Synthetischer Teil 28 8. Darstellung von α-verzweigten Säureamiden als Transfektionslipide 8.1. α-verzweigte Carbonsäuren Eine sehr einfache Methode zur Darstellung der hydrophoben Einheit von Transfektionslipiden führte über langkettig α-verzweigte Carbonsäuren. In Analogie zu bereits publizierten Arbeiten 83,84,85 wurde die Einführung von Alkylverzweigungen unterschiedlicher Kettenlänge in die 2-Position langkettiger Carbonsäuren über eine Zweitalkylierung der entsprechenden Monoalkylmalonester 3a,d,e durchgeführt. Die Einführung von Alkylsubstituenten in die 2-Position von Carbonsäuren über die entsprechenden Dianionen ist ebenfalls beschrieben worden 86. Aufgrund der gesammelten Erfahrungen in der Arbeitsgruppe, wurde die Methode über eine Zweitalkylierung favorisiert 87. Die exadecylmalonsäurediethylester sind durch Monoalkylierung von Malonsäurediethylester sowie durch Kondensation von Carbonsäureestern und xalsäureestern zugänglich 88,89. Wie in der Literatur 90,91,92 beschrieben, entstanden bei der Monoalkylierung der Malonsäurediethylester auch Dialkylmalonsäurediethylester als ebenprodukte, deren Bildung sich nicht unterdrücken lässt. Deshalb wurden die langkettigen Alkylmalonester im Anschluss an die Alkylierung destilliert, um sie in ausreichender Reinheit zu erhalten. Da die Acidität der synthetisierten Monoalkyl-βdicarbonylverbindungen geringer ist, als die der unsubstituierten Grundkörper und die Dialkyl-β-dicarbonylprodukte unter den allgemeinen Bedingungen der Alkylierungsreaktion (alkoholisches Alkalialkoholat) leicht solvolytisch zu spalten sind 93, mussten definierte Reaktionsbedingungen für die Zweitalkylierung eingehalten werden. Auch die Ausbeuten waren in hohem Maße vom Lösungsmittel, dem Deprotonierungsreagenz und dem Alkylierungsmittel abhängig. Aus diesem Grund wurden Toluol bzw. Xylol als Lösungsmittel mit hohen Siedepunkten verwendet. Die Deprotonierung der Alkylmalonsäurediethylester erfolgte mit atriumhydrid. Eine Alkylierungszeit von 12-16 Stunden erwies sich als optimal. Die nach der Aufarbeitung erhaltenen rohen Dialkylmalonester 24a,b,c wurden nicht destillativ gereinigt, sondern gleich durch alkalische ydrolyse mit Kaliumhydroxid verseift. Die Freisetzung der Dicarbonsäuren 25a,b,c aus ihren Salzen erfolgte durch Salzsäure in wässriger Suspension. Durch Umkristallisation aus geeigneten Lösungsmitteln wurden die Dialkylmalonsäuren DC-rein erhalten und anschließend zu den verzweigten Monocarbonsäuren 26a,b,c decarboxyliert. Die Abspaltung von Kohlendioxid erfolgte zwischen 150-200 C. Die Decarboxylierung ließ sich durch Säuren und schwache Basen katalytisch beschleunigen. Diese Reaktion verläuft ähnlich dem cyclischen Mechanismus,
Synthetischer Teil 29 wie er bei den Esterpyrolysen formuliert ist. Es handelt sich dabei um die pyrolytische Bildung eines lefins, das aber in diesem Fall ein Enol ist und sofort in die energieärmere Ketoform übergeht. Dünnschichtchromatographisch nachweisbare unverzweigte Säuren konnten durch K-Extraktion leicht entfernt werden. Wiederum konnten die Rohprodukte durch einfaches Umkristallisieren gereinigt werden. 2a/2c/2d a TBAI Toluol 2a/2c/2d a TBAI Xylol 1a 3a,d,e 24a,b,c 2a C 16 33 Br 2c C 14 29 Br 2d C 18 37 Br 24a = C 14 29 24b = C 16 33 24c = C 18 37 3a = C 16 33 3d = C 14 29 3e = C 18 37 26a,b,c 150-200 C -C 2 1. K/Et 2. Cl/ 2 25a,b,c 25a = C 14 29 26a = C 14 29 25b = C 16 33 26b = C 16 33 25c = C 18 37 26c = C 18 37 Abb. 19: Darstellung der α-verzweigten Carbonsäuren. 8.2. α-verzweigte Säureamide 26a,b,c SCl 2 27a,b,c Cl 14a/14b/14c/14d/TEA CCl 3 R 2 28a,b,c,d,e,f 26a = C 14 29 26b = C 16 33 26c = C 18 37 27a = C 14 29 27b = C 16 33 27c = C 18 37 14a 14b 2 2 2 14c 2 2 2 14d 28a = C 14 29, R 2 = (C) 2 (C 2 ) 2 28b = C 14 29, R 2 = 2 (C 2 ) 2 28c = C 14 29, R 2 = [ 2 (C 2 ) 2 ] 2 (C 2 ) 2 28d = C 14 29, R 2 = 2 (C 2 ) 4 28e = C 16 33, R 2 = 2 (C 2 ) 2 28f = C 14 33, R 2 = 2 (C 2 ) 4 2 2 Abb. 20: Darstellung der α-verzweigten Säureamide.
