KAITEL 4 ZUSAMMEFASSUG UD AUSBLICK 91 4 Zusammenfassung und Ausblick Bei einem selbstreplizierenden System ist im Allgemeinen die Stabilität des termolekularen Komplexes (aus Templat und den beiden Eduktmolekülen) gegenüber dem Duplex (zwei Templatmoleküle) aus entropischen Gründen benachteiligt, so dass die meisten Templatmoleküle als Duplex vorliegen. Dies führt prinzipiell zu parabolischem Wachstum. Eine als Replikase wirkende berfläche könnte exponentielles Wachstum bewirken, wenn der termolekulare Komplex kovalent an die berfläche gebunden vorläge, während der daraus gebildete Templat-Duplex nicht mehr kovalent gebunden wäre. In der vorliegenden Arbeit wurden grundlegende Versuche durchgeführt, die einen Weg für die praktische Durchführung der Selbstreplikation an unterschiedlich modifizierten berflächen aufzeigt. In Vorversuchen wurde anhand der Modellsubstanzen 1-Methylimidazol (MeIm), 1-Aminopropylimidazol (AI), Histamin (HisA) und Histidinmethylester (HisMe), die Kinetik der hosphoimidazolidbildung in Lösung untersucht, um daraus Kosequenzen für die Bildung festphasengebundener hosphoimidazolide abzuleiten. Mit Hilfe des Computerprogramms SimFit wurden aus den experimentellen Daten Geschwindigkeitskonstanten berechnet, anhand derer dann Simulationen durchgeführt werden konnten, die eine gezieltere lanung der Versuche an der Festphase erlaubten. Eine Gegenüberstellung der beiden Imidazolderivate AI und Histamin zeigte, dass Histamin eindeutig gegenüber AI zu bevorzugen ist. Die erste Stufe der hosphoimidazolidbildung verläuft auch bei geringeren Imidazolkonzentrationen mit hohen Ausbeuten, die zweite Stufe der hosphoamidatbildung ist nur im Falle von Histamin erfolgversprechend. In den anschließenden Versuchen an der Festphase wurde Histamin allerdings nicht als solches eingesetzt, sondern als Histidin (His), welches als geschütztes Derivat für die eptidsynthese zur Verfügung steht und zusammen mit anderen Aminosäuren an die Festphase gekoppelt werden kann. Die Synthese imidazolhaltiger berflächen wurde
KAITEL 4 ZUSAMMEFASSUG UD AUSBLICK 92 über die Kopplung der Aminosäure Histidin an eine Aminofestphase vorgenommen. Als Festphase wurde EGA (VABICHEM) eingesetzt, welche große oren mit polaren Eigenschaften aufweist und somit für Reaktionen mit großen Molekülen in wässrigen Lösungen am besten geeignet ist. H 2 + H H 2 H H 2 CH 2 CH 2 EGA H H His 2 Abb. 62: Kopplung von Histidin an eine Aminofestphase Unter Verwendung des Fmoc-Verfahrens zur eptidsynthese wurden folgende Festphasenmodifikationen synthetisiert und in Selbstreplikationsexperimenten getestet: EGA-H-His-H-Ac Festphase 1 EGA-H-His-H 2 Festphase 2 EGA-H-His-Leu-H-Ac Festphase 3 EGA-H-Lys-His-H-Ac Festphase 4 EGA-H-Asp-His-H-Ac Festphase 5 EGA-H-His-Arg-Ser-Arg-Leu-Ile-Trp-H 2 Festphase 6 Als Trinucleotid-3 -phosphat wurde 5 -geschütztes 3 CCGp eingesetzt, womit erstmalig festphasengebundene hosphoimidazolide isoliert werden konnten (Abb. 63).
KAITEL 4 ZUSAMMEFASSUG UD AUSBLICK 93 3 -CCG- + H EDC 3 -CCG- Abb. 63: Bildung des festphasengebundenen hosphoimidazolids eines Trinucleotid-3 -phosphats Als Aminokomponente wurde ncgg eingesetzt, welches unter Ausbildung einer hosphoamidatbindung zu dem selbstkomplementären Hexanucleotid CCGpnCGG führt (Abb. 64). 3 -CCG- + H 2 CGG 3 -CCG- H CGG + H Abb. 64: Reaktion des festphasengebundenen hosphoimidazolids eines Trinucleotid-3 -phosphats mit einem Trinucleotid-5 -aminoderivat Der Reaktionsverlauf wurde durch HLC-Messung von aus der überstehenden Lösung entnommenen roben verfolgt. Ein Beispiel zeigt Abbildung 65. Aus den erhaltenen Messpunkten wurden mit Hilfe von SimFit die entsprechenden Geschwindigkeitskonstanten berechnet. Es wurden Reaktionen bei unterschiedlichen Anfangskonzentrationen an festphasengebundenem hosphoimidazolid bzw. Aminokomponente
KAITEL 4 ZUSAMMEFASSUG UD AUSBLICK 94 durchgeführt. Da eine Verdopplung der Ausgangskonzentration zu einer Verdopplung der Reaktionsgeschwindigkeit führt, kann man das festphasengebundene hosphoimidazolid so behandeln, als ob es in Lösung wäre. Es handelt sich also um eine heterogene Reaktion, die trotzdem wie eine homogene behandelt werden kann. 2,4 Konzentration [mm] 2,0 1,6 1,2 0,8 n pn p 0,4 0,0 0 60 120 180 240 300 360 Zeit [h] Abb. 65: Konzentrationsverlauf bei der Reaktion eines Trinucleotid-5 -aminoderivats mit dem festphasengebundenen hosphoimidazolid eines Trinucleotid-3 -phosphats (Kinetik 1) Die Zugabe von CCGCGG als Templat (T) zu Beginn der Reaktion führt zu einer deutlichen Steigerung der hosphoamidatbildungsgeschwindigkeit, was den Autokatalysecharakter bestätigt. Die autokatalytische Reaktionsordnung wurde dadurch bestimmt, dass diese in dem vorgeschlagenen Reaktionsmodell (Abschnitt 3.3.1) sukzessive variiert wurde. Man erkennt eine deutliche Verbesserung des Fits bis etwa 0,4 bzw. 0,5, so dass eine Autokatalyse (mit parabolischem Wachstum) überaus wahrscheinlich ist. Allerdings nimmt danach die Güte des Fites (RMS-Wert) nur noch ganz
