 0,27 0,4060 R68S µm 6-MPH 4 37,75-3,14 < ,57-1,66 0,0176 Tabelle 17: Übergangstemperaturen T m1/2 sowie T m2/3 für R68S unter Zugabe von BH 4, BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4. ΔT m1/2 und ΔT m2/3 zeigen den Temperaturunterschied im Vergleich zu R68S ohne Zugabe eines Kofaktors. Eine in Kapitel bereits beschriebene Besonderheit der Variante R68S war die signifikante Abnahme der Fluoreszenzintensität im nativen Zustand durch Bindung des Kofaktors BH 4. Einen vergleichbaren Effekt erzielte bei den untersuchten BH 4 -Derivaten lediglich Sepiapterin, am deutlichsten in der Konzentration von 200 µm. BH 2 in einer Konzentration von 43 µm sowie 6-MPH 4 in den Konzentrationen von 500 bzw µm führten zu einer Zunahme der Hydrophobizität. Diese geht vermutlich mit konformativen Änderungen einher, die die im DSF-Assay beobachtete Destabilisierung vor allem der regulatorischen Domänen von R68S erklären könnte. BH 2 in höheren Konzentrationen sowie 200 µm 6-MPH 4 zeigten keine signifikante Veränderung der Hydrophobizität von R68S im nativen Zustand.

68 Ergebnisse 68 Abbildung 30: Vergleich der Hydrophobizität von R68S im nativen Zustand und im Komplexzustand mit BH 4 und seinen Derivaten. Der Kofaktor BH 4 bewirkte bei der PAH-Variante R261Q eine Verschiebung der T m -Werte zu höheren Temperaturen. In der Untersuchung mit den drei Kofaktoren Sepiapterin, BH 2 und 6- MPH 4 zeigte Sepiapterin den deutlichsten Effekt, wenn auch nicht so stark ausgeprägt wie der von BH 4. T m1/2 ΔT m1/2 ( C) p-wert T m2/3 ΔT m2/3 ( C) R261Q 38, , p-wert R261Q + 43 µm BH 4 45,11 6,79 < ,89 6,76 < R261Q + 75 µm BH 4 46,13 7,81 < ,13 8,00 < R261Q µm BH 4 46,84 8,52 < ,78 8,65 < R261Q + 43 µm BH 2 40,48 2,16 0, ,09 0,96 0,1101 R261Q + 75 µm BH 2 38,97 0,65 0, ,80 0,67 0,2572 R261Q µm BH 2 40,45 2,13 0, ,47 1,34 0,0492 R261Q + 43 µm SP 40,96 2,64 0, ,98 1,85 0,0155 R261Q + 75 µm SP 40,71 2,39 0, ,50 1,37 0,0430 R261Q µm SP 41,40 3,08 0, ,87 2,74 0,0030 R261Q µm 6-MPH 4 37,99-0,33 0, ,27 0,14 0,7945 R261Q µm 6-MPH 4 38,35 0,03 0, ,31 0,18 0,7600 R261Q µm 6-MPH 4 37,49-0,83 0, ,42-0,71 0,2523 Tabelle 18: Übergangstemperaturen T m1/2 sowie T m2/3 für R261Q unter Zugabe von BH 4, BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4. ΔT m1/2 und ΔT m2/3 zeigen den Temperaturunterschied im Vergleich zu R261Q ohne Zugabe eines Kofaktors.