Synthetischer Teil 30 Um Amine als Kopfgruppen einzuführen, wurde auf die bewährte Kupplung zu Amiden zurückgegriffen. Die α-verzweigten Säuren ließen sich durch einen Überschuss an Thionylchlorid in die entsprechend reaktiven Säurechloride überführen. Die anschließende Aminolyse war mit guten Ausbeuten verbunden. Die entstandenen Amide 28a-f konnten aufgrund ihrer kristallinen Eigenschaften aus eptan umkristallisiert werden. 8.3. α-verzweigte Säurediamide Die Verwendung der Diamine 14b,d als Spacer ermöglichte es, die Synthesestrategie erheblich zu erweitern. Es bot sich an, die freie Aminfunktion für weitere Umsetzungen zu nutzen. Unter Verwendung einer Kombination aus und 1-ydroxybenzotriazol wurden unterschiedliche geschützte Aminosäuren 29a-h gekuppelt 94. Als Schutzgruppen eigneten sich die Benzyloxycarbonyl- und tert.-butyloxycarbonyl-reste sehr gut. Bei der Benzyloxycarbonyl-Methode benutzt man als schützende Gruppe am Stickstoff den Benzyloxycarbonyl-Rest (früher als Carbobenzoxy-Rest (Cbo- oder Z-Rest) bezeichnet 48 ). Zunehmende Bedeutung erlangt weiterhin der tert.-butyloxycarbonyl-rest (BC-Rest) als Schutzgruppe am Stickstoff. Im Fall der Aminosäure Lysin 29d wurden die -Schutzgruppen durch Umsetzen mit Di-tert.butyldicarbonat erhalten 95. ach erfolgter Amidbildung 30a-j ließ sich der Cbo-Rest durch katalytische ydrierung leicht wieder abspalten, wobei Toluol, Kohlendioxid und das gewünschte Produkt entstanden. Der tert.-butyloxycarbonyl-rest zeichnet sich dadurch aus, dass er mit starken Säuren abgespalten werden kann. Die erhaltenen Produkte 31a-j mussten jedoch durch chromatographische perationen aufgereinigt werden und ließen sich nicht umkristallisieren. Das vorgestellte synthetische Schema ermöglichte es, auf einfachem Wege Lipide mit unterschiedlichen Kopfgruppen, Spacer oder Kettenlänge zu synthetisieren. 27 C 13 27 C 13 28b 2 Z-Gly- 29a BT C 2 Cl 2 27 C 13 27 C 13 30a (Z-Gly) BT C 2 Cl 2 27 C 13 27 C 13 (Boc-Leu) Boc-Leu- 29b 30b Abb. 21: Darstellung der α-verzweigten Säurediamide I.
Synthetischer Teil 31 27 C 13 27 C 13 28b 2 S BT C 2 Cl 2 27 C 13 27 C 13 (Boc-Meth) Boc-Meth- 29c 30c BT C 2 Cl 2 27 C 13 27 C 13 (Boc-Lys(Boc)) Boc-Lys(Boc)- 29d 30d BT C 2 Cl 2 27 C 13 27 C 13 (Z-Lys(Z)) Z-Lys(Z)- 29e 30e 31 C 15 31 C 15 28d 2 Boc-Gly- 29f BT C 2 Cl 2 31 C 15 31 C 15 30f BT C 2 Cl 2 31 C 15 31 C 15 (Boc-Pro) Boc-Pro- 29g 30g 27 C 13 27 C 13 28e 2 Boc-Gly- 29f BT C 2 Cl 2 27 C 13 27 C 13 30h BT C 2 Cl 2 27 C 13 27 C 13 (Boc-Thr) Boc-Thr- 29h 30i 31 C 15 31 C 15 28f 2 Boc-Gly- 29f BT C 2 Cl 2 31 C 15 31 C 15 30j Abb. 21b: Darstellung der α-verzweigten Säurediamide II.
Synthetischer Teil 32 27 C 13 27 C 13 30a (Z-Gly) 2, Pd/C 27 C 13 27 C 13 31a 2 27 C 13 27 C 13 27 C 13 27 C 13 27 C 13 27 C 13 30b 30c 30d (Boc-Leu) (Boc-Meth) (Boc-Lys(Boc)) Cl Cl Cl 27 C 13 27 C 13 27 C 13 27 C 13 27 C 13 27 C 13 31b 31c 31d 2 S 2 2 *Cl *Cl 2 *Cl 27 C 13 27 C 13 31 C 15 31 C 15 31 C 15 31 C 15 27 C 13 27 C 13 27 C 13 27 C 13 (Z-Lys(Z)) 30e 30f (Boc-Pro) 30g 30h (Boc-Thr) 30i 2, Pd/C Cl Cl Cl Cl 27 C 13 27 C 13 31 C 15 31 C 15 31 C 15 31 C 15 27 C 13 27 C 13 27 C 13 27 C 13 31e 31f 31g 31h 31i 2 2 2 *Cl *Cl 2 *Cl 2 *Cl 31 C 15 31 C 15 30j Cl 31 C 15 31 C 15 31j 2 *Cl Abb. 22: Abspaltung der Schutzgruppen.