KAITEL 4 ZUSAMMEFASSUG UD AUSBLICK 95 leicht wieder zu, so dass eine höhere autokatalytische Reaktionsordnung (mit diesem Verfahren) nicht vollkommen ausgeschlossen werden kann. achdem gezeigt werden konnte, dass die untersuchte Reaktion an der Festphase unter Autokatalyse abläuft, sollte nun durch Modifikation der Festphase versucht werden die Reaktion zu beeinflussen, um eventuell eine Erhöhung der autokatalytischen Reaktionsordnung zu erreichen. In einem Fall wurde die Aminogruppe des Histidins nicht geschützt (Festphase 2), in den anderen Fällen wurde zusätzlich zu Histidin eine zweite Aminosäure eingebaut (Festphasen 3-5). Dadurch wird der sterische Anspruch erhöht, sowie positive bzw. negative Ladungen an der berfläche erzeugt. Bei Festphase 6 handelt es sich um ein ligopeptid mit bekanntermaßen DA-bindenden Eigenschaften. ach der hosphoimidazolidbildung an der jeweiligen Festphase, wurde je ein kinetisches Experiment unter Zugabe des 5 -Aminotrinucleotids durchgeführt. Die experimentellen Daten für die Festphasen 2-5 wurden nach demselben Reaktionsmechanismus gefittet. Der Fit wird allerdings bei einer höheren autokatalytischen Reaktionsordnung deutlich besser. Da der beobachtete Effekt bei allen untersuchten Festphasen auftritt, kann er nicht auf ein bestimmtes Strukturmerkmal der Festphase zurückgeführt werden. Bei der Untersuchung der Festphase 6, die ein DA-bindendes Heptapeptid enthält, kam es zu dem überraschenden Befund, dass die Reaktion des anfangs gebildeten hosphoimidazolids mit dem 5 -Aminotrinucleotid ausblieb. Anhand der Struktur des ligopeptids konnte eine Erklärung gefunden werden: in räumlicher achbarschaft zu dem Imidazolring des Histidins befindet sich die H-Gruppe des Serins, so dass ein intramolekularer Angriff dieser H-Gruppe an der hosphatgruppe des hosphoimidazolids zu einer kovalenten Bindung des Trinucleotids an die Festphase führt. Alle Experimente wurden in Gegenwart von 1M acl-lösung durchgeführt um nichtspezifische Wechselwirkungen der ligonucleotide mit der Festphase zu reduzieren. Ein vergleichender Versuch ohne acl-zusatz zeigte aber eine deutliche Beschleunigung der hosphoamidatbildung. Diese Beobachtung lässt darauf schließen,
KAITEL 4 ZUSAMMEFASSUG UD AUSBLICK 96 dass ionische Wechselwirkungen mit der Festphase eine entscheidende Rolle spielen können. b der autokatalytische Reaktionskanal davon überproportional profitiert, müsste allerdings noch geprüft werden. Die geringere Ionenstärke in der Lösung führt dazu, dass die ligonucleotide nichtkovalent an der Festphase gebunden bleiben, so dass die Kinetik nicht mehr in der überstehenden Lösung verfolgt werden kann. Eine Konzentrationsbestimmung ist nur nach Abbruch der Reaktion, durch Zugabe eines Überschusses an acl-lösung, möglich. Es zeigte sich aber, dass bei einer höheren Ladungsdichte an der Festphase, acl-lösung (auch gesättigte) nicht ausreicht um die ligonucleotide vollständig von der Festphase zu lösen. Dies ist auch der Grund dafür, dass die am vielverspechendsten Ansätze über Histidin- oder Argininreiche eptidsequenzen an der Festphase, nicht durch eine Verfolgung der Kinetik in der überstehenden Lösung möglich ist. achdem die grundsätzliche Möglichkeit der Durchführung eines Selbstreplikationsexperimentes unter Einbeziehung einer Festphase als modifizierbare berfläche aufgezeigt wurde, kann nun mit der Suche derjenigen Festphasenmodifikation begonnen werden, die exponentielles Wachstum ermöglicht. Diese Suche kann einerseits durch gezielte Versuche, andererseits aber auch durch geeignetes Screening zuvor hergestellter eptidbibliotheken erfolgen. Durch kombinatorische Synthese kann mit Hilfe der natürlichen Aminosäuren eine Vielzahl unterschiedlich modifizierter Festphasen erfolgen. Als Einschränkung sind bisher nur eine zu hohe positive Ladungsdichte, sowie eine räumliche achbarschaft von Serin und Histidin erkennbar.