69 Ergebnisse 69 Der T m1/2 -Wert, und damit die Entfaltung der regulatorischen Domänen, wurde um bis zu 3,1 C stabilisiert, T m2/3, also die Entfaltung der katalytischen Domänen, um bis zu 2,7 C. BH 2 wirkte sich vor allem auf den ersten Temperaturübergang stabilisierend aus, im zweiten Temperaturübergang war diese Stabilisierung nur bei einer BH 2 -Konzentration von 200 µm statistisch signifikant. 6-MPH 4 zeigte bis auf eine stärkere Zunahme der Fluoreszenzintensität mit zunehmender Temperatur keinen signifikanten Effekt auf die Übergangstemperaturen. Auch bei der Variante Y417H wurde durch den Kofaktor BH 4 eine signifikante Rechtsverschiebung und damit Stabilisierung der Entfaltungskurve im ersten und zweiten Temperaturübergang induziert. Die alternativen Kofaktoren BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 wirkten sich insgesamt stabilisierend auf den ersten Temperaturübergang aus, wenn auch nicht so deutlich wie es mit BH 4 der Fall war. Durch die höchste Sepiapterinkonzentration von 200 µm konnte eine Stabilisierung um 3,6 C gemessen werden. Im zweiten Temperaturübergang konnte bei keinem der untersuchten Kofaktoren ein signifikanter Effekt nachgewiesen werden. Das heißt, die untersuchten BH 4 -Derivate üben ihre stabilisierende Wirkung vorzugsweise auf die regulatorischen Domänen von Y417H aus. Y417H 35, , Y417H + 43 µm BH 4 44,67 9,04 < ,47 6,08 0,0011 Y417H + 75 µm BH 4 44,56 8,93 < ,36 5,97 0,0013 Y417H µm BH 4 44,28 8,65 < ,70 5,31 0,0020 Y417H + 43 µm BH 2 37,71 2,08 0, ,43 0,04 0,9652 Y417H + 75 µm BH 2 36,84 1,21 0, ,63-0,76 0,4497 Y417H µm BH 2 37,42 1,79 0, ,73 0,34 0,7165 Y417H + 43 µm SP 38,26 2,63 0, ,79 0,40 0,6781 Y417H + 75 µm SP 38,89 3,26 0, ,02 0,63 0,5250 Y417H µm SP 39,21 3,58 0, ,10 0,71 0,4854 Y417H µm 6-MPH 4 37, , ,12-0,27 0,7869 Y417H µm 6-MPH 4 37,98 2,35 0, ,47 0,08 0,9339 Y417H µm 6-MPH 4 36,80 1,17 0, ,29-2,10 0,0666 Tabelle 19: Übergangstemperaturen T m1/2 sowie T m2/3 für Y417H unter Zugabe von BH 4, BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4. ΔT m1/2 und ΔT m2/3 zeigen den Temperaturunterschied im Vergleich zu Y417H ohne Zugabe eines Kofaktors.

70 Ergebnisse Vergleich der Aktivierungsenergien der PAH-Varianten im Komplex mit BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 Für die Kofaktoren BH 2, Sepiapterin und 6-MPH 4 wurden ebenfalls kinetische Denaturierungen durchgeführt. Anschließend wurde der Logarithmus der Geschwindigkeitskonstanten im Arrheniusplot gegen die reziproke Temperatur aufgetragen und aus der Steigung der Geraden die Aktivierungsenergien berechnet. Die Aktivierungsenergien der Varianten im Komplex mit Sepiapterin und 6-MPH 4 konnten nicht berechnet werden, da die Standardabweichung in den zeitabhängigen Denaturierungen zu groß war. Daher werden im Folgenden nur die Daten mit BH 4 und BH 2 verglichen. Der PAH-Wildtyp zeigte einen Anstieg der Aktivierungsenergien mit BH 4 und BH 2 um Faktor 1,5 und 1,2. Im Vergleich zum PAH-Wildtyp waren die Aktivierungsenergien von R68S und Y417H um 80% bzw. 46% erniedrigt. R261Q zeigte dafür eine um 17% höhere Aktivierungsenergie, was nochmals die möglicherweise etwas stabilere, da kompaktere Konformation der Variante auch ohne Kofaktor unterstreicht. Die Bindung von BH 4 an R68S führte zum Anstieg der Aktivierungsenergie um Faktor 2 und die BH 2 -Bindung führte sogar zur 3,5-fachen Erhöhung der Aktivierungsenergie von R68S. Dafür zeigten weder BH 4 noch BH 2 einen signifikanten Einfluss auf die Variante R261Q, die wie oben beschrieben im nativen Zustand in einer stabileren Konformation vorzuliegen scheint. Die Aktivierungsenergie von Y417H konnte im Komplex mit BH 4 auf das Level des PAH-Wildtyps ohne Kofaktor angehoben werden und auch BH 2 zeigte eine Erhöhung der Aktivierungsenergie von Y417H um Faktor 1,6. Abbildung 31: Aktivierungsenergien der PAH-Varianten R68S, R261Q und Y417H ohne und nach Zugabe der Kofaktoren BH 4 und BH 2 im Vergleich mit dem PAH-Wildtyp.